Pengaruh Pemberian Curcuminoid dalam Mencegah dan Memperbaiki Kerusakan Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus Model Diabetes Mellitus Ditinjau dari Ekspresi Kolagen Tipe IV Chapter III VI
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratorik ex
vivo karena baik sampel maupun perlakuan lebih terkendali, terukur dan
pengaruh perlakuan dapat lebih dipercaya. Rancangan penelitian ini
menggunakan randomized post test only control group laboratory
experimental design untuk mengetahui efek pemberian curcuminoid
terhadap tikus model DM setiap unit eksperimen dengan pengukuran
variabel yang hanya dilakukan setelah pemberian perlakuan. Pengambilan
sampel dilakukan secara acak dan ada kontrol pembanding.
3.2 Tempat dan Teknik Pengambilan Data Penelitian
3.2.1 Tempat penelitian
Penelitian
mempunyai
Laboratorium
dilakukan
di
laboratorium
yang
peralatan
lengkap
serta
Biokimia
Fakultas
Kedokteran
terstandarisasi
pengalaman
memadai
Universitas
dan
di
Airlangga
(Surabaya) untuk pemeliharaan, perlakuan pada hewan coba, pemberian
curcuminoid dan juga pengambilan jaringan koklea. Pembuatan blok serta
pemotongan blok jaringan, pewarnaan Hematoxylin dan Eosin (HE),
pemeriksaan
imunohistokimia
dan
penghitungan
sel
dilakukan
di
Laboratorium Patologi Anatomi Rumah Sakit Umum Daerah dr. Soetomo
(Surabaya).
3.2.2 Teknik Pengambilan Data
Data yang dianalisis dalam penelitian ini merupakan data sekunder dari
sebuah penelitian besar yang dilakukan oleh Tengku Siti Hajar Haryuna
dan dibiayai oleh DIPA Direktorat Penelitian Pengabdian kepada
Masyarakat Tahun Anggaran 2015 No. 120/SP2H/PL/Dit.Litabmas/II/2015
tanggal 05 Februari 2015.
27
Universitas Sumatera Utara
28
3.3 Variabel Penelitian
3.3.1 Variabel bebas (independen)
Variabel bebas adalah stres hiperglikemia yang didapatkan melalui
injeksi streptozotocin (STZ) 60 mg/kgbb/ekor serta pemberian curcuminoid
dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari/ekor selama 3 dan 8 hari.
3.3.2 Variabel terikat (dependen)
Respon molekuler pada fibroblas berupa ekspresi kolagen tipe IV.
3.3.3 Variabel terkendali
Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin tikus, kandang tikus
terpisah, berat badan tikus, makanan dan minuman tikus, cara pemberian
perlakuan injeksi STZ serta curcuminoid, prosedur penelitian dan cara
pemeliharaan hewan coba.
3.4 Sampel
Penelitian ini menggunakan tikus karena tikus memiliki kemiripan
struktur telinga dalam dengan manusia. Tikus telah digunakan sebagai
model hewan coba untuk penelitian penyakit ketulian genetik manusia dan
terbukti bermanfaat dalam membantu mengidentifikasi gen yang sesuai
pada manusia yang berperan dalam perkembangan sistem auditorius.
Tikus dinyatakan homolog (>70%) dengan manusia (Purnami, 2009).
Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin jantan, kondisi
sehat, umur dewasa (2-3 bulan), dengan berat badan 150-250 gram agar
perubahan berat selama penelitian relatif kecil (Haryuna, 2013).
Sampel penelitian ini menggunakan tikus dengan galur populasi yang
sama, homogen dalam jenis kelamin dan umur, tikus tersebut merupakan
hasil pembiakan (breeding) di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran
Universitas Airlangga. Perlakuan pada tikus dengan injeksi STZ dengan
dosis tertentu, kemudian diukur variabel penelitian hanya setelah
pemberian perlakuan.
Universitas Sumatera Utara
29
Rancangan penelitian memiliki kriteria sebagai berikut:
1. Pengambilan sampel dilakukan secara acak,
2. STZ diberikan dalam dosis tertentu sesuai berat badan tikus,
3. Ada kontrol pembanding,
4. Bersifat double blind.
Selanjutnya data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan uji
statistik SPSS untuk mencapai tujuan penelitian.
3.4.1 Besar sampel
Besar sampel ditentukan berdasarkan jumlah ulangan yang dianggap
telah cukup baik (Federer, 1955), dengan rumus sebagai berikut:
(k-1) (r-1) ≥ 15)
Keterangan:
k = jumlah kelompok subyek penelitian (k = 6)
r = jumlah ulangan
Perhitungan:
(6-1) (r-1) ≥ 15. 5r – 5 ≥ 15. 5r ≥ 20. r ≥ 4
Berdasarkan hasil penghitungan r (ulangan) minimal sama dengan 4
kali, maka ditetapkan ulangan tiap kelompok 4.
r = 4; n = r x k; n = 4 x 6 = 24
ditetapkan besar sampel secara keseluruhan yaitu minimal 24 ekor tikus.
3.4.2 Pengelompokan sampel
Berdasarkan rumus di atas maka besar sampel adalah tikus yang
diambil peneliti secara random untuk tiap kelompok perlakuan, sehingga
sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 24 ekor tikus yang
dibagi menjadi 6 kelompok sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
30
P0 (Tanpa perlakuan=Kontrol)
K1 (Kelompok 1)
P1 (Perlakuan 1)
K2 (Kelompok 2)
P2 (Perlakuan 2)
K3 (Kelompok 3)
P3 (Perlakuan 3)
K4 (Kelompok 4)
P4 (Perlakuan 4)
K5 (Kelompok 5)
P5 (Perlakuan 5)
K6 (Kelompok 6)
R
Subyek
R
:
Randomisasi.
K1
:
Kelompok kontrol, diberikan injeksi buffer natrium sitrat (1x).
K2
:
Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single dose.
K3
:
Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
200
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari.
K4
:
Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
400
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari.
K5
:
Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
200
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari.
K6
:
Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
400
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari.
3.4.3 Teknik pengambilan sampel
Tikus putih jantan Rattus norvegicus galur Wistar didapat dari institusi
penyedia yang memiliki kualifikasi standar dan reputasi yang baik
(Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga).
Universitas Sumatera Utara
31
Sebelum digunakan sebagai subyek penelitian, hewan coba dilakukan
evaluasi klinis dan dikondisikan dalam lingkungan yang sesuai (selama
14 x 24 jam) untuk meyakinkan bahwa hewan tersebut tidak berpenyakit
atau tidak berpotensi menularkan penyakit.
Sebelum mendapatkan perlakuan penelitian, dilakukan skrining dengan
beberapa kriteria, yaitu:
1. Kriteria inklusi:
Hewan coba berusia 2-3 bulan, jenis kelamin jantan dan berat badan
150-250 gram.
2. Kriteria eksklusi:
a. Hewan
dinyatakan
oleh
dokter
hewan
konsultan
terbukti
berpenyakit, baik penyakit menular atau tidak menular atau cedera
fisik atau berpotensi menularkan penyakit dalam kurun waktu
evaluasi klinis di dalam kondisi lingkungan yang sesuai (selama
14 x 24 jam).
b. Hewan terdeteksi memiliki kelainan bawaan yang dinyatakan oleh
dokter hewan konsultan.
c. Hewan berperilaku agresif, dalam pengamatan sering menyerang
anggota kelompok lain.
Setelah didapatkan sampel yang homogen melalui skrining dengan
kriteria inklusi dan eksklusi di atas, dilakukan pembagian kelompok
sampel yang homogen secara alokasi random sehingga setiap anggota
sampel mempunyai kesempatan sama untuk menempati kelompoknya.
Penelitian berlangsung dengan prosedur perlakuan hewan secara
benar ditinjau dari prinsip 3R (Reduction, Replacement, Refinement) serta
prinsip 5F (Freedom from Hunger and Thirst, Freedom from Discomfort,
Freedom from Pain, Injury or Disease, Freedom to Express Normal
Behaviour, Freedom from Fear and Distress) (FAO, 2011) dan
diberlakukan kriteria Putus Uji apabila subyek penelitian mengalami sakit
atau kematian sehingga tidak bisa memenuhi prosedur penelitian yang
membutuhkan waktu 3-8 hari.
Universitas Sumatera Utara
32
Selanjutnya tikus diterminasi dan dilakukan pengambilan jaringan
koklea untuk dibuat sediaan dan pengecatan imunohistokimia untuk
analisis ekspresi kolagen tipe IV.
3.5 Definisi Operasional Variabel Penelitian
1. Induksi DM
Injeksi STZ dengan dosis 60 mg/kgbb/ekor single dose secara
intraperitoneal, kemudian kadar gula darah diukur 2 hari pasca injeksi,
sampai terjadi kondisi hiperglikemia (KGD >200 mg/dl).
2. Hiperglikemia adalah keadaan dimana kadar gula darah tikus
mencapai >200 mg/dl yang diukur menggunakan strip pengukur kadar
gula darah merk Gluko DR® Bio Sensor dari allmedicus.
3. Curcuminoid
Zat pigmen kuning yang diekstraksi dari tumbuhan Curcuma
domestica Val. atau Curcuma longa Linnaeus. Pada penelitian ini
yang digunakan adalah curcuminoid serbuk dengan kadar 80%
curcuminoid standar dari Tradimun. Sediaan yang diberikan berupa
curcuminoid serbuk dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari per ekor
tikus.
4. Fibroblas: sel yang terdapat pada jaringan dinding lateral koklea. Sel
berinti tunggal.
5. Ekspresi kolagen tipe IV
Ekspresi
kolagen
tipe
IV
diidentifikasi
dengan
pengecatan
imunohistokimia pada sel fibroblas dinding lateral koklea tikus yang
terekspresi warna coklat pada sitoplasma pada tiap kelompok di
bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 40x yang diamati oleh 3
orang pengamat untuk kemudian dilakukan penghitungan skor
imunoreaktif. Skor imunoreaktif diperoleh dengan mengalikan skor
luas dengan skor intensitas. Hasil ukur skor imunoreaktif adalah 0-9.
Dalam penelitian ini digunakan antibodi polyclonal Anti-COL4A2.
Universitas Sumatera Utara
33
3.6 Alat dan Bahan Penelitian
3.6.1 Hewan coba yang dikenai perlakuan
Tikus putih jantan Rattus norvegicus galur Wistar yang memenuhi
kriteria inklusi dan eksklusi, kemudian dikelompokkan secara acak.
3.6.2 Bahan perlakuan
1. STZ
STZ merupakan senyawa nitrosourea yang disimpan pada suhu 200 C.
Konsentrasi STZ adalah 22,5 mg/l dengan dosis penggunaan 60
mg/kgbb/ekor tikus, disimpan dalam tabung reaksi yang ditutup
dengan aluminium foil (karena sensitif terhadap cahaya).
2. Curcuminoid
Curcuminoid yang dipakai berasal dari Curcuma longa Linnaeus
dengan kadar curcuminoid 80% yang berasal dari Tradimun. Sediaan
yang diberikan berupa curcuminoid serbuk dengan dosis 200 dan 400
mg/kgbb/hari perekor tikus.
3. Buffer natrium sitrat
Buffer natrium sitrat
dibuat dengan melarutkan 1,47 gram Natrium
sitrat dalam 50 ml dH2O.
4. CMC
CMC dibuat dengan mensuspensikan 0,5 gram CMC dalam 100 cc
larutan akuades.
3.6.3 Alat dan bahan pemeriksaan laboratorium
Alat yang digunakan: kandang tikus, gunting bedah, disposible syringe,
mikroskop binokuler, gelas obyek dan cover glass, mikrotom, hot plate, tap
water, tabung reaksi, pipet pasteur steril, tabung silikon, pipet mikro, beker
gelas, NGT no.10, spuit 3 cc dan 5 cc, Gluko DR® Bio Sensor, timbangan,
aluminium foil, pot, formalin 10% untuk fiksasi jaringan dan lemari es.
Universitas Sumatera Utara
34
Bahan untuk pembuatan blok parafin, proses deparafinisasi, HE dan
imunohistokimia meliputi Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA),
formalin 10%, H2O2 3%, xylol, alkohol (30%, 50%, 70%, 80% dan 96%),
dH2O, larutan HE, entelan, paraffin lunak dan keras, Fetal Bovine Serum
(FBS), Phosphate Buffer Saline (PBS), antibodi primer yaitu polyclonal
Anti-COL4A2 dan biotinylated secondary Ab (anti rabbit), Horse Radish
Peroxidase (HRP) streptavidin, pewarna Meyer-Hematoxilen, substrat
Diamino Benzidine (DAB) dan entelan.
3.7 Prosedur Penelitian
3.7.1 Tahap persiapan
Untuk menjamin bahwa semua prosedur yang dilakukan pada
penelitian ini laik etik, maka sebelum dilakukan penelitian proposal
diajukan terlebih dahulu pada Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas
Sumatera Utara untuk mendapatkan penilaian dan pengesahan kelaikan
etik.
3.7.2 Prosedur induksi diabetes menggunakan STZ
Membuat tikus model DM :
1. Hewan coba dipuasakan terlebih dahulu selama 4 jam untuk
mengosongkan lambung dan mengurangi risiko aspirasi.
2. Hitung kebutuhan induksi dosis STZ 60 mg/kgbb/ekor.
3. Hitung kebutuhan dapar sitrat yang dibutuhkan dengan konsentrasi
STZ 22,5 mg/ml dalam dapar sitrat.
4. Siapkan tabung dan bungkus dengan aluminium foil pada bagian
luarnya.
5. 15-20 menit sebelum diinduksi, timbang STZ yang dibutuhkan
kemudian larutkan ke dalam dapar sitrat yang telah ditentukan.
6. Masukkan larutan STZ yang diperoleh ke dalam tabung berbungkus
aluminium foil.
Universitas Sumatera Utara
35
7. 30 detik sampai 1 menit sebelum induksi segera pindahkan larutan
STZ ke dalam spuit 1 ml.
8. Injeksikan larutan STZ melalui intraperitoneal tikus sesuai dengan
kebutuhan dosis per ekor. Induksi dilakukan hanya satu kali.
9. Berikan larutan sukrosa 10% atau dekstrosa 10% sepanjang malam
pertama setelah induksi untuk menghindari sudden hypoglycemic post
injection.
10. Tikus diperiksa KGD puasa setiap pagi (puasa tikus dengan cara tidak
diberi pakan dan kandang dikosongkan dari sekam selama 6 jam).
Hiperglikemia yang bermakna akan dijumpai 2 hari setelah induksi.
11. Pada kelompok 2 dilakukan terminasi 3 hari setelah hiperglikemia.
Pada kelompok 3 dan 4, setelah hiperglikemia diberikan curcuminoid
selama 3 hari sebelum terminasi. Pada kelompok 5 dan 6, setelah
hiperglikemia diberikan curcuminoid selama 8 hari sebelum terminasi.
3.7.3 Prosedur pemberian curcuminoid
Curcuminoid (kadar curcuminoid 80%) dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari
perekor tikus disuspensikan dalam CMC 0,5% (CMC dibuat dengan
mensuspensikan 0,5 gram CMC dalam 100 cc larutan akuades). Setelah
disuspensikan, diberikan ke tikus dengan menggunakan Naso Gastric
Tube (NGT).
3.7.4 Perlakuan pada tikus
Setelah tikus putih beradaptasi terhadap lingkungan kandang di
laboratorium selama 2 minggu, selanjutnya perlakuan diberikan sesuai
dengan kelompok yang direncanakan.
3.7.5 Prosedur pengambilan jaringan koklea tikus
Tikus dikorbankan dengan inhalasi eter kemudian dilakukan terminasi.
Selanjutnya dilakukan nekropsi jaringan tulang temporal. Sampel jaringan
diambil, difiksasi dengan
larutan buffer formalin 10% dan dilakukan
dekalsifikasi dengan EDTA selama 4 minggu.
Universitas Sumatera Utara
36
3.7.6 Pemeriksaan laboratorium
1. Fiksasi jaringan dengan pembuatan paraffin block jaringan.
Jaringan tulang didekalsifikasi dengan menggunakan EDTA selama 4
minggu. Jaringan selanjutnya dicuci dengan PBS 3-5 kali untuk
membersihkannya dari kontaminan. Kemudian jaringan difiksasi pada
larutan formalin 10%. Setelah itu dilakukan dehidrasi dengan alkohol
bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolut) masing-masing
selama 60 menit. Dilakukan clearing menggunakan xylol sebanyak 2
kali masing-masing 60 menit. Kemudian dilakukan impregnasi dengan
parafin lunak selama 60 menit pada suhu 480C. Selanjutnya dilakukan
blocking preparat dalam parafin keras pada cetakan dan didiamkan
selama sehari.
2. Proses deparafinisasi.
Dilakukan pemotongan blok parafin setebal 4 µm dengan rotary
microtome. Jaringan yang sudah dipotong dimasukkan dalam air
hangat lalu kemudian diletakkan pada kaca obyek. Kaca obyek
selanjutnya diletakkan di atas hot plate dengan suhu 50-60oC hingga
mengering.
3. Proses pewarnaan HE
Dimasukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak 2 kali masing-masing
selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan alkohol berseri
(absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masing-masing selama 5
menit, kemudian bilas dalam dH2O selama 5 menit. Warnai sediaan
dengan Hemotoxilin selama 10 menit, setelah itu direndam dalam tap
water selama 10 menit lalu dibilas dengan dH2O. Sediaan selanjutnya
diwarnai kembali dengan larutan Eosin selama 3 menit lalu didehidrasi
dengan alkohol berseri 30% dan 50% masing-masing selama 5 menit,
cuci dengan distilled water (dH2O) selama 5 menit dan dikeringanginkan. Inkubasi kembali dengan xylol sebanyak 2 kali masingmasing selama 2 menit kemudian dilakukan mounting dengan entelan
dan tutup dengan cover glass.
Universitas Sumatera Utara
37
4. Proses pewarnaan kolagen tipe IV (imunohistokimia).
Masukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak dua kali masing-masing
selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan alkohol berseri
(absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masing-masing selama 5
menit, kemudian dibilas dalam dH2O selama 5 menit. Masukkan
kembali ke dalam H2O2 3% selama 20 menit, lalu cuci menggunakan
PBS pH 7,4 tiga kali, selama 5 menit. Bloking protein non-spesifik
dilakukan dengan menggunakan 5% FBS yang mengandung 0,25%
Triton X-100 lalu cuci kembali dengan PBS pH 7,4 tiga kali, selama 5
menit. Inkubasi dengan menggunakan antibodi primer yaitu polyclonal
Anti-COL4A2 selama 60 menit, cuci menggunakan PBS pH 7,4 tiga
kali selama 5 menit. Selanjutnya sediaan direaksikan dengan antibodi
sekunder (Biotinylated secondary Ab) selama 60 menit, cuci
menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali selama 5 menit. Inkubasi dengan
HRP steptavidin selama 60 menit, cuci menggunakan PBS pH 7,4 tiga
kali, selama 5 menit. Tetesi dengan DAB dan inkubasi selama 30
menit, cuci menggunakan dH2O, selama 5 menit. Masukkan ke dalam
Mayer Hematoxilin inkubasi selama 10 menit dan cuci menggunakan
tap water. Bilas menggunakan dH2O dan kering-anginkan. Kemudian
mounting menggunakan entelan dan tutup dengan cover glass.
3.7.5 Penghitungan sel
Menggunakan mikroskop Nikon Eclips 100 dengan pembesaran 40x.
Penghitungan jumlah fibroblas terekspresi dilakukan oleh 3 orang
pemeriksa.
1. Semua slide yang sudah berkode ditutup nomor kodenya dan diberi
nomor baru secara acak sehingga pemeriksa dan peneliti yang ikut
memeriksa tidak mengetahui slide yang diperiksa milik sampel yang
mana (double blind).
2. Pengamat terdiri dari 3 orang, masing-masing yaitu peneliti dan 2
orang pemeriksa.
Universitas Sumatera Utara
38
3. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan secara terpisah diantara
ke-3 pemeriksa, disesuaikan dengan kemampuan / kesediaan waktu
pemeriksa.
4. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan terhadap masingmasing slide pada dinding lateral koklea yaitu daerah yang ditandai
dengan adanya fibroblas dengan pembesaran 40x.
5. Hasil penghitungan sel untuk setiap lapangan pandang sesuai dengan
slide yang diperiksa ditulis di lembar kerja.
6. Analisis statistik dilakukan bila semua hasil sudah dikembalikan ke
nomor kode.
Universitas Sumatera Utara
39
3.8 Alur Penelitian
Populasi Hewan
Randomisasi
Kelompok
Kontrol
Kelompok
Perlakuan
Kelompok 1
Kelompok
2
Kelompok
3
Kelompok
4
Kelompok
5
Kelompok
6
Inj. STZ 60
single dose
Inj. STZ 60
single dose
Inj. STZ 60
single dose
Inj. STZ 60
single dose
Inj. STZ 60
single dose
C200
3 hari
C400
3 hari
C200
8 hari
C400
8 hari
Terminasi hari ke-5
Terminasi hari ke-10
Pemeriksaan imunohistokimia
fibroblas dinding lateral koklea
untuk melihat ekspresi
kolagen tipe IV
Gambar 3.1 Alur Penelitian.
3.9 Analisis Statistik
Data penelitian yang diperoleh akan diolah dan dianalisis dengan
menggunakan IBM SPSS Statistics. Sebelum dilakukan analisis, terlebih
dahulu dilakukan uji normalitas dengan uji Shapiro-Wilk. Analisis univariat
Universitas Sumatera Utara
40
dilakukan untuk memperoleh nilai rata-rata hitung (Mean) dan standar
deviasi (SD) untuk tiap kelompok penelitian sehingga dapat diketahui
deskripsi masing-masing variabel dalam penelitian. Analisis bivariat
dilakukan untuk menguji hubungan antara variabel independen terhadap
variabel dependen, menganalisis kesetaraan antara masing-masing
kelompok dan mengetahui perbedaan (penurunan atau peningkatan) yang
terjadi pada masing-masing kelompok setelah diadakan intervensi. Untuk
menganalisis perbedaan atau peningkatan pada masing-masing kelompok
penelitian ini digunakan uji t independen atau uji Mann-Whitney.
Perlakuan diuji pada taraf nyata 5%.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL PENELITIAN
4.1 Fibroblas Dinding Lateral Koklea
Gambar pemeriksaan dengan pengecatan HE digunakan untuk melihat
potongan dinding lateral koklea dan sebagai pembanding atas pengecatan
dengan imunohistokimia (Gambar 4.1).
Gambar
4.1
Penampang
Dinding
Lateral
Koklea
Tikus
dengan
Pengecatan HE (Pembesaran 4x).
4.2 Imunohistokimia Kolagen Tipe IV Setiap Kelompok
Setelah
dievaluasi
dengan
metode
imunohistokimia,
dijumpai
penurunan ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok yang hanya diberikan
injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose (kelompok 2) [Gambar 4.2 (B)]
dibandingkan dengan kelompok lain. Selanjutnya, kelompok DM yang
diberi curcuminoid (kelompok 3, 4, 5 dan 6) menunjukkan ekspresi
kolagen tipe IV lebih banyak dengan densitas warna coklat lebih kuat yang
terekspresi pada fibroblas dibandingkan kelompok DM tanpa pemberian
curcuminoid (kelompok 2) [Gambar 4.2 (C), (D) , (E) dan (F)].
41
Universitas Sumatera Utara
42
A
B
C
D
E
F
Gambar 4.2 Ekspresi Kolagen Tipe IV di Setiap Kelompok (Pembesaran
40x):
(A) Kelompok 1; (B) Kelompok 2; (C) Kelompok 3; (D)
Kelompok 4; (E) Kelompok 5 dan (F) Kelompok 6. Panah
merah menunjukkan ekspresi kolagen tipe IV pada fibroblas
dinding lateral koklea yang ditandai dengan warna coklat.
Universitas Sumatera Utara
43
4.3 Profil Ekspresi Kolagen Tipe IV
Pada penelitian ini jumlah sampel diambil empat ekor tikus pada setiap
kelompok (n=4) dengan karakteristik sampel yang digunakan memenuhi
kriteria inklusi dan eksklusi.
Hasil penelitian yang didapat berdasarkan pemeriksaan histopatologis
dengan metode HE dan imunohistokimia didapatkan gambaran ekspresi
kolagen tipe IV yang merupakan komponen utama dari MES. Selanjutnya
dilakukan analisis statistik untuk mengetahui perbedaan ekspresi tiap
kelompok dimana kelompok 1 merupakan kelompok kontrol, diberikan
injeksi buffer natrium sitrat (1x) dilanjutkan pemberian CMC (setiap hari);
kelompok 2 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian
diterminasi hari ke-5; kelompok 3 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single dose, kemudian diberikan curcuminoid 200 mg/kgbb/hari/ekor
dimulai hari ke-3 selama 3 hari, kemudian diterminasi hari ke-5; kelompok
4 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan
curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari,
kemudian diterminasi hari ke-5; kelompok 5 diberikan injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
200
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari, kemudian diterminasi
hari ke-10; kelompok 6 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose,
kemudian diberikan curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3
selama 8 hari, kemudian diterminasi hari ke-10.
4.3.1 Diagram rerata kolagen tipe IV
Ekspresi kolagen tipe IV ditemukan menurun pada kelompok yang
hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose
(kelompok 2) dan terjadi peningkatan ekspresi kolagen tipe IV pada
kelompok DM yang diberi curcuminoid setelah diinjeksi STZ (kelompok 3,
4, 5 dan 6) (Gambar 4.3).
Universitas Sumatera Utara
44
Gambar 4.3 Diagram Rerata Ekspresi Kolagen Tipe IV pada MasingMasing Kelompok.
4.3.2 Analisis univariat
Analisis univariat dilakukan untuk memperoleh nilai mean dan SD
untuk tiap kelompok penelitian sehingga dapat diketahui deskripsi masingmasing variabel dalam penelitian (Tabel 4.1).
Tabel 4.1 Nilai Mean dan SD pada Setiap Kelompok.
Kelompok
Kolagen Tipe
IV
Mean
SD
Nilai Minimal
Nilai Maksimal
1
4.00
0.00
4
4
2
1.25
0.50
1
2
3
2.25
1.25
1
4
4
6.25
3.77
1
9
5
5.75
2.36
4
9
6
8.25
1.50
6
9
Universitas Sumatera Utara
45
Dari analisis univariat tabel 4.1 di atas, dapat disimpulkan:
1. Ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok yang hanya mendapat
perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose (kelompok 2)
menunjukkan hasil lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol
(kelompok
1)
dan
kelompok
ini
memiliki
ekspresi
terendah
dibandingkan kelompok lain.
2. Dijumpai peningkatan ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok DM
yang diberi curcuminoid (kelompok 3, 4, 5 dan 6) dibandingkan
kelompok
yang
hanya
mendapat
perlakuan
injeksi
STZ
60
mg/kgbb/ekor single dose (kelompok 2).
3. Ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok mendapat perlakuan injeksi
STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid
400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari (kelompok 4)
menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi dibandingkan kelompok yang
mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose,
kemudian diberikan curcuminoid 200 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari
ke-3 selama 3 hari (kelompok 3) dan ekspresi kolagen tipe IV pada
kelompok mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single
dose, kemudian diberikan curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai
hari ke-3 selama 8 hari (kelompok 6) menunjukkan ekspresi yang lebih
tinggi dibandingkan kelompok yang mendapat perlakuan injeksi STZ
60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid 200
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari (kelompok 5).
4. Ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok mendapat perlakuan injeksi
STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid
400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari (kelompok 6)
merupakan ekspresi tertinggi dibandingkan kelompok lain.
Universitas Sumatera Utara
46
4.3.3 Analisis bivariat
Analisis bivariat dilakukan untuk menguji hubungan antara variabel
independen terhadap variabel dependen, menganalisis kesetaraan antara
masing-masing kelompok dan mengetahui perbedaan (penurunan atau
peningkatan) yang terjadi pada masing-masing kelompok setelah
dilakukan intervensi.
Tabel 4.2 Analisis Bivariat Kelompok 1 dan Kelompok 2.
Kelompok
Kolagen Tipe IV
Mean
SD
1
4.00
0.00
2
1.25
0.50
p. value
0.011
Dari analisis tabel 4.2 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat
perbedaan rerata yang bermakna secara statistik (p. value 0.05).
Universitas Sumatera Utara
47
Tabel 4.4 Analisis Bivariat Kelompok 2 dan Kelompok 4.
Kelompok
Kolagen Tipe IV
Mean
SD
2
1.25
0.50
4
6.25
3.77
p. value
0.089
Dari analisis tabel 4.4 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat
perbedaan rerata (peningkatan ekspresi kolagen tipe IV) antara kelompok
yang hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose
(kelompok 2) dengan kelompok yang mendapat perlakuan injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
400
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari (kelompok 4) namun
tidak bermakna secara statistik (p. value >0.05).
Tabel 4.5 Analisis Bivariat Kelompok 2 dan Kelompok 5.
Kelompok
Kolagen Tipe IV
Mean
SD
2
1.25
0.50
5
5.75
2.36
p. value
0.010
Dari analisis tabel 4.5 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat
perbedaan rerata yang bermakna secara statistik (p. value
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratorik ex
vivo karena baik sampel maupun perlakuan lebih terkendali, terukur dan
pengaruh perlakuan dapat lebih dipercaya. Rancangan penelitian ini
menggunakan randomized post test only control group laboratory
experimental design untuk mengetahui efek pemberian curcuminoid
terhadap tikus model DM setiap unit eksperimen dengan pengukuran
variabel yang hanya dilakukan setelah pemberian perlakuan. Pengambilan
sampel dilakukan secara acak dan ada kontrol pembanding.
3.2 Tempat dan Teknik Pengambilan Data Penelitian
3.2.1 Tempat penelitian
Penelitian
mempunyai
Laboratorium
dilakukan
di
laboratorium
yang
peralatan
lengkap
serta
Biokimia
Fakultas
Kedokteran
terstandarisasi
pengalaman
memadai
Universitas
dan
di
Airlangga
(Surabaya) untuk pemeliharaan, perlakuan pada hewan coba, pemberian
curcuminoid dan juga pengambilan jaringan koklea. Pembuatan blok serta
pemotongan blok jaringan, pewarnaan Hematoxylin dan Eosin (HE),
pemeriksaan
imunohistokimia
dan
penghitungan
sel
dilakukan
di
Laboratorium Patologi Anatomi Rumah Sakit Umum Daerah dr. Soetomo
(Surabaya).
3.2.2 Teknik Pengambilan Data
Data yang dianalisis dalam penelitian ini merupakan data sekunder dari
sebuah penelitian besar yang dilakukan oleh Tengku Siti Hajar Haryuna
dan dibiayai oleh DIPA Direktorat Penelitian Pengabdian kepada
Masyarakat Tahun Anggaran 2015 No. 120/SP2H/PL/Dit.Litabmas/II/2015
tanggal 05 Februari 2015.
27
Universitas Sumatera Utara
28
3.3 Variabel Penelitian
3.3.1 Variabel bebas (independen)
Variabel bebas adalah stres hiperglikemia yang didapatkan melalui
injeksi streptozotocin (STZ) 60 mg/kgbb/ekor serta pemberian curcuminoid
dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari/ekor selama 3 dan 8 hari.
3.3.2 Variabel terikat (dependen)
Respon molekuler pada fibroblas berupa ekspresi kolagen tipe IV.
3.3.3 Variabel terkendali
Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin tikus, kandang tikus
terpisah, berat badan tikus, makanan dan minuman tikus, cara pemberian
perlakuan injeksi STZ serta curcuminoid, prosedur penelitian dan cara
pemeliharaan hewan coba.
3.4 Sampel
Penelitian ini menggunakan tikus karena tikus memiliki kemiripan
struktur telinga dalam dengan manusia. Tikus telah digunakan sebagai
model hewan coba untuk penelitian penyakit ketulian genetik manusia dan
terbukti bermanfaat dalam membantu mengidentifikasi gen yang sesuai
pada manusia yang berperan dalam perkembangan sistem auditorius.
Tikus dinyatakan homolog (>70%) dengan manusia (Purnami, 2009).
Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin jantan, kondisi
sehat, umur dewasa (2-3 bulan), dengan berat badan 150-250 gram agar
perubahan berat selama penelitian relatif kecil (Haryuna, 2013).
Sampel penelitian ini menggunakan tikus dengan galur populasi yang
sama, homogen dalam jenis kelamin dan umur, tikus tersebut merupakan
hasil pembiakan (breeding) di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran
Universitas Airlangga. Perlakuan pada tikus dengan injeksi STZ dengan
dosis tertentu, kemudian diukur variabel penelitian hanya setelah
pemberian perlakuan.
Universitas Sumatera Utara
29
Rancangan penelitian memiliki kriteria sebagai berikut:
1. Pengambilan sampel dilakukan secara acak,
2. STZ diberikan dalam dosis tertentu sesuai berat badan tikus,
3. Ada kontrol pembanding,
4. Bersifat double blind.
Selanjutnya data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan uji
statistik SPSS untuk mencapai tujuan penelitian.
3.4.1 Besar sampel
Besar sampel ditentukan berdasarkan jumlah ulangan yang dianggap
telah cukup baik (Federer, 1955), dengan rumus sebagai berikut:
(k-1) (r-1) ≥ 15)
Keterangan:
k = jumlah kelompok subyek penelitian (k = 6)
r = jumlah ulangan
Perhitungan:
(6-1) (r-1) ≥ 15. 5r – 5 ≥ 15. 5r ≥ 20. r ≥ 4
Berdasarkan hasil penghitungan r (ulangan) minimal sama dengan 4
kali, maka ditetapkan ulangan tiap kelompok 4.
r = 4; n = r x k; n = 4 x 6 = 24
ditetapkan besar sampel secara keseluruhan yaitu minimal 24 ekor tikus.
3.4.2 Pengelompokan sampel
Berdasarkan rumus di atas maka besar sampel adalah tikus yang
diambil peneliti secara random untuk tiap kelompok perlakuan, sehingga
sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 24 ekor tikus yang
dibagi menjadi 6 kelompok sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
30
P0 (Tanpa perlakuan=Kontrol)
K1 (Kelompok 1)
P1 (Perlakuan 1)
K2 (Kelompok 2)
P2 (Perlakuan 2)
K3 (Kelompok 3)
P3 (Perlakuan 3)
K4 (Kelompok 4)
P4 (Perlakuan 4)
K5 (Kelompok 5)
P5 (Perlakuan 5)
K6 (Kelompok 6)
R
Subyek
R
:
Randomisasi.
K1
:
Kelompok kontrol, diberikan injeksi buffer natrium sitrat (1x).
K2
:
Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single dose.
K3
:
Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
200
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari.
K4
:
Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
400
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari.
K5
:
Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
200
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari.
K6
:
Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
400
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari.
3.4.3 Teknik pengambilan sampel
Tikus putih jantan Rattus norvegicus galur Wistar didapat dari institusi
penyedia yang memiliki kualifikasi standar dan reputasi yang baik
(Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga).
Universitas Sumatera Utara
31
Sebelum digunakan sebagai subyek penelitian, hewan coba dilakukan
evaluasi klinis dan dikondisikan dalam lingkungan yang sesuai (selama
14 x 24 jam) untuk meyakinkan bahwa hewan tersebut tidak berpenyakit
atau tidak berpotensi menularkan penyakit.
Sebelum mendapatkan perlakuan penelitian, dilakukan skrining dengan
beberapa kriteria, yaitu:
1. Kriteria inklusi:
Hewan coba berusia 2-3 bulan, jenis kelamin jantan dan berat badan
150-250 gram.
2. Kriteria eksklusi:
a. Hewan
dinyatakan
oleh
dokter
hewan
konsultan
terbukti
berpenyakit, baik penyakit menular atau tidak menular atau cedera
fisik atau berpotensi menularkan penyakit dalam kurun waktu
evaluasi klinis di dalam kondisi lingkungan yang sesuai (selama
14 x 24 jam).
b. Hewan terdeteksi memiliki kelainan bawaan yang dinyatakan oleh
dokter hewan konsultan.
c. Hewan berperilaku agresif, dalam pengamatan sering menyerang
anggota kelompok lain.
Setelah didapatkan sampel yang homogen melalui skrining dengan
kriteria inklusi dan eksklusi di atas, dilakukan pembagian kelompok
sampel yang homogen secara alokasi random sehingga setiap anggota
sampel mempunyai kesempatan sama untuk menempati kelompoknya.
Penelitian berlangsung dengan prosedur perlakuan hewan secara
benar ditinjau dari prinsip 3R (Reduction, Replacement, Refinement) serta
prinsip 5F (Freedom from Hunger and Thirst, Freedom from Discomfort,
Freedom from Pain, Injury or Disease, Freedom to Express Normal
Behaviour, Freedom from Fear and Distress) (FAO, 2011) dan
diberlakukan kriteria Putus Uji apabila subyek penelitian mengalami sakit
atau kematian sehingga tidak bisa memenuhi prosedur penelitian yang
membutuhkan waktu 3-8 hari.
Universitas Sumatera Utara
32
Selanjutnya tikus diterminasi dan dilakukan pengambilan jaringan
koklea untuk dibuat sediaan dan pengecatan imunohistokimia untuk
analisis ekspresi kolagen tipe IV.
3.5 Definisi Operasional Variabel Penelitian
1. Induksi DM
Injeksi STZ dengan dosis 60 mg/kgbb/ekor single dose secara
intraperitoneal, kemudian kadar gula darah diukur 2 hari pasca injeksi,
sampai terjadi kondisi hiperglikemia (KGD >200 mg/dl).
2. Hiperglikemia adalah keadaan dimana kadar gula darah tikus
mencapai >200 mg/dl yang diukur menggunakan strip pengukur kadar
gula darah merk Gluko DR® Bio Sensor dari allmedicus.
3. Curcuminoid
Zat pigmen kuning yang diekstraksi dari tumbuhan Curcuma
domestica Val. atau Curcuma longa Linnaeus. Pada penelitian ini
yang digunakan adalah curcuminoid serbuk dengan kadar 80%
curcuminoid standar dari Tradimun. Sediaan yang diberikan berupa
curcuminoid serbuk dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari per ekor
tikus.
4. Fibroblas: sel yang terdapat pada jaringan dinding lateral koklea. Sel
berinti tunggal.
5. Ekspresi kolagen tipe IV
Ekspresi
kolagen
tipe
IV
diidentifikasi
dengan
pengecatan
imunohistokimia pada sel fibroblas dinding lateral koklea tikus yang
terekspresi warna coklat pada sitoplasma pada tiap kelompok di
bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 40x yang diamati oleh 3
orang pengamat untuk kemudian dilakukan penghitungan skor
imunoreaktif. Skor imunoreaktif diperoleh dengan mengalikan skor
luas dengan skor intensitas. Hasil ukur skor imunoreaktif adalah 0-9.
Dalam penelitian ini digunakan antibodi polyclonal Anti-COL4A2.
Universitas Sumatera Utara
33
3.6 Alat dan Bahan Penelitian
3.6.1 Hewan coba yang dikenai perlakuan
Tikus putih jantan Rattus norvegicus galur Wistar yang memenuhi
kriteria inklusi dan eksklusi, kemudian dikelompokkan secara acak.
3.6.2 Bahan perlakuan
1. STZ
STZ merupakan senyawa nitrosourea yang disimpan pada suhu 200 C.
Konsentrasi STZ adalah 22,5 mg/l dengan dosis penggunaan 60
mg/kgbb/ekor tikus, disimpan dalam tabung reaksi yang ditutup
dengan aluminium foil (karena sensitif terhadap cahaya).
2. Curcuminoid
Curcuminoid yang dipakai berasal dari Curcuma longa Linnaeus
dengan kadar curcuminoid 80% yang berasal dari Tradimun. Sediaan
yang diberikan berupa curcuminoid serbuk dengan dosis 200 dan 400
mg/kgbb/hari perekor tikus.
3. Buffer natrium sitrat
Buffer natrium sitrat
dibuat dengan melarutkan 1,47 gram Natrium
sitrat dalam 50 ml dH2O.
4. CMC
CMC dibuat dengan mensuspensikan 0,5 gram CMC dalam 100 cc
larutan akuades.
3.6.3 Alat dan bahan pemeriksaan laboratorium
Alat yang digunakan: kandang tikus, gunting bedah, disposible syringe,
mikroskop binokuler, gelas obyek dan cover glass, mikrotom, hot plate, tap
water, tabung reaksi, pipet pasteur steril, tabung silikon, pipet mikro, beker
gelas, NGT no.10, spuit 3 cc dan 5 cc, Gluko DR® Bio Sensor, timbangan,
aluminium foil, pot, formalin 10% untuk fiksasi jaringan dan lemari es.
Universitas Sumatera Utara
34
Bahan untuk pembuatan blok parafin, proses deparafinisasi, HE dan
imunohistokimia meliputi Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA),
formalin 10%, H2O2 3%, xylol, alkohol (30%, 50%, 70%, 80% dan 96%),
dH2O, larutan HE, entelan, paraffin lunak dan keras, Fetal Bovine Serum
(FBS), Phosphate Buffer Saline (PBS), antibodi primer yaitu polyclonal
Anti-COL4A2 dan biotinylated secondary Ab (anti rabbit), Horse Radish
Peroxidase (HRP) streptavidin, pewarna Meyer-Hematoxilen, substrat
Diamino Benzidine (DAB) dan entelan.
3.7 Prosedur Penelitian
3.7.1 Tahap persiapan
Untuk menjamin bahwa semua prosedur yang dilakukan pada
penelitian ini laik etik, maka sebelum dilakukan penelitian proposal
diajukan terlebih dahulu pada Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas
Sumatera Utara untuk mendapatkan penilaian dan pengesahan kelaikan
etik.
3.7.2 Prosedur induksi diabetes menggunakan STZ
Membuat tikus model DM :
1. Hewan coba dipuasakan terlebih dahulu selama 4 jam untuk
mengosongkan lambung dan mengurangi risiko aspirasi.
2. Hitung kebutuhan induksi dosis STZ 60 mg/kgbb/ekor.
3. Hitung kebutuhan dapar sitrat yang dibutuhkan dengan konsentrasi
STZ 22,5 mg/ml dalam dapar sitrat.
4. Siapkan tabung dan bungkus dengan aluminium foil pada bagian
luarnya.
5. 15-20 menit sebelum diinduksi, timbang STZ yang dibutuhkan
kemudian larutkan ke dalam dapar sitrat yang telah ditentukan.
6. Masukkan larutan STZ yang diperoleh ke dalam tabung berbungkus
aluminium foil.
Universitas Sumatera Utara
35
7. 30 detik sampai 1 menit sebelum induksi segera pindahkan larutan
STZ ke dalam spuit 1 ml.
8. Injeksikan larutan STZ melalui intraperitoneal tikus sesuai dengan
kebutuhan dosis per ekor. Induksi dilakukan hanya satu kali.
9. Berikan larutan sukrosa 10% atau dekstrosa 10% sepanjang malam
pertama setelah induksi untuk menghindari sudden hypoglycemic post
injection.
10. Tikus diperiksa KGD puasa setiap pagi (puasa tikus dengan cara tidak
diberi pakan dan kandang dikosongkan dari sekam selama 6 jam).
Hiperglikemia yang bermakna akan dijumpai 2 hari setelah induksi.
11. Pada kelompok 2 dilakukan terminasi 3 hari setelah hiperglikemia.
Pada kelompok 3 dan 4, setelah hiperglikemia diberikan curcuminoid
selama 3 hari sebelum terminasi. Pada kelompok 5 dan 6, setelah
hiperglikemia diberikan curcuminoid selama 8 hari sebelum terminasi.
3.7.3 Prosedur pemberian curcuminoid
Curcuminoid (kadar curcuminoid 80%) dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari
perekor tikus disuspensikan dalam CMC 0,5% (CMC dibuat dengan
mensuspensikan 0,5 gram CMC dalam 100 cc larutan akuades). Setelah
disuspensikan, diberikan ke tikus dengan menggunakan Naso Gastric
Tube (NGT).
3.7.4 Perlakuan pada tikus
Setelah tikus putih beradaptasi terhadap lingkungan kandang di
laboratorium selama 2 minggu, selanjutnya perlakuan diberikan sesuai
dengan kelompok yang direncanakan.
3.7.5 Prosedur pengambilan jaringan koklea tikus
Tikus dikorbankan dengan inhalasi eter kemudian dilakukan terminasi.
Selanjutnya dilakukan nekropsi jaringan tulang temporal. Sampel jaringan
diambil, difiksasi dengan
larutan buffer formalin 10% dan dilakukan
dekalsifikasi dengan EDTA selama 4 minggu.
Universitas Sumatera Utara
36
3.7.6 Pemeriksaan laboratorium
1. Fiksasi jaringan dengan pembuatan paraffin block jaringan.
Jaringan tulang didekalsifikasi dengan menggunakan EDTA selama 4
minggu. Jaringan selanjutnya dicuci dengan PBS 3-5 kali untuk
membersihkannya dari kontaminan. Kemudian jaringan difiksasi pada
larutan formalin 10%. Setelah itu dilakukan dehidrasi dengan alkohol
bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolut) masing-masing
selama 60 menit. Dilakukan clearing menggunakan xylol sebanyak 2
kali masing-masing 60 menit. Kemudian dilakukan impregnasi dengan
parafin lunak selama 60 menit pada suhu 480C. Selanjutnya dilakukan
blocking preparat dalam parafin keras pada cetakan dan didiamkan
selama sehari.
2. Proses deparafinisasi.
Dilakukan pemotongan blok parafin setebal 4 µm dengan rotary
microtome. Jaringan yang sudah dipotong dimasukkan dalam air
hangat lalu kemudian diletakkan pada kaca obyek. Kaca obyek
selanjutnya diletakkan di atas hot plate dengan suhu 50-60oC hingga
mengering.
3. Proses pewarnaan HE
Dimasukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak 2 kali masing-masing
selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan alkohol berseri
(absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masing-masing selama 5
menit, kemudian bilas dalam dH2O selama 5 menit. Warnai sediaan
dengan Hemotoxilin selama 10 menit, setelah itu direndam dalam tap
water selama 10 menit lalu dibilas dengan dH2O. Sediaan selanjutnya
diwarnai kembali dengan larutan Eosin selama 3 menit lalu didehidrasi
dengan alkohol berseri 30% dan 50% masing-masing selama 5 menit,
cuci dengan distilled water (dH2O) selama 5 menit dan dikeringanginkan. Inkubasi kembali dengan xylol sebanyak 2 kali masingmasing selama 2 menit kemudian dilakukan mounting dengan entelan
dan tutup dengan cover glass.
Universitas Sumatera Utara
37
4. Proses pewarnaan kolagen tipe IV (imunohistokimia).
Masukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak dua kali masing-masing
selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan alkohol berseri
(absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masing-masing selama 5
menit, kemudian dibilas dalam dH2O selama 5 menit. Masukkan
kembali ke dalam H2O2 3% selama 20 menit, lalu cuci menggunakan
PBS pH 7,4 tiga kali, selama 5 menit. Bloking protein non-spesifik
dilakukan dengan menggunakan 5% FBS yang mengandung 0,25%
Triton X-100 lalu cuci kembali dengan PBS pH 7,4 tiga kali, selama 5
menit. Inkubasi dengan menggunakan antibodi primer yaitu polyclonal
Anti-COL4A2 selama 60 menit, cuci menggunakan PBS pH 7,4 tiga
kali selama 5 menit. Selanjutnya sediaan direaksikan dengan antibodi
sekunder (Biotinylated secondary Ab) selama 60 menit, cuci
menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali selama 5 menit. Inkubasi dengan
HRP steptavidin selama 60 menit, cuci menggunakan PBS pH 7,4 tiga
kali, selama 5 menit. Tetesi dengan DAB dan inkubasi selama 30
menit, cuci menggunakan dH2O, selama 5 menit. Masukkan ke dalam
Mayer Hematoxilin inkubasi selama 10 menit dan cuci menggunakan
tap water. Bilas menggunakan dH2O dan kering-anginkan. Kemudian
mounting menggunakan entelan dan tutup dengan cover glass.
3.7.5 Penghitungan sel
Menggunakan mikroskop Nikon Eclips 100 dengan pembesaran 40x.
Penghitungan jumlah fibroblas terekspresi dilakukan oleh 3 orang
pemeriksa.
1. Semua slide yang sudah berkode ditutup nomor kodenya dan diberi
nomor baru secara acak sehingga pemeriksa dan peneliti yang ikut
memeriksa tidak mengetahui slide yang diperiksa milik sampel yang
mana (double blind).
2. Pengamat terdiri dari 3 orang, masing-masing yaitu peneliti dan 2
orang pemeriksa.
Universitas Sumatera Utara
38
3. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan secara terpisah diantara
ke-3 pemeriksa, disesuaikan dengan kemampuan / kesediaan waktu
pemeriksa.
4. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan terhadap masingmasing slide pada dinding lateral koklea yaitu daerah yang ditandai
dengan adanya fibroblas dengan pembesaran 40x.
5. Hasil penghitungan sel untuk setiap lapangan pandang sesuai dengan
slide yang diperiksa ditulis di lembar kerja.
6. Analisis statistik dilakukan bila semua hasil sudah dikembalikan ke
nomor kode.
Universitas Sumatera Utara
39
3.8 Alur Penelitian
Populasi Hewan
Randomisasi
Kelompok
Kontrol
Kelompok
Perlakuan
Kelompok 1
Kelompok
2
Kelompok
3
Kelompok
4
Kelompok
5
Kelompok
6
Inj. STZ 60
single dose
Inj. STZ 60
single dose
Inj. STZ 60
single dose
Inj. STZ 60
single dose
Inj. STZ 60
single dose
C200
3 hari
C400
3 hari
C200
8 hari
C400
8 hari
Terminasi hari ke-5
Terminasi hari ke-10
Pemeriksaan imunohistokimia
fibroblas dinding lateral koklea
untuk melihat ekspresi
kolagen tipe IV
Gambar 3.1 Alur Penelitian.
3.9 Analisis Statistik
Data penelitian yang diperoleh akan diolah dan dianalisis dengan
menggunakan IBM SPSS Statistics. Sebelum dilakukan analisis, terlebih
dahulu dilakukan uji normalitas dengan uji Shapiro-Wilk. Analisis univariat
Universitas Sumatera Utara
40
dilakukan untuk memperoleh nilai rata-rata hitung (Mean) dan standar
deviasi (SD) untuk tiap kelompok penelitian sehingga dapat diketahui
deskripsi masing-masing variabel dalam penelitian. Analisis bivariat
dilakukan untuk menguji hubungan antara variabel independen terhadap
variabel dependen, menganalisis kesetaraan antara masing-masing
kelompok dan mengetahui perbedaan (penurunan atau peningkatan) yang
terjadi pada masing-masing kelompok setelah diadakan intervensi. Untuk
menganalisis perbedaan atau peningkatan pada masing-masing kelompok
penelitian ini digunakan uji t independen atau uji Mann-Whitney.
Perlakuan diuji pada taraf nyata 5%.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL PENELITIAN
4.1 Fibroblas Dinding Lateral Koklea
Gambar pemeriksaan dengan pengecatan HE digunakan untuk melihat
potongan dinding lateral koklea dan sebagai pembanding atas pengecatan
dengan imunohistokimia (Gambar 4.1).
Gambar
4.1
Penampang
Dinding
Lateral
Koklea
Tikus
dengan
Pengecatan HE (Pembesaran 4x).
4.2 Imunohistokimia Kolagen Tipe IV Setiap Kelompok
Setelah
dievaluasi
dengan
metode
imunohistokimia,
dijumpai
penurunan ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok yang hanya diberikan
injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose (kelompok 2) [Gambar 4.2 (B)]
dibandingkan dengan kelompok lain. Selanjutnya, kelompok DM yang
diberi curcuminoid (kelompok 3, 4, 5 dan 6) menunjukkan ekspresi
kolagen tipe IV lebih banyak dengan densitas warna coklat lebih kuat yang
terekspresi pada fibroblas dibandingkan kelompok DM tanpa pemberian
curcuminoid (kelompok 2) [Gambar 4.2 (C), (D) , (E) dan (F)].
41
Universitas Sumatera Utara
42
A
B
C
D
E
F
Gambar 4.2 Ekspresi Kolagen Tipe IV di Setiap Kelompok (Pembesaran
40x):
(A) Kelompok 1; (B) Kelompok 2; (C) Kelompok 3; (D)
Kelompok 4; (E) Kelompok 5 dan (F) Kelompok 6. Panah
merah menunjukkan ekspresi kolagen tipe IV pada fibroblas
dinding lateral koklea yang ditandai dengan warna coklat.
Universitas Sumatera Utara
43
4.3 Profil Ekspresi Kolagen Tipe IV
Pada penelitian ini jumlah sampel diambil empat ekor tikus pada setiap
kelompok (n=4) dengan karakteristik sampel yang digunakan memenuhi
kriteria inklusi dan eksklusi.
Hasil penelitian yang didapat berdasarkan pemeriksaan histopatologis
dengan metode HE dan imunohistokimia didapatkan gambaran ekspresi
kolagen tipe IV yang merupakan komponen utama dari MES. Selanjutnya
dilakukan analisis statistik untuk mengetahui perbedaan ekspresi tiap
kelompok dimana kelompok 1 merupakan kelompok kontrol, diberikan
injeksi buffer natrium sitrat (1x) dilanjutkan pemberian CMC (setiap hari);
kelompok 2 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian
diterminasi hari ke-5; kelompok 3 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor
single dose, kemudian diberikan curcuminoid 200 mg/kgbb/hari/ekor
dimulai hari ke-3 selama 3 hari, kemudian diterminasi hari ke-5; kelompok
4 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan
curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari,
kemudian diterminasi hari ke-5; kelompok 5 diberikan injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
200
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari, kemudian diterminasi
hari ke-10; kelompok 6 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose,
kemudian diberikan curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3
selama 8 hari, kemudian diterminasi hari ke-10.
4.3.1 Diagram rerata kolagen tipe IV
Ekspresi kolagen tipe IV ditemukan menurun pada kelompok yang
hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose
(kelompok 2) dan terjadi peningkatan ekspresi kolagen tipe IV pada
kelompok DM yang diberi curcuminoid setelah diinjeksi STZ (kelompok 3,
4, 5 dan 6) (Gambar 4.3).
Universitas Sumatera Utara
44
Gambar 4.3 Diagram Rerata Ekspresi Kolagen Tipe IV pada MasingMasing Kelompok.
4.3.2 Analisis univariat
Analisis univariat dilakukan untuk memperoleh nilai mean dan SD
untuk tiap kelompok penelitian sehingga dapat diketahui deskripsi masingmasing variabel dalam penelitian (Tabel 4.1).
Tabel 4.1 Nilai Mean dan SD pada Setiap Kelompok.
Kelompok
Kolagen Tipe
IV
Mean
SD
Nilai Minimal
Nilai Maksimal
1
4.00
0.00
4
4
2
1.25
0.50
1
2
3
2.25
1.25
1
4
4
6.25
3.77
1
9
5
5.75
2.36
4
9
6
8.25
1.50
6
9
Universitas Sumatera Utara
45
Dari analisis univariat tabel 4.1 di atas, dapat disimpulkan:
1. Ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok yang hanya mendapat
perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose (kelompok 2)
menunjukkan hasil lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol
(kelompok
1)
dan
kelompok
ini
memiliki
ekspresi
terendah
dibandingkan kelompok lain.
2. Dijumpai peningkatan ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok DM
yang diberi curcuminoid (kelompok 3, 4, 5 dan 6) dibandingkan
kelompok
yang
hanya
mendapat
perlakuan
injeksi
STZ
60
mg/kgbb/ekor single dose (kelompok 2).
3. Ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok mendapat perlakuan injeksi
STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid
400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari (kelompok 4)
menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi dibandingkan kelompok yang
mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose,
kemudian diberikan curcuminoid 200 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari
ke-3 selama 3 hari (kelompok 3) dan ekspresi kolagen tipe IV pada
kelompok mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single
dose, kemudian diberikan curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai
hari ke-3 selama 8 hari (kelompok 6) menunjukkan ekspresi yang lebih
tinggi dibandingkan kelompok yang mendapat perlakuan injeksi STZ
60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid 200
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari (kelompok 5).
4. Ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok mendapat perlakuan injeksi
STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid
400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari (kelompok 6)
merupakan ekspresi tertinggi dibandingkan kelompok lain.
Universitas Sumatera Utara
46
4.3.3 Analisis bivariat
Analisis bivariat dilakukan untuk menguji hubungan antara variabel
independen terhadap variabel dependen, menganalisis kesetaraan antara
masing-masing kelompok dan mengetahui perbedaan (penurunan atau
peningkatan) yang terjadi pada masing-masing kelompok setelah
dilakukan intervensi.
Tabel 4.2 Analisis Bivariat Kelompok 1 dan Kelompok 2.
Kelompok
Kolagen Tipe IV
Mean
SD
1
4.00
0.00
2
1.25
0.50
p. value
0.011
Dari analisis tabel 4.2 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat
perbedaan rerata yang bermakna secara statistik (p. value 0.05).
Universitas Sumatera Utara
47
Tabel 4.4 Analisis Bivariat Kelompok 2 dan Kelompok 4.
Kelompok
Kolagen Tipe IV
Mean
SD
2
1.25
0.50
4
6.25
3.77
p. value
0.089
Dari analisis tabel 4.4 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat
perbedaan rerata (peningkatan ekspresi kolagen tipe IV) antara kelompok
yang hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose
(kelompok 2) dengan kelompok yang mendapat perlakuan injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single
dose,
kemudian
diberikan
curcuminoid
400
mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari (kelompok 4) namun
tidak bermakna secara statistik (p. value >0.05).
Tabel 4.5 Analisis Bivariat Kelompok 2 dan Kelompok 5.
Kelompok
Kolagen Tipe IV
Mean
SD
2
1.25
0.50
5
5.75
2.36
p. value
0.010
Dari analisis tabel 4.5 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat
perbedaan rerata yang bermakna secara statistik (p. value