LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA KINETIKA REAK
LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
PERCOBAAN KE VII
KINETIKA REAKSI ENZIM
Disusun Oleh:
Nama dan NPM
Shift
Kelompok
Nama Asisten
Tgl. Praktikum
Tgl. pengumpulan Laporan
:
:
:
:
:
:
:
:
:
Ambar Puspita Madyaningratri
Irma Astri Pebriliani
Tri Marleni
Ramli Maulana Latief
C
1
Ilham Kholikul, S.Farm.
Selasa, 17 Maret 2015
Selasa, 24 Maret 2015
10060313055
10060313056
10060313057
10060313058
LABORATORIUM FARMASI TERPADU UNIT B
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
2015
I.
Tujuan
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat mengetahui
dan memahami kinetika reaksi enzim dan faktor-faktor yang mempengaruhi
kondisi optimum suatu enzim.
II.
Teori Dasar
Enzim dan Kinetika Reaksi Enzim
Enzim atau biokatalisator adalah katalisator organik yang dihasilkan
oleh sel. Enzim sangat penting dalam kehidupan, karena semua reaksi
metabolisme dikatalis oleh enzim. Jika tidak ada enzim, atau aktivitas enzim
terganggu maka reaksi metabolisme sel akan terhambat hingga pertumbuhan
sel juga terganggu. Reaksi-reaksi enzimatik dibutuhkan agar bakteri dapat
memperoleh makanan/ nutrient dalam keadaan terlarut yang dapat diserap ke
dalam sel, memperoleh energi kimia yang digunakan untuk biosintesis,
perkembangbiakan, pergerakan, dan lain-lain. (Poedjiadi, 2006)
Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah
(Dwidjoseputro, 1992) suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, aktivator
dan inhibitor. Setiap enzim dapat bekerja dengan efektif pada suhu tertentu dan
aktifitasnya akan berkurang jika berada pada kondisi di bawah atau di atas titik
tersebut. Kondisi yang menyebabkan kerja enzim menjadi efektif ini disebut kondisi
optimal. Sebagian besar enzim pada manusia mempunyai suhu optimal yang
mendekati suhub tubuh (35oC– 40oC). Pada suhu tinggi (> 50oC), enzim dapat rusak
dan pada suhu rendah (0oC), enzim menjadi tidak aktif. Suhu yang tidak sesuai
tersebut akan menyebabkan terjadinya perubahan bentuk sisi aktif enzim. Sifat enzim
yang tidak tahan panas atau dapat berubah karena pengaruh suhu ini disebut
termolabil. (Dwidjoseputro, 1992)
Gambar 1. Pengaruh suhu terhadap fungsi enzim
Selain suhu, faktor lingkungan yang mempengaruhi kerja enzim adalah
derajat keasaman (pH). Sebagaimana faktor suhu, enzim juga mempunyai pH tertentu
agar dapat bekerja secara efektif. Enzim dapat bekerja optimal pada pH netral (pH =
7), pH basa, atau pH asam tergantung pada jenis enzim masing-masing. Enzim
pencerna protein misalnya, mempunyai pH paling optimal 1-2, sedangkan enzim
pencernaan yang lain mempunyai pH optimal 8. Pada pH tertentu, enzim dapat
mengubah substrat menjadi hasil akhir. Kemudian, apabila pH tersebut diubah, enzim
dapat mengubah kembali hasil akhir menjadi substrat. (Dwidjoseputro, 1992)
Gambar 2. Pengaruh pH terhadap fungsi enzim
Kadar enzim yang tinggi akan mempengaruhi kecepatan reaksi secara linier
(kecepatan bertambah konstan). Dapat dikatakan bahwa hubungan antara konsentrasi
enzim dengan kecepatan reaksi enzimatis berbanding lurus. kecepatan reaksi suatu
enzim satu dengan yang lain berbeda-beda meskipun mempunyai konsentrasi enzim
yang sama. Konsentrasi enzim yang sangat tinggi dalam suatu sistem yang kompleks
akan berpengaruh terhadap terhadap kecepatan reaksi. (Dwidjoseputro, 1992)
Gambar 3. Pengaruh konsentrasi enzim terhadap fungsi enzim
Pada konsentrasi substrat yang rendah, kenaikan substrat akan meningkatkan
kecepatan reaksi enzimatis hampir secara linier. Jika konsentrasi substrat tinggi, maka
peningkatan kecepatan reaksi enzimatis akan semakin menurun sejalan dengan
peningkatan jumlah substratnya. kecepatan maksimum (v maks) reaksi enzimatis
ditunjukan dengan garis mendatar yang menggambarkan peningkatan kecepatan yang
rendah seiring penambahan konsentrasi substrat. (Dwidjoseputro, 1992)
Gambar 4. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap fungsi enzim
Zat-zat kimia tertentu dapat memacu atau mengaktifkan kegiatan enzim.
Contoh : garam-garam dari logam alkali dan logam alkali tanah dengan konsentrasi
encer, ion kobalt (Co), mangan (Mn), nikel (Ni), magnesium (Mg), dan klor
(Cl).Sedangkaninhibisi aktifitas enzim adalah penurunan kecepatan suatu reaksi
enzimatik yang dalam makhluk hidup penting pada proses metabolisme. Pada
keadaan tertentu suatu reaksi enzimatik dapat membentuk dua atu lebih produk dan
hambatan tersebut dapat ditunjukan hanya pada suatu produk, sedangkan
pembentukan produk yang lain tidak dipengarihi atau malah di tingkatkan. Inhibitor
adalah zat yang dapat menghambat kerja enzim. Berdasarkan tempat kerjanya,
inhibitor terbagi atas, reaksi inhibitor dengan apoenzim, reaksi inhibitor dengan
substrat, reaksi inhibitor dengan substrat, reaksi inhibitor dengan koenzim, reaksi
inhibitor dengan kofaktor, reaksi inhibitor dengan bentuk kompleks enzim.
Mekanisme
Enzim dapat bekerja dengan beberapa cara, yang kesemuaannya menurunkan ΔG‡:
Menurunkan energi aktivasi dengan menciptakan suatu lingkungan yang mana
keadaan transisi terstabilisasi (contohnya mengubah bentuk substrat menjadi
konformasi keadaan transisi ketika ia terikat dengan enzim.)
Menurunkan energi keadaan transisi tanpa mengubah bentuk substrat dengan
menciptakan lingkungan yang memiliki distribusi muatan yang berlawanan
dengan keadaan transisi.
Menyediakan lintasan reaksi alternatif. Contohnya bereaksi dengan substrat
sementara waktu untuk membentuk kompleks Enzim-Substrat antara.
Menurunkan perubahan entropi reaksi dengan menggiring substrat bersama
pada orientasi yang tepat untuk bereaksi. Menariknya, efek entropi ini
melibatkan destabilisasi keadaan dasar, dan kontribusinya terhadap katalis
relatif kecil. (Anonim1, 2015)
Tanpa bantuan enzim, semua bahan makanan yang masuk ke dalam tubuh hanya
sekedar numpang lewat. Enzim merupakan komponen penting yang diperlukan untuk
proses pencernaan dan penyerapan makanan. Kini pemahaman masyarakat mengenai
enzim pencernaan dan fungsinya masih sangat rendah. Umumnya masyarakat hanya
mengaitkan masalah pencernaan dengan penyakit maag. Enzim bertanggung jawab
menjaga kesehatan dan proses metabolisme di dalam tubuh. Kekurangan enzim dapat
menyebabkan
tubuh
mengalami
gangguan
pencernaan
yang
selanjutnya
menyebabkan gangguan penyerapan (malabsorpsi). Gejala malabsorpsi adalah
kembung pada perut, nafsu makan menurun, diare dan perut tidak nyaman. Salah satu
solusi untuk mengatasi masalah malabsosrpsi akibat kekurangan enzim adalah dengan
mengkonsumsi suplemen enzim. Kekurangan enzim akan menyebabkan tubuh
mengalami gangguan pencernaan atau dalam istilah kedokteran disebut maldigesti,
yang selanjutnya dapat menyebabkan gangguan pencernaan atau malabsorbsi. Di sisi
lain, kekurangan enzim juga akan mengakibatkan timbulnya gas yang berlebih di
dalam sistem pencernaan, baik di lambung maupun usus halus dan usus besar
(Almatsier, 2003).
Kinetika reaksi enzimatis dapat digunakan untuk menentukan kadar enzim.
Kinetika reaksi enzimatik dapat diukur dengan mengukur jumlah substrat yang
diubah atau produk yang dihasilkan per satuan waktu, dan pada suatu waktu yang
sangat pendek, atau pada satu titik tertentu pada grafik disebut kecepatan sesaat
(instantaneus velocity). Kecepatan sesaat merupakan tangens dari garis singgung
terhadap grafik pada suatu titik tertentu. Kecepatan sesaat pada waktu mendekati nol,
yaitu saat grafik masih berupa garis lurus disebut kecepatan awal (Vo). Pada reaksi
enzimatis, jika disebut kecepatan, umumnya yang dimaksud adalah kecepatan awal.
Hal ini disebabkan karena pada keadaan awal reaksi, kita dapat mengetahui kondisi/
keadaan dengan lebih tepat. Disamping kecepatan sesaat dan Vo, juga dikenal istilah
kecepatan rata-rata, yaitu perbandingan antara perubahan jumlah substrat terhadap
waktu (Poedjiadi, 1994).
Reaksi enzimatik berlangsung melalui pembentukan kompleks enzim substrat
(ES), bila semua enzim dalam keadaan ES (sistem jenuh oleh substrat) maka laju
reaksi akan mencapai nilai maksimum (Vmaks). Kinetika enzim menginvestigasi
bagaimana enzim mengikat substrat dengan mengubahnya menjadi produk. Data laju
yang digunakan dalam analisa kinetika didapatkan dari asai enzim. Aktivitas enzim
akan meningkat bersamaan dengan peningkatan suhu, laju berbagai proses
metabolisme akan naik sampai batasan suhu maksimal. Prinsip biologis utama adalah
homeostatis, yaitu keadaan dalam tubuh yang selalu mempertahankan keadaan
normalnya. Perubahan relatif kecil saja dapat mempengaruhi aktivitas banyak enzim.
Adanya inhibitor non kompetitif irreversibel dan antiseptik dapat menurunkan
aktivitas enzim. Kecepatan reaksi mula-mula meningkat dengan menaiknya suhu, hal
ini disebabkan oleh peningkatan energi kinetik pada molekul-molekul yang bereaksi.
Akan tetapi pada akhirnya energi kinetik enzim melampaui rintangan energi untuk
memutuskan ikatan hidrogen dan hidrofobik yang lemah, yang mempertahankan
struktur sekunder-tersiernya. Pada suhu ini terjadi denaturasi enzim menunjukkan
suhu optimal. Sebagian besar enzim suhu optimalnya berada diatas suhu dimana
enzim itu berada. Ada dua metode analisis kuantitatif kinetika reaksi enzim, yaitu
asas keseimbangan Michaelis-Menten dan asas teori keadaan tunak (steady state
theory) Briggs-Haldone. Persamaan Michaelis-Menten merupakan persamaan
kecepatan reaksi enzimatik substrat tunggal yang menyatakan hubungan kuantitatif
kecepatan reaksi awal (Vo), kecepatan reaksi maksimum (Vmaks), konsentrasi
substrat [S], dan konstanta Michaelis-Menten [KM] (Murray, 2003).
Pada praktikum ini yang digunakan adalah enzim tripsi. Berikut penguraian enzim
tipsin:
Tripsinogen merupakan enzim inaktif yang harus diaktifkan terlebih dahulu
oleh enzim enterokinase yang dihasilkan oleh usus halus. Tripsinogen berubah
menjadi tripsin yang aktif. Tripsin mengubah protein menjadi peptida dan asam
amino. (Almatsier, 2003).
Tripsin adalah protease serina pankreas dengan substrat khusus rantai lysine
dan arginin. Di manusia, enzim ini memproduksi enzim inaktif dari tripsinogen.
Tripsinogen masuk usus kecil, biasanya melalui cairan empedu dimana tripsinogen
diubah menjadi tripsin aktif. (Alghamdi, 2010).
Fungsi enzim tripsin adalah mengubah protein menjadi bentuk yang lebih
sederhana, seperti pepton dan asam amino. Enzim tripsin dihasilkan oleh kelenjar
pankreas dan dialirkan ke usus 12 jari (duodenum).Selain itu fungsi enzim tripsin
adalah untuk mengubah tripsinogen menjadi tripsin aktif dan menghidrolisis protein
yang dihasilkan oleh pancreas. (Poedjiadi, 2006).
Manfaat enzim tripsin adalah untuk membuat vaksin meningitis dari pankreas
babi dan yang berperan adalah enzim tripsin di dalam pankreas babi.
(Sectiocadavaris, 2011)
Pada praktikum ini substrat yang digunakan adalah kasein. Berikut penguraian
kasein:
Kasein merupakan golongan protein yang komposisinya mencapai 80% dari
komposisi keseluruhan protein susu. Protein kasein terbagi menjadi beberapa
komponen, komponen yang umum dijumpai adalah αs1-kasein, αs2-kasein, β-kasein,
dan κ-kasein. (Anonim, 2014)
Protein kasein memiliki daerah hidrofobik dan hidrofilik yang bervariasi.
Kasein relatif tidak sensitif terhadap panas, dibutuhkan temperatur diatas 120°C
untuk merusak struktur kasein hingga menjadi tidak larut dalam air. Di sisi lain,
kasein cukup sensitif terhadap pH, maka itu protein kasein akan mengendap pada titik
isoelektriknya. Protein kasein mempunyai masa molekul sebesar 106 hingga 109
Dalton. Kasein mampu menyebarkan cahaya. Oleh karena keberadaan kasein di
dalam susu, susu berwarna putih. (Anonim, 2014)
Protein kasein bersama dengan kalsium fosfat, dapat membentuk semacam
partikel koloid yang terdispersi, yang disebut misel (micelles). Karena protein kasein
berupa suspensi, protein tersebut dapat dipisahkan dari campuran menggunakan
sentrifugasi. Setelah sentrifugasi, beberapa protein tertingal di dalam larutan. Protein
yang larut di dalam supernatan tersebut disebut protein whey. (Anonim, 2014)
Kasein mengandung asam beragam asam amino yang diperlukan mamalia
muda untuk tumbuh. Karena memiliki protein berkualitas tinggi seperti kasein, susu
sapi dianggap sebagai salah satu makanan manusia yang paling penting. Lebih jauh
lagi, protein kasein terdesain untuk berikatan dengan kalsium fosfat, yang secara
langsung mengendap pada lambung bayi baru lahir. Hal ini membuat protein tersebut
mudah dicerna. Karena protein kasein dinilai mempunyai signifikansi yang besar
terhadap kehidupan manusia, struktur kasein telah dipelajari secara menyeluruh, akan
tetapi struktur pasti kasein masih diperdebatkan. (Anonim, 2014)
Analisa kuantitatif pada praktikum ini menggunakan instrument spektrofotometer uvvisible,
di
mana
penjabaran
tentang
sprektrofotometri
dan
instrument
spektrofotometer sebagai berikut:
Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya
oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu (Day, 2002). Sinar
ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar
tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran
spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan energi
elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer
UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif.
Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi
dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang
gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. (Rohman, 2007)
Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan
konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam hukum
Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu :
– Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
– Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang sama
– Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain
dalam larutan tersebut
– Tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi
– Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan
Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam rumus sbb :
A = e.b.c
dimana :
A = absorban
e = absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
(Rohman, 2007)
INSTRUMEN SPEKTROFOTOMETRI UV – VIS
PRINSIP KERJA
Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat
polikromatis
di
teruskan
melalui
lensa
menuju
ke
monokromator
pada
spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan
mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkasberkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang
mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya
yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini
kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya yang
diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap
sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan
diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif. (Rohman, 2007)
HAL – HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN
1. Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna
Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna,
maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang
berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan lampu UV.
2. Panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang
mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn
gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang
gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi
adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang gelombang maksimal,
akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer
dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat
kesalahannya akan kecil sekali.
3. Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban
Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang
dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum
elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya
pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang terbentuk.
Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban
pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.
(Rohman, 2007)
III.
Alat Dan Bahan
Alat
Tabung reaksi
Batang pengaduk
Pipet ukur 1 mL, 5 mL, 10 mL
Pipet tetes
Water bath 35oC
Kertas saring
Spektofotometer
Corong kaca
IV.
Bahan
Larutan TCA 20%
Larutan kasein 2% (b/v)
Larutan dapar fosfat 0,1M pH 8
Larutan NaOH
Aquadest
Reagen Folin-Ciocalteu
Larutan Tripsin
Prosedur Kerja
1. Tabung t = 0 menit
Disiapkan 5 tabung reaksi. Dimasukan larutan buffer fosfat dan tripsin dan
tambahkan masing-masing 3 mL larutan TCA 20%, aduk perlahan, dan
diinkubasi selama 30menit dalam water bath 35oC. Setelah 30 menit di
tambahakan larutan kasein dan didiamkan selama 20 menit dalam air es.
Seletah itu disentrifugasi 10 menit dan disaring melalui kertas saring
untuk diambil supernatannya. Lalu dilakukan metode anson pada hasil
filtrate tersebut.
Metode Anson: diambil 2 mL TCA-Filtrat ditambahkan 4 mL NaOH 0,5
M dan 1 mL larutan Folin-Cioalteu. Didiamkan 10 menit kemudian
ditentukan serapannya pada 650 nm.
2. Tabung t = 20 menit
Diinkubasi 5 menit pada water bath
35
ͦ C masing-masing tabung
berpengaduk yang berisi kasein sesuai tabel sambil diaduk. Kemudian
ditambahkan berturut-turut larutan buffer posfat dan larutan tripsin.
Diinkubasikan selama 20 menit pada inkubator 35 ͦ C dihitung setelah
penambahan tripsin. Dihentikan reaksi dengan penambahan 3 mL TCA 20
% kedalam masing-masing tabung dan diaduk sangat kuat. Lalu
Didiamkan selama 20 menit dalam air es untuk menyempurnakan
pengendapan. Dan disentrifugasi selama 10 menit kemudian disaring
untuk diambil supernatannya. Filtrat dilakukan metode anson, yaitu
dicampurkan 2mL TCA-Filtrat dengan 4mL NaOH 0.5 M kemudian
ditambahkan 1 mL larutan Folin-Ciocalteu ( 1 volume reagen ditambah 1
volume aquadest). Kemudian diamkan 10 menit dan ditetapkan
serapannya 650 nm.
No.
I
II
III
IV
V
Tabung
Tripsin
Kasein
Buffer
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
(mL)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
(mL)
0,1
0,1
0,5
0,5
1,0
1,0
3,0
3,0
5,0
5,0
(mL)
5,9
5,9
5,5
5,5
5,0
5,0
3,0
3,0
1,0
1,0
Fosfat
V. Data Pengamatan dan Perhitungan
Tabung t = 0 menit
Setelah semua tabung diisi larutan buffer dan ditambahkan tripsin dan
ditambah TCA 20% larutan berwarna bening tidak ada endapan. Kemudian
diinkubasi semua tabung tetap berwarna bening.
Tabung
Setelah ditambahkan Kasein dan didinginkan
I
II
III
Larutan bening, sedikit putih keruh diatas
Larutan bening, sedikit putih keruh diatas
Larutan bening, larutan berwarna putih keruh di bagian
IV
V
atas
¾ bagian putih keruh
Larutan putih keruh, ada endapan putih
Tabung t = 20 menit
Setelah semua tabung diisi dengan kasein yang berwarna putih keruh.
Tabung
I
II
III
IV
V
Setelah didinginkan dan ditambahkan TCA20%
Bening
Agak putih
Keruh, terdapat gumpalan putih tersebar
Terbentuk endapan keruh
Terbentuk endapan
Pengolahan data absorbansi
No
I
II
III
IV
V
Tabung
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
Perhitungan
1. Menghitung ΔA
ΔA = At20 – At0
ΔA1 = 0.014 – 0.008 = 0.006
ΔA2 = 0.024 – 0.005 = 0.019
ΔA3 = 0.110 – 0.007 = 0.109
ΔA4 = 0.100 – 0.002 = 0.098
ΔA5 = 0.240 – 0.009 = 0.231
Nilai Absorbansi
0.008
0.014
0.005
0.024
0.007
0.110
0.002
0.100
0.009
0.240
2. Menghitung V
V = ΔA/Δt
Δt = t20 – t0
Δt = 20 – 0 = 20 menit
V1 =
V2 =
V3 =
V4 =
V5 =
3.
0.006
=0.3 x 10−3
20
0.019
−3
=0.95 x 10
20
0.109
=5.15 x 10−3
20
0.098
=4.9 x 10−3
20
0.231
−3
=11.5 x 10
20
Menghitung S
S=
Aliquot
x 2%
Vtotal
Vtotal = V setiap tabung
= 7 ml
Aliquot = jumlah kasein
S1 =
S2 =
S3 =
S4 =
S5 =
0.1
x 2 =0.29 x 10−3
7
0.5
x 2 =1.43 x 10−3
7
1.0
−3
x 2 =2.86 x 10
7
3.0
x 2 =8.57 x 10−3
7
5.0
x 2 =14.29 x 10−3
7
4. Grafik Michaelis-Menten
S (X)
−3
0.29 x 10
−3
1.43 x 10
−3
2.86 x 10
−3
8.57 x 10
−3
14.29 x 10
V (Y)
−3
0.3 x 10
−3
0. 95 x 10
−3
5.15 x 10
−3
4.9 x 10
−3
11.5 x 10
a = 6.6969 x 10−4
b = 0.7088
R = 0.9300
Persamaan Michaelis-Menten
Hubungan antara V dengan S
0.01
0.01
0.01
V
0.01
0.01
0
0
0
0
0
0
0.01
0.01
S
0.01
0.01
0.01
0.02
5. Grafik Lineweaver-Burk
1
( X)
S
1
(Y )
V
3,448.27
699.30
349.65
116.68
69.97
3,333.33
1,052.63
194.17
204.08
86.95
a = 79.8107
b = 0.9547
R = 0.990
Hubungan antara 1/S dengan 1/V
Hubungan antara 1/S dengan 1/V
Linear (Hubungan antara 1/S dengan 1/V)
3500
f(x) = 0.95x + 79.81
R² = 0.98
3000
2500
1/V
2000
1500
1000
500
0
0
500
1000
1500
2000
1/S
6.
Menghitung Vmaks dan
KM
2500
3000
3500
4000
b(gradien) =
1
Vmaks
Vmaks =
=a
KM
V maks
maka, Vmaks =
1
a
1
79.811
Vmaks = 0.0125 ppm/menit
KM
= b(gradien) x Vmaks
KM
= 0.9548 x 0.0125
KM
= 0.011935
Gambar
Gambar tabung t=0 setelah ditambahkan larutan Buffer, Tripsin, TCA20%,
dan diinkubasi.
Gambar tabung t=0 setelah ditambahkan kasein dan didinginkan.
VI.
Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan uji untuk mengetahui kinetika reaksi enzim
yang berikatan dengan substrat.
Pertama-tama pengujian dilakukan pada saat t = 0 menit.
Disiapkan tabung reaksi sebanyak 5 buah kemudian diisi oleh buffer
fosfat dalam berbagai konsentrasi. Di sini buffer fosfat berguna untuk
mempertahankan pH optimum enzim agar tidak mudah berubah akibat
penambahan sedikit asam maupun basa. Lalu dimasukkan tripsin ke dalam
masing-masing tabung. Tripsin di sini berperan sebagai enzimnya. Di mana
fungsi enzim tripsin adalah untuk mengubah tripsinogen menjadi tripsin aktif
dan menghidrolisis protein yang dihasilkan oleh pancreas, seperti teori yang
disampaikan Poedjiadi (2006). Kemudian ke dalam masing-masing tabung
ditambahkan larutan TCA 20%. Larutan TCA ini berguna sebagai zat yang
dapat menghentikan mekanise pengikatan antara enzim dan substrat, serta pH
optimum enzim tripsin adalah sekitar 7.8-8.7 (Anonim 2, 2015) . Berikutnya
semua tabung diinkubasi pada suhu 35oC, suhu ini merupakan suhu optimum
kerja enzim tripsin. Setelah diinkubasi, tabung diambil dan ke dalam masingmasing tabung dimasukkan larutan kasein dalam berbagai konsentrasi, kasein
berperan sebagai substrat, di mana kasein merupakan golongan protein yang
komposisinya mencapai 80% dari komposisi keseluruhan protein susu
(Anonim, 2014). Setelah itu semua tabung direndam di dalam air es dengan
tujuan memperjelas bentuk dari endapan jika terdapat endapan. Setelah
penambahan kasein dan didinginkan di air es tersebut, hasil yang didapat
praktikan adalah bahwa dari tabung ke 1 sampai tabung ke 5 kekeruhan pada
larutan terlihat semakin jelas. Hal ini terjadi karena perbedaan konsentrasi
buffer fosfat dan konsentrasi substrat yang berbeda pada setiap tabung. Dapat
dinyatakan bahwa selain menurunnya konsentrasi buffer fosfat pada tabung 1
sampai tabung 5, konsentrasi substrat malah semakin banyak, namun
bukannya meningkatkan kinetika reaksi enzim, tetapi malah menurunkan
kinetikita reaksinya disebabkan konsentrasi enzim yang konstan diberikan
pada setiap tabung, sehingga hanya tabung 1 saja yang dapat lebih banyak
mengubah substrat menjadi produk yang ditandai lebih banyaknya larutan
yang bening dibandingkan dengan larutan yang putih keruh. Sebaliknya, pda
tabung 5 keseluruhan larutan berwarna putih keruh dan terdapat endapan,
adanya endapan menandakan bahwa enzim terdenaturasi sehingga tidak dapat
mengubah substrat menjadi produk.
Tahap selanjutnya, kelima larutan
disentrifugasi dan disaring untuk mendapatkan supernatantnya. Hasil filtrasi
lebih lanjut dilakukan dengan cara metode Anson, yaitu memakai prinsip kerja
spektrofotometri yang menggunakan instrument uv-vis. Untuk mendapatkan
data serapan dari kelima supernatant yang ada harus ditambahkan dulu oleh
NaOH, yang berguna untuk menetralkan TCA-filtrat yang bersifat asam,
danditambahkan ragen Folin-Ciocalteu yang berguna sebagai senyawa
kromogenik sekaligus senyawa yang akan mencari gugus aromatic pada
enzim yang berada di supernatant agar dapat mengubah fosfotungstat dan
malibdan menjadi tungstat dan malibdenum yang hasilnya merupakan
senyawa berwarna biru kehijauan agar dapat diukur serapannya pada
instrument spektrofotometer yang memiliki syarat bahwa larutan harus
bersifat netral, tidak boleh asam maupun basa, dan larutan yang diukur
serapannya harus memiliki warna agar dapat terbaca.
Setelah kelima supernatant telah berwarna, segera dilakukan pencarian
nilai absorbansi yang sebelumnya harus ditunggu selama 10 menit guna
mengoptimalkan kerja reagen Folin-Ciocalteu terhadap supernatant. Pengujian
dilakukan pada panjang gelombang 650 nm (panjang gelombang sinar
tampak). Lalu di dapatlah hasil beberapa serapan seperti yang ada pada data
pengamatan.
Pengujian dilakukan pada saat t = 20 menit.
Pada pengujian ini yang dilakukan pertama kali adalah menginkubasi
kelima tabung yang sudah berisi kasein (sebagai substrat) pada suhu 35 oC,
yaitu suhu optimum bagi enzim tripsin. Tiap tabung diaduk agar homogeny
tetapi tidak boleh sampai berbusa. Kemudian pada tiap tabung ditambahkan
buffer fosfat dalam berbagai konsentrasi diikuti penambahan larutan tripsin
yang jumlahnya konstan. Setelah itu semua tabung diinkubasi pada suhu 35 oC
tepat 20 menit setelah penambahan tripsin, hal ini dilakukan dengan tujuan
enzim dapat bekerja optimal lagi pada suhu 35oC setelah sebelumnya telah
mengalami penurunan suhu yang drastis. Untuk menghentikan reaksi enzimsubstrat, ditambahkan larutan TCA 20% ke dalam masing-masing tabung dan
diaduk agar homogen, dan kelima tabung kembali direndam di dalam air es
dengan tujuan untuk menyempurnakan pengendapan. Setelah penambahan
TCA dan telah direndam di dalam air es, didapat hasil yang sama seperti pada
t = 0, di mana larutan akan semakin keruh dan menghasilkan endapan pada
tabung 4 dan tabung 5 akibat perbedaan konsentrasi substrat, konsentrasi
enzim, konsentrasi buffer dan perubahan suhu lingkungan yang drastis di awal
percobaan t = 20 menit ini. Hal ini menandakan bahwa pada tabung 4 dan 5,
enzim sudah terdenaturasi karena terdapatnya endapan pada dasar tabung.
Setelah itu kelima tabung disentrifugasi, kemudian disaring untuk
diambil supernatantnya. Filtrate yang sudah didapat selanjutnya dilakukan
dengan metode Anson. Perlakuannya sama, ditambahkan NaOH untuk
menetralkan asam dari TCA, dan ditambahkan reagen Folin-Ciocalteu untuk
member warna pada supernatant agar dapat diuji pada instrument
spektrofotometer, dan pengujian juga dilakukan pada panjang gelombang 650
nm. Kemudian data absorbansi dari maing-masing supernatant dapat diperoleh
sesuai yang dicantumkan pada data pengamatan.
Penjelasan Kurva
Kurva pertama adalah kurva Michealis-Menten, pada kurva ini terlihat
fluktuatif sehingga sulit sekali ditentukan Vmaks dari kurva tersebut.
Seharusnya kurva yang terbentuk seperti:
Sehingga jika kurva seperti yang ada di atas, maka dapat langsung dihitung
Vmaks dan dapat ditentukan nilai KM-nya. Namun kurva yang didapat tidak
sesuai yang praktikan inginkan, beberapa faktor penyebab terjadinya fluktuatif
pada kurva ini yaitu akibat enzim yang digunakan mungkin saja sudah
mendekati batas daluwarsanya, dan data absorbansi pada tabung 2 pada t = 20
menit kami dapatkan dari kelompok lain, yaitu dari kelompok 4 karena pada
saat pengerjaan tabung 2 oleh kelompok 2 mengalami kesalahan dalam data
absorbansinya, sehingga tidak memungkinkan praktikan pada kelompok ini
untuk memakai data absorbansi dari kelompok 2.
Kurva yang kedua adalah kurva Linewaver-Burk, kurva ini dibuat
dengan tujuan agar kurva yang dihasilkan memiliki kemiringan sehingga
dapat dengan tepat didapatkan hasil regresi yang digunakan untuk menghitung
nilai Vmaks dan KM.
Kesimpulan dari kedua kurva adalah bahwa kemampuan berikatan
enzim dan substrat menurun akibat beberapa faktor, baik dari konsentrasi
enzimnya, konsentrasi substratnya, senyawa tambahan yang bersifat
menghentikan mekanisme kerja ezim berikatan dengan substrat, dan suhu
serta pH optimum enzim.
Nilai Vmaks yang dihasilkan seharusnya sedikit lebih besar karena
jika konsentrasi substrat meningkat, maka hal tersebut dapat meningkatkan
kecepatan awal reaksi serta meningkatkan kemampuan enzim untuk berikatan
dengan substrat. Dan saat sudah dalam keadaan enzim yang jenuh akibat
banyaknya substrat akan dihasilkan nilai Vmaks yang konstan, nilai ini
seharusnya cukup besar jika kemampuan berikatan enzim dan substatnya
benar-benar tinggi, namun hasil yang praktikan dapatkan yaitu nilai Vmaks
hanya 0,0118 dan nilai KM = 0,01192. Yang menandakan benar bahwa
kemampuan berikatan enzim dan substrat menurun ditandai tidak besarnya
nilai Vmaks yang dihasilkan. Dan karena nilai Vmaks kecil, maka
mempengaruhi hasil dari nilai KM juga, sehingga nilai KM yang didapat juga
kecil.
VII.
Kesimpulan
1. Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu
konsentrasi enzim dan konsentrasi substrat
2. Enzim tripsin mempunyai pH optimum 7,8 – 8,7
pH, suhu,
3. Metode yang dilakukan pada percobaan kinetika kerja enzim ada tiga
metode
yaitu,
metode
Michaelis-Menten
(penentuan
kurva
1),
Lineweaver-Burk (penentuan kurva 2) dan metode Anson (pencarian nilai
serapan masing-masing supernatant).
4. Nilai absorbansi yang dihasilkan dari percobaan pada tiap tabung t=0 dan
t=20 cenderung mengalami peningkatan.
5. Grafil Michaelis-Menten memberikan kurva yang fluktuatif.
6. Grafik Lineweuver-burk yang dihasilkan yang dihasilkan dari praktikum
ini tidak linier atau tidak lurus.
7. Nilai Vmax yang didapat = 0.0125 ppm/menit
8. Nilai Km yang didapat = 0.011935
DAFTAR PUSTAKA
Almatsier, Sunita. 2003. Prinsip Dasar Ilmu Gizi.Jakarta: Gramedia PustakaUtama
Day, R. A. & A. L. Underwood.2002.Analisis Kimia Kuantitatif.Jakarta: Erlangga
Dwijoseputro.1992.Pengantar Fisiologi Tumbuhan.Jakarta: Gramedia Pustaka Utama
Murray, R. K., dkk.2003.Harper’s Illustraterd Biochemistry 26th Edition.USA:
McGraw-Hill Companies
Poedjiadi, Anna.1994.Dasar-dasar Biokimia.Jakarta: UI Press
Poedjiadi, Anna. dan F.M. Titin Supriyanti.2006.Dasar-Dasar Biokimia.Jakarta: UI
Press
Rohman, Abdul.2007.Kimia Farmasi Analisis.Yogyakarta: Pustaka Pelajar
Alghamdi,
Amani.
2010.
Trypsin
Activity.
http://amanialghamdi.wordpress.com/Trypsin-Activity/
Diakses pada 21 Maret 2015
Pukul 18:15
Anonim.2014.Kasein.http://id.wikipedia.org/wiki/Kasein
Diakses pada 21 Maret 2015
Pukul 18:17
Anonim1.2015.Enzim. http://id.wikipedia.org/wiki/Enzim
Diakses pada 21 Maret 2015
Pukul 18:20
Anonim2.2015.pH
Optimum
biochem.com/introbiochem/effectsph.html
Diakses pada 21 Maret 2015
Enzim.
http://www.worthington-
Pukul 18:21
Biologipedia.
2011.
Cara
Kerja
Enzim
Tripsin. http://Biologipedia.wordpress.com/2011/0…
Diakses pada 21 Maret 2015
Pukul 18:23
Sectiocadavaris. 2011.Peran Enzim. http://sectiocadaveris.wordpress.com/artikelkedokteran/peran-enzim-dalam-metabolisme-dan-pemanfaatannya-di-bidangdiagnosis-dan-pengobatan/
Diakses pada 21 Maret 2015
Pukul 19:05
PERCOBAAN KE VII
KINETIKA REAKSI ENZIM
Disusun Oleh:
Nama dan NPM
Shift
Kelompok
Nama Asisten
Tgl. Praktikum
Tgl. pengumpulan Laporan
:
:
:
:
:
:
:
:
:
Ambar Puspita Madyaningratri
Irma Astri Pebriliani
Tri Marleni
Ramli Maulana Latief
C
1
Ilham Kholikul, S.Farm.
Selasa, 17 Maret 2015
Selasa, 24 Maret 2015
10060313055
10060313056
10060313057
10060313058
LABORATORIUM FARMASI TERPADU UNIT B
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
2015
I.
Tujuan
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat mengetahui
dan memahami kinetika reaksi enzim dan faktor-faktor yang mempengaruhi
kondisi optimum suatu enzim.
II.
Teori Dasar
Enzim dan Kinetika Reaksi Enzim
Enzim atau biokatalisator adalah katalisator organik yang dihasilkan
oleh sel. Enzim sangat penting dalam kehidupan, karena semua reaksi
metabolisme dikatalis oleh enzim. Jika tidak ada enzim, atau aktivitas enzim
terganggu maka reaksi metabolisme sel akan terhambat hingga pertumbuhan
sel juga terganggu. Reaksi-reaksi enzimatik dibutuhkan agar bakteri dapat
memperoleh makanan/ nutrient dalam keadaan terlarut yang dapat diserap ke
dalam sel, memperoleh energi kimia yang digunakan untuk biosintesis,
perkembangbiakan, pergerakan, dan lain-lain. (Poedjiadi, 2006)
Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah
(Dwidjoseputro, 1992) suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, aktivator
dan inhibitor. Setiap enzim dapat bekerja dengan efektif pada suhu tertentu dan
aktifitasnya akan berkurang jika berada pada kondisi di bawah atau di atas titik
tersebut. Kondisi yang menyebabkan kerja enzim menjadi efektif ini disebut kondisi
optimal. Sebagian besar enzim pada manusia mempunyai suhu optimal yang
mendekati suhub tubuh (35oC– 40oC). Pada suhu tinggi (> 50oC), enzim dapat rusak
dan pada suhu rendah (0oC), enzim menjadi tidak aktif. Suhu yang tidak sesuai
tersebut akan menyebabkan terjadinya perubahan bentuk sisi aktif enzim. Sifat enzim
yang tidak tahan panas atau dapat berubah karena pengaruh suhu ini disebut
termolabil. (Dwidjoseputro, 1992)
Gambar 1. Pengaruh suhu terhadap fungsi enzim
Selain suhu, faktor lingkungan yang mempengaruhi kerja enzim adalah
derajat keasaman (pH). Sebagaimana faktor suhu, enzim juga mempunyai pH tertentu
agar dapat bekerja secara efektif. Enzim dapat bekerja optimal pada pH netral (pH =
7), pH basa, atau pH asam tergantung pada jenis enzim masing-masing. Enzim
pencerna protein misalnya, mempunyai pH paling optimal 1-2, sedangkan enzim
pencernaan yang lain mempunyai pH optimal 8. Pada pH tertentu, enzim dapat
mengubah substrat menjadi hasil akhir. Kemudian, apabila pH tersebut diubah, enzim
dapat mengubah kembali hasil akhir menjadi substrat. (Dwidjoseputro, 1992)
Gambar 2. Pengaruh pH terhadap fungsi enzim
Kadar enzim yang tinggi akan mempengaruhi kecepatan reaksi secara linier
(kecepatan bertambah konstan). Dapat dikatakan bahwa hubungan antara konsentrasi
enzim dengan kecepatan reaksi enzimatis berbanding lurus. kecepatan reaksi suatu
enzim satu dengan yang lain berbeda-beda meskipun mempunyai konsentrasi enzim
yang sama. Konsentrasi enzim yang sangat tinggi dalam suatu sistem yang kompleks
akan berpengaruh terhadap terhadap kecepatan reaksi. (Dwidjoseputro, 1992)
Gambar 3. Pengaruh konsentrasi enzim terhadap fungsi enzim
Pada konsentrasi substrat yang rendah, kenaikan substrat akan meningkatkan
kecepatan reaksi enzimatis hampir secara linier. Jika konsentrasi substrat tinggi, maka
peningkatan kecepatan reaksi enzimatis akan semakin menurun sejalan dengan
peningkatan jumlah substratnya. kecepatan maksimum (v maks) reaksi enzimatis
ditunjukan dengan garis mendatar yang menggambarkan peningkatan kecepatan yang
rendah seiring penambahan konsentrasi substrat. (Dwidjoseputro, 1992)
Gambar 4. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap fungsi enzim
Zat-zat kimia tertentu dapat memacu atau mengaktifkan kegiatan enzim.
Contoh : garam-garam dari logam alkali dan logam alkali tanah dengan konsentrasi
encer, ion kobalt (Co), mangan (Mn), nikel (Ni), magnesium (Mg), dan klor
(Cl).Sedangkaninhibisi aktifitas enzim adalah penurunan kecepatan suatu reaksi
enzimatik yang dalam makhluk hidup penting pada proses metabolisme. Pada
keadaan tertentu suatu reaksi enzimatik dapat membentuk dua atu lebih produk dan
hambatan tersebut dapat ditunjukan hanya pada suatu produk, sedangkan
pembentukan produk yang lain tidak dipengarihi atau malah di tingkatkan. Inhibitor
adalah zat yang dapat menghambat kerja enzim. Berdasarkan tempat kerjanya,
inhibitor terbagi atas, reaksi inhibitor dengan apoenzim, reaksi inhibitor dengan
substrat, reaksi inhibitor dengan substrat, reaksi inhibitor dengan koenzim, reaksi
inhibitor dengan kofaktor, reaksi inhibitor dengan bentuk kompleks enzim.
Mekanisme
Enzim dapat bekerja dengan beberapa cara, yang kesemuaannya menurunkan ΔG‡:
Menurunkan energi aktivasi dengan menciptakan suatu lingkungan yang mana
keadaan transisi terstabilisasi (contohnya mengubah bentuk substrat menjadi
konformasi keadaan transisi ketika ia terikat dengan enzim.)
Menurunkan energi keadaan transisi tanpa mengubah bentuk substrat dengan
menciptakan lingkungan yang memiliki distribusi muatan yang berlawanan
dengan keadaan transisi.
Menyediakan lintasan reaksi alternatif. Contohnya bereaksi dengan substrat
sementara waktu untuk membentuk kompleks Enzim-Substrat antara.
Menurunkan perubahan entropi reaksi dengan menggiring substrat bersama
pada orientasi yang tepat untuk bereaksi. Menariknya, efek entropi ini
melibatkan destabilisasi keadaan dasar, dan kontribusinya terhadap katalis
relatif kecil. (Anonim1, 2015)
Tanpa bantuan enzim, semua bahan makanan yang masuk ke dalam tubuh hanya
sekedar numpang lewat. Enzim merupakan komponen penting yang diperlukan untuk
proses pencernaan dan penyerapan makanan. Kini pemahaman masyarakat mengenai
enzim pencernaan dan fungsinya masih sangat rendah. Umumnya masyarakat hanya
mengaitkan masalah pencernaan dengan penyakit maag. Enzim bertanggung jawab
menjaga kesehatan dan proses metabolisme di dalam tubuh. Kekurangan enzim dapat
menyebabkan
tubuh
mengalami
gangguan
pencernaan
yang
selanjutnya
menyebabkan gangguan penyerapan (malabsorpsi). Gejala malabsorpsi adalah
kembung pada perut, nafsu makan menurun, diare dan perut tidak nyaman. Salah satu
solusi untuk mengatasi masalah malabsosrpsi akibat kekurangan enzim adalah dengan
mengkonsumsi suplemen enzim. Kekurangan enzim akan menyebabkan tubuh
mengalami gangguan pencernaan atau dalam istilah kedokteran disebut maldigesti,
yang selanjutnya dapat menyebabkan gangguan pencernaan atau malabsorbsi. Di sisi
lain, kekurangan enzim juga akan mengakibatkan timbulnya gas yang berlebih di
dalam sistem pencernaan, baik di lambung maupun usus halus dan usus besar
(Almatsier, 2003).
Kinetika reaksi enzimatis dapat digunakan untuk menentukan kadar enzim.
Kinetika reaksi enzimatik dapat diukur dengan mengukur jumlah substrat yang
diubah atau produk yang dihasilkan per satuan waktu, dan pada suatu waktu yang
sangat pendek, atau pada satu titik tertentu pada grafik disebut kecepatan sesaat
(instantaneus velocity). Kecepatan sesaat merupakan tangens dari garis singgung
terhadap grafik pada suatu titik tertentu. Kecepatan sesaat pada waktu mendekati nol,
yaitu saat grafik masih berupa garis lurus disebut kecepatan awal (Vo). Pada reaksi
enzimatis, jika disebut kecepatan, umumnya yang dimaksud adalah kecepatan awal.
Hal ini disebabkan karena pada keadaan awal reaksi, kita dapat mengetahui kondisi/
keadaan dengan lebih tepat. Disamping kecepatan sesaat dan Vo, juga dikenal istilah
kecepatan rata-rata, yaitu perbandingan antara perubahan jumlah substrat terhadap
waktu (Poedjiadi, 1994).
Reaksi enzimatik berlangsung melalui pembentukan kompleks enzim substrat
(ES), bila semua enzim dalam keadaan ES (sistem jenuh oleh substrat) maka laju
reaksi akan mencapai nilai maksimum (Vmaks). Kinetika enzim menginvestigasi
bagaimana enzim mengikat substrat dengan mengubahnya menjadi produk. Data laju
yang digunakan dalam analisa kinetika didapatkan dari asai enzim. Aktivitas enzim
akan meningkat bersamaan dengan peningkatan suhu, laju berbagai proses
metabolisme akan naik sampai batasan suhu maksimal. Prinsip biologis utama adalah
homeostatis, yaitu keadaan dalam tubuh yang selalu mempertahankan keadaan
normalnya. Perubahan relatif kecil saja dapat mempengaruhi aktivitas banyak enzim.
Adanya inhibitor non kompetitif irreversibel dan antiseptik dapat menurunkan
aktivitas enzim. Kecepatan reaksi mula-mula meningkat dengan menaiknya suhu, hal
ini disebabkan oleh peningkatan energi kinetik pada molekul-molekul yang bereaksi.
Akan tetapi pada akhirnya energi kinetik enzim melampaui rintangan energi untuk
memutuskan ikatan hidrogen dan hidrofobik yang lemah, yang mempertahankan
struktur sekunder-tersiernya. Pada suhu ini terjadi denaturasi enzim menunjukkan
suhu optimal. Sebagian besar enzim suhu optimalnya berada diatas suhu dimana
enzim itu berada. Ada dua metode analisis kuantitatif kinetika reaksi enzim, yaitu
asas keseimbangan Michaelis-Menten dan asas teori keadaan tunak (steady state
theory) Briggs-Haldone. Persamaan Michaelis-Menten merupakan persamaan
kecepatan reaksi enzimatik substrat tunggal yang menyatakan hubungan kuantitatif
kecepatan reaksi awal (Vo), kecepatan reaksi maksimum (Vmaks), konsentrasi
substrat [S], dan konstanta Michaelis-Menten [KM] (Murray, 2003).
Pada praktikum ini yang digunakan adalah enzim tripsi. Berikut penguraian enzim
tipsin:
Tripsinogen merupakan enzim inaktif yang harus diaktifkan terlebih dahulu
oleh enzim enterokinase yang dihasilkan oleh usus halus. Tripsinogen berubah
menjadi tripsin yang aktif. Tripsin mengubah protein menjadi peptida dan asam
amino. (Almatsier, 2003).
Tripsin adalah protease serina pankreas dengan substrat khusus rantai lysine
dan arginin. Di manusia, enzim ini memproduksi enzim inaktif dari tripsinogen.
Tripsinogen masuk usus kecil, biasanya melalui cairan empedu dimana tripsinogen
diubah menjadi tripsin aktif. (Alghamdi, 2010).
Fungsi enzim tripsin adalah mengubah protein menjadi bentuk yang lebih
sederhana, seperti pepton dan asam amino. Enzim tripsin dihasilkan oleh kelenjar
pankreas dan dialirkan ke usus 12 jari (duodenum).Selain itu fungsi enzim tripsin
adalah untuk mengubah tripsinogen menjadi tripsin aktif dan menghidrolisis protein
yang dihasilkan oleh pancreas. (Poedjiadi, 2006).
Manfaat enzim tripsin adalah untuk membuat vaksin meningitis dari pankreas
babi dan yang berperan adalah enzim tripsin di dalam pankreas babi.
(Sectiocadavaris, 2011)
Pada praktikum ini substrat yang digunakan adalah kasein. Berikut penguraian
kasein:
Kasein merupakan golongan protein yang komposisinya mencapai 80% dari
komposisi keseluruhan protein susu. Protein kasein terbagi menjadi beberapa
komponen, komponen yang umum dijumpai adalah αs1-kasein, αs2-kasein, β-kasein,
dan κ-kasein. (Anonim, 2014)
Protein kasein memiliki daerah hidrofobik dan hidrofilik yang bervariasi.
Kasein relatif tidak sensitif terhadap panas, dibutuhkan temperatur diatas 120°C
untuk merusak struktur kasein hingga menjadi tidak larut dalam air. Di sisi lain,
kasein cukup sensitif terhadap pH, maka itu protein kasein akan mengendap pada titik
isoelektriknya. Protein kasein mempunyai masa molekul sebesar 106 hingga 109
Dalton. Kasein mampu menyebarkan cahaya. Oleh karena keberadaan kasein di
dalam susu, susu berwarna putih. (Anonim, 2014)
Protein kasein bersama dengan kalsium fosfat, dapat membentuk semacam
partikel koloid yang terdispersi, yang disebut misel (micelles). Karena protein kasein
berupa suspensi, protein tersebut dapat dipisahkan dari campuran menggunakan
sentrifugasi. Setelah sentrifugasi, beberapa protein tertingal di dalam larutan. Protein
yang larut di dalam supernatan tersebut disebut protein whey. (Anonim, 2014)
Kasein mengandung asam beragam asam amino yang diperlukan mamalia
muda untuk tumbuh. Karena memiliki protein berkualitas tinggi seperti kasein, susu
sapi dianggap sebagai salah satu makanan manusia yang paling penting. Lebih jauh
lagi, protein kasein terdesain untuk berikatan dengan kalsium fosfat, yang secara
langsung mengendap pada lambung bayi baru lahir. Hal ini membuat protein tersebut
mudah dicerna. Karena protein kasein dinilai mempunyai signifikansi yang besar
terhadap kehidupan manusia, struktur kasein telah dipelajari secara menyeluruh, akan
tetapi struktur pasti kasein masih diperdebatkan. (Anonim, 2014)
Analisa kuantitatif pada praktikum ini menggunakan instrument spektrofotometer uvvisible,
di
mana
penjabaran
tentang
sprektrofotometri
dan
instrument
spektrofotometer sebagai berikut:
Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya
oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu (Day, 2002). Sinar
ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar
tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran
spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan energi
elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer
UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif.
Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi
dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang
gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. (Rohman, 2007)
Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan
konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam hukum
Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu :
– Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
– Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang sama
– Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain
dalam larutan tersebut
– Tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi
– Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan
Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam rumus sbb :
A = e.b.c
dimana :
A = absorban
e = absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
(Rohman, 2007)
INSTRUMEN SPEKTROFOTOMETRI UV – VIS
PRINSIP KERJA
Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat
polikromatis
di
teruskan
melalui
lensa
menuju
ke
monokromator
pada
spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan
mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkasberkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang
mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya
yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini
kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya yang
diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap
sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan
diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif. (Rohman, 2007)
HAL – HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN
1. Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna
Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna,
maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang
berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan lampu UV.
2. Panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang
mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn
gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang
gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi
adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang gelombang maksimal,
akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer
dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat
kesalahannya akan kecil sekali.
3. Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban
Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang
dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum
elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya
pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang terbentuk.
Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban
pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.
(Rohman, 2007)
III.
Alat Dan Bahan
Alat
Tabung reaksi
Batang pengaduk
Pipet ukur 1 mL, 5 mL, 10 mL
Pipet tetes
Water bath 35oC
Kertas saring
Spektofotometer
Corong kaca
IV.
Bahan
Larutan TCA 20%
Larutan kasein 2% (b/v)
Larutan dapar fosfat 0,1M pH 8
Larutan NaOH
Aquadest
Reagen Folin-Ciocalteu
Larutan Tripsin
Prosedur Kerja
1. Tabung t = 0 menit
Disiapkan 5 tabung reaksi. Dimasukan larutan buffer fosfat dan tripsin dan
tambahkan masing-masing 3 mL larutan TCA 20%, aduk perlahan, dan
diinkubasi selama 30menit dalam water bath 35oC. Setelah 30 menit di
tambahakan larutan kasein dan didiamkan selama 20 menit dalam air es.
Seletah itu disentrifugasi 10 menit dan disaring melalui kertas saring
untuk diambil supernatannya. Lalu dilakukan metode anson pada hasil
filtrate tersebut.
Metode Anson: diambil 2 mL TCA-Filtrat ditambahkan 4 mL NaOH 0,5
M dan 1 mL larutan Folin-Cioalteu. Didiamkan 10 menit kemudian
ditentukan serapannya pada 650 nm.
2. Tabung t = 20 menit
Diinkubasi 5 menit pada water bath
35
ͦ C masing-masing tabung
berpengaduk yang berisi kasein sesuai tabel sambil diaduk. Kemudian
ditambahkan berturut-turut larutan buffer posfat dan larutan tripsin.
Diinkubasikan selama 20 menit pada inkubator 35 ͦ C dihitung setelah
penambahan tripsin. Dihentikan reaksi dengan penambahan 3 mL TCA 20
% kedalam masing-masing tabung dan diaduk sangat kuat. Lalu
Didiamkan selama 20 menit dalam air es untuk menyempurnakan
pengendapan. Dan disentrifugasi selama 10 menit kemudian disaring
untuk diambil supernatannya. Filtrat dilakukan metode anson, yaitu
dicampurkan 2mL TCA-Filtrat dengan 4mL NaOH 0.5 M kemudian
ditambahkan 1 mL larutan Folin-Ciocalteu ( 1 volume reagen ditambah 1
volume aquadest). Kemudian diamkan 10 menit dan ditetapkan
serapannya 650 nm.
No.
I
II
III
IV
V
Tabung
Tripsin
Kasein
Buffer
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
(mL)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
(mL)
0,1
0,1
0,5
0,5
1,0
1,0
3,0
3,0
5,0
5,0
(mL)
5,9
5,9
5,5
5,5
5,0
5,0
3,0
3,0
1,0
1,0
Fosfat
V. Data Pengamatan dan Perhitungan
Tabung t = 0 menit
Setelah semua tabung diisi larutan buffer dan ditambahkan tripsin dan
ditambah TCA 20% larutan berwarna bening tidak ada endapan. Kemudian
diinkubasi semua tabung tetap berwarna bening.
Tabung
Setelah ditambahkan Kasein dan didinginkan
I
II
III
Larutan bening, sedikit putih keruh diatas
Larutan bening, sedikit putih keruh diatas
Larutan bening, larutan berwarna putih keruh di bagian
IV
V
atas
¾ bagian putih keruh
Larutan putih keruh, ada endapan putih
Tabung t = 20 menit
Setelah semua tabung diisi dengan kasein yang berwarna putih keruh.
Tabung
I
II
III
IV
V
Setelah didinginkan dan ditambahkan TCA20%
Bening
Agak putih
Keruh, terdapat gumpalan putih tersebar
Terbentuk endapan keruh
Terbentuk endapan
Pengolahan data absorbansi
No
I
II
III
IV
V
Tabung
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
T=0
T = 20
Perhitungan
1. Menghitung ΔA
ΔA = At20 – At0
ΔA1 = 0.014 – 0.008 = 0.006
ΔA2 = 0.024 – 0.005 = 0.019
ΔA3 = 0.110 – 0.007 = 0.109
ΔA4 = 0.100 – 0.002 = 0.098
ΔA5 = 0.240 – 0.009 = 0.231
Nilai Absorbansi
0.008
0.014
0.005
0.024
0.007
0.110
0.002
0.100
0.009
0.240
2. Menghitung V
V = ΔA/Δt
Δt = t20 – t0
Δt = 20 – 0 = 20 menit
V1 =
V2 =
V3 =
V4 =
V5 =
3.
0.006
=0.3 x 10−3
20
0.019
−3
=0.95 x 10
20
0.109
=5.15 x 10−3
20
0.098
=4.9 x 10−3
20
0.231
−3
=11.5 x 10
20
Menghitung S
S=
Aliquot
x 2%
Vtotal
Vtotal = V setiap tabung
= 7 ml
Aliquot = jumlah kasein
S1 =
S2 =
S3 =
S4 =
S5 =
0.1
x 2 =0.29 x 10−3
7
0.5
x 2 =1.43 x 10−3
7
1.0
−3
x 2 =2.86 x 10
7
3.0
x 2 =8.57 x 10−3
7
5.0
x 2 =14.29 x 10−3
7
4. Grafik Michaelis-Menten
S (X)
−3
0.29 x 10
−3
1.43 x 10
−3
2.86 x 10
−3
8.57 x 10
−3
14.29 x 10
V (Y)
−3
0.3 x 10
−3
0. 95 x 10
−3
5.15 x 10
−3
4.9 x 10
−3
11.5 x 10
a = 6.6969 x 10−4
b = 0.7088
R = 0.9300
Persamaan Michaelis-Menten
Hubungan antara V dengan S
0.01
0.01
0.01
V
0.01
0.01
0
0
0
0
0
0
0.01
0.01
S
0.01
0.01
0.01
0.02
5. Grafik Lineweaver-Burk
1
( X)
S
1
(Y )
V
3,448.27
699.30
349.65
116.68
69.97
3,333.33
1,052.63
194.17
204.08
86.95
a = 79.8107
b = 0.9547
R = 0.990
Hubungan antara 1/S dengan 1/V
Hubungan antara 1/S dengan 1/V
Linear (Hubungan antara 1/S dengan 1/V)
3500
f(x) = 0.95x + 79.81
R² = 0.98
3000
2500
1/V
2000
1500
1000
500
0
0
500
1000
1500
2000
1/S
6.
Menghitung Vmaks dan
KM
2500
3000
3500
4000
b(gradien) =
1
Vmaks
Vmaks =
=a
KM
V maks
maka, Vmaks =
1
a
1
79.811
Vmaks = 0.0125 ppm/menit
KM
= b(gradien) x Vmaks
KM
= 0.9548 x 0.0125
KM
= 0.011935
Gambar
Gambar tabung t=0 setelah ditambahkan larutan Buffer, Tripsin, TCA20%,
dan diinkubasi.
Gambar tabung t=0 setelah ditambahkan kasein dan didinginkan.
VI.
Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan uji untuk mengetahui kinetika reaksi enzim
yang berikatan dengan substrat.
Pertama-tama pengujian dilakukan pada saat t = 0 menit.
Disiapkan tabung reaksi sebanyak 5 buah kemudian diisi oleh buffer
fosfat dalam berbagai konsentrasi. Di sini buffer fosfat berguna untuk
mempertahankan pH optimum enzim agar tidak mudah berubah akibat
penambahan sedikit asam maupun basa. Lalu dimasukkan tripsin ke dalam
masing-masing tabung. Tripsin di sini berperan sebagai enzimnya. Di mana
fungsi enzim tripsin adalah untuk mengubah tripsinogen menjadi tripsin aktif
dan menghidrolisis protein yang dihasilkan oleh pancreas, seperti teori yang
disampaikan Poedjiadi (2006). Kemudian ke dalam masing-masing tabung
ditambahkan larutan TCA 20%. Larutan TCA ini berguna sebagai zat yang
dapat menghentikan mekanise pengikatan antara enzim dan substrat, serta pH
optimum enzim tripsin adalah sekitar 7.8-8.7 (Anonim 2, 2015) . Berikutnya
semua tabung diinkubasi pada suhu 35oC, suhu ini merupakan suhu optimum
kerja enzim tripsin. Setelah diinkubasi, tabung diambil dan ke dalam masingmasing tabung dimasukkan larutan kasein dalam berbagai konsentrasi, kasein
berperan sebagai substrat, di mana kasein merupakan golongan protein yang
komposisinya mencapai 80% dari komposisi keseluruhan protein susu
(Anonim, 2014). Setelah itu semua tabung direndam di dalam air es dengan
tujuan memperjelas bentuk dari endapan jika terdapat endapan. Setelah
penambahan kasein dan didinginkan di air es tersebut, hasil yang didapat
praktikan adalah bahwa dari tabung ke 1 sampai tabung ke 5 kekeruhan pada
larutan terlihat semakin jelas. Hal ini terjadi karena perbedaan konsentrasi
buffer fosfat dan konsentrasi substrat yang berbeda pada setiap tabung. Dapat
dinyatakan bahwa selain menurunnya konsentrasi buffer fosfat pada tabung 1
sampai tabung 5, konsentrasi substrat malah semakin banyak, namun
bukannya meningkatkan kinetika reaksi enzim, tetapi malah menurunkan
kinetikita reaksinya disebabkan konsentrasi enzim yang konstan diberikan
pada setiap tabung, sehingga hanya tabung 1 saja yang dapat lebih banyak
mengubah substrat menjadi produk yang ditandai lebih banyaknya larutan
yang bening dibandingkan dengan larutan yang putih keruh. Sebaliknya, pda
tabung 5 keseluruhan larutan berwarna putih keruh dan terdapat endapan,
adanya endapan menandakan bahwa enzim terdenaturasi sehingga tidak dapat
mengubah substrat menjadi produk.
Tahap selanjutnya, kelima larutan
disentrifugasi dan disaring untuk mendapatkan supernatantnya. Hasil filtrasi
lebih lanjut dilakukan dengan cara metode Anson, yaitu memakai prinsip kerja
spektrofotometri yang menggunakan instrument uv-vis. Untuk mendapatkan
data serapan dari kelima supernatant yang ada harus ditambahkan dulu oleh
NaOH, yang berguna untuk menetralkan TCA-filtrat yang bersifat asam,
danditambahkan ragen Folin-Ciocalteu yang berguna sebagai senyawa
kromogenik sekaligus senyawa yang akan mencari gugus aromatic pada
enzim yang berada di supernatant agar dapat mengubah fosfotungstat dan
malibdan menjadi tungstat dan malibdenum yang hasilnya merupakan
senyawa berwarna biru kehijauan agar dapat diukur serapannya pada
instrument spektrofotometer yang memiliki syarat bahwa larutan harus
bersifat netral, tidak boleh asam maupun basa, dan larutan yang diukur
serapannya harus memiliki warna agar dapat terbaca.
Setelah kelima supernatant telah berwarna, segera dilakukan pencarian
nilai absorbansi yang sebelumnya harus ditunggu selama 10 menit guna
mengoptimalkan kerja reagen Folin-Ciocalteu terhadap supernatant. Pengujian
dilakukan pada panjang gelombang 650 nm (panjang gelombang sinar
tampak). Lalu di dapatlah hasil beberapa serapan seperti yang ada pada data
pengamatan.
Pengujian dilakukan pada saat t = 20 menit.
Pada pengujian ini yang dilakukan pertama kali adalah menginkubasi
kelima tabung yang sudah berisi kasein (sebagai substrat) pada suhu 35 oC,
yaitu suhu optimum bagi enzim tripsin. Tiap tabung diaduk agar homogeny
tetapi tidak boleh sampai berbusa. Kemudian pada tiap tabung ditambahkan
buffer fosfat dalam berbagai konsentrasi diikuti penambahan larutan tripsin
yang jumlahnya konstan. Setelah itu semua tabung diinkubasi pada suhu 35 oC
tepat 20 menit setelah penambahan tripsin, hal ini dilakukan dengan tujuan
enzim dapat bekerja optimal lagi pada suhu 35oC setelah sebelumnya telah
mengalami penurunan suhu yang drastis. Untuk menghentikan reaksi enzimsubstrat, ditambahkan larutan TCA 20% ke dalam masing-masing tabung dan
diaduk agar homogen, dan kelima tabung kembali direndam di dalam air es
dengan tujuan untuk menyempurnakan pengendapan. Setelah penambahan
TCA dan telah direndam di dalam air es, didapat hasil yang sama seperti pada
t = 0, di mana larutan akan semakin keruh dan menghasilkan endapan pada
tabung 4 dan tabung 5 akibat perbedaan konsentrasi substrat, konsentrasi
enzim, konsentrasi buffer dan perubahan suhu lingkungan yang drastis di awal
percobaan t = 20 menit ini. Hal ini menandakan bahwa pada tabung 4 dan 5,
enzim sudah terdenaturasi karena terdapatnya endapan pada dasar tabung.
Setelah itu kelima tabung disentrifugasi, kemudian disaring untuk
diambil supernatantnya. Filtrate yang sudah didapat selanjutnya dilakukan
dengan metode Anson. Perlakuannya sama, ditambahkan NaOH untuk
menetralkan asam dari TCA, dan ditambahkan reagen Folin-Ciocalteu untuk
member warna pada supernatant agar dapat diuji pada instrument
spektrofotometer, dan pengujian juga dilakukan pada panjang gelombang 650
nm. Kemudian data absorbansi dari maing-masing supernatant dapat diperoleh
sesuai yang dicantumkan pada data pengamatan.
Penjelasan Kurva
Kurva pertama adalah kurva Michealis-Menten, pada kurva ini terlihat
fluktuatif sehingga sulit sekali ditentukan Vmaks dari kurva tersebut.
Seharusnya kurva yang terbentuk seperti:
Sehingga jika kurva seperti yang ada di atas, maka dapat langsung dihitung
Vmaks dan dapat ditentukan nilai KM-nya. Namun kurva yang didapat tidak
sesuai yang praktikan inginkan, beberapa faktor penyebab terjadinya fluktuatif
pada kurva ini yaitu akibat enzim yang digunakan mungkin saja sudah
mendekati batas daluwarsanya, dan data absorbansi pada tabung 2 pada t = 20
menit kami dapatkan dari kelompok lain, yaitu dari kelompok 4 karena pada
saat pengerjaan tabung 2 oleh kelompok 2 mengalami kesalahan dalam data
absorbansinya, sehingga tidak memungkinkan praktikan pada kelompok ini
untuk memakai data absorbansi dari kelompok 2.
Kurva yang kedua adalah kurva Linewaver-Burk, kurva ini dibuat
dengan tujuan agar kurva yang dihasilkan memiliki kemiringan sehingga
dapat dengan tepat didapatkan hasil regresi yang digunakan untuk menghitung
nilai Vmaks dan KM.
Kesimpulan dari kedua kurva adalah bahwa kemampuan berikatan
enzim dan substrat menurun akibat beberapa faktor, baik dari konsentrasi
enzimnya, konsentrasi substratnya, senyawa tambahan yang bersifat
menghentikan mekanisme kerja ezim berikatan dengan substrat, dan suhu
serta pH optimum enzim.
Nilai Vmaks yang dihasilkan seharusnya sedikit lebih besar karena
jika konsentrasi substrat meningkat, maka hal tersebut dapat meningkatkan
kecepatan awal reaksi serta meningkatkan kemampuan enzim untuk berikatan
dengan substrat. Dan saat sudah dalam keadaan enzim yang jenuh akibat
banyaknya substrat akan dihasilkan nilai Vmaks yang konstan, nilai ini
seharusnya cukup besar jika kemampuan berikatan enzim dan substatnya
benar-benar tinggi, namun hasil yang praktikan dapatkan yaitu nilai Vmaks
hanya 0,0118 dan nilai KM = 0,01192. Yang menandakan benar bahwa
kemampuan berikatan enzim dan substrat menurun ditandai tidak besarnya
nilai Vmaks yang dihasilkan. Dan karena nilai Vmaks kecil, maka
mempengaruhi hasil dari nilai KM juga, sehingga nilai KM yang didapat juga
kecil.
VII.
Kesimpulan
1. Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu
konsentrasi enzim dan konsentrasi substrat
2. Enzim tripsin mempunyai pH optimum 7,8 – 8,7
pH, suhu,
3. Metode yang dilakukan pada percobaan kinetika kerja enzim ada tiga
metode
yaitu,
metode
Michaelis-Menten
(penentuan
kurva
1),
Lineweaver-Burk (penentuan kurva 2) dan metode Anson (pencarian nilai
serapan masing-masing supernatant).
4. Nilai absorbansi yang dihasilkan dari percobaan pada tiap tabung t=0 dan
t=20 cenderung mengalami peningkatan.
5. Grafil Michaelis-Menten memberikan kurva yang fluktuatif.
6. Grafik Lineweuver-burk yang dihasilkan yang dihasilkan dari praktikum
ini tidak linier atau tidak lurus.
7. Nilai Vmax yang didapat = 0.0125 ppm/menit
8. Nilai Km yang didapat = 0.011935
DAFTAR PUSTAKA
Almatsier, Sunita. 2003. Prinsip Dasar Ilmu Gizi.Jakarta: Gramedia PustakaUtama
Day, R. A. & A. L. Underwood.2002.Analisis Kimia Kuantitatif.Jakarta: Erlangga
Dwijoseputro.1992.Pengantar Fisiologi Tumbuhan.Jakarta: Gramedia Pustaka Utama
Murray, R. K., dkk.2003.Harper’s Illustraterd Biochemistry 26th Edition.USA:
McGraw-Hill Companies
Poedjiadi, Anna.1994.Dasar-dasar Biokimia.Jakarta: UI Press
Poedjiadi, Anna. dan F.M. Titin Supriyanti.2006.Dasar-Dasar Biokimia.Jakarta: UI
Press
Rohman, Abdul.2007.Kimia Farmasi Analisis.Yogyakarta: Pustaka Pelajar
Alghamdi,
Amani.
2010.
Trypsin
Activity.
http://amanialghamdi.wordpress.com/Trypsin-Activity/
Diakses pada 21 Maret 2015
Pukul 18:15
Anonim.2014.Kasein.http://id.wikipedia.org/wiki/Kasein
Diakses pada 21 Maret 2015
Pukul 18:17
Anonim1.2015.Enzim. http://id.wikipedia.org/wiki/Enzim
Diakses pada 21 Maret 2015
Pukul 18:20
Anonim2.2015.pH
Optimum
biochem.com/introbiochem/effectsph.html
Diakses pada 21 Maret 2015
Enzim.
http://www.worthington-
Pukul 18:21
Biologipedia.
2011.
Cara
Kerja
Enzim
Tripsin. http://Biologipedia.wordpress.com/2011/0…
Diakses pada 21 Maret 2015
Pukul 18:23
Sectiocadavaris. 2011.Peran Enzim. http://sectiocadaveris.wordpress.com/artikelkedokteran/peran-enzim-dalam-metabolisme-dan-pemanfaatannya-di-bidangdiagnosis-dan-pengobatan/
Diakses pada 21 Maret 2015
Pukul 19:05