LAPORAN RESMI PRAKTIKUM TEKNOLOGI DNA KL

LAPORAN RESMI PRAKTIKUM TEKNOLOGI DNA
KLONING DNA

Oleh
NAMA

: ANGELIA ASTRIA

NIM

: 31160048

PROGRAM STUDI BIOLOGI
FAKULTAS BIOTEKNOLOGI
UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA
YOGYAKARTA
2017

BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Kloning merupakan proses pembuatan salianan dari suatu gen dengan prinsip
teknologi DNA rekombinan. Molekul DNA rekombinan dibuat dengan menyisipkan
fragmen DNA yang mengandung gen target ke dalam vektor. Vektor berperan sebagai
pembawa gen yang akan dikloning ke dalam sel inang. Vektor rekombinan yang
ditransformasi ke dalam sel inang ikut membelah setiap sel inang melakukan pembelahan
sehingga koloni sel inang yang membanwa vektor dengan gen target akan menghasilkan
salianan gen target yang banyak (Brown (1991).
Komonen-komponen kloning adalah sebagai berikut :
1. Sampel DNA
Sampel DNA yang digunakan untuk dikloning dapat berupa DNA genom atau
DNA komplementer yang merupakan DNA komplemen dari mRNA ( Snustad dan
Simmons, 2012). Sampel DNA dapat juga berasal dari hasil isolasi DNA yang
dimanipulasi lebih lanjut dnegan prosedur subkloning, produk PCR atau
oligonukleotida yang disintetis secara kimiawi (Twyman, 1998 : 325)
2. Vektor
Vektor adalah molekul DNA yang dapat mmbawa DNA asing ke dalam sel
inang dan bereplikasi ke dalam sel inang (Campbell dkk, 2002 : 392). Mlekul DNA
yang berperan sebagai vektor harus memiliki beberapa syarat seperti memiliki
penanda awal replikasi/ origion of replication(ORI), gen penanda seleksi (umumnya

berupa gen resisten pada antibiotik) dan situs pengenalan restriksi yang unik
(multiple cloning sites/ MCS).Salah satu vektor yang sering digunakan adalah
plasmid, plasmid merupakan molekul DNA yang berbentuk lingkaran (sirkular)
beruntai ganda diluar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri dalam
bakteri ( Snustad dan Simmons, 2012).
3. Enzim restriksi
Enzim restriksi merupakan endonuklease yang memecahkan ikatan
fosfodiester pada situs pengenalan spesifik dari DNA. Enzim restriksi
dibedakan berdasarkan hasil potongan yang dihasilkan. Beberapa enzim akan
memotong kedua untai DNA pada posisi yang sama dan akan menghasilkan

potongan blunt end. Potongan blunt end dihasilkan jika enzim memotong DNA
tepat pada bagian tengah situs pengenalannya. Beberapa enzim memotong
untai DNA pada posisi yang berbeda dan menghasilkan potongan kohesif yang
disebut sticky end contoh enzim EcoRI (Brown (1991).
4. Ligasi
Ligasi adalah suatu proses penggabungan fragmen DNA yang saling berlinear
dengan menggunakan ikatan kovalen. Proses ligasi dikatalis oleh enzim ligase
dengan bantuan ATP. Enzim ligase merupakan enzim yang mengkatalis reaksi
pembentukan kembali ikatan fosfodiester antar potongan fragmen DNA.

Contoh enzim ligase adalah T4 ligase. Enzim ligase digunakan dalam teknik
rekayasa genetik karena mampu menyambungkan fragmen DNA ujung rata
(blunt end) dan ujng kohesif (sticky end)(Sambrook dan Russell, 2001).
5. Sel inang
Sel inang dipilih berdasarkan tujuan kloning dan asal gen yang dikloning.
Karakteristik sel inang yang baik antara lain memilikii laju pertumbuhan cepat,
tumbuh dalam jumlah yang banyak, nonpatogenik, genom telah dipetakan,dapat
menerima vektor, dapat menjaga stabilitas gen asing dan dapat mengekspresikan
gen asing (Tamarin, 2001).
Tahapan proses kloning adalah sebagai berikut :
1. Isolasi DNA
2. PCR adalah teknik amplifikasi sekuen DNA spesifik secara in vitro dengan proses
pemanjangan primer untai DNA komplementer (Tamarin, 2001)
3. Restriksi dan ligasi
4. Pembuatan sel kompeten
5. Transformasi adalah intoduksi DNA vektor palsmid yang mengandung gen sisipan
kedalam sel inang bakteri (Tamarin, 2001)
6. Blue and white screening
Metode identifikasi DNA rekombinan adalah dengan α-klomplementasi. Αklomplementasi adalah terbentuknya suatau enzim β-Galaktosidase fungsional karena
kehadiran dua gen dari sumber yang berbeda yaitu α-segmen (dari plasmid) dan ω-segmen

(dari kromosom sel kompeten) (Brock et al, 2015).

B. Tujuan
Memahami dan mengetahui tahapan dalam kloning DNA

BAB II
METODOLOGI
A. Alat
1. Eppendorf 1,5 mL

8. Thermocycler

2. Sentrifuge

9. Elektroforesis

3. Mikropipet

10. Tube PCR

4. Tip

11. Bunsen

5. Tusuk gigi

12. Cawan petri

6. Inkubator

13. Ose

7. Alat vortex

B. Bahan
1. Sampel bakteri Escherichia
coli

2. Sampel bakteri Salmonella
Thypi

14. Enzim T4 ligase
15. Buffer T4 ligase
16. Luria Bertani Broth (LBB)
17. Ampicillin

3. Plasmid PUC19

18. RNAse

4. STET Buffer

19. DNAse RNAse free distilled

5. Lysis buffer

water

6. Isopropanol

20. PCR mix

7. Pottasium-acetat-solution (pH

21. Gel agarosa

5)

22. primer forward lacZ 456 bp

8. Etanol 70%

23. reverse lacZ 456 bp

9. ddH2O

24. TBE

10. enzim BamHI

25. Red safe

11. Enzim EcoRI

26. Loading dye

12. DNA insert

27. Marker

13. DNA vektor

C. Cara kerja
1. Ekstrasi DNA kromosom
Disiapkan eppendorf 1,5 mL dan sampel bakteri yang ditumbuhkan pada medium
LBB
Disentifugasi 6.500 rpm selama 3 menit kemudian dibuang supernatan.
Ditambahkan 500 µl rinse buffer pada pellet dan dilakukan mixing
Disentifugasi 6.500 rpm selama 1 menit
Dibuang supernatan dan Ditambahkan 500 µl rinse buffer pada pellet dan

dilakukan mixing dengan baik
Ditambahkan digestion buffer dan dihomogenkan dengan vortex
Diinkubasi dalam waterbath pada suhu 55 °C selama 60 menit dan mixing setiap
10 menit.
Secara hati-hati ditambahkan 500 µl fenol pada ruang asam.
Digojog selama 20 menit dan disentrifugasi 13.000 rpm, 4 °C selama 5 menit
Fase bagian atas (lendir) yang mengandung DNA dipindahkan ke eppendorf baru
Ditambahkan 500 µl chloroform iso-Amyl Alcohol
Digojog hingga homogen dan disentrifugasi 13.000 rpm, 4 °C selama 5 menit
Fase bagian atas (300-500 µl) dipindahkan ke eppendorf baru
Ditambahkan etanol absolut 2 × volume (600-1000 µl) dan disentrifugasi 13.000
rpm, 4 °C selama 15 menit
Etanol dibuang perlahan dan ditambahkan 300 µl 70% etanol untuk presipitasi
DNA kemudian dan disentrifugasi 13.000 rpm, 4 °C selama 15 menit

DNA dikeringkan dengan cara membalik eppendorf, kemudian DNA dilarutkan
dengan menambahkan 100 µl ddH2O
Ditambahkan 2-3 µl R°C NAse dan disimpan pada suhu ruang semalaman,
kemudian disimpan pada suhu -20°C(sampai saat digunakan)
2. DNA plasmid

Digunakan plasmid dalam bentuk DNA dengan merek dagang Thermo Scientific
3. Elektroforesis DNA dan plasmid
DNA dan plasmid dimigrasikan untuk meihat kualitasnya pada elektroforesis
Pembuatan gel agarosa: 0,8 % agarosa = 0,28 gr (35 mL), TBE : Steril water = 1 :
(500 mL) dan Red safe 5 µl untuk 100 mL

Sampel DNA dan plasmid di mix dengan DNA loading dye 2-3 µl untuk satu
sampel pada parafilm

Dimasukkan ke dalam sumuran agarosa dan di running Elektroforesis ± 1 jam,
80V, kemudian diamati pada imager .
4. Amplifikasi DNA dan plasmid dengan metode PCR
Tube PCR diisi dengan DNAse RNAse free distilled water sebanyak 7 µl
Ditambahkan 10 µl PCR mix

Ditambahkan primer forward (1 µl) dan reverse (1 µl) lacZ 456 bp
Ditambahkan 1 µl DNA/plasmid
Dilanjutkan dengan PCR, kondisi: Pre-denaturasi awal suhu 94 °C selama 2 menit,
Denaturasi pada suhu 94 °C selama 2 menit, Annealing primer pada suhu 58 °C
selama 45 detik, Extension pada suhu 72 °C selama 10 menit Dan dilakukan

sebanyak 30 siklus.
5. Elektroforesis DNA dan plasmid
DNA dan plasmid dimigrasikan untuk meihat kualitasnya pada elektroforesis

Pembuatan gel agarosa : 0,8 % agarosa `0,28 gr (35 mL), TBE : Steril water = 1 :
(500 mL) dan Red safe 5 µl untuk 100 mL

Mix sampel: Loading dye 2-3 µl dan DNA atau plasmid 5 µl

Dimasukkan ke dalam sumuran gel agarosa
Ditambahkan marker 1 kb dan kontrol Escherichia coli

Running elektroforesis ±1 jam dan setelah itu diamati.

6. Restriksi dan ligasi
Restriksi :
DNA kromosom( Escherichia coli ATCC 25922) dan plasmid pUC19 direstriksi
pada tube. Dengan komposisi :DNA kromosom/plasmid 5,3 µl, Enzim BamHI
0,5 µl, Enzim EcoRI 0,5 µl, Buffer 1,0 µl dan dH2O 2,5 µl sehinggal total 15 µl.

Diinkubasi pada 37 °C selama 1 jam.
Ligasi :
Komposisi :DNA insert 5 µl, DNA vektor µl 1, Enzim T4 Ligase 0,5 µl, Buffer
T4 Ligase 0,5 µl dan dH2O 11 µl sehinggal total 18 µl.
Diinkubasi pada 16-18 °C selama semalaman.
Pembuatan sel kompeten :
1 ose E.coli DH5α dikulturkan ke dalam 5 mL Luria Bertani Broth (LBH)
Dinkubasi pada suhu 37 °C semalam.
Diambil 0,4-1 mL kultur stok dari 5 mL LBB dan ditambahkan pada 5 mL LBB
baru.
Diinkubasi pada suhu 37 °C selama ±3jam dalam shaker
Dipindahkan pada eppendorf 1,5 mL dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 8
detik (diulang hingga stok habis)

Pellet+1,5 mL MR(0,75 mL) / MRC (0,75mL) buffer disentrifugasi 12.000 rpm
selama 8 detik dan supernatan dibuang.
Pellet+ 1,5 mL MRC diinkubasi pada es selama 30 menit.
Diambil 150 µl sel kompeten dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 8 detik,
kemudian supernatan dibuang dan pellet diresuspensi dengan 100 µl MRC.
Suspensi sel pada 2 tabung dijadikan dalam satu tabung (stok)
7. Transformasi
18 µl plasmid rekombinan (hasil ligasi) + 50 µl sel kompeten pada tabung baru
diinkbasi pada es selama 30 menit
Dilakukan hect shock dengan pemanasan 42 °C selama 90 detik, diinkubasi pada
es selama 2 menit.
Ditambah 600 µl medium LBB dan diinkubasi pada 37 °C selama 45 menit,
disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 detik.
100 µl diinokulasi pada media LBA 1 yang mengandung ampicillin dan LBA2
yang mengandung ampicillin, IPTG dan X-Gal.
Diinkubasi pada suhu 37 °C semalaman dengan posisi dibalik. Kemudian
dilakukan blue dan white screening untuk identifikasi rekombinan bakteri.

BAB III
HASIL dan PEMBAHASAN

Medium
Perlakuan
A

B

C

BamHI

+

-

+

BamHI+EcoRI

-

+

+++

Vektor (pUC19)

-

-

+++

Insert (E.coli)

-

-

+

Sel kompeten

-

-

+++

E.coli ATCC25922(Sel)

-

+

+++

ddH2O

-

-

+++

Tabel 1. Hasil transformasi

Keterangan :
-

: Tidak ada pertumbuhan

+

: Ada pertumbuhan

+++

: Pertumbuhan lebih banyak

A

: LBB + Ampicillin + X-gal + IPTG

B

: LBB + Ampicillin

C

: LBB
Isolasi DNA kromosom dilakukan untuk mendapatkan
DNA murni yang akan digunakan sebagai insert, insert yang
digunakan adalah DNA dari bakteri Escherichia coli ATCC
25922. Sebagai kontrol negatif digunakan bakteri Salmonella
Typhi NCTC 786, sedangkan untuk vektor digunakan plasmid
pUC19 dalam bentuk DNA sehingga tidak membutuhkan
isolasi plasmid. Berdasarkan gambar 1 (Hasil isolasi DNA

Gambar 1. Hasil isolasi DNA kromosom

kromosom) diketahui bahwa proses isolasi sudah berhasil

dengan baik walaupun pada hasil isolasi DNA bakteri Salmonella Typhi NCTC 786 masih banyak
terdapat smear, adanya DNA kromosom yang diinginkan ditandai dengan tebalnya band DNA

yang terbentuk dengan panjang fragmen DNA Escherichia coli ATCC 25922 dan Salmonella
Typhi NCTC 786 adalah sekitar 1000 bp-2500 bp dengan marker adalah DNA ladder Vivantis.
DNA yang berhasil disolasi dan plasmid kemudian
dilanjutkan dengan tahap PCR. Proses PCR ini bertujuan
untuk mengamplifikasi sekuen DNA spesifik dengan proses
pemanjangan primer pada untai

DNA komplementer

menggunakan primer LacZ 465 bp. Primer ini berfungsi
untuk mengawali proses amplifikasi dan untuk membatasi
fragmen DNA target yang akan diamplifikasi secara
Gambar 2. Hasil PCR DNA kromosom dan
plasmid

spesifik, digunakan PCR 465 pb sebagai primer parsial
untuk menandai daerah yang diamplifikasi sehingga

didapatkan hasil berupa DNA yang memiliki lacZ 465 bp. Berdasarkan gambar 2 (Hasil PCR
DNA kromosom dan plasmid) diketahui bahwa sampel DNA Escherichia coli ATCC 25922 dan
plasmid pUC19 berhasil diamplifikasi, terlihat dengan adanya fragmen DNA Escherichia coli
ATCC 25922 dengan ukuran sekitar 500 bp-1000 bp dan fragmen plasmid pUC19 dengan ukuran
100 bp- 500 bp. Hal ini mengindikasikan bahwa DNA yang diisolasi merupakan DNA yang
memiliki lacZ 465 bp.
Setelah diketahui bahwa DNA dan plasmid yang digunakan memiliki gen lacZ 465 bp maka
dilakukan proses restriksi dan ligasi untuk membuat DNA rekombinan. Proses restriksi dan ligasi
bertujuan untuk memotong DNA dan plasmid kemudian menyambungkan DNA dan plasmid
hingga menjadi DNA rekombinan menggunakan enzim restriksi. Pembuatan DNA rekombinan
menggunakan beberapa perlakuan yaitu dengan perlakuan kromosom+BamHI+EcoRI,
plasmid+BamHI+EcoRI, kromosom+BamHI, plasmid+BamHI dan uncut untuk proses restriksi
dan dilanjutkan dengan proses ligasi. Digunakan enzim T4 ligase yang akan menggabungkan
fragmen DNA dengan plasmid

yang mempunyai ujung tidak rata(sticky end) yang saling

berkomplemen dan ujung rata(blunt end).
Pembuatan sel kompeten dilakukan dengan harapan mendapatkan sel inang yang memiliki
efisiensi transformasi yang tinggi. Digunakan bakteri Escherichia coli DH5α karena menurut
Brown (1991)bakteri Escherichia coli DH5α dapat tumbuh dengan cepat dalam medium
pengayaan.
Tahap selanjutnya adalah penyisipan DNA rekombinan dalam sel kompeten yaitu
Escherichia coli DH5α (transformasi) menggunakan metode heat shock (Sambrook et al., 2001).

DNA rekombinan diperlakukan dengan suhu 42°C(heat shock) selama 90 detik. Menurut Brown
(1991) pemanasan menimbulkan gradien panas yang menyebabkan aliran yang mengalir ke dalam

sel yang memungkinkan DNA masuk ke dalam sel. Bakteri hasil transformasi diinokulasi pada
media LBA yang diberi perlakuan yang berbeda, hasil proses transformasi dapat dilihat ada tabel
1 (Hasil transformasi).
Kontrol positif berupa sel kompeten yang ditumbuhkan ada medium LBB

terdapat

pertumbuhan bakteri Escherichia coli DH5α yang munjukkan bahwa sel kompeten mampu
tumbuh di medium LBB dan tidak terjadi kontaminasi. Kontrol negatif berupa sel kompeten yang
diinokulasi pada medium B yang mengandung LBB+ampicillin tidak terdapat pertumbuhan
bakteri karena bakteri Escherichia coli DH5α tidak mempunyai gen resisten pada antibiotik
ampicillin.

Gambar 3. Sel kompeten dalam
medium C

Gambar 4. Sel kompeten dalam
medium B

Hasil identifikasi yang dilakukan menunjukan bahwa proses transformasi belum berhasil,
ditandai melalui seleksi DNA transforman yang membawa DNA rekombinan target tidak resisten
terhadap antibiotik ampicillin dan terseleksi dengan α-komplementasi ( Wong, 1997). Menurut
Brooker (2005) sel inang yang berhasil mentransformasi plasmid dapat tumbuh membentuk koloni
pada medium agar dengan antibiotik, sedangkan sel yang tanpa plasmid tidak akan tumbuh karrena
rentan terhadap ampicillin.

Gambar 5. BamHI dalam medium A

Gambar 6. BamHI dalam medium B

Keterangan : tidak terdapat pertumbuhan bakteri DNA rekombinan yang dipotong dengan enzim
BamHI

Gambar 7. BamHI+EcoRI dalam
medium A

Gambar 8. BamHI+EcoRI dalam
medium B

Keterangan: tidak terdapat pertumbuhan bakteri DNA rekombinan yang dipotong dengan enzim
BamHI+EcoRI.
Seharusnya yang diharapkan terdapat pertumbuhan koloni putih-biru pada plate medium A
dengan perlakuan hasil DNA rekombinan yang dipotong dengan enzim BamHI dan enzim
BamHI+EcoRI yang menunjukkan kerja gen lacZ 465 bp yang mengekpresikan β-galaktosidase.
Pada vektor plasmid pUC19 terdapat multiple cloning site (MCS) yang terdapat gen LacZ 465 bp.
Hasil rekombinan jika ditransformasikan ke sel kompeten maka insert akan merusak gen LacZ
465 bp sehingga gen tersebut tidak dapat diekspresikan. Ekspresi gen LacZ 465 bp ditunjukkan
dengan terbentuknya enzim β-galaktosidase yang dengan adanya inducer IPTG akan mengurai
substrat X-Gal sehinga terbentuk indol yang merubah warna koloni menjadi biru. Rusaknya gen
LacZ 465 bp akan tersisipi oleh insert yang menyebabkan tidak terbentuk enzim β-galaktosidase
sehingga X-Gal tidak dapat terurai, indol tidak terbentuk dan koloni tetap berwarna putih.
Pertumbuhan koloni pada medium C tidak sesuai dengan harapan. Koloni yang tumbuh
hanya berwarna putih dan tidak ada koloni biru. Tidak dapat dipastikan bahwa koloni tersebut
merupakan koloni rekombinan karena tidak terdapat koloni biru sebagai pembanding. Jumlah
koloni putih lebih besar daripada koloni biru mengindikasikan tingkat keberhasilan rekombinan
yang tinggi. seharusnya, hasil yang diperoleh adalah cawan petri yang dipadati oleh koloni-koloni
dengan variasi warna putih dan biru.

BAB IV
KESIMPULAN

Proses kloning yang dilakukan pada praktikun ini belum berhasil dengan baik. Hal ini dapat
diketahui dari hasil identifikasi yang menunjukkan bahwa pertumbuhan koloni hanya berwarna
putih dan belum bisa dipastikan apakah hasil rekombinan berhasil karena tidak adanya
pertumbuhan koloni yang berwarna biru sebagai pembanding. Keberhasilan kloning DNA
dipengaruhi oleh kerberhasilan setiap tahapan proses yang dilakukan yaitu isolasi DNA, PCR,
restriksi, ligasi, pembuatan sel kompeten, transformasi dan blue and white screening.

DAFTAR PUSTAKA

Brock, T. D. M.T. Madigan & J. Martinko.1994. Biology Of Microorganism, New Jersey.
Prentice –Hall. seventh edition
Brown, T.A.1991. Pengantar Kloning Gen. Alih Bahasa : Soemiati, A.M. Yayasan Essentia
Medika. Yogyakarta.
Campbell, N.A., Reece, J.B. and Mitchell,L.G.2002. Biologi Edisi kelima jilid 1 . Jakarta :
Erlangga.
Sambrook J,Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. New York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Snustad, D.P. and Simmons, M.J. 2012. Principles of genetics sixth edition. Wiley.
Tamarin, R.H., 2001, Principles of Genetics, Seventh editions, The McGraw-Hill
Companies.
Twyman R.M. 1998. Advenced molecular biology. Singapore : Bios Scientific Publisher,
Springer-Verlag.

LAMPIRAN

E.coli ATCC (sel) dalam medium A

E.coli ATCC (sel) dalam medium B

ddH2O dalam medium A
ddH2O dalam medium B

BamHI dalam medium C

Vektor dalam medium B

E.coli ATCC (sel) dalam medium C

ddH2O dalam medium C

BamHI+EcoRI dalam medium C

Vektor dalam medium A

Vektor dalam medium C

Insert dalam medium A

Insert dalam medium B

Insert dalam medium C

Sel kompeten dalam medium A