Kloning tanaman apoptin GFP pada tembaka
STRATEGI KLONING
APOPTIN + GFP PADA
TANAMAN TEMBAKAU
DENGAN
AGROBACTERIUM
Vina Damayanti
Ambar Maresya
Kelompok 5
Claudia Maya
1306412180
1306370865
1306370796
Seffiani
1306370783
Getta Austin
(1306405364)
Itamar Pascana S
1306371016
Rekayasa Genetika
Teknologi Bioproses Fakultas
Teknik
Universitas Indonesia
Depok
STRATEGI KLONING
APOPTIN + GFP PADA TANAMAN
TEMBAKAU DENGAN
AGROBACTERIUM
Modifikasi Gen
endo-1,4-betaD-glucanase
Pemilihan
Vektor Puc19
Pemilihan
Host E.Coli
ER2275
Pemilihan
Restriction Site
pada Plasmid
Transformasi
menggunakan
Triparental
Mating
TRANSFORMASI
PLASMID KE ECOLI DENGAN
METODE HEAT
SHOCK + CACL2
Modifikasi
Gen Apoptin
Penyisipan GFP
ke dalam
Plasmid
Introduksi ke
Tanaman
Tembakau
(Nicotiana
tabacum L.)
Seleksi
Strategi Modifikasi Gen
endo-1,4-beta-D-glucanase
Endo-1,4-beta-D-glucanase
• Endo-1,4-β-D-glucanases (EGS) merupakan
enzim spesifik yang mengkatalisis reaksi
hidrolisis dari selulosa. Enzim ini dapat berasal
dari fungi, bakteri, dan protozoa.
• Specific activity: ~80 U/mg (40oC, pH 4.5,
CM-cellulose 4M as substrate)
Pemilihan Vektor pUC19
Banyak digunakan sebagai vektor untuk kloning dalam E.coli
pUC19 diisolasi dari E. coli strain ER2272
Memiliki circular double stranded DNA dan mempunyai 2686
bp (base pairs).
Mudah ditransfeksikan kedalam E coli dengan metode yang
sederhana dan relatif murah (seperti heat shock)
Dapat dengan cepat bereplikasi dan mudah diseleksi dengan
metode white/blue color selection (Yanisch-Perron, 1985;
Chung, et al., 1989).
Pemilihan Host E.Coli ER2275
Host cell ini merupakan sel inang
yang cocok sebagai growth strain
bagi vektor plasmid pUC19 dan
sangat cocok dijadikan media
transformasi.
1. Transformasinya efisien, strain ini
memiliki tingkat efisiensi tinggi.
2. Disablement yang baik, memiliki
penanda (marker).
3. Dapat membuat replikasi plasmid
berjalan dengan stabil.
Peta Plasmid pUC19 beserta Restriction Site nya
Memiliki origin of replication, sebagai syarat replikasi. Vektor pUC19 memiliki yang namanya oriV
Mempunyai dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inangnya nanti. Gen
marker ini dapat ditandai dengan amphicilin dan blue-white screening.
Ukuran yang sesuai, memiliki ukuran yang relatif kecil dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga
dapat dengan mudah melintasinya.
Memiliki multiple cloning site (MCS) dalam menjalankan fungsinya. Sekuen Multiple cloning site berada
pada bagian 5 dari lacZ gene yang mengkodekan untuk amino, bagian N terminal dari beta-galactosidase
(LacZ) dari E.coli.
Pemilihan Restriction Site pada Plasmid
• Untuk melakukan cloning DNA insert ke dalam vector cloning, dibutuhkan dua enzim
restriksi yang berbeda untuk membentuk ujung yang kompatibel.
• Enzim yang digunakan menghasilkan ujung yang kohesif atau sticky ends untuk
memastikan bahwa penggabungan insert berada pada arah yang benar. Enzim yang
dipilih diusahakan agar tidak menghasilkan potongan yang komplemen satu sama
lainnya (compatible end) sehingga arah penyisipan fragmen dapat terbalik.
• Restriction Site yang dipilih adalah BamHI pada ujung 5‟ dan EcoRI pada ujung 3 ‟.
BamHI (GGATCC) dan EcoRI (GAATTC) memiliki ujung sticky end (kohesif) dan
tidak terdapat dalam sekuens gen endo-1,4-beta-D-glucanase
Penyisipan GFP ke dalam Plasmid
GFP (Green Fluorescence Protein)
• Asal : Ubur-ubur Aequoria victoria
• Memancarkan warna Hijau pada 509 nm.
• Sequence :
1 MSKGEELFTG VVPILVELDG
DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFICTT
51GKLPVPWPTL VTTFSYGVQC
FSRYPDHMKQ HDFFKSAMPE GYVQERTIFF
101 KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV
NRIELKGIDF
KEDGNILGHK
LEYNYNSHNV
151 YIMADKQKNG IKVNFKIRHN
IEDGSVQLAD
HYQQNTPIGD
GPVLLPDNHY
201 LSTQSALSKD
PNEKRDHMVL LEFVTAAGIT
HGMDELYK
Lokasi penyisipan GFP
• Daerah
bialophos/phosphinothric
in-resistance (BiPR)
dipotong dan disisipi
dengan gen GFP.
• Restriction Site :
BlPI di ujung 5’
MauB1 di ujung 3’
PCR
• Forward Primer
5’- GC TGAGC ATG AGC AAA GGA GAA G3’
Length : 23 bp
GC Content : 52 %
Melting Temperatur : 57,1 °C
• Reverse Primer
5’- GC GCGCGC TTT ATA GAG CTC AT-3’
Length : 22 bp
GC Content : 55 %
Melting Temperatur : 56,7 °C
Modifikasi Gen Apoptin
Modifikasi Gen Apoptin
Pencarian Sekuens Gen Apoptin
Pemilihan Situs Restriksi pada vektor
GFP
Pembuatan Primer forward dan
reverse
PCR
Modifikasi Gen Apoptin
Sekuens Gen Apoptin
Desain modifikasi gen Apoptin
5’
3’
3’
5’
Modifikasi Gen Apoptin
1. Forward primer
Desain forward primer yaitu
3’
5’
5’-ATGAACGCTCTCCAAGAAGAT-3’
Dari data primer diatas, dapat di cari perkiraan berikut:
Tm = 60°C, sesuai dengan Tm yang baik harus sama atau diatas 60°C
%GC = 42,85%, sesuai dengan kandungan GC dalam primer harus berada
diantara 40 - 60%
Modifikasi Gen Apoptin
1. Reverse primer
Desain reverse primer yaitu
3’
5’
3’- GTCAGAATATGTGGAAGAACATT-5’
5’-TTACAGTCTTATACACCTTCTTG-3’
Dari data primer diatas, dapat di cari perkiraan berikut:
Tm = 80°C, sesuai dengan Tm yang baik harus diatas 60°C
%GC = 42,6%, sesuai dengan kandungan GC dalam primer harus berada diantara
40 - 60%
Modifikasi Gen Apoptin
Hakikat dari amplifikasi dengan PCR adalah penggantian beberapa
enzim yang biasa terdapat dalam sel dengan pemanasan dan
pendinginan sampel. Amplifikasi PCR terdiri dari beberapa
rangkaian proses, yaitu:
a. Denaturasi: yaitu pemutusan ikatan hidrogen DNA pada suhu 95 oC
b. Annealing: yaitu proses penempelan primer pada template DNA pada
suhu 55-60oC
c. Sintesis DNA: di mana Tag Polymerase melakukan sintesis pada DNA
yang baru dibentuk pada suhu 72oC
Hasil PCR
TRANSFORMASI PLASMID KE E-COLI DENGAN
METODE HEAT SHOCK + CACL2
Binary Vector
Menggunakan binary vector
(berisi region T-DNA) dan Tiplasmid (berisi gen virulensi) yang
terpisah
Binary vector memiliki T-DNA yang
berisi gene of interest, serta
penanda seleksi untuk bakteri &
tanaman
Binary
vector
Binary vector kemudian ditransform
ke dalam E. coli dan ditransfer ke A.
tumefaciens yang telah memiliki Tiplasmid non-aktif berisi gen virulensi
melalui suatu metode
E. coli
Mengapa CaCl2?
• Beberapa bakteri memiliki
spesialisasi protein
membran untuk membawa
DNA ke dalam sel mereka
• Ca merangsang
penyerapan DNA ke dalam
bakteri
Sekarang plasmid berada di dalam, lalu tambahkan media Super Optimal broth with
Catabolite repression (SOC)
SOC media menutrisi Ecoli untuk tumbuh dan membelah
Plasmid juga akan membelah didalam Ecoli
Jika plasmid yang bereproduksi, mereka akan menyediakan sel Ecoli dengan resistensi
amp sehingga mereka dapat tumbuh di medium mengandung ampicilin
Hanya sel yang tertransformasi yang dapat tumbuh
Proses Replikasi didalam E-coli
Video
Transformasi menggunakan Triparental
Mating
Dalam Triparental
Mating digunakan 3
macam bakteri yaitu:
Bakteri E. Coli yang
mengandung plasmid
pGreen II 0229
(mrngandung gen
apoptin yang telah di
tambahkan GFP)
Bakteri E.coli HB 101
yang mengandung
helper pRK 2013
A. Tumefaciens
E. coli yang
membawa
pGreen II 0229
ditumbuhkan
dalam media LB
padat yang
mengandung
antibiotik
kanamisin 50
mg/ kemudian
diinkubasi pada
suhu 37ºC
selama 16 jam
. E. coli yang
membawa
plasmid helper
ditumbuhkan
pada media LB
padat dengan
penambahan
antibiotik
kanamisin 50
mg/L
Bakteri A.
Tumefaciens
ditumbuhkan
dalam media LB
padat yang
mengandung
antibiotik 50
mg/L tetrasiklin
dan diinkubasi
pada suhu 28ºC
selama 32 jam.
Setelah dilakukan
inkubasi, biakan
diambil satu gores
dan dilarutkan
didalam 1 ml media
LB cair. Biakan
dicampur di media
LB padat dengan
memasukkan 20 μl
secara berurutan
E.coli yang
membawa pGreen II
0229, E. coli yang
membawa helper
pRK 2013 dan A.
tumefaciens. Biakan
diinkubasi pada suhu
28ºC selama 32 jam.
Kemudian, masingmasing biakan
diambil satu gores
dan dilarutkan
dalam medium LB
cair. Selanjutnya,
masing-masing
biakan dicampur
secara
berurutan: E.coli yan
g mengandung
pGreen II
0229, E.coli HB
101, A. tumefaciens.
Lalu, diinkubasi
selama 32 jam pada
suhu 28°C.
Untuk memastikan
perpindahan gen
apoptin ini, maka
biakan di ambil satu
gores lalu
diencerkan dan di
ambil sekitar 10 μl
dari hasil
pengenceran
disebarkan dalam
media seleksi LB +
50 mg/L kanamisin
+ 50 mg/L tetrasiklin
dan diinkubasi pada
suhu 28ºC selama
32 jam.
Introduksi ke Tanaman Tembakau (Nicotiana
tabacum L.)
Strategi Introduksi ke Tanaman Tembakau
(Nicotiana tabacum L.)
Satu koloni Agrobacterium tumifaciens yang positif membawa
plasmid ekspresi rekombinan ditumbuhkan pada media, suhu
28ºC selama 48 jam.
Kultur bakteri disentrifus pada 4000 rpm selama 10 menit.
Pelet diresuspensikan dengan 10 ml larutan MS + vitamin B5
dan mengandung 200 µM asetosiringone lalu diinkubasi
goyang dengan kecepatan 150 rpm selama 2-3 jam atau
sampai OD600 = 0.3.
Sumber eksplan tembakau yang digunakan adalah daun tembakau hasil
perbanyakan kultur in-vitro.
Daun yang dipakai untuk infeksi adalah daun ke-2 dan 3 dari pucuk. Lembaran
daun dipotong dengan ukuran 1 cm x 1 cm, dimasukkan ke dalam suspensi
Agrobacterium tumifaciens
lalu diinkubasikan pada kondisi tanpa cahaya (gelap), suhu 28°C, penggoyangan
dengan kecepatan 75 rpm selama 15 menit. Potongan daun dikeringkan
menggunakan tissue steril lalu ditanam pada media ko-kultivasi yang di atasnya
telah diberi kertas saring steril.
Inkubasi dilakukan di ruangan gelap pada suhu 28ºC selama 1 hari. Potongan daun
dicuci dengan larutan MS sebanyak 2 kali dan larutan MS+250 µg/ml cefotaksim
sebanyak 2 kali.
Potongan daun yang sudah bersih ditanam di media eliminasi dan diinkubasi
selama 5 hari di ruang kultur jaringan.
Mekanisme infeksi Agrobacterium ke dalam sel tanaman meliputi
tiga tahap, sebagai berikut (Day dan Lichtenstein, 1992).
Penempelan
Agrobacterium pada
daun tanaman
Pengenalan
Agrobacterium
dengan molekul
sinyal yang
dihasilkan oleh sel
tanaman yang
terluka, kemudian
secara kemotaksis
Agrobacterium
bergerak dan
menempel pada sel
tanaman.
Agrobacterium tumefaciens
colonizing tobacco leaves
Gen-gen vir pada
plasmid Ti merespon
molekul sinyal yang
dihasilkan oleh sel
tanaman dan
selanjutnya
menginduksi
ekspresi gen-gen vir
untuk memotong
rantai tunggal T-DNA
dan
memindahkannya ke
dalam inti sel
tanaman.
T-DNA terintegrasi ke
dalam genom
tanaman dan gengen pada T-DNA
diekspresikan dalam
sel tanaman.
Ekspresi gen-gen onc
(oncogen)
menyebabkan sel
berproliferasi,
sedangkan ekspresi
gen-gen opin
bertanggungjawab
untuk sintesis derivat
asam amino opin
Seleksi
Metode Seleksi
Gen penyeleksi
berguna untuk menyeleksi dan/atau membedakan sel, jaringan,
organ atau tanaman yang tertransformasi dari yang tidak
tertransformasi.
Apa itu GFP ?
Green (hijau) fluorescent (sinar) Protein
(protein)
Sekelompok protein dengan struktur mirip satu sama lain yang pendaran
warna hijau apabila disorot/dipapar dengan cahaya biru di rentang untraviolet
Aequorea victoria
Struktur GFP
Metode Seleksi
http://www.dnaftb.org/34/problem.html
Klik
Seleksi Kalus
Tahapan Seleksi Kalus dengan Metode Goerge dan Sherington
Kalus tembakau hasil transformasi dimultiplikasi pada medium MS ditambah NAA
kadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 1 mg/L + kanamisin 100 ug/mL sebagai marker
seleksi.
Diamati persentase hidup eksplan, tinggi eksplan (mm), dan jumlah daun yang
ditampilkan dalam bentuk histogram untuk menunjukkan tingkat multiplikasi
eksplan.
Seluruh tahapan multiplikasi dan induksi dilakukan dalam kondisi aseptis dan
diinkubasi pada pencahayaan sekitar 1000 lux (dengan transmission light) fase
gelap 8 jam dan fase terang 16 jam serta suhu 25-280C selama 8 minggu.
Daftar Pustaka
• Anonim. (2014). [Online] Tersedia pada :
https://shareok.org/bitstream/handle/11244/10441/Michael%20ukp
ong%20dissertation%20final_submit1.pdf?sequence=2
diakses pada 3 oktober 2015 pukul 11.49 WIB
• Anonim. (2014).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC202241/?page=2 .
[Online] Tersedia pada : diakses pada 3 oktober 2015 pukul 11.52
WIB
• Oswald, Nick. 2007. Choosing a Competent E.coli Strain, [online],
tersedia pada diakses pada 3 oktober 2015 pukul 13.25 WIB
• S.B. Primrose, R.M. Twyman, and R.W. Old. 2001.Principles of Gene
Manipulation 6th edition. UK : Blackwell publishing
APOPTIN + GFP PADA
TANAMAN TEMBAKAU
DENGAN
AGROBACTERIUM
Vina Damayanti
Ambar Maresya
Kelompok 5
Claudia Maya
1306412180
1306370865
1306370796
Seffiani
1306370783
Getta Austin
(1306405364)
Itamar Pascana S
1306371016
Rekayasa Genetika
Teknologi Bioproses Fakultas
Teknik
Universitas Indonesia
Depok
STRATEGI KLONING
APOPTIN + GFP PADA TANAMAN
TEMBAKAU DENGAN
AGROBACTERIUM
Modifikasi Gen
endo-1,4-betaD-glucanase
Pemilihan
Vektor Puc19
Pemilihan
Host E.Coli
ER2275
Pemilihan
Restriction Site
pada Plasmid
Transformasi
menggunakan
Triparental
Mating
TRANSFORMASI
PLASMID KE ECOLI DENGAN
METODE HEAT
SHOCK + CACL2
Modifikasi
Gen Apoptin
Penyisipan GFP
ke dalam
Plasmid
Introduksi ke
Tanaman
Tembakau
(Nicotiana
tabacum L.)
Seleksi
Strategi Modifikasi Gen
endo-1,4-beta-D-glucanase
Endo-1,4-beta-D-glucanase
• Endo-1,4-β-D-glucanases (EGS) merupakan
enzim spesifik yang mengkatalisis reaksi
hidrolisis dari selulosa. Enzim ini dapat berasal
dari fungi, bakteri, dan protozoa.
• Specific activity: ~80 U/mg (40oC, pH 4.5,
CM-cellulose 4M as substrate)
Pemilihan Vektor pUC19
Banyak digunakan sebagai vektor untuk kloning dalam E.coli
pUC19 diisolasi dari E. coli strain ER2272
Memiliki circular double stranded DNA dan mempunyai 2686
bp (base pairs).
Mudah ditransfeksikan kedalam E coli dengan metode yang
sederhana dan relatif murah (seperti heat shock)
Dapat dengan cepat bereplikasi dan mudah diseleksi dengan
metode white/blue color selection (Yanisch-Perron, 1985;
Chung, et al., 1989).
Pemilihan Host E.Coli ER2275
Host cell ini merupakan sel inang
yang cocok sebagai growth strain
bagi vektor plasmid pUC19 dan
sangat cocok dijadikan media
transformasi.
1. Transformasinya efisien, strain ini
memiliki tingkat efisiensi tinggi.
2. Disablement yang baik, memiliki
penanda (marker).
3. Dapat membuat replikasi plasmid
berjalan dengan stabil.
Peta Plasmid pUC19 beserta Restriction Site nya
Memiliki origin of replication, sebagai syarat replikasi. Vektor pUC19 memiliki yang namanya oriV
Mempunyai dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inangnya nanti. Gen
marker ini dapat ditandai dengan amphicilin dan blue-white screening.
Ukuran yang sesuai, memiliki ukuran yang relatif kecil dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga
dapat dengan mudah melintasinya.
Memiliki multiple cloning site (MCS) dalam menjalankan fungsinya. Sekuen Multiple cloning site berada
pada bagian 5 dari lacZ gene yang mengkodekan untuk amino, bagian N terminal dari beta-galactosidase
(LacZ) dari E.coli.
Pemilihan Restriction Site pada Plasmid
• Untuk melakukan cloning DNA insert ke dalam vector cloning, dibutuhkan dua enzim
restriksi yang berbeda untuk membentuk ujung yang kompatibel.
• Enzim yang digunakan menghasilkan ujung yang kohesif atau sticky ends untuk
memastikan bahwa penggabungan insert berada pada arah yang benar. Enzim yang
dipilih diusahakan agar tidak menghasilkan potongan yang komplemen satu sama
lainnya (compatible end) sehingga arah penyisipan fragmen dapat terbalik.
• Restriction Site yang dipilih adalah BamHI pada ujung 5‟ dan EcoRI pada ujung 3 ‟.
BamHI (GGATCC) dan EcoRI (GAATTC) memiliki ujung sticky end (kohesif) dan
tidak terdapat dalam sekuens gen endo-1,4-beta-D-glucanase
Penyisipan GFP ke dalam Plasmid
GFP (Green Fluorescence Protein)
• Asal : Ubur-ubur Aequoria victoria
• Memancarkan warna Hijau pada 509 nm.
• Sequence :
1 MSKGEELFTG VVPILVELDG
DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFICTT
51GKLPVPWPTL VTTFSYGVQC
FSRYPDHMKQ HDFFKSAMPE GYVQERTIFF
101 KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV
NRIELKGIDF
KEDGNILGHK
LEYNYNSHNV
151 YIMADKQKNG IKVNFKIRHN
IEDGSVQLAD
HYQQNTPIGD
GPVLLPDNHY
201 LSTQSALSKD
PNEKRDHMVL LEFVTAAGIT
HGMDELYK
Lokasi penyisipan GFP
• Daerah
bialophos/phosphinothric
in-resistance (BiPR)
dipotong dan disisipi
dengan gen GFP.
• Restriction Site :
BlPI di ujung 5’
MauB1 di ujung 3’
PCR
• Forward Primer
5’- GC TGAGC ATG AGC AAA GGA GAA G3’
Length : 23 bp
GC Content : 52 %
Melting Temperatur : 57,1 °C
• Reverse Primer
5’- GC GCGCGC TTT ATA GAG CTC AT-3’
Length : 22 bp
GC Content : 55 %
Melting Temperatur : 56,7 °C
Modifikasi Gen Apoptin
Modifikasi Gen Apoptin
Pencarian Sekuens Gen Apoptin
Pemilihan Situs Restriksi pada vektor
GFP
Pembuatan Primer forward dan
reverse
PCR
Modifikasi Gen Apoptin
Sekuens Gen Apoptin
Desain modifikasi gen Apoptin
5’
3’
3’
5’
Modifikasi Gen Apoptin
1. Forward primer
Desain forward primer yaitu
3’
5’
5’-ATGAACGCTCTCCAAGAAGAT-3’
Dari data primer diatas, dapat di cari perkiraan berikut:
Tm = 60°C, sesuai dengan Tm yang baik harus sama atau diatas 60°C
%GC = 42,85%, sesuai dengan kandungan GC dalam primer harus berada
diantara 40 - 60%
Modifikasi Gen Apoptin
1. Reverse primer
Desain reverse primer yaitu
3’
5’
3’- GTCAGAATATGTGGAAGAACATT-5’
5’-TTACAGTCTTATACACCTTCTTG-3’
Dari data primer diatas, dapat di cari perkiraan berikut:
Tm = 80°C, sesuai dengan Tm yang baik harus diatas 60°C
%GC = 42,6%, sesuai dengan kandungan GC dalam primer harus berada diantara
40 - 60%
Modifikasi Gen Apoptin
Hakikat dari amplifikasi dengan PCR adalah penggantian beberapa
enzim yang biasa terdapat dalam sel dengan pemanasan dan
pendinginan sampel. Amplifikasi PCR terdiri dari beberapa
rangkaian proses, yaitu:
a. Denaturasi: yaitu pemutusan ikatan hidrogen DNA pada suhu 95 oC
b. Annealing: yaitu proses penempelan primer pada template DNA pada
suhu 55-60oC
c. Sintesis DNA: di mana Tag Polymerase melakukan sintesis pada DNA
yang baru dibentuk pada suhu 72oC
Hasil PCR
TRANSFORMASI PLASMID KE E-COLI DENGAN
METODE HEAT SHOCK + CACL2
Binary Vector
Menggunakan binary vector
(berisi region T-DNA) dan Tiplasmid (berisi gen virulensi) yang
terpisah
Binary vector memiliki T-DNA yang
berisi gene of interest, serta
penanda seleksi untuk bakteri &
tanaman
Binary
vector
Binary vector kemudian ditransform
ke dalam E. coli dan ditransfer ke A.
tumefaciens yang telah memiliki Tiplasmid non-aktif berisi gen virulensi
melalui suatu metode
E. coli
Mengapa CaCl2?
• Beberapa bakteri memiliki
spesialisasi protein
membran untuk membawa
DNA ke dalam sel mereka
• Ca merangsang
penyerapan DNA ke dalam
bakteri
Sekarang plasmid berada di dalam, lalu tambahkan media Super Optimal broth with
Catabolite repression (SOC)
SOC media menutrisi Ecoli untuk tumbuh dan membelah
Plasmid juga akan membelah didalam Ecoli
Jika plasmid yang bereproduksi, mereka akan menyediakan sel Ecoli dengan resistensi
amp sehingga mereka dapat tumbuh di medium mengandung ampicilin
Hanya sel yang tertransformasi yang dapat tumbuh
Proses Replikasi didalam E-coli
Video
Transformasi menggunakan Triparental
Mating
Dalam Triparental
Mating digunakan 3
macam bakteri yaitu:
Bakteri E. Coli yang
mengandung plasmid
pGreen II 0229
(mrngandung gen
apoptin yang telah di
tambahkan GFP)
Bakteri E.coli HB 101
yang mengandung
helper pRK 2013
A. Tumefaciens
E. coli yang
membawa
pGreen II 0229
ditumbuhkan
dalam media LB
padat yang
mengandung
antibiotik
kanamisin 50
mg/ kemudian
diinkubasi pada
suhu 37ºC
selama 16 jam
. E. coli yang
membawa
plasmid helper
ditumbuhkan
pada media LB
padat dengan
penambahan
antibiotik
kanamisin 50
mg/L
Bakteri A.
Tumefaciens
ditumbuhkan
dalam media LB
padat yang
mengandung
antibiotik 50
mg/L tetrasiklin
dan diinkubasi
pada suhu 28ºC
selama 32 jam.
Setelah dilakukan
inkubasi, biakan
diambil satu gores
dan dilarutkan
didalam 1 ml media
LB cair. Biakan
dicampur di media
LB padat dengan
memasukkan 20 μl
secara berurutan
E.coli yang
membawa pGreen II
0229, E. coli yang
membawa helper
pRK 2013 dan A.
tumefaciens. Biakan
diinkubasi pada suhu
28ºC selama 32 jam.
Kemudian, masingmasing biakan
diambil satu gores
dan dilarutkan
dalam medium LB
cair. Selanjutnya,
masing-masing
biakan dicampur
secara
berurutan: E.coli yan
g mengandung
pGreen II
0229, E.coli HB
101, A. tumefaciens.
Lalu, diinkubasi
selama 32 jam pada
suhu 28°C.
Untuk memastikan
perpindahan gen
apoptin ini, maka
biakan di ambil satu
gores lalu
diencerkan dan di
ambil sekitar 10 μl
dari hasil
pengenceran
disebarkan dalam
media seleksi LB +
50 mg/L kanamisin
+ 50 mg/L tetrasiklin
dan diinkubasi pada
suhu 28ºC selama
32 jam.
Introduksi ke Tanaman Tembakau (Nicotiana
tabacum L.)
Strategi Introduksi ke Tanaman Tembakau
(Nicotiana tabacum L.)
Satu koloni Agrobacterium tumifaciens yang positif membawa
plasmid ekspresi rekombinan ditumbuhkan pada media, suhu
28ºC selama 48 jam.
Kultur bakteri disentrifus pada 4000 rpm selama 10 menit.
Pelet diresuspensikan dengan 10 ml larutan MS + vitamin B5
dan mengandung 200 µM asetosiringone lalu diinkubasi
goyang dengan kecepatan 150 rpm selama 2-3 jam atau
sampai OD600 = 0.3.
Sumber eksplan tembakau yang digunakan adalah daun tembakau hasil
perbanyakan kultur in-vitro.
Daun yang dipakai untuk infeksi adalah daun ke-2 dan 3 dari pucuk. Lembaran
daun dipotong dengan ukuran 1 cm x 1 cm, dimasukkan ke dalam suspensi
Agrobacterium tumifaciens
lalu diinkubasikan pada kondisi tanpa cahaya (gelap), suhu 28°C, penggoyangan
dengan kecepatan 75 rpm selama 15 menit. Potongan daun dikeringkan
menggunakan tissue steril lalu ditanam pada media ko-kultivasi yang di atasnya
telah diberi kertas saring steril.
Inkubasi dilakukan di ruangan gelap pada suhu 28ºC selama 1 hari. Potongan daun
dicuci dengan larutan MS sebanyak 2 kali dan larutan MS+250 µg/ml cefotaksim
sebanyak 2 kali.
Potongan daun yang sudah bersih ditanam di media eliminasi dan diinkubasi
selama 5 hari di ruang kultur jaringan.
Mekanisme infeksi Agrobacterium ke dalam sel tanaman meliputi
tiga tahap, sebagai berikut (Day dan Lichtenstein, 1992).
Penempelan
Agrobacterium pada
daun tanaman
Pengenalan
Agrobacterium
dengan molekul
sinyal yang
dihasilkan oleh sel
tanaman yang
terluka, kemudian
secara kemotaksis
Agrobacterium
bergerak dan
menempel pada sel
tanaman.
Agrobacterium tumefaciens
colonizing tobacco leaves
Gen-gen vir pada
plasmid Ti merespon
molekul sinyal yang
dihasilkan oleh sel
tanaman dan
selanjutnya
menginduksi
ekspresi gen-gen vir
untuk memotong
rantai tunggal T-DNA
dan
memindahkannya ke
dalam inti sel
tanaman.
T-DNA terintegrasi ke
dalam genom
tanaman dan gengen pada T-DNA
diekspresikan dalam
sel tanaman.
Ekspresi gen-gen onc
(oncogen)
menyebabkan sel
berproliferasi,
sedangkan ekspresi
gen-gen opin
bertanggungjawab
untuk sintesis derivat
asam amino opin
Seleksi
Metode Seleksi
Gen penyeleksi
berguna untuk menyeleksi dan/atau membedakan sel, jaringan,
organ atau tanaman yang tertransformasi dari yang tidak
tertransformasi.
Apa itu GFP ?
Green (hijau) fluorescent (sinar) Protein
(protein)
Sekelompok protein dengan struktur mirip satu sama lain yang pendaran
warna hijau apabila disorot/dipapar dengan cahaya biru di rentang untraviolet
Aequorea victoria
Struktur GFP
Metode Seleksi
http://www.dnaftb.org/34/problem.html
Klik
Seleksi Kalus
Tahapan Seleksi Kalus dengan Metode Goerge dan Sherington
Kalus tembakau hasil transformasi dimultiplikasi pada medium MS ditambah NAA
kadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 1 mg/L + kanamisin 100 ug/mL sebagai marker
seleksi.
Diamati persentase hidup eksplan, tinggi eksplan (mm), dan jumlah daun yang
ditampilkan dalam bentuk histogram untuk menunjukkan tingkat multiplikasi
eksplan.
Seluruh tahapan multiplikasi dan induksi dilakukan dalam kondisi aseptis dan
diinkubasi pada pencahayaan sekitar 1000 lux (dengan transmission light) fase
gelap 8 jam dan fase terang 16 jam serta suhu 25-280C selama 8 minggu.
Daftar Pustaka
• Anonim. (2014). [Online] Tersedia pada :
https://shareok.org/bitstream/handle/11244/10441/Michael%20ukp
ong%20dissertation%20final_submit1.pdf?sequence=2
diakses pada 3 oktober 2015 pukul 11.49 WIB
• Anonim. (2014).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC202241/?page=2 .
[Online] Tersedia pada : diakses pada 3 oktober 2015 pukul 11.52
WIB
• Oswald, Nick. 2007. Choosing a Competent E.coli Strain, [online],
tersedia pada diakses pada 3 oktober 2015 pukul 13.25 WIB
• S.B. Primrose, R.M. Twyman, and R.W. Old. 2001.Principles of Gene
Manipulation 6th edition. UK : Blackwell publishing