Bioreaksi pada buah pisang docx

LAPORAN
PRAKTIKUM BIOREAKSI
METABOLISME PROTEIN PADA PEMATANGAN BUAH PISANG

Disusun Oleh:
Denok Risky Ayu Paramita 101810301015
Luluk Masnia

101810301032

Binti Risalatul Muawanah 101810301033

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2013

I. Judul
Metabolisme Protein Pada Pematangan Buah Pisang
II. Tujuan

 Mempelajari proses bioreaksi yang terjadi pada pematangan buah pisang.
III. Dasar Teori
Pisang Ambon yang masak mempunyai komposisi kimia antara lain
adalah: kadar gula 88,28%, gula reduksi 5,44%, sukrosa 1,05%, pati 0,84%,
protein 0,68%, pektin 0,93%, protopektin 0,21%, lemak 0,53%, serat kasar 1,28%,
dan abu 1,33%. Metabolisme protein dalam pemasakan buah pisang dapat
diketahui berdasarkan kadar enzim yang berperan dalam proses pematangan buah
pisang. Kadar protein yang dimaksud adalah jumlah total enzim yang berperan
dalam proses pemasakan buah pisang.
Pemasakan buah pisang adalah suatu proses biokimia yang bersifat
degradasi dan sintesis. Kedua proses biokimia ini terjadi baik di kulit maupun di
daging buah. Proses biokimia yang terjadi pada kulit pisang menyebabkan
perubahan tekstur buah sehingga buah menjadi lunak. Pada kulit pisang, senyawa
yang mengalami degradasi adalah senyawa pektin, selulosa, hemiselulosa dan
klorofil. Senyawa pada daging buah yang mengalami perubahan kimiawi adalah
amilum. Amilum diubah menjadi glukosa dan fruktosa melalui proses
metabolisme dengan bantuan enzim-enzim.
Perubahan warna merupakan perubahan yang paling menonjol selama
pemasakan buah pisang. Hal ini dikarenakan hilangnya klorofil dan menyebabkan
timbulnya karatenoid yang berwarna kuning. Enzim yang berperan dalam proses

ini yaitu enzim klorofilase. Selain itu, terdapat pula enzim peroksidase yang
menyebabkan terbentuknya bercak-bercak coklat pada kulit buah pisang yang
terlalu matang. Sedangkan enzim-enzim yang mengalami kenaikan aktivitas
selama proses pemasakan dan ada hubungannya dengan tekstur buah adalah
enzim pektinesterase, enzim poligalakturonase, dan protopektinase. Enzim-enzim
tersebut berperan dalam pengubahan susunan kimia dinding sel yang
menyebabkan tekstur buah menjadi lunak.

Perubahan utama yang terjadi pada pematangan daging buah pisang yaitu
berkurangnya pati dan bertambahnya kadar gula total dalam bentuk glukosa,
fruktosa, dan sukrosa. Degradasi amilum menjadi kadar gula ini disebabkan oleh
enzim-enzim yang berperan dalam penimbunan sukrosa di sitosol. Kenaikan
akumulasi sukrosa berkorelasi dengan aktivitas enzim sukrosa fosfat sintase,
enzim sukrosa sintase dan enzim invertase.
Elektroforesis

merupakan

metode

pemisahan

untuk

karakterisasi

makromolekul, berat molekul, dan penetapan kemurnian protein. Teknik ini
didasarkan atas pergerakan molekul- molekul seperti DNA, RNA, dan protein
yang bermuatan dalam suatu medan listrik. SDS-PAGE merupakan salah satu
teknik ektroforesis yang menggunakan poliakrilamida sebagai bahan pemisahan.
Prinsip kerja dari teknik SDS-PAGE yaitu membuat sampel analisis bermuatan
sama sehingga muatan tidak memengaruhi pergerakan komponen sampel dalam
gel. Pemisahan sampel dilakukan dengan memasukkan sampel dalam sumur gel
dan akan melewati matriks gel berdasarkan berat molekulnya dalam suatu medan
listrik.
IV. Metodologi Percobaan
4.1 Alat
-

Kain kasa 15 x 15 cm

Tabung reaksi
Rak tabung reaksi
Botol semprot
Neraca Analitik
Blender
Pisau
Labu Ukur 100 mL
Labu ukur 50 mL
Labu ukur 25 mL
Gelas Ukur 100 mL
Beaker Glass 150 mL
Beaker glass 1000 mL
Sentrifuge
Tabung Sentrifuge
Pipet Mohr 10 mL
Pipet mikro 1 mL
Pipet volume 10 mL

2 helai
6 buah

1 buah
1 buah

1 buah
1 buah
1 buah
2 buah
4 buah
1 buah
10 buah
2 buah
1 buah
1 buah

-

Pipet Tetes
3 buah
Ball pipet
1 buah

Corong
1 buah
Erlenmeyer 150 mL
2 buah
Erlenmeyer 50 mL
1 buah
Erlenmeyer 1000 mL
1 buah
pH meter
Penangas
Batang Pengaduk
Spatula
Oven
Stopwatch
Wadah botol atau tabung eppendrof
Aparatus elektroforesis horizontal
Cetakan gel 20x16x1 cm3
Pembungkus plastik
Nampan plastik
Stirrer magnetik

Lemari es
Penjepit besi
Microwave

3 buah
1 set
1 buah
3 buah
1 set
1 buah

4.2 Bahan
-

Buah pisang mentah dengan warna kulit hijau dan tekstur keras,
setengah matang dengan kulit buah kuning dan teksturnya keras, dan

-

matang dengan warna kulit buah kuning dan tekstur lunak

Ammonium Sulfat
Larutan NaCl 5%
Aquades
Aquademin
Larutan Buffer Tris-HCl pH 7
Larutan 2M Buffer Tris-HCl pH 8,8
Larutan 1M Buffer Tris-HCl pH 6,8
Larutan SDS 10%
Larutan Gliserol 50%
Gel elektroforesis: gel poliakrilamida
Indikator bromfenol blue 1%
Larutan HCl 1%
Larutan HCl pekat
Larutan buffer elektroforesis
TEMED (sebagai senyawa radikal yang mempolimerisasi gel
poliakrilamid)

-

Amonium persulfat (senyawa radikal yang mempolimerisasi gel

-

poliakrilamid)
Larutan sigmacote atau vaselin
Larutan Comassie gel staining 1 Liter
Larutan Comassie blue gel staining 1 Liter
Larutan Resolving gel/gel bawah
Larutan Stacking gel/ gel atas

4.3 Metode Percobaan
Metode percobaan yang dilakukan pada praktikum bioreaksi protein pada
pemasakan daging buah pisang ambon ini antara lain:
a. Penyiapan bahan
b. Penyiapan dan perlakuan sampel
c. Pemisahan enzim
d. Pengukuran BM enzim dengan elektroforesis
a. Penyiapanbahan
1. Pemilihan bahan
Buah pisang yang dipilih adalah buah pisang yang mentah dengan

tekstur keras, setengah matang dengan kulit buah kuning dan
teksturnya keras, dan matang dengan warna kulit buah kuning dan
tekstur lunak
2. Membuat larutan 600 mL NaCl 5%. Selanjutnya diletakkan dalam
lemari es.
3. Membuat 500 ml larutan buffer Tris-HCL.
a.

Pengenceran Tris
-

Ditimbang 0,6 gr Tris lalu dimasukkan ke dalam beker glass.

-

Diencerkan menjadi 50 mL dengan aquades.

b.

Pengenceran HCl

-

Diambil 1,98 mL HCl 12,6 M.

-

dimasukkan ke dalam beker glass.

-

Diencerkan menjadi 250 mL dengan aquades.

c.

Pembuatan Buffer
-

Dimasukkan larutan Tris yang sudah dibuat sebelumnya ke
dalam beker glass.

-

Ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M sampai menunjukkan
pH yang diinginkan yaitu pH 7.

b. Penyiapan sampel dan perlakuan sampel
1. Buah pisang dikupas dan dipisahkan dari kulit buah pisang.
2. Diambil daging buah pisang secukupnya
3. Daging buah dipotongkecil dan ditambahkan larutan NaCl 5% dingin
dengan perbandingan (1:9) kemudian diblender sampai mencair dan
halus. Proses ini perlu dijaga jangan sampai suhu meningkat diatas
4.

10oC.
Cairan hasil blender, didiamkan sampai terbentuk dua fase (bagian

5.

endapan dan larutan).
Larutan dari slory di sentrifuse kecepatan max 4000 rpm selama max

20 menit.
c. Pemisahan enzim
1. Pemisahan enzim berdasarkan BM
Pemisahan enzim didasarkan BM yang mengendap dalam medium
amonium sulfat.
2. Pemisahan enzim dalam medium (NH4)2SO4 18%, dilakukan dengan
cara sentrifugasi supernatan (kecepatan 8000rpm selama20 menit).
3. Pelet 1 yang dihasilkan dicuci dengan buffer Tris-HCl.
4. Supernatan 1 dipindahkan kedalam tabung dan ditambah lagi
(NH4)2SO4 menjadi 28% kemudian disentrifugasi kembali (kecepatan
8000rpm selama 20 menit).
5. Pelet 2 yang dihasilkan dicuci dengan buffer Tris-HCL.
d. Analisis enzim dengan elektroforesis
A. Menyiapkan Bahan Kimia
a. Preparasi2M Tris-HCl (pH 8,8)


Campurkan ke dalam beaker glass 24,2 gramTris dan 50 mL



aquademin.
Masukkan dalam gelas beaker dan ukur pH larutan dengan pH



meter sambil diaduk dengan stirrer.
Tambahkan beberapa mL HCl sampai pH larutan sama dengan
8,8.

b.Preparasi1M Tris-HCl (pH 6,8)



Campurkan ke dalam beaker glass 12,1 gramTris dan 50 mL



aquademin.
Masukkan dalam gelas beaker dan ukur pH larutan dengan pH



meter sambil diaduk dengan stirrer.
Tambahkan beberapa mL HCl sampai pH larutan sama dengan
6,8.

c. Larutan akrilamida
 Campurkan ke dalam beaker glass 29,2 gram akrilamida dan 0,8
bis akrilamida.
Larutkan dengan

sampai

total

volumenya 100 mL.
d. Larutan B (separating gel buffer)
 Campurkan 75 mL 2M tris-HCl (pH 8,8), 4 mL 10% SDS
 Larutkan dengan menambahkan aquademin sampai

total

volumenya 100 mL.
e. Larutan C (gel buffer)
 Campurkan 50 mL 1M tris-HCl (pH 6,8), 4 mL 10% SDS
 Larutkan dengan menambahkan aquademin sampai

total

volumenya 100 mL.
f. Buffer Elektroforesis
 Campurkan 3 gram tris, 14,4 gram glisin, dan 1 gram SDS
 Larutkan dengan menambahkan aquademin sampai

total



menambahkan

aquademin

volumenya 1 mL.
g. Buffer untuk sampel
 Campurkan 0,6 mL 1M tris HCl (pH 6,8), 5 mL gliserol, 2 mL


SDS, 0,512 mercapthenol, dan 1 mL 1% bromfenol blue
Larutkan dengan menambahkan aquademin sampai

total

volumenya 10 mL.
h. Comassie gel staining
 Larutkan 1 gram comassie, 450 mL methanol, 450 aquademin, dan
100 mL asam asetat hingga diperoleh total volume1 L.
i. Comassie blue gel destain
 Campurkan 100 mL methanol, 100 mL asam asetat, dan 800 mL
hingga diperoleh total volume1 L.
j. Resolving gel/ gel bawah



Campurkan aquademin 1,67 mL, 1,25 mL larutan tris-HCl (pH
8,8) (larutan B), 0,05 mL 10% SDS, 2mL akrilamida bis (larutan

A), 50 µL 10 % ammonium persulfat, dan 5 µL TEMED
k. Stacking gel/gel atas
 Campurkan aquademin 1,525 mL, 0,625 mL larutan tris-HCl
(pH 6,8) (larutan C), 0,325 mL akrilamida (larutan A), 0,025µL
10% SDS, 50 µL 10 % ammonium persulfat, dan 5 µL TEMED
B. Preparasi Sampel
a. Larutan sampel dilarutkan dalam Tris-HCl buffer yang mengandung
SDS sesuai dengan kebutuhan.
b. Tambahkan buffer sampel dengan perbandingan sesuai kemampuan
sumur (20µL-40µL) per sumur
c. Tunggu selama 10 menit
C. Prosedur Pembuatan Gel Elektroforesis
a. Membersihkan semua peralatan elektroforesis dengan menggunakan
etanol, lap dengan tisu jangan sampai ada bekas minyak atau debu
yang menempel
b. merangkai alat elektroforesis serta mengetes dengan aquades
sehingga tidak terjadi kebocoran
c. Menyiapkan bahan kimia serta sampel yang akan diinjekkan
d. Mencampur sampel dengan buffer sampel yang telah disiapkan
dengan konsentrasi persampel 20µL-40µL
e. Membuat resolving gel (gel bawah) dengan komposisi yang telah
ditetapkan
f. Menunggu gel bawah sampai benar-benar kering dan kuat selama
±30 menit
g. Setelah gel bawah terbentuk, dilanjutkan dengan membuat gel atas
dengan komposisi seperti diatas
h. Menunggu selama ±30 menit agar gel atas terbentuk
i. Setelah gel atas dan bawah terbentuk isi sumur
j. Menginjek sumur-sumur dengan sampel dan standar yang telah
diketahui kadar proteinnya dengan volume 20µL-40µL
k. Memasukkan buffer elektroforesis ke dalam tendon secara hati-hati
sehingga sumur terisi buffer elektroforesis
l. Menutup alat elektroforesis kemudian melakukan running dengan
daya 100 mA selama ±30menit

m. Menjaga agar selama proses running sampel tidak sampai hanyut ke
dalam buffer elektroforesis
n. Menghentikan proses running, melepas sumber arus listrik,
mengeluarkan buffer elektroforesis, dan membongkar peralatan
o. Melepas gel dari kaca secara hati-hati dengan memasukkan ke
dalam aquades
p. Melakukan pewarnaan gel dengan commasie blue staining selama
3-5 menit
q. Mencuci dengan aquademin 2-3 kali
r. Menghilangkan warna dengan larutan destaining yang telah dibuat
selama 2-3 kali
s. Membiarkan gel di dalam larutan destaining selama 24 jam sambil
digoyang-goyang
t. Melakukan pembacaan pita protein yang tampak (menandakan sub
unit atau fraksi protein).

Cara membuktikan:

Daging Buah Pisang
Dipotong kecil-kecil
Ditambah larutan NaCl 5%
Diblender
Didiamkan
Disentrifuse

Supernatan

Pelet

Ditambahkan Ammonium sulfat 18%
Disentrifuse
Supernatan 1

Pelet 1
Ditambahkan Ammonium sulfat 28%
Disentrifuse

Supernatan 2

Pelet 2

Diuji menggunakan
elektroforesis

V. Pembahasan
Sampel yang digunakan dalam percobaan ini didasarkan pada perbedaan
tingkat kematangan buah pisang yang dapat dilihat dari warna kulit buah pisang.
Perbedaan tingkat kematangan akan mengindikasikan perbedaan bioreksi di
dalamnya. Pisang yang digunakan adalah pisang gajih mentah (warna kulit buah
hijau), setengah matang (warna kulit buah hijau kekuningan), dan matang (warna
kulit buah kuning).

Gambar 1. Pisang yang digunakan pada percobaan
Penyiapan sampel diawali denganmengupas kulit buah pisang. Selanjutnya
diambil daging buah pisang secukupnya. Daging buah dipotong kecil dan
ditambahkan larutan NaCl 5% dingin dengan perbandingan (1:9). Campuran buah
pisang dengan larutan NaCl disimpan dalam freezer selama 24 jam. Fungsi
penambahan NaCl 5 % adalah sebagai pelarut enzim agar enzim terdispersi
sempurna. Campuran buah pisang dengan larutan NaCl 5% dingin diblender
untuk mengeluarkan enzim-enzim dari dalam sel. Keadaan dingin diberikan untuk
menonaktifkan enzim agar enzim tidak rusak karena panas dari proses blender.

Gambar 2. proses pemblenderan buah pisang
Enzim yang terdapat pada buah pisang diisolasi dengan cara sentrifuge. Pada
proses sentrifuge akan dihasilkan ekstrak kasar dari enzim. Pemurnian enzim
dilakukan melalui fraksinasi bertahap menggunakan ammonium sulfat. Tujuan
pemurnian bertahap ini adalah untuk dapat menghasilkan enzim yang tingkat
kemurniannya semakin tinggi.
Sampel yang telah diblender dipisahkan dari seratnya dengan cara filtrasi
menggunakan kain kasa.Filtrat yang dihasilkan disentrifugasi dengan kecepatan
4000 rpm selama 20 menit.

Gambar 3. Proses penyaringan, filtrat yang dihasilkan, dan proses sentrifugasi
Proses sentrifugasi menghasilkan pelet dan supernatan. Supernatan ditambahkan
amonium sulfat18% sebagai medium pengendap enzim – enzim yang terdapat
pada daging buah pisang.Amonium sulfat(NH4)2SO4menyebabkan larutan enzim
mengalami peristiwa salting out yaitu daya larut dari protein berkurang sehingga
enzim terpisah sebagai endapan.Kemudian larutan disentrifuse kembali dengan
kecepatan 8000 rpmselama 20 menit. Sentrifuse akan menghasilkan supernatan 1
dan pelet 1. Supernatan 1 diambil dan disisihkan. Pelet 1 yang ada di dinding
tabung sentrifuse diambil dengan cara dikerok dengan spatula dan dilarutkan
dalam buffer tris-HCl. Pelet 1 disimpan dalam lemari es agar enzim tidak rusak
dan digunakan untuk analisis selanjutnya. Gambar pelet 1adalah sebagai berikut:

Gambar 4. Pelet 1 sampel pisang mentah, setengah matang, dan matang
Supernatan 1 ditambahkan amonium sulfat 28% dan disentrifuge dengan
kecepatan 8000 rpm selama 20 menit. Penambahan ammonium sulfat 28%
dilakukan karena dalam supernatan 1dimungkinkan masih terdapat enzim yang

terdispersi. Hasil yang diperoleh yakni supernatan 2 dan pelet 2. Pelet 2 dilarutkan
dalam buffer Tris-HCl serta disimpan dalam lemari es untuk analisis selanjutnya.

Gambar 5. Pelet 2 sampel pisang mentah, setengah matang, dan matang
Analisis enzim yang terdapat dalam buah pisang dilakukan dengan teknik
elektroforesisSDS-PAGE

(SodiumDodecyl

Sulfate–PolyacrylamidaGel

Electrophoresis). Prinsip dasar dari metode ini yaitu pemisahan protein melalui
gel poliakrilamida dengan menyeragamkan muatan protein terlebih dahulu
sehingga migrasi protein tidak dipengaruhi besarnya muatan, namun didasarkan
pada ukuran dan berat molekulnya.
Preparasi sampel untuk elektroforesis dilakukan dengan pelarutan pada
larutan buffer yang mengandung tris HCl (pH 6,8), gliseroluntuk menambah berat
sampel sehingga akan mudah bermigrasi ke gel bawah, SDS untuk mendenaturasi
sampel protein dan memberikan

muatan negatif , mercapthenol untuk

memutuskan ikatan disulfide dari struktur protein, dan bromfenol blue sebagai
larutan pewarna untuk menandai kemajuan proses elektroforesis dan menentukan
kapan saatnya harus menghentikan proses.

Gambar 6. Proses preparasi sampel
Langkah awal dari karakterisasi ini adalah membuat gel elektroforesis. Gel
elektroforesis befungsi sebagai matriks penyangga untuk mencegah terjadinya
difusi akibat timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamida
dibuat dari polimerisasi acrilamida dan bis-akrilamida. Bis-akrilamida berperan
sebagai cross-linking agent sehingga larutan akrilamida membentuk gel. Besarnya
pori-pori gel bergantung pada konsentrasi akrilamida dan bis akrilamida yang
digunakan. Semakin besar konsentrasi bis-akrilamida maka semakin kecil ukuran
pori-pori gel. Perbandingan konsentrasi ini merupakan perbandingan yang standar
dan sesuai antuk analisis protein enzim.
Gel poliakrilamida (PAGE) yang sudah dibuat dicampur dengan suatu
detergen anion sodium dodesil sulfat (SDS). Penggunaan poliakrilamida
mempunyai keunggulan dengan gel lainnya, karena tidak bereaksi dengan sampel
dan tidak membentuk matrik dengan sampel, sehingga tidak menghambat
pergerakan sampel yang memungkinkan pemisahan protein secara sempurna,
selain itu mempunyai daya pemisahan yang cukup tinggi.
Gel elektroforesis terdiri dari gel atas (stacking gel) dan gel bawah
(resolving gel). Stacking gel terletak pada bagian atas, digunakan untuk mencetak
sumur (sekat pemisah untuk penempatan sempel). Gel bawah (resolving gel)
merupakan gel yang komposisinya paling banyak dan terletak dibagian bawah.
Gel bawah (resolving gel) berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan berat
molekulnya.Gel atas dan gel bawah dibuat dengan reagen-reagen yang sama tetapi
berbeda komposisinya dan pH dari tris-HCl. Gel dibuat dari campurkan
aquademin sebagai pelarut, larutan tris-HCl (pH 6,8), akrilamida, SDS,
ammonium persulfat dan TEMED sebagai radikal bebas untuk proses polimerisasi

akrilamida. Gel bawah ditambah bis akrilamida yang berfungsi sebagai croslinking agent pada gel dan memiliki komposisi akrilamida yang lebih banyak. Gel
poliakrilamidadibuat menggunakan cetakan gel membentuk lembaran segiempat
dengan ketebalan tertentu.

Gambar 7. Proses pembuatan gel poliakrilamida
Sampel protein dimasukkan pada sumur-sumur di gel bagian atas,
menggunakan pipet mikro dengan volume injeksi 20-40 µL. Penginjeksian sampel
harus dilakukan pada posisi tengah agar sampel tidak masuk pada sumur
disebelahnya.

Gambar 8. Proses penginjekkan sampel
Buffer elektroforesis ke dalam tandon secara hati-hati sehingga sumur
terisi buffer elektroforesis. Fungsi penambahan buffer adalah untuk meningkatkan
kekuatan ion di dalam larutan. Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan,
maka aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi protein sangat lambat.

Gambar 9. Proses penambahan buffer
Selanjutnya dilakukan proses running untuk memulai proses elektroforesis.

Gambar 10. Proses running
Running dilakukan pada daya 100 mA dan 200 V selama ±30 menit. Tujuan
dilakukannya running adalah untuk menyeparasi SDS-lapisan protein yang
bermuatan negatif sehingga akan berimigrasi ke gel dasar (anoda) di bawah
pengaruh medan listrik. Sampel protein yang telah terdenaturasi dan bermuatan
negatif karena pemberian SDS akan bermigrasi ke arah kutub positif (anoda) pada
bagian bawah ketika diberikan arus. Jarak yang ditempuh sampel protein
ditentukan

oleh

ukuran

molekul

dalam

menembus

pori-pori

gel

poliakrilamida.Semakin kecil molekul tersebut, makin jauh jarak yang ditempuh.
Bagian atas dan bawah gel saat running harus terendam buffer elektroforesis
karena sistem yang digunakan dalam elektroforesis yaitu wet sistem dan
digunakan arus listrik, jika salah satu bagiannya tidak terendam maka arus listrik
tidak dapat mengalir.Setelah proses running selesai, sumber arus listrik

dilepas,mengeluarkan

buffer

elektroforesis,

dan

membongkar

peralatan.

Selanjutnya melepas gel dari kaca secara hati-hati dengan memasukkan ke dalam
aquades.

Gambar 11.

Proses

pelepasan

gel dari

kaca
Gel

yang

telah

dilepaskan

selanjutnya

dilakukan

pewarnaan

menggunakan commasie blue staining selama 3-5 menit. Tujuan penambahan
commasie

blue

stainingadalah

untuk

memvisualisasi

enzim

hasil

elektroforesis.Commassieblue stainingakan terikat pada protein dan membuat
bagian gel yang berisi fraksi protein akan berwarna biru. Gel tersebut direndam
dalam larutan pewarna selama 3-5 menit sambil digoyang-goyang:

Gambar 12. Proses pewarnaan gel
Untuk menghilangkan warna, maka ditambahkan dengan larutan destaing selama
2-3 kali. Gel direndam ke dalam larutan destaining selama semalam (24 jam)
sambil digoyang-goyang.

Gambar 13. Proses pencucian warna pada gel dan proses penggoyangan
Setelah 24 jam dilakukan perendaman, tahapan terakhir adalah melakukan
pembacaan pita protein yang tampak (menandakan sub unit atau fraksi protein).
Hasil percobaan menunjukkan spot yang terlihat jelas adalah spot dari
sampel BSA. Hasil ini kurang sesuai dengan yang diharapkan karena spot untuk
sampel dari pelet daging pisang dan beberapa sampel protein (putih telur dan
glisin) tidak dapat terdeteksi. Indikasi ketidaksesuaian hasil percobaan adalah
pada gel yang digunakan. Hal ini dikarenakan, sampel menunjukkan hasil uji

positif terhadap reagen biuret.
Gambar 14. Hasil pengujian dengan biuret
Berdasarkan hasil ini maka, ada indikasi komposisi gel yang digunakan
kurang sesuai untuk sampel yang dianalisis. Secara teori, apabila komposisi
TEMED dan APS terlalu banyak dapat menyebabkan protein teroksidasi dan
perubahan pada buffer, sedangkan pemakaian APS yang terlalu sedikit dapat
memperlambat reaksi sehingga polimerisasi akan berjalan lambat. Pemilihan
konsentrasi gel yang tepat juga menentukan keberhasilan pemisahan fraksi protein

karena menentukan besar pori-pori matriks gel, makin tinggi konsentrasi gel maka
pori yang terbentuk semakin kecil.
Gambar 15. Spot BSA pada gel poliakrilamida
Komposisi akrilamida dan bis-akrilamida sangat mempengaruhi besarnya
pori-pori gel poliakrilamida yang terbentuk. Berdasarkan hasil spot yang
diperoleh, dapat diketahui bahwa komposisi akrilamida dan bis-akrilamida yang
digunakan kurang sesuai untuk sampel yang digunakan. Hal ini dikarenakan, tidak
terbentuk spot pemisahan dari sampel ekstrak enzim daging pisang dan sampel

yang mengandung protein (putih telur dan glisin). Apabila diamati dari kondisi
sekitar sumur, terdapat warna biru di dasar sumur. Hal ini menunjukkan bahwa
terdapat sampel protein di tempat masuknya sumur. Spot sampel tidak terdapat
dalam gel karena ukuran pori-pori gel terlalu kecil sehingga sampel protein tidak
dapat menembus pori dari del poliakrilamida. Ukuran BSA yang kecil (berat
molekul 66 kDa) menyebabkan BSA dapat masuk ke dalam dan membentuk spot
dalam gel. Dengan demikian, diperlukan komposisi akrilamid dan bis-akrilamida
yang sesuai dengan ukuran dari sampel yang akan di analisis agar spot yang
terbentuk dapat diidentifikasi dan dibedakan dengan jelas.
VI. Kesimpulan
Beberapa kesimpulan yang diperoleh dalam percobaan ini diantaranya:
1) Pemurnian enzim pada buah pisang dilakukan dengan fraksinasi bertingkat
pada medium amonium sulfat.
2) Identifikasi protein dilakukan dengan SDS-PAGE yang dapat memisahkan
protein berdasarkan muatan dan ukuran dari molekul.

3) Spot protein enzim pada pisang tidak dapat terbentuk.
4) Komposisi gel memengaruhi keberhasilan percobaan.