Uji Brine Shrimp Lethality test [BST] fraksi air brokoli [Brassica oleracea Var. italica] beserta profil Kromatografi Lapis Tipis [KLT] - USD Repository

  

UJI BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BST) FRAKSI AIR

BROKOLI (Brassica oleracea var. italica)

BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :

  Sinta Kiranawati NIM : 028114070

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

  Ia membaringkan aku di padang yang berumput hijau, Ia membimbing aku ke air yang tenang; Ia menyegarkan jiwaku. Ia menuntun aku di jalan yang benar oleh karena nama-Nya.

  Mazmur 23:2-3 Orang yang paling sempurna bukanlah orang dengan otak yang sempurna melainkan orang yang dapat mempergunakan sebaik-baiknya dari bagian otaknya yang kurang sempurna

• Aristoteles *

  Kupersembahkan skripsi ini untuk :

Bapak & Ibuku tercinta sebagai tanda hormat dan baktiku

Kakak-kakakku (Mas Aji, Mba Dewi, dan Mba Ika) Almamaterku

  

PRAKATA

  Puji dan syukur penulis haturkan kepada Bapa Yang Maha Kasih atas limpahan karunia dan kasih yang diberikannya selama proses penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul Uji Brine Shrimp Lethality Test (BST) Fraksi Air Brokoli (Brassica oleracea var. italica) beserta Profil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) sehingga dapat terselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) dari Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  Selama pelaksanaan penelitian hingga terselesaikannya penyusunan skripsi ini, penulis tidak dapat lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh sebab itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen pembimbing yang dengan penuh kesabaran dan ketulusan memberikan petunjuk, saran dan perhatian selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi ini. 3. dr. Luciana Kuswibawati, M.Kes., selaku dosen penguji yang telah bersedia menguji, memberikan saran dan masukan yang sangat berguna dalam penyelesaian skripsi ini.

  4. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah bersedia menguji, memberikan saran dan masukan yang sangat berguna dalam penyelesaian skripsi ini.

  5. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing akademik yang telah membantu selama proses perkuliahan.

  6. Segenap dosen dan karyawan yang telah membantu selama penyelesaian skripsi ini.

  7. Bapak dan ibuku tercinta atas segala kasih, kesabaran, perhatian, semangat dan doa yang telah dicurahkan kepadaku.

  8. Kakak-kakak terbaikku (Mas Aji, Mba Dewi, dan Mba Ika) atas dukungan, perhatian, bantuan, kasih dan doanya.

  9. Danang Eka Saputra atas ketulusan hati, kasih, kesabaran, bantuan dan keceriaan yang selalu menghiasi hari-hariku.

  10. Pak Lik Gendro beserta keluarga atas bantuannya mencari tanaman brokoli serta dukungan dan doanya.

  11. Ayu dan Prima atas kebersamaan kita dalam suka dan duka selama penelitian, dan yang selalu memberiku semangat, perhatian dan bantuan.

  12. Fifi, Yuni, Kristin, Wira, Titin, Rosa dan Devi ’03 atas bantuan dan kebersamaan selama penelitian di laboratorium.

  13. Lena yang telah membantuku selama penelitian menggunakan larva udang, Ulin, Lia ’03, Puri, Asti, Wenny, Tjun Liong, Didit, Peter, Beni, Yinni, Rika, Lian, Elay, dan Devi atas bantuan yang sangat berharga.

  14. Teman-teman kelompok C atas kekompakan, keceriaan, dan kerjasamanya, serta teman-teman angkatan 2002 atas kebersamaannya.

  15. Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Andri, Pak Mukmin, Mas Parlan, dan Mas Kunto, atas bantuan yang sangat berguna selama proses penelitian di laboratorium.

  16. Teman-teman “Kost Mawar”: Alin dan Mina atas persahabatan, perhatian dan bantuannya, Ica dan Mba Yessy atas dukungannya, Yogi, Agnes, Ika, Mei, Mba Virgin, Raras, Tina, Anas, Ana, Nana, Diah, Cici, Ani, Sisil, Ferry, Ata, Evrin, dan Putri atas keceriaan dan kebersamaannya.

  Dengan segala kerendahan hati, penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun. Akhir kata, penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan perkembangan ilmu pengetahuan.

  Penulis

  

INTISARI

  Brokoli (Brassica oleracea var. italica) merupakan tumbuhan yang dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai sayuran. Alil isotiosianat diketahui bersifat antikanker karena dapat menghambat pertumbuhan sel kanker serta menginduksi apoptosis. Brokoli mengandung alil isotiosianat dalam konsentrasi yang tinggi. Suatu senyawa antikanker memiliki toksisitas tertentu sehingga dapat membunuh sel kanker. Maka dari itu, perlu dilakukan uji Brine Shrimp Lethality Test (BST) untuk mengetahui efek toksik fraksi air brokoli yang dinyatakan oleh LC 50 .

  Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian post test only control group design. Pengujian efek toksik brokoli dibuat dalam bentuk fraksi air, karena alil isotiosianat memiliki kelarutan dalam air. Fraksi air diperoleh dengan cara brokoli dibuat jus dengan penambahan air kemudian disaring. Hasil penyaringan tersebut ditambah dengan pelarut kloroform untuk mengambil senyawa yang tidak larut air, kedua pelarut kemudian dipisahkan sehingga didapatkan fraksi air dan fraksi kloroform. Fraksi air dibuat seri konsentrasi 320; 580; 1000; 1900; dan 3400 µg/ml. Hewan uji yang digunakan adalah 10 larva Artemia salina LEACH (artemia) dengan replikasi lima kali dan dibandingkan dengan kontrol negatif untuk tiap-tiap seri konsentrasi. Data diperoleh dengan menghitung jumlah artemia yang mati setelah 24 jam perlakuan. Nilai LC dihitung dengan metode analisis probit. Nilai LC < 1000

  50 50 µg/ml dinyatakan memiliki efek toksik.

  Hasil uji toksisitas dengan metode (BST) diperoleh nilai LC

  50 untuk fraksi

  air adalah 631 µg/ml. Dari hasil tersebut maka fraksi air memiliki efek toksik terhadap larva artemia. Setelah dilakukan uji kualitatif dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dapat diketahui bahwa dalam fraksi air brokoli terkandung senyawa kimia alil isotiosianat.

  Kata kunci : Brassica oleracea var. italica, uji Brine Shrimp Lethality Test (BST), fraksi air, LC , Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dan alil

  50 isotiosianat.

  

ABSTRACT

  Broccoli (Brassica oleracea var. italica) is a kind of vegetable. Alyl Isothiocyanates is an anticancer that can supress the growth of cancer cells also induce apoptosis. Broccoli contain of alyl isothiocyanates in high concentration.

  Anticancer compound have certain toxicity that can kill cancer cell. Therefore, it is necessary to do Brine Shrimp Lethality Test (BST) to know the toxic effect of water fraction from broccoli stated by LC 50 .

  This research was the pure experimental with post test only control group design. The broccoli’s toxic effect test was made in the form of water fraction based on solubility from alyl isothiocyanates. Water fractions were obtained by juiceing and filtering the broccoli, and then it was added by chloroform to remove the compound that do not have solubility in water. It was separated to get water fraction and chloroform fraction. Water fraction was made concentration series 320; 580; 1000; 1900; dan 3400 µg/ml. The animal testee that was used are 10

  

Artemia salina LEACH (artemia) larvae with 5 times of replication and it is

  compared with negative control for each concentration series. Datas are obtained by counting the amount of dead artemia after 24 hours. The value of LC

  50 is

  counted by probit analysis method. The value of LC

  50 < 1000 µg/ml has toxic effect.

  The result toxicity test from BST show LC from water fraction was 631

  50

  µg/ml. The result shows that water fraction has toxic effect on artemia larvae. The qualitatif test with Thin Layer Chromatography (TLC) shows that water fraction of broccoli contain alyl isothiocyanates.

  Key words : Brassica oleracea var. italica, Brine Shrimp Lethality Test (BST), water fraction, LC

  50 , Thin Layer Chromatography (TLC), and alyl isothiocyanates.

  DAFTAR ISI Halaman

  HALAMAN JUDUL .................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... iv PRAKATA.................................................................................................... v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... viii

  INTISARI ..................................................................................................... ix

  ABSTRACT .................................................................................................... x

  DAFTAR ISI................................................................................................. xi DAFTAR TABEL......................................................................................... xv DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xvii

  BAB I. PENDAHULUAN............................................................................ 1 A. Latar Belakang ................................................................................ 1

  1. Perumusan masalah.................................................................... 2

  2. Keaslian Penelitian..................................................................... 3

  3. Manfaat Penelitian ..................................................................... 3

  B. Tujuan Penelitian............................................................................. 3

  BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA .......................................................... 4 A. Brokoli ............................................................................................ 4

  2. Morfologi dan Habitat Tanaman Brokoli................................... 4

  2. Penggunaan Artemia salina LEACH pada Metode BST ........... 13

  I. Landasan Teori ................................................................................. 22 J. Hipotesis ........................................................................................... 23

  H. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .................................................... 21

  G. Toksisitas ........................................................................................ 21

  F. Siklus Sel ......................................................................................... 20

  E. Apoptosis ......................................................................................... 18

  2. Karsinogenesis ........................................................................... 17

  1. Pengertian Kanker...................................................................... 16

  D. Kanker ............................................................................................. 16

  1. Pengertian BST .......................................................................... 13

  3. Kandungan Kimia ...................................................................... 5

  C. Brine Shrimp Lethality Test (BST) ................................................. 13

  5. Lingkungan Hidup Artemia ....................................................... 12

  4. Cara Makan Artemia.................................................................. 11

  3. Perkembangbiakan dan Siklus Hidup Artemia .......................... 10

  2. Tahap Perkembangan Larva Artemia ........................................ 8

  1. Keterangan Zoologi ................................................................... 8

  B. Artemia............................................................................................ 8

  4. Khasiat dan Kegunaan ............................................................... 7

  BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .................................................... 24 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...................................................... 24

  B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ................................. 24

  1. Variabel Penelitian..................................................................... 24

  2. Definisi Operasional .................................................................. 24

  C. Bahan Penelitian.............................................................................. 25

  D. Alat Penelitian................................................................................. 26

  E. Tata Cara Penelitian ........................................................................ 26

  1. Determinasi Tanaman ................................................................ 26

  2. Pengumpulan Bahan dan Penyarian........................................... 27

  3. Pembuatan Air Laut Buatan....................................................... 27

  4. Penetasan Siste Artemia............................................................. 28

  5. Penentuan Nilai LC dengan Metode BST ............................... 28

  50

  6. Identifikasi Alil Isotiosianat dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ...................................................................... 30

  F. Analisis Hasil................................................................................... 31

  BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN............................. 32 A. Determinasi Tanaman ..................................................................... 32 B. Pengumpulan Bahan........................................................................ 32 C. Pembuatan Fraksi Air Brokoli......................................................... 33 D. Pembuatan Air Laut Buatan ............................................................ 33 E. Penetasan Siste Artemia .................................................................. 34 F. Penentuan Nilai LC dengan Metode BST..................................... 36

  50 G. Uji Kualitatif Fraksi Air dengan Metode KLT ............................... 44

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................... 50

  A. Kesimpulan ..................................................................................... 50

  B. Saran................................................................................................ 50 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 51 LAMPIRAN.................................................................................................. 54 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 67

  

DAFTAR TABEL

Halaman

  Tabel I. Komposisi Bahan Untuk Pembuatan Air Laut Buatan (ALB) .......................................................................................... 28

  Tabel

  II Persentase Kematian Larva Artemia pada Berbagai Konsentrasi Fraksi Air ................................................................ 41

  Tabel III. Hasil uji KLT fraksi air brokoli untuk pemeriksaan alil isotiosianat dengan fase diam silika gel GF 254 dan fase gerak n-butanol, n-propanol, asam asetat glasial, air

  v

  (30:10:10:10, / v )......................................................................... 49

  DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Hidrolisis Glukosinolat oleh Enzim Mirosinase membentuk Aglikon Alil Isotiosianat ................................... 6 Gambar 2. Struktur Kimia Alil Isotiosianat ............................................ 6 Gambar 3. Perubahan Bentuk Burayak................................................... 9 Gambar 4. Bagian-Bagian Tubuh Artemia Dewasa................................ 10 Gambar 5. Siklus Hidup Artemia Biseksual ........................................... 11 Gambar 6. Mekanisme Apoptosis........................................................... 18 Gambar 7. Siklus Sel .............................................................................. 20 Gambar 8. Mekanisme aktivitas isotiosianat dalam mematikan sel ....... 39 Gambar 9. Kurva Hubungan Nilai Probit versus Log Konsentrasi

  Fraksi Air .............................................................................. 42 Gambar 10. Kromatogram Fraksi Air Brokoli untuk Pemeriksaan

  Senyawa Alil Isotiosianat ..................................................... 45 Gambar 11. Reaksi antara Alil Isotiosianat dengan Ninhidrin ................. 48 Gambar 12. Tanaman Brokoli (Brassica oleracea var. italica)................ 55 Gambar 13. Brokoli .................................................................................. 55 Gambar 14. Larva Artemia salina LEACH .............................................. 56 Gambar 15. Bak Penetasan untuk Larva Artemia salina LEACH............ 56 Gambar 16. Kromatografi Lapis Tipis Fraksi Air dari Brokoli untuk

  Pemeriksaan Alil Isotiosianat ............................................... 57

  DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. Surat Determinasi ................................................................. 54 Lampiran 2. Foto Penelitian ...................................................................... 55 Lampiran 3. Cara Pembuatan Pereaksi Semprot Ninhidrin ...................... 57 Lampiran 4. Cara Pembuatan Ekstrak Alii sativi Bulbus dalam

  Pelarut Metanol sebagai Pembanding pada Uji KLT Senyawa Alil Isotiosianat ..................................................... 58

  Lampiran 5. Perhitungan untuk Membuat Larutan Stok Fraksi Air.......... 58 Lampiran 6. Perhitungan untuk Membuat Variasai Konsentrasi

  Larutan Sampel dari Fraksi Air............................................. 59 Lampiran 7. Data Kematian Larva Artemia salina Leach pada

  Kontrol Metanol dari Fraksi Air Setelah 24 jam .................. 61 Lampiran 8. Data Kematian Larva Artemia salina Leach Karena

  Pengaruh Fraksi Air Setelah 24 jam ..................................... 62 Lampiran 9. Perhitungan Persentase Kematian Larva Artemia pada Fraksi Air Menggunakan Rumus Abbot ............................... 62 Lampiran 10. Perhitungan Data Statistik Fraksi Air Menggunakan

  Analisis Probit....................................................................... 63

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Kanker dianggap sebagai penyebab kematian kedua setelah penyakit

  kardiovaskuler (Dipiro et al., 1997). Penanganan kanker hingga saat ini yang tersedia pada umumnya adalah operasi, terapi radiasi, kemoterapi, terapi hormon, dan terapi imun (Anonim, 2005). Namun pengobatan dengan metode tersebut dapat memberikan efek samping yang merugikan. Maka dari itu, pengobatan tradisional dari bahan alam mulai dicari dan digunakan.

  Sayuran selain digunakan sebagai bahan makanan, ternyata juga dapat digunakan sebagai obat tradisional yaitu untuk mencegah atau mengobati penyakit kanker. Tanaman brokoli (Brassica oleracea var. italica) mengandung glukosinolat dalam konsentrasi tinggi (Misiewicz, Skupinska, and Guttman, 2003). Ketika jaringan tanaman dihancurkan, glukosinolat yang terdapat dalam vakuola sel akan dilepaskan dan dihidrolisis oleh enzim mirosinase yang terdapat dalam sitoplasma (Krul et al., 2002). Enzim mirosinase akan melepaskan glukosa, sehingga dihasilkan aglikon dari glukosinolat yang memiliki aktivitas sebagai antikanker salah satunya adalah alil isotiosianat. Alil isotiosianat memiliki kelarutan dalam air (Anonim, 2001), oleh karena itu fraksi air dari brokoli mengandung senyawa alil isotiosianat.

  Alil isotiosianat dapat menghambat proliferasi sel kanker, aktivitas antiproliferasi alil isotiosianat dalam melawan sel kanker disebabkan oleh karena apoptosis (Xiao et al., 2003). Hal ini yang menyebabkan brokoli dapat dikatakan sebagai salah satu jenis sayuran yang memiliki aktivitas antikanker.

  Suatu senyawa yang bersifat antikanker akan memiliki toksisitas tertentu sehingga dapat digunakan untuk membunuh sel-sel kanker (Katzung, 2004). Oleh karena itu, toksisitas dari senyawa alil isotiosianat perlu diketahui. Pencarian obat tradisional yang mengandung senyawa antikanker dari tanaman, dapat dilakukan dengan cara skrining uji toksisitas menggunakan hewan uji Artemia salina LEACH dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) (Meyer et al., 1982).

  Prinsip metode ini yaitu uji toksisitas akut terhadap larva artemia dengan _{B B} penentuan nilai LC

  50 setelah perlakuan 24 jam. Artemia dalam uji ini digunakan

  karena memiliki kesamaan sistem enzim dengan mamalia, misalnya DNA- _{P P P P} + +

  

dependent RNA polymerase , dan ouabaine sensitive Na & K dependent ATPase

(Solis, Wright, Anderson, Gupta, and Phillipson, 1993).

  Dari latar belakang diatas, maka penggunaan brokoli sebagai obat antikanker perlu diketahui toksisitasnya dengan metode BST. Toksisitas brokoli dapat diketahui dengan menguji efek toksik fraksi air brokoli yang dinyatakan _{B B B B} dengan nilai LC

  50 (Lethal Concentration 50). LC 50 merupakan konsentrasi suatu _{B B}

  larutan yang dapat menyebabkan kematian 50% hewan uji. Jika nilai LC

  50 < 1000

  µg/ml maka suatu larutan senyawa dikatakan memiliki efek toksik (Meyer et al., 1982), sehingga diharapkan senyawa tersebut bersifat sitotoksik.

1. Perumusan masalah

  a. Apakah fraksi air brokoli bersifat toksik terhadap larva artemia dan seberapa _{B B} besar efek toksiknya yang dinyatakan dengan nilai LC

  50 ? b. Bagaimana profil Kromatograi Lapis Tipis senyawa alil isotiosianat yang terdapat dalam fraksi air brokoli?

  2. Keaslian penelitian

  Dari hasil penelusuran pustaka yang telah dilakukan, belum pernah dilakukan penelitian mengenai uji BST tanaman brokoli.

  3. Manfaat penelitian

  a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi yang berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya dalam bidang farmasi mengenai besarnya efek toksik brokoli terhadap larva artemia dengan metode BST.

  b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tambahan bagi masyarakat mengenai khasiat brokoli selain sebagai bahan makanan juga dapat digunakan untuk mencegah ataupun mengobati penyakit kanker.

B. Tujuan Penelitian

  1. Mengetahui apakah fraksi air brokoli bersifat toksik terhadap larva artemia dan _{B B} seberapa besar efek toksiknya yang dinyatakan dengan nilai LC

  50.

  2. Mengetahui bagaimana profil Kromatograi Lapis Tipis alil isotiosianat yang terdapat dalam fraksi air brokoli.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Brokoli

  1. Keterangan botani

  Berdasarkan klasifikasinya (Mills, 2001), brokoli termasuk ke dalam varietas Brassica oleracea var. italica, serta anggota dari famili Cruciferaceae.

  Brokoli memiliki nama asing broccoli (Inggris), dengan nama simplisia Brassicae oleraceae (brokoli).

  2. Morfologi dan habitat tanaman brokoli

  Brokoli memiliki tangkai daun agak panjang dan helai daun berlekuk- lekuk memanjang. Massa bunga brokoli (curd) tersusun secara kompak membentuk bulatan bewarna hijau tua atau hijau kebiru-biruan, dengan diameter antara 15 - 20 cm atau lebih. Pada kondisi lingkungan yang sesuai, massa bunga brokoli dapat tumbuh memanjang menjadi tangkai bunga yang penuh dengan kuntum bunga. Tiap bunga terdiri atas empat helai daun kelopak (calyx), empat helai daun mahkota bunga (corolla), enam benang sari yang komposisinya empat memanjang dan dua pendek. Bakal buah terbagi dua ruang, dan setiap ruang berisi bakal biji (Rukmana, 1995).

  Menurut Rukmana (1995), brokoli cocok ditanam pada suhu rendah yaitu berkisar antara 15,5 - 18ºC dan maksimum 24ºC. Sedangkan tempat yang cocok untuk menanam tanaman brokoli pada umumnya yaitu pada daerah dataran tinggi, dengan ketinggian diatas 700 m dari permukaan laut.

  Pemanenan brokoli dapat dilakukan setelah umurnya mencapai 60 - 90 hari sejak ditanam, sebelum bunganya mekar, dan sewaktu massa bunganya masih berwarna hijau. Jika bunganya telah mekar, tangkai bunganya akan memanjang dan keluarlah kuntum-kuntum bunga berwarna kuning. Brokoli tidak tahan dengan pemasakan yang terlalu lama, selain itu pemanasan terlalu lama akan mengurangi khasiat brokoli (Dalimartha, 2000).

3. Kandungan kimia

  Tanaman yang termasuk dalam genus Brassica memiliki kandungan lemak yang sedikit sehingga rendah energi, selain itu tanaman ini merupakan sumber vitamin, mineral, dan serat yang berguna dalam mencegah penyakit kanker. Tanaman ini juga mengandung sejumlah besar senyawa aktif, dimana beberapa diantaranya dapat digunakan untuk melawan kanker. Senyawa aktif ini meliputi glukosinolat, isotiosianat, karotenoid, kumarin, ditioltion, flavonoid, indol, fenol, dan terpen (Nestle, 1997).

  Tanaman brokoli (Brassica oleracea var. italica) mengandung glukosinolat dalam konsentrasi tinggi (Misiewicz, Skupinska, and Guttman, 2003). Ketika jaringan tanaman dihancurkan, glukosinolat yang terdapat dalam vakuola sel akan dilepaskan dan dihidrolisis oleh enzim mirosinase yang terdapat dalam sitoplasma (Krul et al., 2002).

  Enzim mirosinase yang terdapat dalam sitoplasma akan melepaskan glukosa dan aglikon dari glukosinolat yaitu isotiosianat, nitril dan beberapa produk lainnya. Pemanasan brokoli dapat merusak enzim mirosinase, namun glukosinolat masih dapat mencapai usus besar untuk didegradasi oleh mikroflora usus. Glukosinolat dihidrolisis oleh Bacteroides thetaiotaomicron yang terdapat di _{T T} dalam tubuh manusia membentuk alil isotiosianat ( Krul et al., 2002).

  Ilmuwan dari Johns Hopkins University School of Medicine menyatakan bahwa glukosinolat tidak memiliki sifat sebagai antikanker sedangkan isotiosianat bersifat antikanker (Surjadi, 2005). Selain itu, metabolisme isotiosianat memiliki bioavailabilitas enam kali lebih tinggi dari pada glukosinolat (Shapiro, Fahey, Wade, Stephenson, & Talalay, 2001).

  

Gambar 1. Hidrolisis Glukosinolat oleh Enzim Mirosinase membentuk

_{T T}

Aglikon Alil Isotiosianat ( Krul et al., 2002).

  Salah satu isotiosianat dalam brokoli yang memiliki aktivitas antikanker adalah alil isotiosianat (gambar 2). Alil isotiosianat memiliki kelarutan dalam air (Anonim, 2001), oleh karena itu fraksi air dari brokoli mengandung senyawa alil isotiosianat.

  CH N CH

  2 CH C

  

2

S

Gambar 2. Struktur Kimia Alil Isotiosianat (Anonim, 2001)

4. Khasiat dan kegunaan

  Brokoli akan mempercepat proses penyembuhan setelah sakit berat serta dapat digunakan untuk mencegah dan menghambat perkembangan sel kanker (Dalimartha, 2000).

  Alil isotiosianat dapat menghambat proliferasi sel kanker, aktivitas antiproliferasi alil isotiosianat dalam melawan sel kanker disebabkan oleh karena kemampuannya dalam menahan sel pada fase M serta dapat menginduksi apoptosis (Xiao et al., 2003). _{P P} + + _{P P}

  Isotiosianat dapat menghambat aktifitas Na & K -ATPase (Breier et al., 1995). Isotiosianat banyak mendapat perhatian karena aktivitasnya sebagai antikanker. Sebagai senyawa antikanker isotiosianat memiliki kemampuan untuk mematikan sel kanker, hal ini dapat dilihat dari aktivitasnya dalam menginduksi apoptosis dan menghentikan pertumbuhan sel pada fase S (sintesis DNA) dan fase M (mitosis) dalam siklus hidup sel (Li Tang et al., 2006). Isotiosianat yang merupakan hasil hidrolisis dari senyawa glukosinolat dapat menginduksi p53, dimana p53 merupakan tumor suppressor gene atau gen penekan tumor yang dapat menyebabkan terjadinya apoptosis (Pappa et al., 2006). _{B B}

  Aktivitas p53 dalam menghentikan siklus hidup sel terjadi pada fase G 1 . Ketika terjadi kerusakan DNA, p53 akan menginduksi p21 untuk berikatan dan menginaktivasi cdk2 (cyclin-dependent kinase 2 yang berperan penting dalam _{B B B B} tahap transisi fase G /S), sehingga proses transisi dari fase G ke fase S menjadi

  1

  1

  terhambat hingga terjadi perbaikan DNA. Namun apabila tidak terjadi perbaikan

  DNA yang efektif, p53 akan memerintahkan sel untuk menjalani program bunuh diri atau apoptosis (Best, 2006).

B. Artemia

  1. Keterangan zoologi

  Artemia termasuk spesies Artemia salina LEACH yang merupakan anggota dari famili Artemiidae. Artemia biasa disebut juga dengan udang renik air asin dan memiliki nama asing brine shrimp. Artemia hidup dalam air laut yang berkadar garam tinggi (Mudjiman, 1989).

  2. Tahap perkembangan larva artemia

  a. Telur Istilah untuk telur artemia adalah siste, yaitu telur yang telah berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan kemudian diselubungi oleh cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna untuk melindungi embrio terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultra violet, dan mempermudah pengapungan (Mudjiman, 1989).

  b. Burayak Siste artemia yang kering, jika direndam dalam air laut yang bersuhu 25ºC, akan menetas dalam waktu 24 - 36 jam. Dari dalam cangkangnya keluarlah burayak (larva) yang juga dikenal dengan istilah nauplius. Dalam perkembangan selanjutnya, burayak akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis).

  Setiap kali burayak mengalami perubahan bentuk merupakan satu tingkatan.

  Burayak tingkat I dinamakan instar I, tingkat II instar II, demikian seterusnya sampai instar XV dan menjadi artemia dewasa (Mudjiman, 1989).

  Burayak yang baru saja menetas masih dalam tingkatan instar I. Bentuknya bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 µm dan beratnya 15 µg. Warnanya kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan. Oleh karena itu, mereka belum memerlukan makanan (Mudjiman, 1989).

  Sekitar 24 jam setelah menetas, burayak akan berubah menjadi instar II. Lebih lama lagi akan berubah menjadi instar III. Pada tingkatan instar II, burayak sudah mempunyai mulut, saluran pencernaan, dan dubur. Oleh karena itu, mereka mulai mencari makanan. Bersamaan dengan itu, cadangan makanannya sudah mulai habis. Pengumpulan makanannya mereka lakukan dengan menggerak- gerakkan antena II-nya. Antena II tersebut juga berguna untuk bergerak. Tubuh instar II dan instar III sudah lebih panjang dari instar I (Mudjiman, 1989).

  

Gambar 3. Perubahan bentuk burayak (Mudjiman, 1989) c. Artemia dewasa Artemia dewasa bentuknya telah sempurna, dengan ukuran panjang sekitar 1 cm dan beratnya 10 mg. Torakopodanya yang sudah lengkap sebanyak 11 pasang (Mudjiman, 1989).

  

Gambar 4. Bagian-bagian tubuh Artemia dewasa (Mudjiman, 1989)

3. Perkembangbiakan dan siklus hidup artemia

  Menurut Mudjiman (1989), artemia dapat berkembang biak secara ovovivipar maupun ovipar. Pada cara ovovivipar yang keluar dari induknya sudah berupa burayak jadi sudah langsung hidup sebagai artemia muda. Sedangkan pada cara ovipar, yang keluar dari induknya berupa telur yang bercangkang, dan untuk menjadi burayak harus mengalami proses penetasan terlebih dahulu.

  

Gambar 5. Siklus hidup Artemia biseksual (Mudjiman, 1989)

4. Cara makan artemia

  Artemia memiliki cara makan yang sederhana yaitu dengan jalan menyaring makanan (filter feeder). Sebagai penyaring makanan artemia menelan apa saja yang ukurannya kecil (± 50 mikron), baik benda hidup, benda mati, benda keras maupun benda lunak. Artemia tidak dapat membedakan mana makanan dan yang bukan makanan. Sehingga apa yang terdapat dalam perut artemia belum tentu merupakan makanan (Mudjiman, 1989).

  Pada artemia dewasa pengambilan makanannya dibantu oleh kaki-kakinya (torakopoda), sedangkan burayak dibantu oleh antena II-nya. Kaki-kaki artemia akan bergerak terus-menerus, karena selain berfungsi sebagai alat gerak juga berfungsi sebagai alat pernafasan. Dengan demikian, selama makanannya

5. Lingkungan hidup artemia

  a. Suhu Artemia tidak dapat bertahan hidup pada suhu kurang dari 6ºC atau lebih dari 35ºC. Namun, hal ini tergantung pada ras dan kebiasaan tempat hidupnya, untuk pertumbuhan artemia sebaiknya berkisar antara 25 - 30ºC (Mudjiman, 1989).

  b. Kadar garam Kadar garam memberikan pengaruh terhadap proses pertumbuhan siste.

  Pertumbuhan siste ternyata membutuhkan air yang kadar garamnya rendah yaitu berkisar antara 5 - 7 permil. Batas ini berlainan untuk tiap jenis artemia. Apabila kadar garam terlalu tinggi, maka siste tidak akan menetas karena tekanan osmosis di luar siste lebih tinggi, sehingga siste tidak dapat menyerap air yang cukup untuk proses metabolismenya (Mudjiman, 1989).

  c. Oksigen terlarut Artemia dapat menyesuaikan diri terhadap perubahan kadar oksigen terlarut. Pada kadar garam yang hanya 1 ppm (bagian per juta), artemia masih dapat bertahan. Sebaliknya, mereka pun dapat hidup pada kejenuhan oksigen lebih dari 150 persen (Mudjiman, 1989).

  d. Asam basa (pH) Pengaruh pH terhadap kehidupan artemia muda dan dewasa masih belum jelas.Yang sudah jelas adalah pengaruh pH terhadap penetasan siste. Apabila pH air untuk penetasan kurang dari 8, maka efisiensi penetasannya akan menurun.

  Siste banyak yang tidak menetas atau waktu penetasannya menjadi lebih panjang (Mudjiman, 1989).

C. Brine Shrimp Lethality Test (BST)

  1. Pengertian BST

  BST merupakan metode pengujian toksisitas suatu senyawa menggunakan hewan uji larva artemia. Prinsip metode ini adalah uji toksisitas akut terhadap _{B B} larva artemia dengan penentuan nilai LC

  50 setelah perlakuan 24 jam.

  Metode BST sebenarnya tidak spesifik untuk antitumor namun metode BST memiliki manfaat untuk memonitor aktivitas sitotoksik senyawa dalam waktu yang singkat dan biaya yang cukup murah jika dibandingkan dengan pengujian sitotoksisitas dengan biakan sel kanker. Beberapa keuntungan lain dari metode BST yaitu peralatan yang digunakan sederhana dan tidak memerlukan kondisi yang steril, serta jumlah sampel yang dibutuhkan tidak terlalu banyak (Meyer et al., 1982).

  2. Penggunaan Artemia salina LEACH pada metode BST Artemia salina Leach digunakan untuk pengujian senyawa aktif biologis

  karena artemia mempunyai kesamaan dengan sistem enzim mamalia, misalnya _{P P P P} + + tipe DNA-dependent RNA polymerase, dan ouabaine sensitive Na dan K

  

dependent ATPase (Solis et al, 1993). DNA-dependent RNA polymerase

  merupakan sistem yang berperan dalam proses sintesis protein. RNA polymerase akan berikatan dengan DNA pada tahap transkripsi di dalam nukleus dimana DNA berperan sebagai cetakan dalam pembuatan nukleotida RNA yang baru.

  Jenis molekul RNA yang dimaksud yaitu RNA messenger (mRNA) yang akan membawa pesan genetika dari DNA kebagian-bagian pensintesis protein dari sel tersebut. Pesan genetik yang dibawa oleh mRNA akan ditafsirkan oleh tRNA pada tahap translasi di dalam sitoplasma, tRNA juga akan mentransfer asam amino dari sitoplasma ke ribosom (Campbell, Recee, and Mitchell, 2002).

  Tiap molekul tRNA akan menghubungkan kodon mRNA tertentu dengan asam amino tertentu, kemudian asam amino spesifik tersebut akan dibawa ke ujung rantai polipeptida yang sedang tumbuh di ribosom. Polipeptida akan dihubungkan dengan asam amino oleh ikatan peptida, rRNA berfungsi untuk mengkatalisis proses pembentukan ikatan peptida. Selama proses dan sesudah sintesisnya, suatu rantai polipeptida mulai menggulung dan melipat secara spontan membentuk protein fungsional dengan konformasi yang spesifik (Campbell et al., 2002). _{P P P P} + +

  Di dalam sel terdapat mekanisme transport ion Na dan K , untuk _{P P P P} + + mengontrol keseimbangan antara keluar dan masuknya ion Na dan K maka diperlukan suatu protein membran plasma yang terdapat dalam jumlah yang cukup banyak pada neuron yang disebut pompa natrium-kalium (Corwin, 1996). _{P P} + + _{P P P P P P}

  Na /K ATPase ditemukan dalam semua bagian tubuh manusia. Na /K ATPase mengkatalisis hidrolisis ATP ke ADP serta menggunakan tenaga untuk _{P P P P} + + mengeluarkan 3 Na dari sel dan mengambil 2 K ke dalam tiap sel bagi tiap mol _{P P} + + _{P P}

  ATP yang dihidrolisis, aktivitas Na /K ATPase dihambat oleh ouabain (Ganong, 1995).

  Pada hewan, pemeliharaan tekanan dan volume sel yang normal _{P P P P P P P P} + - + + tergantung atas pompa Na dan K . Tanpa pompa ini, Cl dan Na akan memasuki sel menuruni perbedaan konsentrasinya, serta air akan mengikuti sepanjang perbedaan osmotik yang diciptakan sehingga menyebabkan sel membengkak (Ganong, 1995). Sel yang membengkak selanjutnya bisa mengalami lisis sehingga sel tersebut mati.

  Artemia cukup akurat digunakan sebagai model sel kanker, hal ini telah dibuktikan melalui penelitian yang dilakukan oleh Carballo et al. Penelitian ini bertujuan untuk melihat sensitivitas larva artemia dalam mendeteksi aktivitas sitotoksik suatu ekstrak isopropanolik dari 14 jenis invertebrata laut dan 6 jenis makroalga. Sensitivitas larva artemia dibandingkan dengan sel kanker paru-paru dan sel kanker kolon.

  Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa ekstrak yang memiliki aktivitas sitotoksik yang cukup tinggi bahkan dapat mematikan sel kanker juga dapat memberikan efek yang sama pada larva artemia. Aktivitasnya yaitu dapat menghambat proses penetasan larva serta menyebabkan kematian larva dengan nilai persen kematian yang cukup tinggi. Salah satu contohnya yaitu ekstrak dari

  

Pacifigorgia adamsii memiliki aktivitas sitotoksik 127% GI (growth inhibition)

  terhadap sel kanker paru-paru dan 86% GI terhadap sel kanker kolon, ekstrak ini dapat menghambat penetasan larva artemia sebesar 76% dan memberikan persen kematian yang cukup tinggi yaitu sebesar 68% (Carballo et al., 2002).

  Aktivitas sitotoksik diatas 60% dikatakan bersifat aktif, sedangkan diatas 100% dikatakan dapat menyebabkan kematian sel. Larva artemia yang digunakan berumur 48 jam karena pada umur ini larva memiliki sensitivitas maksimal terhadap ekstrak yang memiliki aktivitas sitotoksik (Carballo et al., 2002).

  Disamping artemia memiliki persamaan dengan mamalia, alasan lain digunakan artemia yaitu karena mudah didapatkan dan harganya murah serta tahan lama bila disimpan dalam bentuk telur kering. Namun, penggunaan hewan uji artemia juga memiliki kelemahan yaitu ketidakmampuan artemia mendeteksi senyawa yang dalam aktivitas fisiologisnya memerlukan aktivasi di dalam sel tubuh mamalia, misalnya senyawa 6-merkaptopurin (Solis et al., 1993).

D. Kanker

1. Pengertian kanker

  Kanker dianggap sebagai penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskuler. Kanker dapat ditandai dengan pertumbuhan sel yang tidak terkontrol, kerusakan jaringan setempat dan sekitarnya, serta kanker dapat menyebar luas (Dipiro et al., 1997).

  Dalam keadaan normal sel hanya akan membelah diri bila tubuh membutuhkan, misalnya ada sel-sel yang perlu diganti karena mati atau rusak.

  Sedangkan sel kanker akan membelah meskipun tidak diperlukan, sehingga terjadi sel-sel baru yang berlebihan. Sel-sel baru mempunyai sifat seperti induknya yang sakit yaitu sel-sel yang tidak mempunyai daya atur (Kuswibawati, 2000).

  Kanker merupakan tumor yang ganas, namun kanker berbeda dengan tumor jinak. Tumor jinak memiliki sifat tidak menginvasi dan tidak merusak jaringan sehat, pertumbuhannya hanya terbatas pada jaringan tertentu saja. Biasanya apabila dilakukan pembedahan akan sembuh total. Tumor dikatakan ganas apabila menginvasi dan merusak organ tubuh lainnya yang masih sehat, serta akan mengalami metastasis (Anonim, 2005).

2. Karsinogenesis

  Kanker atau neoplasma terbentuk dari sel yang mengalami perubahan mekanisme normal dalam mengontrol pertumbuhan dan proliferasi. Mekanisme terbentuknya kanker meliputi beberapa tahap yaitu

  a. inisiasi Tahap pemaparan substansi karsinogenik terhadap sel normal yang menyebabkan kerusakan genetik, apabila tidak diperbaiki akan menyebabkan mutasi seluler bersifat irreversibel.

  b. promosi Zat karsinogen atau faktor lain akan mengubah lingkungannya menjadi berpotensi untuk tumbuhnya sel mutasi dari pada sel normal. Perbedaan antara promosi dengan inisiasi yaitu pada tahap promosi bersifat reversibel. Hal ini yang menyebabkan kemoprevensi dapat dilakukan, diantaranya dengan perubahan gaya hidup dan diet.

  c. progresi Terjadi perubahan genetik yang lebih lanjut sehingga menyebabkan peningkatan proliferasi sel. Pada tahap ini terjadi invasi tumor ke jaringan sekitar dan mengalami metastase (Dipiro et al., 1997).

E. Apoptosis

  Apoptosis berbeda dengan nekrosis, nekrosis yaitu kematian sel yang terjadi karena kerusakan sel secara akut sedangkan apoptosis yaitu suatu program kematian sel. Apoptosis merupakan suatu proses biologi normal. Sebagai contoh pada saat pembentukan jari tangan dan jari kaki embrio, sel diantara jari-jari perlu melakukan proses apoptosis sehingga jari-jari bisa terpisah (Anonim, 2006).

  Proses apoptosis masih kontroversial dan tidak mudah untuk mendefinisikannya. Apoptosis ditandai dengan kondensasi kromatin, penyusutan sitoplasma, dilatasi retikulum endoplasmik, dan pembengkakan membran. Sel yang telah mati akan difagositosis oleh makrofag (Henkart, 1999).

  Gambar 6. Mekanisme Apoptosis (Anonim, 2007) Berdasarkan hasil studi (Henkart, 1999), yang menstimuli proses apoptosis adalah kerusakan DNA. Apabila siklus sel mendeteksi ada DNA yang rusak di dalam sel, maka tumor suppressor gen yang disebut p53 akan menghentikan sel untuk membelah diri, hingga kerusakan DNA sudah diperbaiki. Apabila sel tidak dapat memperbaiki DNA yang rusak, p53 memerintahkan sel untuk menjalani program bunuh diri (progammed cell death atau apoptosis). Programmed cell

  

death adalah bagian yang normal dari kehidupan sel, dan dikontrol secara ketat

oleh banyak gen terutama oleh p53 (Anonim, 2005).

  Tumor suppressor gen berfungsi sebagai pengatur pertumbuhan sel,

  apabila diaktifkan maka akan menghentikan siklus pembelahan sel, sehingga dapat mencegah pembelahan sel selanjutnya (Anonim, 2005). Di dalam sel kanker terdapat satu atau beberapa mutasi yang menghambat p53 menjalani tugasnya, sehingga p53 membiarkan sel melanjutkan pembelahan diri walaupun terdapat DNA yang rusak (Anonim, 2005). Apabila terjadi gangguan pada pengaturan p53 dapat merusak jalur apoptosis sehingga memungkinkan terbentuknya tumor (Anonim, 2007).

  Menurut Best (2006), untuk mematikan sel, p53 akan menginduksi transkripsi beberapa gen yang meliputi apaf-1 (apoptosis protease-activating

  

factor ) dan protein BAX. Protein BAX merupakan anggota dari protein

  sitoplasma yg mengatur terjadinya apoptosis. Protein BAX terdapat pada mitokondria, dimana BAX akan melepaskan sitokrom c. Apaf-1 dan sitokrom c dapat membentuk caspase-9 yang menyebabkan terjadinya apoptosis.

F. Siklus Sel

  

Gambar 7. Siklus Sel (Best, 2006)

_{B B}

  Siklus sel dapat dibagi menjadi empat fase yaitu fase M, fase G _{B B}

  1 , fase S,

  dan fase G . Siklus sel dimulai dari fase M yang merupakan fase mitosis dimana

2 B B

  sel akan mengalami pembelahan. Fase G

  1 merupakan growth phase yang pertama,

  pada fase ini terjadi sintesis protein dan pertumbuhan sel untuk memperoleh ukuran sel yang normal sebelum membelah menjadi dua secara mitosis. Fase S merupakan fase terjadinya sintesis DNA (replikasi DNA) dalam persiapan _{B B} pembelahan sel. Fase G ditandai dengan perbaikan DNA yang rusak pada saat

  2

  replikasi DNA, dan terjadi persiapan untuk mitosis selanjutnya. Pada akhir fase _{B B B B} G

1 , terdapat fase G yang merupakan fase istirahat dalam siklus sel (Best, 2006).