Uji Aktivitas Biologi Kitosan Dari Cangkang Rajungan (Portunus pelagis Dan Portunus trituberculatus) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test

UJI AKTIVITAS BIOLOGI KITOSAN DARI CANGKANG RAJUNGAN (Portunus pelagis DAN Portunus trituberculatus) DENGAN

METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST SKRIPSI

OLEH: MUTTAQIN NIM 091524036

PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

UJI AKTIVITAS BIOLOGI KITOSAN DARI CANGKANG RAJUNGAN (Portunus pelagis DAN Portunus trituberculatus) DENGAN

METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara OLEH:

MUTTAQIN NIM 091524036

PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

PENGESAHAN SKRIPSI

UJI AKTIVITAS BIOLOGI KITOSAN DARI CANGKANG RAJUNGAN (Portunus pelagis DAN Portunus trituberculatus) DENGAN METODE

BRINE SHRIMP LETHALITY TEST OLEH:

MUTTAQIN NIM 091524036

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara Pada tanggal : Juli 2011

Pembimbing I, Panitia Penguji,

Dra. Suwarti Aris. M.Si., Apt. Dra. Masfria, MS., Apt. NIP 195107231982032001 NIP 195707231986012001 Pembimbing II,

Dra. Suwarti Aris. M.Si., Apt. NIP 195107231982032001 Dra. Aswita Hafni Lubis, M.Si., Apt.

NIP 195304031983032001

Dra. Erly Sitompul, M.Si., Apt. NIP 195006121980032001

Drs. Immanuel S. Meliala, M.Si., Apt. NIP 195001261983031002

Medan, Juli 2011 Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Dekan,

Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195311281983031002

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala yang telah memberikan penulis kesehatan dan kesempatan untuk menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini. Terima kasih tidak terhingga kepada Ayahanda Sahman, Ibunda Nafsiah, Kakanda Afwan Syah dan Ijran Syah, Adinda Dina, elis dan yubdi Serta bang Ya’qub, bang Abdi, Rio, Pandu, Didi, dan Arif yang memberikan do’a dan dorongan demi selesainya skripsi ini.

Penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih sebesar-besarnya kepada Ibu Dra. Suwarti Aris, M.Si., Apt., dan Ibu Dra. Aswita Hafni Lubis, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan dan nasehat selama melakukan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi yang telah memberikan fasilitas sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan

2. Ibu Dra. Tuti Roida, M.Si., Apt., selaku penasehat akademik yang telah memperhatikan dan membimbing penulis selama masa perkuliahan.

3. Ibu Dra. Masfria, MS., Apt. Ibu Dra. Erly Sitompul, M.Si., Apt., dan Bapak Drs. Immanuel S. Meliala, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik dan saran kepada penulis dalam penyelesaian skripsi ini. 4. Dosen-Dosen Staf Pengajar Fakultas Farmasi yang telah banyak membimbing

5. Teman-temanku Safri, Tian, Hendra, Bayu, Teddy, Ira, Winda, Sri, Denny, Anita, Iza, Ipit, Hetty, Teti, Rika, Maria serta Abang, Adik-adik di Fakultas Farmasi, dan rekan-rekan Ekstensi Farmasi 2009 lainnya yang tidak dapat disebut satu persatu, yang selalu menjadi temanku berbagi suka duka, membantu dan memberi dorongan semangat kepada penulis

6. Kepala dan Staf Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian atas seluruh fasilitas yang diberikan selama proses penelitian.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna. Untuk itu penulis dengan segala kerendahan hati bersedia menerima kritikan dan saran yang membangun dari kesempurnaan skripsi ini.

Medan, Juli 2011 Penulis,

Muttaqin

UJI AKTIVITAS BIOLOGI KITOSAN DARI CANGKANG RAJUNGAN (Portunus pelagis DAN Portunus trituberculatus) DENGAN METODE

BRINE SHRIMP LETHALITY TEST

Abstrak

Pada pengolahan rajungan dihasilkan limbah cangkang yang bermanfaat sebagai sumber kitin. Kitin (poli-N-asetil-D-glukosamin) merupakan polimer alam yang terdapat pada Crustacean. Senyawa turunan kitin yang mempunyai sifat kimia dan efek yang lebih baik, yaitu kitosan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi kitin dari cangkang rajungan, mengubah menjadi kitosan dan menguji aktivitas biologinya. Isolasi kitin dari cangkang rajungan meliputi dua tahap, yaitu deproteinasi dengan NaOH 2N dan demineralisasi dengan HCl 1,5 N. Pengubahan kitin menjadi kitosan dengan menghilangkan gugus asetil (deasetilasi) dengan NaOH 50%. Kelarutan kitosan diuji dalam asam asetat 1%. Kitosan dikarakterisasi dengan menentukan derajat deasetilasi dengan base line FTIR, penetapan kadar air dan abu total dengan metode gravimetri. Aktivitas biologi kitosan diuji dengan Brine Shrimp Lethality Test (BST). Data dianalisis menggunakan regresi linear untuk memperoleh harga LC50. Karakteristik kitosan

diperoleh derajat deasetilasi, kadar air dan kadar abu 82,7%,4,60% dan 0,69%. Hasil uji aktivitas biologi kitosan terhadap larva Artemia salina Leach diperoleh LC50 146,86 bpj. Menurut Meyer et al., (1982), senyawa dikatakan memiliki

aktivitas biologi jika nilai LC50 < 1000 μg/ml.

BIOLOGICAL ACTIVITY TEST OF CHITOSAN FROM CRAB SHELL (Portunus pelagis AND Portunus Trituberculatus)

BY BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BST)

Abstract

In processing of crabs was also obtained the wasted of shell, which is benificial as source of chitin. Chitin (poly N-acetyl-D-Glukosamin) is a natural polimer in crustacean. However, the derivate of chitin is knows as chitosan has a better chemically and effect. The aims of this research is to isolate chitin from crabs shell, transform chitin to chitosan and it’s biological activity test. Isolation of chitin included two steps, such as deproteinization by NaOH 2N and demineralization by HCl 1,5N. Transformation of chitin to chitosan by deacetylation by using NaOH 50%. Solubility of chitosan was determinated in acetic acid 1%. Chitosan was characterizated by determine degree of deacetylation by base line FTIR, water content and total ash content by gravimetric. Biological activity of chitosan was evaluated by using Brine Shrimp Lethality Test (BST). Data was analyzed by using linier regression to obtain LC50 value. The

characteristic of chitosan was obtained deacetylation degree, water content, total ash concent are 82,7%, 4,60% and 0,69%. Respectively, while, biological activity of chitosan to Artemia salina Leach larvae was obtained LC50 value is 146,86

ppm. According to Meyer at al., (1982), Compound is considered having biological activity if the LC50 value is lower than 1000 µg/ml.

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ... i

HALAMAN PENGESAHAN ... ii

KATA PENGANTAR ... iii

ABSTRAK ... v

ABSTRACT ... vi

DAFTAR ISI ... vii

DAFTAR TABEL ... ... x

DAFTAR GAMBAR ... ... xi

DAFTAR LAMPIRAN ... xii

BAB I. PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 3

1.3 Hipotesis ... 3

1.4 Tujuan Penelitian ... 3

1.5 Manfaat Penelitian... ... 3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... 4

2.1 Uraian hewan ... 4

2.1.1. Habitat dan morfologi ... 4

2.1.2. Taksonomi ... 5

2.1.3. Kandungan senyawa dari cangkang kepiting ... 5

2.3 Kitosan... 7

2.4 Derajat deasetilasi ... 9

2.5 Uji aktivitas biologi ... 10

2.5.1. Brine Shrimp Lethality Test ... 11

2.5.2. Metode Potato Disk ... 12

2.5.3. Uji terhadap Lemna minor L. ... 12

2.6 Uraian Artemia salina Leach. ... 13

2.6.1. Habitat dan morfologi ... 13

2.6.2. Taksonomi ... 14

2.7 Spektroskopi FTIR ... 15

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN... 16

3.1 Alat-Alat ... 16

3.2 Bahan-Bahan ... 16

3.3 Pembuatan Pereaksi ... 16

3.4 Lokasi Penelitian ... 17

3.5 Pengumpulan dan Pengolahan cangkang rajungan ... 17

3.5.1. Pengumpulan cangkang ... 17

3.5.2. Identifikasi hewan ... 18

3.5.3. Pengolahan bahan ... 18

3.6 Penentuan kadar air serbuk cangkang rajungan ... 18

3.7 Isolasi Kitin ... 18

3.7.1 Tahap deproteinasi... 19

3.7.2 Tahap demineralisasi ... 19

3.9 Karakterisasi kitosan ……… ... 20

3.9.1 Penentuan degree of deacetylation ... 20

3.9.2 Penentuan kadar air ... 20

3.9.3 Penentuan kadar abu ... 21

3.10 Uji Aktivitas Biologi ... 21

3.10.1 Penetasan Telur Artemia salina Leach ... 21

3.10.2 Pembuatan Larutan Induk ... 21

3.10.3 Pembuatan Larutan Uji ... 22

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 24

4.1 Identifikasi hewan ... 24

4.2 Isolasi kitin dan pembuatan kitosan ... 24

4.3 Karakteristik kitosan ... 25

4.4 Uji aktivitas biologi ... 26

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 27

5.1 Kesimpulan ... 27

5.2 Saran ... 27

DAFTAR PUSTAKA ... 28

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

3.1Kitin dan kitosan dari cangkang rajungan ... 24 3.2Karakteristik kitosan dan persyaratan ... 25

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Struktur kitin... 6 2. Struktur kitosan………... 8 3. Siklus hidup Artemia salina Leach………... 14

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Hasil identifikasi hewan... 30

2. Gambar hewan... 31

3. Perhitungan kadar air serbuk cangkang rajungan ... 32

4. Data dan Perhitungan Karakterisasi Kitosan ... 34

5. Bagan Kerja ... 38

6. Data Persen Kematian Nauplii... 46

7. Perhitungan Uji Aktivitas Biologi ... 47

UJI AKTIVITAS BIOLOGI KITOSAN DARI CANGKANG RAJUNGAN (Portunus pelagis DAN Portunus trituberculatus) DENGAN METODE

BRINE SHRIMP LETHALITY TEST

Abstrak

Pada pengolahan rajungan dihasilkan limbah cangkang yang bermanfaat sebagai sumber kitin. Kitin (poli-N-asetil-D-glukosamin) merupakan polimer alam yang terdapat pada Crustacean. Senyawa turunan kitin yang mempunyai sifat kimia dan efek yang lebih baik, yaitu kitosan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi kitin dari cangkang rajungan, mengubah menjadi kitosan dan menguji aktivitas biologinya. Isolasi kitin dari cangkang rajungan meliputi dua tahap, yaitu deproteinasi dengan NaOH 2N dan demineralisasi dengan HCl 1,5 N. Pengubahan kitin menjadi kitosan dengan menghilangkan gugus asetil (deasetilasi) dengan NaOH 50%. Kelarutan kitosan diuji dalam asam asetat 1%. Kitosan dikarakterisasi dengan menentukan derajat deasetilasi dengan base line FTIR, penetapan kadar air dan abu total dengan metode gravimetri. Aktivitas biologi kitosan diuji dengan Brine Shrimp Lethality Test (BST). Data dianalisis menggunakan regresi linear untuk memperoleh harga LC50. Karakteristik kitosan

diperoleh derajat deasetilasi, kadar air dan kadar abu 82,7%,4,60% dan 0,69%. Hasil uji aktivitas biologi kitosan terhadap larva Artemia salina Leach diperoleh LC50 146,86 bpj. Menurut Meyer et al., (1982), senyawa dikatakan memiliki

aktivitas biologi jika nilai LC50 < 1000 μg/ml.

BIOLOGICAL ACTIVITY TEST OF CHITOSAN FROM CRAB SHELL (Portunus pelagis AND Portunus Trituberculatus)

BY BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BST)

Abstract

In processing of crabs was also obtained the wasted of shell, which is benificial as source of chitin. Chitin (poly N-acetyl-D-Glukosamin) is a natural polimer in crustacean. However, the derivate of chitin is knows as chitosan has a better chemically and effect. The aims of this research is to isolate chitin from crabs shell, transform chitin to chitosan and it’s biological activity test. Isolation of chitin included two steps, such as deproteinization by NaOH 2N and demineralization by HCl 1,5N. Transformation of chitin to chitosan by deacetylation by using NaOH 50%. Solubility of chitosan was determinated in acetic acid 1%. Chitosan was characterizated by determine degree of deacetylation by base line FTIR, water content and total ash content by gravimetric. Biological activity of chitosan was evaluated by using Brine Shrimp Lethality Test (BST). Data was analyzed by using linier regression to obtain LC50 value. The

characteristic of chitosan was obtained deacetylation degree, water content, total ash concent are 82,7%, 4,60% and 0,69%. Respectively, while, biological activity of chitosan to Artemia salina Leach larvae was obtained LC50 value is 146,86

ppm. According to Meyer at al., (1982), Compound is considered having biological activity if the LC50 value is lower than 1000 µg/ml.

BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang

Rajungan merupakan salah satu komoditas ekspor sektor perikanan Indonesia yang dijual dalam bentuk rajungan beku atau kemasan daging dalam kaleng. Dalam proses pengambilan dagingnya, dihasilkan limbah kulit (cangkang) cukup banyak, jumlahnya mencapai sekitar 40-60% dari total berat rajungan (Rahayu dan Purnavita, 2007).

Meningkatnya jumlah limbah cangkang rajungan masih merupakan masalah serius yang perlu dicarikan solusi pemanfaatannya. Hal ini bukan saja memberikan nilai tambah pada usaha pengolahan rajungan, tetapi juga dapat menanggulangi masalah pencemaran lingkungan yang ditimbulkan, terutama masalah bau serta estetika lingkungan yang kurang baik (Rahayu dan Purnavita, 2007).

Limbah cangkang rajungan masih mengandung senyawa kimia cukup banyak yaitu protein, mineral dan kitin. Kitin adalah polimer alam yang tidak larut dalam air, sehingga penggunaannya terbatas. Namun dengan modifikasi kimia dapat diperoleh senyawa turunan kitin yang mempunyai sifat kimia dan efek yang lebih baik, yaitu kitosan (Hargono dan Sumantri, 2008).

Kitosan telah dikenal sebagai bahan tambahan dalam sediaan obat, sebagai bahan pelembab dan pembuatan kontak lensa yang lunak dan bersih. Kitosan telah menarik perhatian para peneliti karena dapat menurunkan kolesterol yang didasarkan pada kemampuannya berikatan dengan lemak. Kitosan memiliki gugus aktif yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba (pengawet), dapat

mempercepat penyembuhan luka bakar, luka/gangren penderita diabetes, (Rahayu dan Purnavita, 2007; Hargono dan Sumantri,2008). Selain itu, kitosan juga memiliki sifat sebagai antioksidan yang didasarkan pada kemampuan menangkap radikal bebas 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (Yen, et al, 2008). Berdasarkan penelitian Hasegawa, et al (2001), kitosan menginduksi apoptosis sel tumor dengan mengaktivasi caspase-3. Senyawa-senyawa antikanker penginduksi apoptosis menembus membran sel, berinteraksi dengan sel target dan menyebabkan kematian sel (sitotoksisitas).

Untuk mendapatkan senyawa kimia yang aktif sebagai antikanker, dapat dilakukan uji aktivitas. Salah satu uji aktivitas yang paling sederhana yang dapat dilakukan dengan mudah dan dapat diandalkan adalah uji aktivitas Metode Brine

Shrimp menggunakan larva (nauplii) udang laut Artemia salina Leach.

Kandungan kimia aktif biologi dapat bersifat racun jika digunakan pada dosis yang tinggi, tetapi pada dosis rendah dapat menjadi bermanfaat dengan demikian secara in vivo kematian suatu hewan percobaan dapat dipakai sebagai alat pemantau penapisan awal kandungan kimia aktif suatu bahan alam terhadap ekstrak, fraksi maupun isolat. Namun pengujian ini masih bersifat umum oleh karena itu perlu dilakukan uji lain yang lebih terarah untuk mengetahui aktivitas spesifiknya (Mclaughlin dan Rogers, 1998).

Berdasarkan hal diatas, maka peneliti tertarik untuk melakukan uji pendahuluan yaitu uji aktivitas biologi kitosan menggunakan metode Brine

1.2. Perumusan masalah

Berdasarkan uraian di atas, maka permasalahan penelitian ini adalah : a. Apakah limbah cangkang rajungan dapat dimanfaatkan sebagai bahan

baku pembuatan kitosan.

b. Apakah kitosan dari cangkang rajungan memiliki aktivitas biologi terhadap larva Artemia salina Leach.

1.3 Hipotesis

a. Limbah cangkang rajungan dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku pembuatan kitosan.

b. Kitosan dari cangkang rajungan memiliki aktivitas biologi terhadap larva

Artemia salina Leach. 1.4 Tujuan penelitian

a. Untuk mengetahui manfaat cangkang rajungan sebagai bahan baku pembuatan kitosan

b. Untuk mengetahui aktivitas biologi kitosan dari cangkang rajungan terhadap Artemia salina Leach.

1.5 Manfaat penelitian

Melalui penelitian ini diharapkan agar limbah cangkang rajungan dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku pembuatan kitosan dan memberikan informasi tentang aktivitas biologinya.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Uraian hewan

2.1.1 Habitat dan morfologi

Rajungan termasuk hewan dasar laut yang dapat berenang ke permukaan pada malam hari untuk mencari makan. Rajungan hidup di daerah pantai berpasir lumpur dan di perairan depan hutan mangrove. Rajungan biasanya hidup dengan membenamkan tubuhnya ke dalam pasir (Indriyani, 2006).

Rajungan jantan berwarna dasar biru dengan bercak-bercak putih terang, sedangkan rajungan betina berwarna dasar hijau kotor dengan bercak-bercak putih kotor (Indriyani, 2006). Cangkang memiliki duri sebanyak sembilan buah terdapat pada sebelah mata kanan-kiri. Pada duri yang terakhir berukuran lebih panjang dari duri-duri lainnya dan merupakan titik ukuran lebar cangkang. Perut atau biasa disebut abdomen terlipat ke depan di bawah cangkang. Abdomen jantan sempit dan meruncing ke depan. Abdomen betina melebar dan membulat, gunanya untuk menyimpan telur (Juwana dan Kasijan, 2000).

Rajungan yang ditangkap di perairan pantai pada umumnya mempunyai mempunyai kisaran lebar cangkang 8-13 cm dengan berat rata-rata 100 gram, sedangkan rajungan yang berasal dari perairan lebih dalam mempunyai kisaran lebar cangkang 12-15 cm dengan berat rata-rata 200 gram. Selain itu pernah juga ditemukan rajungan dengan lebar cangkang 20 cm dan beratnya mencapai 400 gram (Juwana dan Kasijan, 2000).

2.1.2 Taksonomi

Klasifikasi rajungan menurut Indriyani (2006) adalah sebagai berikut : Filum : Arthropoda

Kelas : Crustacea Sub kelas : Malacostraca Ordo : Eucaridae Sub ordo : Decapoda Famili : Portunidae Genus : Portunus

Spesies : Portunus pelagis ♂ dan Portunus trituberculatus ♀

2.1.3 Kandungan senyawa dari cangkang kepiting

Cangkang kepiting secara umum mengandung protein 15,60-23,90%, kalsium karbonat 53,70-78,40%, dan kitin 18,70-32,20% yang juga tergantung pada jenis kepiting dan tempat hidupnya (Puspawati dan Simpen, 2010).

2.2 Kitin

Kitin (C

8H13NO5)n merupakan biopolimer dari unit N-asetil-D-glukosamin

yang saling berikatan dengan ikatan β(1→4) dengan rumus molekul C8H13NO5)n

yang tersusun atas 47% C, 6% H, 7% N dan 40% O. Struktur kitin menyerupai selulosa dan hanya berbeda pada gugus yang terikat di posisi atom C2. Gugus C2

pada selulosa adalah gugus hidroksil, sedangkan pada C2 kitin adalah gugus

N-asetil (-NHCOCH3, asetamida) (Sugita, dkk, 2009).

Kitin adalah amorf berwarna putih, tidak berasa, tidak berbau, dan tidak larut dalam air, pelarut organik umumnya, asam-asam anorganik dan basa encer. Sumber kitin yang sangat potensial adalah kerangka luar Crustacea (seperti

udang, rajungan, dan lobster), serangga, dinding yeast dan jamur, serta mollusca (Rinaudo, 2006). Adapun struktur kitin adalah sebagai berikut:

Gambar 1. Struktur kitin Gambar 1. Struktur kitin

Kitin tidak larut dalam air sehingga penggunaannya terbatas. Namun dengan modifikasi struktur kimianya maka akan diperoleh senyawa turunan kitin yang mempunyai sifat kimia yang lebih baik. Salah satu turunan kitin adalah kitosan, suatu senyawa yang dapat dihasilkan dari proses hidrolisis kitin menggunakan basa kuat (proses deasetilasi) (Puspawati dan Simpen, 2010).

Tahapan isolasi kitin dan pembuatan kitosan adalah sebagai berikut : 1. Deproteinasi

Cangkang luar Crustaceae mengandung kitin yang berikatan dengan kalsium karbonat (CaCO3) dan protein. Kadar protein pada cangkang sekitar

30-40% dari komponen organik totalnya. Protein terikat secara fisik dan sebagian lainnya terikat secara kovalen, yang kadarnya beragam untuk setiap jenis

crustaceae. Deproteinasi kitin merupakan reaksi hidrolisis dalam suasana asam

dan basa. Lazimnya hidrolisis dilakukan dalam suasana basa menggunakan larutan NaOH. Pada tahap deproteinasi ini, protein diubah menjadi natrium proteinat yang larut dalam air (Sugita, dkk, 2009).

2. Demineralisasi

Cangkang Crustaceae umumnya mengandung 30-50% mineral berdasarkan bobot kering, dengan mineral terbanyak berupa CaCO3. Selain itu

terdapat pula Ca3(PO4)2 dengan kadar 8-10% dari total bahan anorganik. Senyawa

CaCO3 lebih mudah dipisahkan dibandingkan protein karena garam-garam

anorganik hanya terikat secara fisik. Demineralisasi secara umum dilakukan dengan larutan HCl atau asam lain seperti H2SO4 (Sugita, dkk, 2009).

3. Deasetilasi

Kandungan gugus asetil pada kitin secara teoritis adalah 21,2 %. Deasetilasi secara kimia dapat dilakukan dengan menggunakan basa kuat NaOH atau KOH. Penggunaan KOH dapat memutuskan ikatan hidrogen yang kuat antar rantai kitin, sehingga NaOH sering dipakai pada tahap deasetilasi ini (Sugita, dkk, 2009).

2.3 Kitosan

Kitosan adalah turunan kitin, yang diperoleh dari proses deasetilasi kitin. Kitosan pertama kali ditemukan oleh Rouget pada tahun 1859. Kitosan adalah biopolimer glukosamin linier yang terbentuk dari unit ulang 2-amino-deoksi-β -D-glukosa atau disebut (1-4)-2-amino-2-deoksi-β-D-glukosa dan ini merupakan nama asli kitosan yang mempunyai berat molekul rata-rata 120.000 (Rinaudo, 2006).

Gambar 2. Struktur kitosan

Metode penyediaan kitosan pertama kali dibuat oleh Hope Seyler pada tahun 1894 yaitu dengan merefluks kitin dalam larutan kalium hidroksida pada temperatur 180oC. Penelitian terakhir menunjukkan bahwa penggunaan KOH dapat memutuskan rantai kitin (Agusnar, 2006).

Perbedaan kitin dan kitosan terletak pada gugus asetamida pada gugus asetamida pada karbon kedua (C2) dalam struktur molekulnya. Sebagian dari

gugus asetil pada kitosan digantikan dengan atom hidrogen melalui reaksi hidrolisis dengan alkali pekat (Puspawati dan Simpen, 2010).

Karakteristik fisiko-kimia kitosan yaitu : berwarna putih dan berbentuk serpihan seperti bubuk. Kelarutan kitosan yang baik adalah dalam asam asetat 1-2%. Selain itu kitosan larut dalam HCL encer, HNO3 encer, H3PO4 0,5% dan

tidak larut dalam asam pekat dan basa kuat. Dalam kondisi asam berair, gugus amino (-NH2), kitosan akan menangkap H+ dari lingkungannya, sehingga gugus

aminonya terprotonasi menjadi –NH3+. Gugus -NH3+ inilah yang menyebabkan

kitosan bertindak sebagai garam, sehingga dapat larut dalam air. Perlu diketahui bahwa kelarutan kitosan dipengaruhi oleh bobot molekul, derajat deasetilasi dan rotasi spesifiknya yang beragam bergantung pada sumber dan metode isolasinya (Sugita, dkk, 2009).

Adanya gugus –NH3+ berhubungan dengan sifat kitosan yang efektif dalam

hal kapasitas dan kemampuan adsorpsinya terhadap ion logam (merkuri) dibandingkan dengan kitin. Hal ini dimungkinkan karena jumlah gugus amina bebas (sebanding dengan besar derajat deasetilasi) dalam kitosan yang tersedia

untuk pengkhelatan, lebih banyak dibandingkan pada kitin, sehingga kemampuan (% pengumpulan) kitosan dalam mengikat ion logam pun diperoleh lebih besar dari pada kitin (Agusnar, 2006).

Kitosan dapat digunakan sebagai pengawet karena sifat-sifat yang dimiliki yaitu dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme perusak. Selain itu, melapisi produk yang diawetkan sehingga terjadi interaksi minimal antara produk dan lingkungannya. Berbagai hipotesis yang sampai saat ini masih berkembang mengenai mekanisme kerja kitosan sebagai pengawet, yaitu kitosan memiliki afinitas yang sangat kuat dengan DNA mikroba sehingga dapat berkaitan dengan DNA yang kemudian mengganggu mRNA dan sintesa protein (Sari, 2008).

2.4 Derajat deasetilasi

Kitin yang diperoleh dari deproteinisasi dan demineralisasi tidak larut dalam sebagian pereaksi kimia. Untuk memudahkan kelarutannya, maka kitin dideasetilasi dengan pelarut alkali menjadi kitosan. Setelah melalui proses deasetilasi maka daya absorbsinya akan meningkat dengan bertambahnya gugus amino (NH2) yang terdapat di dalamnya. Peningkatan kelarutan berbanding lurus

dengan peningkatan derajat deasetilasi. Hal ini disebabkan gugus asetil pada kitin yang dipotong oleh proses deasetilasi akan menyisakan gugus amina. Ion H pada gugus amina menjadikan kitosan mudah berinteraksi dengan air melalui ikatan hidrogen (Agusnar, 2006).

Derajat deasetilasi kitosan dapat diukur dengan berbagai metode. Yang paling lazim digunakan adalah metode garis dasar Spektroskopi IR Transformasi Fourier (FTIR) yang pertama kali diajukan oleh Moore dan Robert pada tahun

1977. Teknik ini memberikan beberapa keuntungan, yaitu relatif lebih cepat, sampel tidak perlu murni, dan tingkat ketelitian tinggi (Sugita, dkk. 2009).

Derajat deasetilasi ditentukan untuk mengetahui seberapa besar kitin yang sudah berubah menjadi kitosan. Derajat deasetilasi kitosan ditentukan berdasarkan rumus :

DD = %DD = 1 –

[

x

]

100%

Semakin banyak gugus asetil yang dihilangkan, maka semakin tinggi nilai derajat deasetilasinya. Kitosan dengan derajat deasetilasi 70-90% dinamakan kitosan pasaran (Puspawati dan Simpen, 2010).

2.5 Uji aktivitas biologi

Penelitian terhadap senyawa aktif dari bahan alam sangat digalakkan. Tetapi banyak bahan-bahan obat alami yang telah diisolasi, dikarakterisasi dan dipublikasikan tanpa dilanjutkan dengan uji aktivitas biologi. Aktivitas biologi tumbuhan dan hewan tersebut tidak diketahui hingga bertahun-tahun. Hal ini disebabkan karena karena pencarian untuk senyawa yang memiliki aktivitas farmakologi sering menggunakan uji aktivitas dengan biaya yang mahal. Hambatan biaya ini mempengaruhi kegiatan farmakologis. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu uji aktivitas yang secara umum sederhana, mudah dan murah namun dapat dipercaya dan dapat mendeteksi adanya senyawa yang mempunyai aktivitas biologi secara luas yang terdapat pada ekstrak, fraksi dan isolat. Beberapa uji pendahuluan yang memenuhi syarat-syarat di atas antara lain: Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST), Potato Disk, dan Uji terhadap Lemna

2.5.1 Brine Shrimp Lethality Test

Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi. Oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktivitas dan juga untuk memonitor fraksi bioaktif selama fraksinasi dan pemurnian.

Salah satu organisme yang sangat sesuai untuk hewan uji tersebut adalah

brine shrimp (udang laut). Brine shrimp test sudah digunakan untuk berbagai

sistem bioassay yaitu untuk menganalisa residu pestisida, mikotoksin, polutan pada air sungai. Dalam fraksinasi yang diarahkan dengan bioassay, metode brine

shrimp telah digunakan untuk memonitor fraksi aktif mikotoksin dan antibiotik

pada ekstrak jamur (Meyer, et al, 1982).

Artemia salina Leach adalah sejenis udang air asin. Telurnya merupakan

makanan ikan tropis dan telur tersebut dapat dijumpai di toko-toko yang menjual ikan hias tropis dengan nama brine shrimp eggs. Telur ini dapat bertahan selama bertahun-tahun dalam keadaan kering. Jika dimasukkan dalam larutan air laut, telur-telur akan menetas dalam waktu 48 jam dan menghasilkan sejumlah nauplii.

Nauplii Artemia salina Leach ini dapat dipakai sebagai alat yang baik untuk

mendeteksi senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas biologi (Mclaughlin dan Rogers, 1998).

2.5.2 Metode Potato Disk (menghambat tumor crown gall)

Crown gall adalah penyakit tumor pada tumbuhan yang ditimbulkan oleh

strain yang spesifik dari bakteri gram negatif Agrobacterium tumefaciens. Terdapat kesamaan antara mekanisme terjadinya tumor pada tumbuhan dan pada hewan, senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan tumor pada tumbuhan

juga dapat berfungsi sebagai antitumor pada hewan. Uji ini merupakan uji pendahuluan yang sederhana untuk menemukan senyawa antikanker dari bahan alami. Penghambatan pertumbuhan crown gall tumor pada potato disk oleh ekstrak alami, menunjukkan bahwa ekstrak bahan alami tersebut aktif (Mclaughlin dan Rogers, 1998).

2.5.3 Uji terhadap Lemna minor L.

Lemna minor L. adalah tumbuhan monokotil yang hidup di daerah

perairan. Pada kondisi normal, kondisi ini secara langsung menghasilkan anak daun. Jika ekstrak bahan alami dapat menghambat pertumbuhan dari anak daun tumbuhan Lemna minor L., maka ekstrak bahan alami tersebut dapat berkhasiat sebagai antitumor (Mclaughlin dan Rogers, 1998).

2.5.4 Uji Terhadap cell line

Bahan alami yang telah dinyatakan aktif pada uji pendahuluan, selanjutnya dilakukan uji pada tahap berikutnya yaitu uji cell line. Uji ini menggunakan sel-sel kanker secara in vitro, zat-zat antikanker diuji langsung terhadap sel-sel kanker. Contoh-contoh cell line yang banyak digunakan dalam pengujian zat-zat antikanker antara lain L-1210 (leukimia pada tikus), S-256 (sarcoma pada manusia) (Mclaughlin dan Rogers, 1998).

2.6 Uraian Artemia salina Leach. 2.6.1 Habitat dan morfologi

Pada kondisi alamiah, artemia hidup di danau–danau dan perairan bersalinitas tinggi. Oleh karena itu, artemia disebut juga udang renik asin (brine

shrimp). Secara fisik, artemia tidak mempunyai pertahanan tubuh. Oleh karena itu

kemampuan hidup di danau dengan salinitas tinggi merupakan sistem pertahanan alamiah artemia terhadap musuh-musuh pemangsanya. Artemia dapat hidup pada temperatur 25-30oC (Mudjiman, 1989).

Telur artemia (udang laut) yang kering direndam dalam air laut, akan menetas dalam waktu 24-36 jam. Dalam cangkang keluar larva yang disebut dengan istilah nauplii. Dalam perkembangan selanjutnya, nauplii akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis). Setiap kali mengalami perubahan bentuk merupakan satu tingkatan. Tahapan perkembangan pertama disebut

instar I, bentuk lonjong dengan panjang sekitar 0,4 mm dan beratnya 15 µg/ml.

Warnanya kemerah-merahan karena masih banyak mengandung cadangan makanan. Oleh karena itu masih belum perlu makan. Setelah 24 jam, nauplii akan berubah menjadi instar II. Pada tingkat ini nauplii mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan, dan dubur. Oleh karena itu mereka mulai mencari makanan, dan bersamaan dengan itu cadangan makanannya pun mulai habis. Artemia mempunyai cara makan dengan jalan menyaring makanannya atau filter feeder. Selama perubahan terjadi, nauplii akan mengalami perubahan mata majemuk, antena dan kaki. Setelah menjadi instar XV, kakinya sudah lengkap 11 pasang maka nauplii telah berubah menjadi nauplii Artemia dewasa. Proses ini berlangsung antara 1-3 minggu. Artemia dewasa mempunyai panjang sekitar 1 cm

dan beratnya 10 mg. Artemia dapat hidup sampai 6 bulan dan bertelur 4-5 kali. Setiap kali bertelur dapat menghasilkan 50-300 butir telur (Mudjiman, 1989).

Siklus hidup artemia adalah sebagai berikut:

Gambar. 3 Siklus hidup Artemia salina Leach 2.6.2 Taksonomi

Klasifikasi artemia adalah sebagai berikut: Filum : Arthropoda

Kelas : Crustaceae Subkelas : Branchiophoda Ordo : Anostraca Famili : Artemiidae Genus : Artemia

2.7 Spektroskopi FTIR

Spektroskopi Fourier Transform Infrared pada prinsipnya sama dengan spektroskopi infra merah, hanya saja pada spektroskopi FTIR ditambahkan alat optik (fourier transform) untuk menghasilkan spektra yang lebih baik, sehingga spektroskopi FTIR dapat menghasilkan puncak yang diinginkan, dimana dengan spektroskopi inframerah puncak tersebut tidak muncul (Khan, et al, 2002).

Metode yang digunakan untuk menentukan absorbs pada spectra inframerah adalah metode garis dasar (baseline). Dengan metode ini transmitan pada bilangan gelombang yang diinginkan ditentukan dengan membandingkan jarak antara dasar pita dan puncak pita pada bilangan gelombang yang diinginkan tersebut, yang secara matematis diberikan melalui persamaan sebagai berikut :

Transmitan (T) =

Karena absorbansi merupakan logaritma negative dari transmitan, maka absorbansi dapat dinyatakan sebagai berikut :

A= - log

=

log

Dimana I adalah intensitas sisa dan merupakan intensitas awal

Bila suatu senyawa menyerap radiasi pada suatu panjang gelombang tertentu, intensitas radiasi yang diteruskan oleh contoh akan berkurang. Ini menyebabkan suatu penurunan %T dan terlihat di dalam spectrum sebagai suatu sumur, yang disebut sebagai puncak absorbsi atau pita absorbsi (peak atau band). Bagian spektrum dimana %T menunjukkan angka 100 (atau mendekati 100) disebut garis dasar (baseline), yang di dalam spektrum inframerah direkam pada bagian atas (Fessenden, 1992).

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

Metode yang digunakan adalah metode eksperimental meliputi pengumpulan cangkang rajungan, isolasi kitin (deproteinasi dan demineralisasi), deasetilasi kitin menjadi kitosan, karakterisasi dan uji aktivitas biologi kitosan menggunakan larva Artemia salina Leach.

3.1 Alat-Alat

Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas laboratorium, termometer,

hot plate, ayakan, kertas saring, oven, lemari pengering, desikator, vial, bejana

penetasan telur Artemia salina Leach, lampu 18 watt (Hannochs),

Spektrofotometer Fourier Transformation Infra Red (Shimadzu), oven listrik

(Stork), neraca analitik (Vibra AJ) dan penangas air (Yenaco).

3.2 Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah cangkang rajungan, ragi, telur

Artemia salina Leach, air suling dan aqua bidestilata.

Bahan-bahan kimia yang digunakan berkualitas proanalisis yaitu natrium hidroksida, asam klorida, asam asetat glasial, kalium bromida dan asam fosfat. Sedangkan natrium klorida berkualitas teknis.

3.3 Pembuatan pereaksi 3.3.1 NaOH 2N

Sebanyak 8,002 gram NaOH dilarutkan dalam air suling bebas CO2

3.3.2 NaOH 0,0603N

Sebanyak 120,6 mg NaOH dilarutkan dalam air suling bebas CO2 sampai

50 ml.

3.3.3 NaOH 50% b/v

Sebanyak 250 gram NaOH dilarutkan dalam air suling bebas CO2 sampai

500 ml.

3.3.4 HCl 1,5N

Sebanyak 62,2 ml HCl pekat ditambahkan air suling sampai 500 ml.

3.3.5 HCL 0,5 % v/v

Sebanyak 0,5 ml HCl pekat ditambahkan air suling sampai 100 ml.

3.3.6 Suspensi NaCMC 0,5 % b/v

Dimasukkan 5 ml air panas dalam lumpang, ditaburkan 250 mg NaCMC, dibiarkan 15 menit sampai mengembang. Lalu digerus dan ditambahkan air sampai 50 ml.

3.3.7 Suspensi ragi

Sebanyak 600 mg ragi ditambahkan air suling sampai 10 ml.

3.4 Lokasi penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.5 Pengumpulan dan pengolahan cangkang rajungan 3.5.1 Pengumpulan cangkang

Pengumpulan cangkang dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan hewan yang sama dari daerah lain. Cangkang rajungan diambil

dari tempat pengolahan kepiting di Desa Gosong Telaga, Aceh Singkil, Propinsi Nanggroe Aceh Darussalam.

3.5.2 Identifikasi hewan

Identifikasi hewan dilakukan oleh Pusat Lembaga Ilmu Pengetahuan Oceanografi, Jakarta. Hasil identifikasi hewan dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 17.

3.5.3 Pengolahan bahan

Cangkang rajungan dicuci sampai bersih dan dikeringkan di bawah sinar matahari selama 2 hari. Kemudian dihaluskan, diayak dan ditimbang.

3.6 Penentuan kadar air serbuk cangkang rajungan

Ditimbang 2 gram serbuk, dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah diketahui bobotnya. Kemudian dimasukkan ke dalam oven, dipanaskan pada suhu 105oC selama 3 jam, lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai berat konstan.

Kadar air dihitung dengan persamaan sebagai berikut, Kadar air = x 100%

x = bobot serbuk mula-mula y = bobot serbuk kering

(AOAC, 1999)

3.7 Isolasi kitin

Isolasi kitin meliputi dua tahap, yaitu tahap deproteinasi dan demineralisasi (Puspawati dan Simpen, 2010).

3.7.1 Tahap deproteinasi

Ditimbang 120 gram serbuk cangkang rajungan, ditambahkan larutan NaOH 2N sebanyak 720 ml (perbandingan serbuk dan larutan 1:6 b/v), sambil diaduk dan dipanaskan pada suhu 800C selama 1 jam. Setelah dipisahkan dari larutannya, serbuk dicuci dengan air hingga netral. Kemudian diuapkan pada pengangas air dan dikeringkan pada suhu 70-800C selama 4 jam dalam oven. Lalu ditimbang serbuk yang bebas protein.

3.7.2 Tahap Demineralisasi

Serbuk 97 gram ditambahkan menggunakan 1455 ml HCl 1,5N (perbandingan serbuk dan larutan 1:15 b/v) dan dipanaskan pada suhu 70-800C selama 1 jam, lalu disaring. Endapan dicuci dengan air hingga air bilasan tidak keruh dengan penambahan AgNO3. Kemudian diuapkan pada pengangas air dan

dikeringkan dalam oven pada suhu 70-800C selama 4 jam. Kitin yang bebas mineral dan protein diuji kelarutannya dalam asam fosfat pekat (1:100 b/v).

3.8 Pembuatan Kitosan

Kitin 21 gram ditambahkan 420 ml NaOH 50% (perbandingan serbuk dan larutan 1:20 b/v) pada suhu 80-900C selama 4 jam. Kemudian disaring, rendemen dicuci dengan akuades hingga netral. Lalu diuapkan pada pengangas air dan dikeringkan dalam oven dengan suhu 70-800C selama 4 jam. Kitosan yang diperoleh diuji kelarutannya dalam asam asetat 1 % (1:100 b/v) (Puspawati dan Simpen, 2010).

3.9 Karakterisasi kitosan

3.9.1 Penentuan derajat deasetilasi

Penentuan DD menggunakan spektrofotometer Fourier Transformation

Infra Red (FTIR) dilakukan dengan cara sebagai berikut: ditimbang 10 mg kitosan

dan digerus homogen dengan 90 mg KBr. Selanjutnya diukur dengan Spektrofotometer FTIR. Puncak tertinggi dicatat dan diukur dari garis dasar yang dipilih. Kitin yang terasetilasi sempurna (100%) menghasilkan nilai A1655 = 1,33.

Dengan diperoleh perbandingan absorban antara bilangan gelombang λ 1655 cm-1 (serapan pita amida) dan 3450 cm-1 (serapan gugus hidroksil) maka % DD kitosan dapat dihitung dengan persamaan Domszy dan Robert sebagai berikut:

%DD = 1 –

[

x

]

100%

(Khan, et al, 2002)

3.9.2 Penentuan kadar air

Sebanyak 2 gram kitosan dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah diketahui bobotnya. Kemudian dimasukkan ke dalam oven, dipanaskan pada suhu 105oC selama 3 jam, lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai berat konstan.

Kadar air dihitung dengan persamaan sebagai berikut: Kadar air = x 100%

x = bobot sampel mula-mula y = bobot sampel kering

(AOAC, 1999)

3.9.3 Penentuan kadar abu

Kadar abu ditentukan ditentukan dengan cara sebanyak 2 gram kitosan dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah diketahui bobotnya. Selanjutnya kitosan tersebut dibakar sampai tidak berasap, kemudian dimasukkan ke dalam tanur pengabuan bersuhu 6000C sampai diperoleh abu berwarna putih. Kemudian, didinginkan dalam desikator, lalu ditimbang. Kadar abu dihitung dengan persamaan sebagai berikut:

Kadar abu = x 100%

(AOAC, 1999).

3.10 Uji aktivitas biologi

3.10.1 Penetasan telur Artemia salina Leach

Disiapkan air laut buatan dengan melarutkan 38 gram garam laut dengan

aqua bidestilata dicukupkan hingga 1 liter, kemudian disaring. Bejana penetasan

disekat menjadi dua bagian, yaitu bagian yang besar dan bagian yang kecil, lalu diberi lubang pada sekatnya. Setelah air laut buatan dimasukkan ke dalam bejana, telur Artemia salina Leach ditaburkan ke dalam bagian yang kecil kemudian bagian atasnya ditutup dengan aluminium foil sedangkan bagian yang besar dibiarkan terbuka menghadap lampu. Setelah 48 jam, telur akan menetas menjadi larva dan siap digunakan untuk hewan uji.

3.10.2 Pembuatan larutan induk

a. Pembuatan Larutan I dengan konsentrasi 10.000 ppm

Ditimbang 50 mg kitosan, dilarutkan dengan larutan HCl 0,5%sampai 5 ml. b. Pembuatan Larutan II dengan konsentrasi 1000 ppm

c. Pembuatan Larutan III dengan konsentrasi 100 ppm

Dipipet dari larutan II 0,5 ml dan dicukupkan dengan akuades sampai 5 ml.

3.10.3 Pembuatan larutan uji

a. Larutan konsentrasi 1000 ppm

Dipipet 0,5 ml larutan I, ditambahkan 0,5 ml NaOH 0,0603N (pH = 7), 2 ml air laut buatan, dan 1 ml suspensi NaCMC. Dimasukkan 10 ekor larva Artemia

salina Leach, dicukupkan air laut buatan sampai 5 ml dan ditambahkan 1 tetes

suspensi ragi.

b. Larutan konsentrasi 100 ppm

Dipipet 0,5 ml larutan II, ditambahkan 0,05 ml NaOH 0,0603N (pH = 7), 2 ml air laut buatan dan 1 ml suspensi NaCMC. Dimasukkan 10 ekor larva Artemia

salina Leach, dicukupkan air laut buatan sampai 5 ml dan ditambahkan 1 tetes

suspensi ragi.

c. Larutan konsentrasi 10 ppm

Dipipet 0,5 ml larutan III, ditambahkan 0,005 ml NaOH 0,0603N (pH = 7), 2 ml air laut buatan dan 1 ml suspensi NaCMC. Dimasukkan 10 ekor larva Artemia

salina Leach, dicukupkan air laut buatan sampai 5 ml dan ditambahkan 1 tetes

suspensi ragi. d. Larutan kontrol

Dipipet 0,5 ml HCl 0,5 % dan ditambahkan 0,5 ml NaOH 0,0603N (pH = 7), 2 ml air laut buatan dan 1 ml suspensi NaCMC. Dimasukkan 10 ekor larva

Artemia salina Leach, dicukupkan air laut buatan sampai 5 ml dan ditambahkan 1

Disiapkan 3 vial untuk masing-masing konsentrasi larutan uji. Sehingga semuanya menjadi 9 vial dan 1 vial untuk kontrol. Semua vial diletakkan di bawah lampu. Setelah 24 jam dihitung jumlah nauplii yang mati. Data dianalisis dengan Analisis regresi linear untuk menentukan nilai LC50 (Meyer, et al, 1982).

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Identifikasi hewan

Hasil identifikasi sampel hewan yang dilakukan oleh Pusat lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Pusat Penelitian Oseanografi, Jakarta adalah

Portunus trituberculatus (betina) dan Portunus pelagis (jantan). 4.2 Isolasi kitin dan pembuatan kitosan

Isolasi kitin dari cangkang rajungan melalui dua tahap yaitu deproteinasi dan demineralisasi. Proses deproteinasi dilakukan dengan penambahan basa kuat yaitu NaOH. Deproteinasi dilakukan mengingat bahwa protein merupakan salah satu penyusun cangkang rajungan yang cukup besar. Demikian juga dengan penghilangan mineral dilakukan dengan penambahan asam klorida encer. Asam klorida akan melarutkan mineral yang ada. Reaksinya sebagai berikut :

CaCO3+ 2HCl CaCl2 +H2O + CO2

Kitin yang diperoleh larut dalam asam fosfat, menunjukkan bahwa kitin sudah tidak mengandung protein dan mineral.

Kitin yang diperoleh dideasetilasi dengan penambahan NaOH 50% dan dipanaskan selama 90oC selama 4 jam. Kitin dan kitosan yang diperoleh dapat dilihat pada tabel sebagai berikut,

Tabel 3.1. Kitin dan kitosan dari cangkang rajungan Cangkang Rajungan (gram) Kitin (gram)

%

Kitosan (gram)

%

Kitosan yang diperoleh larut dalam asam asetat 1 %, menunjukkan bahwa kitin sudah terdeasetilasi menjadi kitosan.

4.3 Karakteristik kitosan

Penentuan derajat deasetilasi kitosan menggunakan persamaan Domszy dan Robert. Absorbasi amida pada bilangan gelombang 1655 cm-1 (diperoleh 1654,92 cm-1) sebagai ukuran kandungan gugus N-asetil dan pada bilangan gelombang 3450 cm-1 (diperoleh 3522,02 cm-1) dari puncak hidroksil yang berfungsi sebagai standar internal untuk mengoreksi perbedaan kadar kitosan dalam pelet KBr (Khan, et al, 2002). Hasil penentuan derajat deasetilasi kitosan adalah 70,38 %.

Hasil karakterisasi kitosan meliputi derajat deasetilasi, kadar air dan kadar abu dapat dilihat pada tabel berikut :

Tabel.3.2 Karakteristik kitosan dan persyaratan

Parameter Hasil yang diperoleh Persyaratan

Derajat deasetilasi 70,38% ≥ 70 %

Kadar air 4,60% ≤ 10,0 %

Kadar abu total 0,69% ≤ 2,0 %

Berdasarkan hasil karakterisasi, kitosan yang diperoleh memenuhi persyaratan (Sugita, dkk, 2009).

4.4 Uji aktivitas biologi

Uji aktivitas biologi kitosan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) diperoleh LC50 = 146,86 ppm. Dari hasil pengujian menunjukkan bahwa

kitosan memiliki aktivitas biologi. Senyawa dikatakan aktif atau memiliki aktivitas biologi terhadap Artemia salina Leach apabila memiliki nilai LC50<1000

µg/ml (Meyer, et al., 1982).

Mekanisme kematian larva berhubungan dengan aktivitas senyawa kimia. Cara kerjanya adalah dengan bertindak sebagai racun perut. Oleh karena itu, bila senyawa senyawa ini masuk ke dalam tubuh larva, alat pencernaannya akan terganggu. Selain itu, senyawa ini menghambat reseptor perasa pada daerah mulut larva. Hal ini mengakibatkan larva gagal mendapatkan stimulus rasa sehingga tidak mampu mengenali makanannya (Mutia, D, 2010).

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan :

a. Cangkang rajungan dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku pembuatan kitosan, melalui proses deproteinasi, demineralisasi dan deasetilasi.

b. Kitosan memiliki aktivitas biologi terhadap larva Artemia Salina Leach dengan LC50 = 146,86 ppm

5.2 Saran

Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk melakukan uji aktivitas biologi kitosan dari cangkang rajungan dengan metode lain, misalnya dengan metode cell line.

DAFTAR PUSTAKA

Agusnar, H. (2006). Pemanfaatan Kulit Udang (Penaues Monodon) Sebagai Kitosan dan Turunannya Untuk Menurunkan Konsentrasi Ion Logam Ni dan Cr dengan Ekstraksi Fase Padat sebagai Sumber Air Bersih.

Disertasi, Program Doktor Kimia, Universitas Sumatera Utara.

AOAC, (1999). Official Methods of Analysis of AOAC International 5th revision, Volume 2. Cunnif P (Editor. Maryland), AOAC International.

Ditjen POM. (1979). Farmakope Indonesia. Edisi III. Departemen Kesehatan RI. Jakarta. Halaman 696.

Fessenden, J.R., dan Fessenden, J.S., (1992). Kimia Organik Edisi III, Penerbit Erlangga, Surabaya. Halaman 314.

Hargono, A., dan Sumantri, I, (2008). Pembuatan Kitosan dari Limbah Cangkang

Udang serta Aplikasinya dalam Mereduksi Kolesterol Lemak Kambing.

Februari 2011.

Hasegawa, M., Yagi, K., Iwakawa, S., and Hirai, M., (2001). Chitosan Induces Apoptosis Via Caspase-3 Activation In Bladder Tumor Cells. In Japan

Cancer Journal.

tanggal 20 Januari 2011.

Indriyani, A. 2006. Mengkaji Pengaruh Penyimpanan rajungan (PortunusPelagicus linn) Mentah dan Matang di Mini Plant Terhadap

Mutu Daging di Plant.

Oktober 2010.

Juwana, S. dan Kasijan, R., (2000). Rajungan Perikanan, Cara Budidaya dan

Menu Masakan. Penerbit Djambatan, Jakarta. Halaman 4

Khan, T.A., Peh, K.K., Ching, H.S., (2002). Reporting Degree of Deacetylation Values of Chitosan : The Influence of Analytical Methods in Pharm

Pharmaceut Science Journal. Page 205-212.

McLaughlin, J.L., Rogers,L.L. (1998). The Use Of Biological Assays To Evaluate Botanicals. Drug Information Journal. Pages 513 - 517

Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Nichols,D.E., Jacobsen,L.B., Mclaughlin,J.L., (1982). Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay far Active Plant Constituents, Plant Medica Journal. Pages 31 - 35.

Mudjiman, A., (1989). Udang Renik Air Asin (Artemia Salina). Jakarta : Penerbit Bhratara. Hal 56

Mutia, D. (2010). Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Buah Anggur (Vitis vinifera)

Terhadap Larva Artemia salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Karya Tulis Ilmiah, Program Pendidikan Sarjana

Kedokteran, Fakultas KedokteranUniversitas Diponegoro, Semarang. Halaman 13.

Puspawati, N.M., dan Simpen, I.N., (2010). Optimasi Deasetilasi Khitin dari Kulit

Udang dan Cangkang Kepiting Limbah Restoran Seafood Menjadi Khitosan Melalui Variasi Konsentrasi NaOH. Jurnal Kimia FMIPA

Universitas Udayana, Bali. Halaman 79-90.

Rahayu, R.H., dan Purnavita, S. (2007). Optimalisasi Pembuatan Kitosan Dari

Kitin Limbah Cangkang Rajungan (Portunus Pelagicus) Untuk Adsorben Ion Logam Merkuri.www.eprints.undip.ac.id. Diakses tanggal 3

November 2010.

Rinaudo, M., (2006). Chitin and Chitosan : Properties and Applicatons. Polymer

Journal in Elsevier. Page 604;611.

Sari, N.J., 2008. Pemberian Chitosan Sebagai Bahan Pengawet Alami dan Pengaruhnya Terhadap Kandungan Protein dan organoleptik pada bakso udang. Tesis, Program Pascasarjana, Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Sugita, P., Wukirsari, T., Sjahriza, A., Wahyono, D.,(2009). Kitosan, Sumber

Biomaterial Masa Depan. Institut Teknologi Bandung Press, Bandung.

Halaman 30.

Yen, M.T., Yang, J.H., dan Mau, J.L., (2008). Antioxidant Properties Of Chitosan From Crabs Shells, In Carbohydrate Polymers Journal, Elsevier, Page 840-844.

Lampiran 2.Gambar Hewan

Rajungan betina (Portunus trituberculatus)

Lampiran 3.Data Perhitungan

Kadar air Serbuk Cangkang Rajungan

Kadar air = x 100% x = bobot sampel mula-mula

y = bobot sampel kering a. Kadar air I

Cawan kosong = 45,073 g Berat sampel (x) = 2,012 g

Berat cawan + sampel setelah dikeringkan = 46,943 g Berat sampel setelah kering (y) = 1,870 g

Kadar air = x 100%

= 7,05 % b. Kadar air II

Cawan kosong = 43,226 g Berat sampel (x) = 2,003 g

Berat cawan + sampel setelah dikeringkan = 45,084 g Berat sampel setelah kering (y) = 1,858 g

Kadar air = x 100%

c. Kadar air III

Cawan kosong = 47,715 g Berat sampel (x) = 2,098 g

Berat cawan + sampel setelah dikeringkan = 49,667 g Berat sampel setelah kering (y) = 1,952 g

Kadar air = x 100%

= 6,95 % Kadar air rata-rata =

=

Lampiran 4.Data Perhitungan Karakterisasi Kitosan a. Derajat Deasetilasi

%DD = 1 –

[

x

]

100%

= Log

=

Log

=

0,66

%DD = 1 –

[

x

]

100% = (1-0,2961) x 100% = 70,38 %

=5,8

P=1,

2,

P=1,4

= Log

=

Log

Lampiran4.(lanjutan) b. Kadar Air Kitosan

Kadar air =

x

100% x = bobot kitosan mula-mula y = bobot kitosan kering a. Kadar air I

Berat Cawan kosong = 42,971 Berat kitosan (x) = 2,011 g

Berat cawan + kitosan setelah dikeringkan = 44,882 g Berat kitosan setelah kering (y) = 1,911 g

Kadar air = x 100%

= 4,97 % b. Kadar air II

Cawan kosong = 44,088 g Berat kitosan (x) = 2,003 g

Berat cawan + kitosan setelah dikeringkan = 45,996 g Berat kitosan setelah kering (y) = 1,908 g

Kadar air = x 100%

= 4,74 % c. Kadar air III

Cawan kosong = 46,265 g Berat kitosan (x) = 2,001 g

Berat kitosan setelah kering (y) = 1,919 g

Kadar air = x 100%

= 4,09 % Kadar air rata-rata =

=

Lampiran4. (lanjutan) c. Kadar Abu Kitosan

Kadar abu : = x 100%

a. Kadar abu I

Berat sampel = 2,0001 g

Berat Abu = 0,0139 g

% kadar = x 100%

= 0,69 % b. Kadar abu II

Berat sampel = 2,0002 g Berat Abu = 0,0139 g

% kadar = x 100%

= 0,69 % c. Kadar abu III

Berat sampel = 2,0001 g Berat Abu = 0,0139 g

% kadar = x 100%

= 0,69 %

Kadar abu rata-rata =

Lampiran5. BaganKerja

a. Bagan Pengolahan cangkang rajungan

Dicuci dengan air

Dikeringkan selama 2 hari di bawah sinar matahari

Dihaluskan dan diayak ditimbang

Cangkang Rajungan 5 kg

Serbuk cangkang 1000 g Cangkang Rajungan kering

Lampiran5 (lanjutan)

b. Bagan Tahap Deproteinasi

Ditimbang 120 gram

` Ditambahkan NaOH 2N sebanyak 720 ml (1:6)

Dipanaskan pada suhu 80 oC selama 1 jam, lalu disaring

dicuci dengan akuades sampai netral

dikeringkan pada penangas air dan dilanjutkan pada oven suhu 80-90oC selama 4 jam

Serbuk cangkang rajungan

endapan filtrat

Serbuk cangkang rajungan bebas

Lampiran5.(lanjutan) c. Bagan Demineralisasi

Ditimbang 97 gram

` Ditambahkan HCl 1,5 N sebanyak 1455 ml

(1:15 b/v)

Dipanaskan pada suhu 80 oC selama 1 jam, lalu disaring

dicuci dengan akuades sampai air bilasan tidak keruh dengan penambahan AgNO3

dikeringkan pada penangas air dan dilanjutkan pada oven suhu 80-90oC selama 4 jam

dilarutkan dalam asam fosfat pekat

Serbuk cangkang rajungan bebas protein

endapan filtrat

Kitin

Lampiran5.(lanjutan)

d. Bagan Tahap Pembuatan kitosan

Ditimbang 21 gram

` Ditambahkan NaOH 50% sebanyak 420 ml

(1:20 b/v)

Dipanaskan pada suhu 80-90 oCselama 4 jam, lalu disaring

dicuci dengan akuades sampai netral

dikeringkan pada penangas air dan dilanjutkan pada oven suhu 80-90 oC selama 4 jam

dilarutkan dalam asam asetat 1 % dan dikarakterisasi

Kitin

endapan filtrat

Kitosan

Lampiran5. (lanjutan) e. Pembuatan Larutan Induk

Dilarutkan dalam HCl 0,5% sampai 5 ml

Dipipet 0,5 ml dan diencerkan dengan akuades 5 ml

Dipipet 0,5 ml dan diencerkan dengan akuades 5 ml 50 mg kitosan

Larutan I C = 10.000 bpj

Larutan II C = 1000 bpj

Larutan III C = 100 bpj

Lampiran5.(lanjutan)

f. Bagan Kerja Brine Shrimp Lethality Test

Dipipet 0,5 ml,ditambahkan 0,5 ml NaOH 0,0603N (pH =7) ditambahkan2 ml air laut buatan dan 1 ml NaCMC

ditambahkan 10 ekor larva Artemia salina dicukupkan dengan air laut buatan hingga 5 ml ditambahkan1tetes suspensi ragi

Dipipet 0,5 ml, ditambahkan 0,05 ml NaOH 0,0603N (pH =7) Ditambahkan 2 ml air laut buatan dan 1 ml NaCMC

ditambahkan 10 ekor larva Artemia salina dicukupkan dengan air laut buatan hingga 5 ml ditambahkan1tetes suspensi ragi

Larutan I C = 10.000 bpj

Larutan Uji C = 1000 bpj

Larutan Uji C = 100 bpj Larutan II C = 1000 bpj

Lampiran5.(lanjutan)

Dipipet 0,5 ml, ditambahkan 0,005 ml NaOH 0,0603N (pH =7) ditambahkan 2 ml air laut buatan dan 1 ml NaCMC

ditambahkan 10 ekor larva Artemia salina dicukupkan dengan air laut buatan hingga 5 ml

ditambahkan1tetes suspensi ragi

Dipipet 0,5 ml HCL 0,5 % dan 0,5 ml NaOH 0,0603 N (pH =7) ditambahkan 2 ml air laut buatan dan 1 ml NaCMC

ditambahkan 10 ekor larva Artemia salina dicukupkan dengan air laut buatan hingga 5 ml ditambahkan 1 tetes suspensi ragi

Larutan Uji C = 10 bpj Larutan III C = 100 bpj

Larutan Kontrol Larutan Kontrol

Lampiran5. (lanjutan)

dibiarkan di bawah sinar lampu selama 24 jam dihitung jumlah larva yang mati

dihitung nilai LC50menggunakan analisis regresi linear

Hasil Larutan

Lampiran 6. Data Persen Kematian Nauplii

Konsentrasi (µg/ml)

Jumlah nauplii yang mati

Jumlah nauplii yang hidup

% Kematian nauplii

% Kematian

rata-rata P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P2

10 2 3 1 8 7 9 20 30 10 20

100 4 4 5 6 6 5 40 40 50 43,33

1000 7 8 7 3 2 3 70 80 70 73,33

Lampiran7. Perhitungan Uji Aktivitas Biologi 1. Perhitungan Persentase Kematian

Persentase Kematian =

(

)

X100%

Total Kontrol Tes−

Tes = Jumlah kematian nauplii larutan uji Kontrol = Jumlah kematian nauplii larutan kontrol Total = Jumlah nauplii yang digunakan

2. PerhitunganHarga LC50

Menggunakan Analisa Regresi Linear.

2.1. Perhitungan harga LC50

Perhitungan harga LC50 menggunakan metode Analisa Regresi Linier

No

Log Konsentrasi

(X)

% Kematian

(Y) XY X

2

1. 1 20 20 1

2. 2 43,33 86,66 4

3. 3 73,33 219,99 9

∑X = 6

= 2

∑Y = 136,66

= 45,55 ∑XY = 326,65 ∑X

2

= 14

Persamaan garis regresi linear : Y = aX + b Y = persentase kematian

Lampiran7 (lanjutan)

a =

(

)

( )

/ X / 2 2 n X n Y X XY

∑

∑

∑

∑ ∑

− − = =

=

= 26,66

b = Y - aX

= 45,55 – 26,66 . 2 = 45,55 – 53,34 = -7,77

Y = aX + b

= 26,66 X -7,77 Untuk Y = 50

50 = 26,66X -7,77 X =

X = 2,1669 LC50 = 146,86 µg/ml

Lampiran5.(lanjutan)

Dipipet 0,5 ml, ditambahkan 0,005 ml NaOH 0,0603N (pH =7) ditambahkan 2 ml air laut buatan dan 1 ml NaCMC

ditambahkan 10 ekor larva Artemia salina dicukupkan dengan air laut buatan hingga 5 ml

ditambahkan1tetes suspensi ragi

Dipipet 0,5 ml HCL 0,5 % dan 0,5 ml NaOH 0,0603 N (pH =7) ditambahkan 2 ml air laut buatan dan 1 ml NaCMC

ditambahkan 10 ekor larva Artemia salina dicukupkan dengan air laut buatan hingga 5 ml ditambahkan 1 tetes suspensi ragi

Larutan Uji C = 10 bpj Larutan III C = 100 bpj

Larutan Kontrol Larutan Kontrol

Lampiran5. (lanjutan)

dibiarkan di bawah sinar lampu selama 24 jam dihitung jumlah larva yang mati

dihitung nilai LC50menggunakan analisis regresi linear

Hasil Larutan

Lampiran 6. Data Persen Kematian Nauplii

Konsentrasi (µg/ml)

Jumlah nauplii yang mati

Jumlah nauplii yang hidup

% Kematian nauplii

% Kematian

rata-rata P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P2

10 2 3 1 8 7 9 20 30 10 20

100 4 4 5 6 6 5 40 40 50 43,33

1000 7 8 7 3 2 3 70 80 70 73,33

Kontrol - 10 0 0

Lampiran7. Perhitungan Uji Aktivitas Biologi 1. Perhitungan Persentase Kematian

Persentase Kematian =

(

)

X100%

Total Kontrol Tes−

Tes = Jumlah kematian nauplii larutan uji Kontrol = Jumlah kematian nauplii larutan kontrol Total = Jumlah nauplii yang digunakan

2. PerhitunganHarga LC50

Menggunakan Analisa Regresi Linear. 2.1. Perhitungan harga LC50

Perhitungan harga LC50 menggunakan metode Analisa Regresi Linier

No

Log Konsentrasi

(X)

% Kematian

(Y) XY X

2

1. 1 20 20 1

2. 2 43,33 86,66 4

3. 3 73,33 219,99 9

∑X = 6

= 2

∑Y = 136,66

= 45,55 ∑XY = 326,65 ∑X 2

= 14

Persamaan garis regresi linear : Y = aX + b Y = persentase kematian

Lampiran7 (lanjutan)

a =

(

)

( )

/ X / 2 2 n X n Y X XY

∑

∑

∑

∑ ∑

− − = =

=

= 26,66

b = Y - aX

= 45,55 – 26,66 . 2 = 45,55 – 53,34 = -7,77

Y = aX + b

= 26,66 X -7,77 Untuk Y = 50

50 = 26,66X -7,77

X =

X = 2,1669 LC50 = 146,86 µg/ml