Penuntun Praktikum Mikrobiologi Akuatik

  PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI A K U A T I K Oleh: Dr. Ir. YUNILAS, M.P Dr. ERI YUSNI, MSc FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS SUMATERA UTARA AGUSTUS, 2017

  

LATIHAN 1

PENGENALAN ALAT

Tujuan:

  1. Mengenal bermacam-macam peralatan yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi.

  2. Mengetahui fungsi dari peralatan yang digunakan secara benar.

  Pendahuluan Mikrobiologi merupakan suatu ilmu yang mempelajari tentang kehidupan

mikroorganisme meliputi morfologi, struktur, fungsi serta metabolisme yang dilakukan

dalam proses kelangsungan hidupnya yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang.

Dibutuhkan peralatan khusus yang mendukung untuk tercapainya tujuan dalam

pengamatan mikroorganisme.

  Peralatan yang digunakan haruslah dalam keadaan steril atau bebas dari kuman, bakteri, virus dan jamur. Perlu adanya pengetahuan tentang cara

• – cara atau teknik sterilisasi. Hal ini dilakukan karena alat
• – alat yang digunakan memiliki teknik sterilisasi yang berbeda (Dwidjoseputro, 2003).

  Sebelum melakukan praktikum, terlebih dahulu kita harus mengenal atau

mengetahui tentang peralatan yang digunakan dalam melakukan praktikum tersebut.

Hal ini berguna untuk mempermudah kita dalam melaksanakan percobaan, sehingga

resiko kecelakaan di laboratorium dapat ditanggulangi. Kebersihan dan kesempurnaan

alat sangat penting untuk bekerja di laboratorium. Alat yang kelihatan secara kasat

mata, belum tentu bersih, tergantung pada pemahaman seorang analis mengenai apa

artinya bersih. Alat kaca seperti gelas piala atau erlenmeyer paling baik dibersihkan

dengan sabun atau deterjen sintetik. Pipet, buret, dan labu volumetrik mungkin

memerlukan larutan deterjen panas untuk bisa bersih benar (Day dan Underwood,

1998).

  Prosedur Kerja

1. Simulasi/demo alat yang digunakan dan penjelasan cara kerja serta fungsi alat.

2. Praktek penggunaan alat dengan benar.

  Alat dan Fungsinya

  Peralatan yang digunakan dalam praktikum laboratorium mikrobiologi aukuatik meliputi:

  1. Ose / Jarum Inokulum (inoculating loop) Ose/ jarum merupakan jarum inoculum yang terbuat dari kawat nichrome atau

platinum, digunakan untuk menginokulasi mikrobia dari suatu media ke media lainnya.

Jarum inokulasi terbuat dalam dua bentuk yaitu bentuk ujung jarum yang berbentuk

lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop, dan yang

berbentuk lurus disebut inoculating needle/Transfer needle. Bentuk jarum ose

(inoculating loop) digunakan untuk melakukan streak di permukaan agar, sedangkan

inoculating needle digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab

inoculating). Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan mikroorganisme

untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru.

  2. Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube) Tabung reaksi merupakan peralatan kaca yang berfungsi sebagai wadah untuk

pengenceran, menumbuhkan mikroba dan pengujian biokimiawi. Tabung reaksi terbuat

dari dua macam model yaitu ada yang memiliki tutup dan ada yang tidak. Tabung reaksi

yang tidak memiliki tutup sebagai gantinya dapat ditutup dengan kapas, metal, plastik

atau aluminium foil. Tabung reaksi digunakan sebagai wadah yang diisi media padat,

semi padat dan cair. Tabung reaksi diisi media padat dalam bentuk media agar tegak

(deep tube agar) dan agar miring (slants agar).

  3. Cawan Petri (Petri Dish) Cawan petri merupakan wadah yang berfungsi untuk kegiatan isolasi, pemurnian

dan membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. Cawan petri terdiri dari berbagai ukuran

diameter. Cawan dengan diameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml,

sedangkan cawan berdiameter 9 cm dapat diisi media sebanyak 10 ml.

  4. Mikropipet (Micropippete) dan Tip Mikropipet merupakan peralatan mikrobiologi yang berfungsi untuk memindahkan cairan yang bervolume kecil, biasanya kurang dari 1000 μl. Mikropipet

memiliki ukuran yang beragam. Ada mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette ) antara 1μl sampai 20 μl, atau mikropipet

yang tidak bisa diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume

pipette ) misalnya mikropipet 5 μl. Dalam penggunaannya, mikropipet memerlukan tip.

  5. Gelas ukur (Graduated Cylinder) Gelas ukur berfungsi untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya.

  6. Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask) Labu erlenmeyar berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan Labu

Erlenmeyer juga dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan

sebagai penyusun komposisi media, menampung akuades, kultivasi mikroba dalam

kultur cair, dll. Ukuran erlenmeyer beragam sesuai dengan kebutuhan volume cairan

yang akan digunakan. Volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25 ml, 50 ml, 100

ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb.

  7. Beaker Glass Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Beaker glass dapat digunakan untuk preparasi media, menampung akuades dll.

8. Batang L (L Rod) disebut juga spreader.

  Batang L berfungsi dalam isolasi dan pembiakan mikroba yaitu untuk

menyebarkan cairan di permukaan media supaya mikroba yang tersuspensi dalam cairan

tersebut tersebar merata.

  9. Tabung Durham (Durham Tube) Tabung durham berfungsi untuk menampung hasil fermentasi mikroorganisme

berupa gas. Tabung durham bentuknya seperti tabung reaksi namun memiliki ukuran

lebih kecil dibanding tabung reaksi. Tabung durham itu ditempatkan terbalik di dalam

tabung reaksi yang lebih besar dan tabung ini kemudian diisi dengan medium cair.

Setelah seluruhnya disterilkan dan medium sudah dingin, maka dapat dilakukan

inokulasi. Jika bakteri yang ditumbuhkan dalam media tersebut memang menghasilkan

gas, maka gas akan tampak sebagai gelembung pada dasar tabung durham.

  10.Termometer (thermometer) Termometer berfungsi untuk mengukur suhu suatu larutan atau ruang inkubator.

Prinsip kerjanya yaitu mengukur suhu sesuai laju air raksa di dalam thermometer.

Termometer adalah batang kaca yang panjangnya 300 mm, diameter 6-7 mm berisi air

raksa dan gas, serta dilengkapi dengan skala derajat Celcius.

  Apparatus

  1. Autoklaf (Autoclave) Autoklaf merupakan alat pemanas yang digunakan untuk mensterilisasi suatu alat atau bahan menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (121

  C, 15 lbs) selama

kurang lebih 15 menit. Suhu yang tinggi akan membunuh microorganisme. Autoklaf

ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri,

tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Endospora dapat dibunuh pada

suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer normal. Pada suhu

121 °C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, dimana sel vegetatif bakteri

dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu 65 °C. Perhitungan waktu

sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai 121 °C. Jika objek

yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian dalam autoklaf

akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total untuk

memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 °C untuk waktu 10-15 menit.

Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar akan diautoklaf

karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mencapai suhu

sterilisasi.

  2. Oven Oven berfungsi untuk sterilisasi kering. Alat-alat yang disterilkan menggunakan

oven antara lain peralatan gelas seperti cawan petri, tabung reaksi, dll. Sterilisasi kering

o dengan oven dilakukan dengan cara memanaskan pada suhu 180 C selama 1 jam.

  3. Hot plate stirrer dan Stirre bar

  Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk

menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan. Pelat (plate) yang terdapat dalam

alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi.

Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-100

dari SBS® misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L, dengan kecepatan sangat

o lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425 C.

  4. Pembakar Bunsen (Bunsen Burner) Bunsen adalah salah satu alat yang berfungsi untuk mensteril. Api yang menyala

dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan

kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Dalam sterilisasi jarum ose

atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api

yang berwarna biru (paling panas).

  5. Inkubator (Incubator) Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu.

  6. Penangas air (Water bath) Penangas air berfungsi untuk menyimpan media agar (yang digunakan untuk

analisa dengan teknik tuang/pure plate ) supaya media tetap dalam kondisi leleh/cair,

o bisanya suhu diatur pada kisaran 40-45

  C. Untuk menjaga air pada penangas air tidak

terkontaminasi mikro organisme maka perlu ditambahkan citric acid 0.3% dan

potassium sorbat 0.1%. 7. pH Meter pH meter berfungsi untuk mencek derajat keasaman/pH media, karena derajat keasaman sangan berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroba.

  8. Timbangan digital / neraca digital Neraca digital berfungsi untuk menimbang media dan juga sample atau contoh uji saat preparasi.

9. Biological Safety Cabinet / Laminar Air Flow

  Biological Safety Cabinet (BSC) atau disebut juga Laminar Air Flow (LAF)

adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola

pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasisinar UV

beberapa jam sebelum digunakan.

  10. Colony counter Colony counter adalah alat yang berfungsi untuk mempermudah perhitungan

koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawan karena adanya kaca pembesar.

  

Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk

pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat

ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset.

  11. Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope) Mikroskop Cahaya merupakan salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme.

Kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Pada

umumnya mata tidak mampu membedakan benda dengan diameter lebih kecil dari 0,1

mm.

  12. Mikroskop stereo (Zoom Stereo Microscope) Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek yang membutuhkan perbesaran

tidak terlalu besar. Di Laboratorium Mikrobiologi, mikroskop stereo biasanya

digunakan untuk mengamati secara detail bentuk koloni dan jamur.

  Alat-alat lain yang perlu diketahui di laboratorium mikrobiologi: pelobang sumuran, haemositometer, kaca obyek, kaca obyek cekung, shaker incubator, shaker resiprok, vortex, glass pin, kaca penutup, pinset, gelas arloji, disk blank, disk antibiotik, filter bakteri, tabung Durham.

  Pertanyaan:

  1. Jelaskan berbagai peralatan yang digunakan beserta fungsinya dalam praktikum mikrobiologi!

  2. Coba jelaskan prinsip kerja alat autoclave!

  3. Jelaskan perbedaan fungsi dari peralatan autoclave dengan oven!

  Lembaran Pengamatan

  

LATIHAN 1

PENGENALAN PERALATAN LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

  Nama/NIM : Fakultas/Program Studi : Hari/Tanggal : Group/Kelompok :

  No. Nama Alat Gambar Fungsi/Kegunaan

  

LATIHAN 2

STERILISASI

Tujuan:

  1. Mengetahui beberapa metode sterilisasi alat dan bahan dalam pengamatan mikrobiologis.

  2. Mengetahui perbedaan metode sterilisasi serta dapat melakukannya sesuai prosedur.

  Pendahuluan

  Sterilisasi merupakan suatu proses pembebasan bahan atau alat dari semua bentuk organism hidup. Berdasarkan alat yang digunakan maka sterilisasi ada dikelompokan atas 2 yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi kering. Sterilisasi basah menggunakan autoclave, umumnya yang disterilkan bahan-bahan mengandung air seperti media, aquades atau larutan lainnya. Sedangkan sterilisasi kering menggunakan oven, umumnya yang disterilkan peralatan peralat seperti tabung reaksi, cawan petri dll.

  Berdasarkan prosedur kerja maka sterilisasi dibedakan atas sterilisasi secara fisik, mekanik dan kimiawi. Sterilisasi secara fisik adalah sterilisasi yang dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran. Pemanasan (pembakaran) secara langsung seperti pemanasan jarum ose atau pinset, pemanasan kering dengan menggunakan oven. Sterilisasi secara kimiawi dengan cara menyemprot atau membilas alat dengan desinfektan dan anti septik. Sedangkan sterilisasi secara mekanik adalah sterilisasi menggunakan saringan berpori sangat kecil antara 0.22 mikron sampai 0.45 mikron sehingga mikroba tertahan pada saringan biasa disebut sebagai sterilisasi mekanik. Cara ini biasanya dilakukan untuk sterilisasi bahan yang tidak tahan atau peka terhadap panas seperti antibiotik ataupun senyawa enzim.

  Berbagai metode sterilisasi

  1. Sterisasi Fisik

  a. Pemanasan basah menggunakan autoclave

• Pemanasan melalui penguapan (uap air) menggunakan autoclave pada suhu 121 C dengan tekanan 15 psi/2 atm selama 15 menit:
• Merebus (boiling)
• Pasteurisasi

• HTST (high temperature short time): pemanasan pada suhu 72 C selama 15 detik
• LTLT (low temperature short time): pemanasan pada suhu 65 C selama 30 menit

  b. Pemanasan kering dengan pembakaran atau penggunaan oven

• Pembakaran (incenerasi)
• Pemanasan menggunakan oven dengan adanya udara panas pada suhu 180 C selama 2 jam atau pada suhu 210 C selama 30 menit

  c. Radiasi (dengan sinar ultra violet)

  2. Secara Kimia

  a. Penggunaan desinfektan dan anti septik

  b. Penggunaan pengawet

  c. Penggunaan antibiotic

  Gambar 2. Sterilkan meja kerja sebelum melakukan kegiatan

  3. Secara Mekanik Filtrasi (penyaringan cairan atau penyaringan udara)

  Pelaksanaan Praktikum: Bahan dan Alat

  Bahan : Aquadesh, alkohol 70%, spritus, aluminium foil, kapas, plastik, kertas label, lakban bening, selotip, serbet/lap tangan, tali (benang bola), tisu gulung, kain kasa steril, kapas, kertas minyak/layang-layang, wipol (desinfektan). Alat : tabung reaksi, cawan petri, erlenmeyer, batang pengaduk, beaker glas, jarum ose, mikro pipet, pinset, botol aquades, botol semprot/spyer, tabung durham, autoclave, oven.

  Prosedur Kerja

  a. Sterilisasi Kering (menggunakan oven)

  1. Peralan kaca seperti awan petri dan tabung reaksi dicuci bersih lalu mengeringkan peralatan

  2. Peralatan kaca tersebut dibungkus dengan kertas minyak/layang-layang

  3. Peralatan yang sudah dibungkus dimasukan kedalam oven lalu atur suhu 180 C selama 2 jam atau pada suhu 210 C selama 30 menit

  4. Tekan tombol power

  5. Setelah 2 jam atau 30 menit (tergantung suhu yang digunakan), turunkan suhu dan matikan tombol power.

  6. Setelah suhu turun, peralatan yang telah disterilkan tersebut diambil dan dikeluarkan dari dalam oven lalu diletakkan di tempat yang bersih.

  b. Sterilisasi Basah (menggunakan autoklaf)

  1. Peralatan dan media yang akan disterilkan dibungkus dengan kertas minyak/layang-layang aluminium poil dan plastic tahan panas

  2. Masukkan semua alat dan media yang sudah disiapkan ke dalam keranjang dan masukkan ke dalam autoclave

  3. Tutup dengan rapat dan kunci pintu autoklaf

  4. Tekan tombol On

  5. Atur suhu 121 C pada tekanan 15 psi (2 atm) selama 15 menit 6. Tekan tombol Enter, sterilisasi akan berakhir pada saat alaram berbunyi.

  7. Tekan tombol off, biarkan beberapa menit sampai suhu dalam autoklaf turun.

  8. Buka pintu autoklaf dan keluarkan alat dan bahan yang telah disterilkan tadi.

  c. Sterilisasi Kimiawi

  1. Peralatan cawan petri dan gelas obyek (terbuat dari bahan gelas) dicuci hingga bersih lalu dikeringkan peralatan dengan kain lap halus.

  2. Siapkan larutan alkohol (70%).

  3. Siapkan kapas steril.

  4. Tuangkan larutan alkohol secukupnya pada kapas steril kemudian menggosokkan pada cawan dan gelas obyek secara merata.

  Kerja Aseptis:

  1. Sebelum mulai kerja tangan disemprot dengan alcohol 70%

  2. Lingkungan kerja, meja disemprot dengan alcohol

  3. Peralatan dan bahan yang sudah disterilkan seperti tabung/cawan/Erlenmeyer sebaikknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminasi masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.

  4. Peralatan pinset, batang L, spider, dan lain-lain dapat disemprot alcohol terlebih dahulu lalu dibakar.

  5. Jarum ose yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi.

  6. Jika bekerja di ruang safety cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tapi jika diluar safety cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya.

  Pertanyaan:

  1. Apa yang dimaksud dengan sterilisasi, steril dan sterilitas?

  2. Mengapa peralatan yang akan digunakan harus disterilkan?

  3. Jelaskan pengertian aseptic dan bagaimana prinsip kerja secara aseptic!

  Lembaran Pengamatan

LATIHAN 2

STERILISASI

  Nama/NIM : Fakultas/Program Studi : Hari/Tanggal : Group/Kelompok :

  No. Nama Alat Metode Steril Suhu dan Waktu

  

LATIHAN 3

MEMBUAT MEDIA PERTUMBUHAN

Tujuan: 1. Mengetahui berbagai jenis dan fungsi media.

2. Mengetahui cara membuat media pertumbuhan.

  Pendahuluan

  Media pertumbuhan mikroba dibutuhkan mulai dari proses isolasi sampai pada tahap pengamatan. Media pertumbuhan mikroorganisme adalah media yang mengandung berbagai zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhan dan perkembangannya. Unsur-unsur tersebut terdiri dari unsur makro (C,H,O, N dan P) dan unsur mikro (Fe, Mg serta vitamin) dan bahan tambahan lainnya seperti phenol red yang berfungsi sebagai indikator kemasaman media dan antibiotik. Media pertumbuhan bagi mikrobia ini dapat bentuk media cair ataupun media padat.

  Bahan penyusun media pertumbuhan mikroba umumnya terdiri dari bahan dasar seperti air sebagai pelarut dan agar atau gelatin ataupun silica gel yang berfungsi memadatkan media. Media pertumbuhan dibedakan juga berdasarkan sifat fisik, komposisi penyusunnya serta tujuan.

  Macam-Macam Media Pertumbuhan

  1. Media Berdasar Sifat Fisik

  a. Media padat (solid) adalah media yang mengandung agar 1-2% sehingga setelah dingin media menjadi padat.

  b. Media setengah padat (semi solid) adalah media yang mengandung agar 0.3 - 0.4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat dan tidak begitu cair.

  c. Media cair (liquid) adalah media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (nutrient broth), LB (lactose broth).

  2. Media Berdasarkan Komposisi

  a. Media sintesis adalah media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose agar, Mac conkey agar. b. Media semi sintesis adalah media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misalnya PDA (potato dextrose agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang.

  c. Media non sintesis adalah media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalya tomato juice agar, brain heart infution agar, pancreatic.

  3. Media Berdasarkan Tujuan

  a. Media untuk isolasi: Media ini mengandung semua senyawa essensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya nutrient broth, blood agar.

  b. Media selektif/penghambat: Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambahn suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan, seperti Luria bertani medium yang ditambah amphisilin untuk merangsang e.coli, resisten antibiotic dan menghambat kontaminan yang peka.

  c. Media diperkaya (enrichment): Media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang tumbuh pada media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembangbiak, tetapi membutuhkan komponen kompleks: blood tellurite agar, bile agar, serum agar.

  d. Media untuk peremajaan kultur: Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur.

  e. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik: Media ini digunakan untuk mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba.

  f. Media untuk karakterisasi bakteri: Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indicator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia.

  g. Media differsial: bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasakan karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diffential.

  Beberapa syarat yang harus dipenuhi sebagai media biakan yaitu : 1) Mengandung

  

nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme yang berkembang, 2) Memiliki

kelembaban optimum bagi pertumbuhan mikroorganisme, 3) Mengandung oksigen

  (kultur bakteri aerob) dan pH sesuai serta 4) Harus bebas dari mikroba lain dan steril.

  Bahan dan Alat

  Bahan : Aquadesh, Media Nutrien Agar (NA), Media Nutrien Broth (NB), Media PDA, Tryptone Soya Agar (TSA), kapas, kertas layang, plastik, alkohol 70%, spritus, kapas steril, aluminium foil, tissu, kertas label.

  Alat: Lampu bunsen, cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, timbangan, hot plate, stirer, batang pengaduk, spatula, autoklaf, beaker glas, jarum ose, mikro pipet, pinset, gelas ukur, rak tabung reaksi, botol aquades, botol semprot/spyer, timbangan digital, autoclave, oven, incubator, lemari pendingin/freezer, stirer, vortex.

  Prosedur Kerja

A. Pembuatan Media Umum (Cara I):

  1. Timbang media sesuai prosedur di kemasan. Media ditimbang secara hati-hati lalu masukkan kedalam Erlenmeyer

  2. Media yang ada di erlemnmeyer ditambah aquades dan aduk sampai homogen dengan batang 
pengaduk 


  3. Setelah homogen media dipanaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen 
pemanas sambil diaduk sampai media tercampur homogen (ditunjukkan dengan warna yang kuning jernih). Perhatian: pada saat

  pemanasan jangan sampai terbentuk buih berlebihan sampai meluap!

  


  4. Media dituangkan ke dalam tabung reaksi dengan volume tertentu menggunakan pipet volume: 5 ml untuk agar miring, 10 ml untuk agar tegak, lalu diautocklaf.

  Tutup tabung reaksi dengan penutup tabung (penutupan jangan terlalu rapat!) 


  5. Media NB dituangkan ke dalam tabung reaksi masing- masing tabung reaksi 8 ml. Tutup tabung reaksi dengan kapas atau penutup tabung (penutupan jangan

  terlalu rapat!) 


  6. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan o autoklaf selama 15 menit, tekanan 1 atm 121

  C. (Pelajari cara mengoperasikan

  autoklaf dengan benar!)

  


  7. Setelah diotoklaf: media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak tabung dan biarkan memadat, media NA 5 ml inkubasikan miring dan biarkan memadat. Media sisa NA tuangkan dalam cawan petri dan biarkan o memadat. Media NA 15 ml dibiarkan sampai suhu 45-50 C (untuk isolasi mikroorganisme

  ). 


  8. Media NB dalam tabung reaksi biarkan dingin. Seluruh media NA dan NB ini akan digunakan untuk percobaan selanjutnya.

  Gambar 3. Pembuatan media agar

B. Pembuatan Media Umum (Cara II):

  Bahan yang diperlukan antara lain: kentang sebanyak 100 gram, dektrosa 5 gram, aga 15 gram dan aquadest sebanyak 500 ml Cara Kerja

  1. Kentang dikupas dan iris, lalu cuci bersih dan selanjutnya direbus dengan aquadest selama 1-2 jam 


  2. Ekstrak kentang disaring menggunakan penyaring sampai 500 ml

  3. Ekstrak kentang ditambah agar dan dektrosa, aduk hingga 
homogeny serta didihkan diatas kompor atau hot plate stirrer. 
 4. pH diatur hingga 5- 6 dengan 
menambahkan HCl atau NaOH dan ukur den gan pH meter. 


5. Masukkan larutan ke dalam erlenmeyer atau dapat langsung 
dibuat agar

  pinggan atau agar miring 
 6. Sterilkan media dengan autoklaf 


  Nutrien Broth (NB) Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai pemadat. Proses pembuatannyapun lebih sederhana, tidak memerlukan panas, peptone dan beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk.

C. Pembuatan Media Selektif:

  MgSO4. 7H2O, 1 g Na2CO3, 20 g agar, 0,25 g CMC, 0,25 g xylan, 0,25 g lignin, 0,25 g mannan.

  3. Setelah homogen media dipanaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen 
pemanas sambil diaduk sampai media tercampur homogen

   Setelah diotoklaf: media dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak tabung dan biarkan memadat atau miring dan biarkan memadat.

  
 6.

  autoklaf dengan benar!)

  C. (Pelajari cara mengoperasikan

  5. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit, tekanan 1 atm 121 o

  Tutup tabung reaksi dengan penutup tabung (penutupan jangan terlalu rapat!) 


  4. Media dituangkan ke dalam tabung reaksi dengan volume tertentu menggunakan pipet volume: 5 ml untuk NA miring, 10 ml untuk NA tegak, lalu diautocklaf.

  2. Media yang ada di erlemnmeyer ditambah aquades dan aduk sampai homogen dengan batang 
pengaduk 


  Media selektif Czapek Dox Agar (CDA) yang dimodifikasi (Yunilas, 2016) untuk isolasi fungi selulolitik yaitu: 0,2% NaNO

  1. Timbang semua bahan sesuai formulasinya, lalu masukkan kedalam Erlenmeyer

  Media selektif yang dimodifikasi (Yunilas et al., 2013) untuk isolasi bakteri

lignoselulolitik menggunakan: (0,5 g pepton, 0,5 g yeast agar, 0,1 g K2HPO4, 0,02 g

  2 PO 4 ; 0,04% yeast ekstrak; 2% agar dan 1% (masing- masing CMC, xylan, lignin dan manan), streptomisin 0,01 %, pH diatur 4,5.

  2 O; 0,05% KH

  4 .7H

  0.001% FeSO

  2 O;

  3 ; 0,05% KCL; 0,05% MgSO 4 .7H

  Prosedur Kerja

  Pertanyaan:

  1. Jelaskan pengertian dan fungsi media pertumbuhan!

  2. Mengapa media pertumbuhan yang akan digunakan harus disterilkan?

  3. Jelaskan cara membuat media umum untuk pertumbuhan bakteri!

  4. Pada pembuatan media selektif ada bahan tertentu dimasukkan, apa tujuan dari penambahan bahan tersebut? Lembaran Pengamatan

  

LATIHAN 3

MEMBUAT MEDIA PERTUMBUHAN

  Nama/NIM : Fakultas/Program Studi : Hari/Tanggal : Group/Kelompok :

  No. Nama Bahan Formula Metode Sterilisasi

  Suhu dan Waktu

  

LATIHAN 4

ISOLASI BAKTERI DARI LINGKUNGAN AKUATIK

  Tujuan:

  1. Mengetahui teknik mengisolasi bakteri dengan benar

  2. Mengkarakteristik koloni bakteri yang diisolasi dari lingkungan aquatik Pendahuluan

  Mikroba ditemukan di alam dalam kondisi campuran dan hampir tidak

ditemukan sebagai spesies tunggal. Mereka melakukan aktivitas secara bersama-sama

dengan membentuk suatu hubungan yang saling bersinergis, simbiosis, suksesi, bahkan

ada yang bersifat antagonis. Untuk melakukan pengamatan terhadap mikroorganisme

biasanya diperlukan suatu teknik pemisahan spesis-spesis yang berbeda dari populasi

campuran atau biakan campuran menjadi spesies-spesies tunggal sebagai biakan murni.

  Isolasi mikroorganisme adalah suatu upaya pemindahan mikroba diluar dari

lingkungan alamiahnya untuk mendapatkan biakan murni. Pemisahan mikroorganisme

dari lingkungan bertujuan untuk memperoleh biakan murni yang sudah tidak bercampur

lagi dengan mikroba lainnya. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis

mikroba dengan mikroba lainnya yang terdapat pada suatu substrat atau lingkungan

sekitarnya. Sehingga dalam mempelajari ilmu mikroorganisme kita harus mengerti dan

  memahami bagaimana mendapatkan mikroba murni dengan cara mengisolasi dan memisahkan mikrobia tersebut sesuai dengan tujuannya. Melalui isolasi kita dapat mempelajari morfologi, biologi ataupun karakteristik mikrobia tersebut.

  Sifat hidup bakteri secara umum adalah sapotrofik pada sisa buangan hewan

ataupun tanaman yang sudah mati, tetapi banyak juga parasitik pada hewan, manusia,

dan tanaman dengan menyebabkan banyak penyakit (Suriawiria 2008). Menurut

Waluyo (2007), pengamatan bekteri dapat dilakukan secara individual, satu per satu,

maupun secara kelompok dalam bentuk koloni. Bila bakteri yang ditumbuhkan di dalam

medium yang tidak cair, maka akan terjadi suatu kelompok yang dinamakan koloni.

  

Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk tersebut merupakan ciri

khas bagi suatu spesies tertentu.

  Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu

antara lain: sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi, tempat hidup atau asal

mikroba tersebut, medium pertumbuhan yang sesuai, cara menginokulasi mikroba, cara

menginkubasi mikroba, cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa kultur

murni dan sesuai dengan yang dimaksud dan cara memelihara agar mikroba yang telah

diisolasi tetap merupakan kultur murni.

  Bahan dan Alat:

  Bahan : Sampel sumber isolat berupa air kolam, air laut atau air di daerah rawa-rawa, Aquadesh, Media Nutrien Agar (NA), media agar seletif dimodifikasi (Yunilas, 2013), kapas, kertas layang, plastik, alkohol 70%, spritus, aluminium foil, tissu, kertas label,

  Alat: Lampu Bunsen, cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet volumetrik, timbangan, botol sampel, hot plate, stirer, batang pengaduk, spatula, autoklaf, ikubator.

  Prosedur Kerja:

  1. Sampel air kolam diambil dengan menggunakan botol steril. Botol yang telah berisi air hasil sampling dimasukkan ke dalam coolbox untuk menjaga agar bakteri tidak mati kemudian dibawa ke laboratorium untuk dianalisis.

  2. Sampel dipindahkan ke tabung reaksi steril setelah sampai dilaboratorium

  3. Siapkan media agar selektif, lalu lakukan isolasi menggunakan metode goresan pada media agar dengan cara membakar jarum ose supaya steril dan kemudian dicelup pada sampel air.

  4. Jarum yang telah di celup digoreskan pada media agar selektif.

  4. Media yang sudah diinokulasi, diinkubasi selama 24 C untuk

• – 48 jam pada suhu 37 pengamatan mikroba yang tumbuh.

  5. Koloni yang tumbuh diamati morfologinya meliputi bentuk, elevasi, tepi dan warna koloni.

  6. Koloni bakteri yang sudah tumbuh pada medium agar umum (selektif) dipindahkan lagi ke medium yang baru untuk mendapatkan isolate murni.

  7. Pemurnian dilakukan sampai diperoleh koloni tunggal menggunakan metode cawan gores (streak plate). Isolat murni yang telah diperoleh disimpan di dalam agar miring Nutrient Agar (NA).

  Pertanyaan:

  1. Coba jelaskan pengertian isolasi dan inokulasi!

  2. Jelaskan metode yang dapat dilakukan dalam inokulasi!

  

3. Jelaskan karakteristik pertumbuhan miktoba pada media padat dan media cair!

  Gambar 4. Morfologi Koloni Mikrobia

  Lembaran Pengamatan

LATIHAN 4

ISOLASI BAKTERI DARI LINGKUNGAN AQUATIK

  Nama/NIM : Fakultas/Program Studi : Hari/Tanggal : Group/Kelompok :

  Hasil dan Pengamatan MorfolobiKoloni Bakteri

  Kode Isolat Ukuran Bentuk Elevasi Pinggir Warna

  

LATIHAN 5

TEKNIK BIAKAN MURNI

Tujuan:

  1. Mengetahui prinsip dasar teknik biakan

  2. Mendapatkan 1 jenis mikroorganisme yang diinginkan

  Pendahuluan Teknik biakan murni pertama kali dilakukan oleh Robert Koch pada tahun 1843

• – 1910, seorang ahli kebangsaan Jerman. Bakteri yang dimurnikan adalah bakteri

  Bacillus anthracis penyebab penyakit antrax pada sapi dan domba di Eropa pada saat

  itu. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu jenis mikroorganisme,

  sedangkan biakan campuran adalah biakan yang terdiri dari berbagai jenis

  mikroorganisme.

  Biakan murni dari suatu biakan campuran dapat diperoleh dengan beberapa

metode. Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain

digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural

morfologi, fisiologi, dan serologi dibutuhkan mikroorganisme yang berasal dari satu

spesies.

  Gambar 5. Menuang media secara aseptis Gambar 6. Memindahkan biakan secara aseptis

  Metode Teknik Biakan Murni

1. Metode cawan gores (streak plate method) Metode ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu.

  

metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan

terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Ada beberapa tipe goresan yaitu:

sinambung, radian, kuadran dan goresan T.

  Gambar 7. Streak PlateMethod secara Goresan Sinambung Gambar 8. Streak Plate Method secara Goresan T

2. Metode cawan sebar (spread plate method)

  Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni terse but dapat dihitung.


  Gambar 9. Metode agar sebar dan agar tuang

3. Metode cawan tuang (pour plate method)

  Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada o temperatur 45-50 C dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni- koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut.

  Bahan dan Alat Bahan: Media NA, PDA, kultur bakteri, kultur jamur, wipol, alcohol.

  Alat:

  Cawan petri, tabung reaksi, pipet serologi, propipet, jarum ose noddle, hockey stick, spatula, vortex, lampu Bunsen, Incubator, Pemanas air.

  Prosedur Kerja:

  1) Metode Cawan Gores

  1. Tuang media agar NA cair ke dalam cawan petri secara aseptis, lalu biarkan memadat.

  2. Inokulasi satu ose bakteri dari biakan campuran ke dalam media NA tadi dengan cara menggores sesuai tipe goresan yang diinginkan (radian, kuadran, sinambung, tipe goresan T).

  3. Media NA yang telah diinokulasi, dibungkus dengan kertas pembungkus, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C.

  4. Amati pertumbuhan bakterinya!

  b) Metode Cawan Tuang

  1. Ambil 1 ose koloni bakteri dari biakan campuran secara aseptis lalu dimasukan

• 2 ke tabung reaksi berisi aquadest steril, kemudian lakukan seri pengeceran 10 .
• 1

  2. Ambil sebanyak 0,1 mL dan diinokulasi ke dalam media agar NA cair suhu berkisar 45-50 C.

  3. Media NA yang sudah diinokulasi tersebut di vortex supaya homogen.

  4. Tuang media NA tersebut ke dalam cawan petri secara aseptis.

  5. Ratakan dengan cara memutar membentuk angka delapan, lalu dibiarkan memadat.

  6. Bungkus media agar NA tersebut dengan kertas pembungkus, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C.

  7. Amati pertumbuhan bakterinya!

  c) Metode Cawan Sebar

  1. Tuang media agar NA cair ke dalam cawan petri secara aseptis, lalu biarkan memadat.

  2. Siapkan 3 tabung masing masing berisi 10 mL, 9 mL dan 9 mL aquadest.

  3. Ambil 1 ose koloni bakteri dari biakan campuran secara aseptis lalu dimasukan ke tabung reaksi berisi aquadest steril 10 ml, kemudian lakukan seri pengeceran dan dihomogen dengan vortex, hasilnya disebut suspensi.

  4. Ambil 1 ml suspense kemudian diinokulasi pada tabung reaksi kedua berisi 9 mL aquadest, demikian juga pada tabung selanjutnya.

  5. Hasil pengenceran dari tabung 2 dan 3 diambil masing-masing sebanyak 0,1 mL dan diinokulasi ke dalam media agar NA yang telah memadat tadi.

  6. Hockey stick disterilkan dengan cara dicelup pada alcohol dan dibakar.

  7. Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan hockey stick secara merata dan biarkan sampai permukaan agar mengering. 


  8. Setelah mengering, bungkus dengan kertas pembungkus, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C.

  9. Amati pertumbuhan bakterinya!

  d) Teknik Biakan Murni untuk jamur/fungi

  1. Tuang media agar PDA cair dituang ke dalam cawan petri secara aseptis, lalu biarkan memadat.

  2. Ambil spora atau meselium dari biakan campuran, kemudian inokulasi secara aseptis ke dalam media PDA dengan cara menotolkannya pada permukaan media.

  3. Bungkus dengan kertas pembungkus, selanjutnya diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang atau 29 C.

  4. Amati pertumbuhan koloni fungi/jamur!

  Pertanyaan:

  1. Jelaskan tujuan melakukan biakan murni!

  2. Jelaskan beberapa metode yang dapat dilakukan dalam biakan murni!

  Lembaran Pengamatan

LATIHAN 5

TEKNIK BIAKAN MURNI

  Nama/NIM : Fakultas/Program Studi : Hari/Tanggal : Group/Kelompok :

  No. Kode Isolate Metode Inokulasi Jenis Media Pengamatan

  

LATIHAN 6

PENGAMATAN MORFOLOGI PROTOZOA

Tujuan:

1. Mengetahui morfologi protozo dari sampel air

  2. Mengidentifikasi spesies protozoa dari sampel air

  Pendahuluan

  Protozoa (protista) adalah hewan bersel satu, berinti sejati dan tidak memiliki dinding sel. Bentuk tubuh setiap protozoa berbeda-beda antara satu dengan yang lainnya, pada fase yang berbeda dalam siklus hidupnya. Berdasarkan pergerakannya, protozoa dikelompokkan atas yaitu Flagellata (bergerak menggunakan flagel, misalnya Trypanosoma dan Tricomanas), Rhizopoda (bergerak dengan pseudopodia atau kaki semu, misalnya Amoeba), Ciliata (bergerak dengan cilia atau rambut getar, misalnya Paramecium), dan Sporozoa (tidak memiliki alat gerak, misalnya Plasmodium Sp.).

  Pada umumnya protozoa hidup soliter pada habitat yang beragam. Sebagian besar hidup di air laut atau air tawar, misalnya di selokan, kolam, sungai, danau, rawa ataupun genangan air. Disamping itu, ada juga yang hidup di tanah, pohon dan batu. Protozoa berperan sebagai pen gendalikan populasi bakteri dengan jalan memangsa

  

bakteri sebagai makanannya, sehingga dapat mengontrol jumlah populasi Bakteri di

alam. Sebagian protozoa berperan sebagai plankton (zooplankton) dan benthos yang

menjadi makanan hewan air, terutama udang, kepiting, ikan, dll. Fosil Foraminifera

menjadi petunjuk sumber minyak, gas, dan mineral.

  Protozoa dapat menyebabkan penyakit pada manusia dan hewan ternak. Jenis

penyakit Protozoa yang disebabkan oleh Protozoa antara lain: Entamoeba

histolytica (penyakit disentri), Balantidium coli (Penyakit Diare/Balantidiosis),

  Bahan dan Alat

  Bahan: air kolam ikan, air kolam udang, air rawa Alat: Mikroskop, Object Glass, Cover Glass, Handscone, Masker (b/p), Pipet tetes, Tissue