Penuntun Prkatikum Mikrobiologi Peternakan

  PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI P E T E R N A K A N

Disusun Oleh:

  Dr. Ir. YUNILAS, M.P NIP. 196806111993032001 PROGRAM STUDI PETERNAKAN FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

FEBRUARI, 2017

KATA PENGANTAR

  Puji dan Syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT Tuhan semesta alam berkah rahmad dan hidayah-Nya penulis telah dapat menyelesaikan buku Modul Praktikum Mikrobiologi Peternakan pada Program Studi Peternakan, Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.

  Buku ini dibuat sebagai panduan mahasiswa dalam melakukan praktikum Mikrobiologi Peternakan pada Program Studi Peternakan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara. Beberapa materi disajikan dengan harapan dapat memperkaya wawasan pengetahuan praktis tentang mikrobiologis khususnya dibidang peternakan. Selain membaca buku ini, mahasiswa diharapkan mencari buku-buku penunjang lain yang berhubungan dengan materi yang di praktikumkan sebagai sumber literatur.

  Penulis menyadari buku ini masih banyak kekurangan, oleh karena itu kritik dan saran demi penyempurnaan buku ini dimasa yang akan mendatang sangat diharapkan. Akhir kata penulis berharap buku ini dapat bermanfaat bagi mahasiswa yang akan melakukan praktikum.

  Medan, Februari 2017 Penulis

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR

  i …………………………………………………..

DAFTAR ISI

  ii …………………………………………………………….

TATA TERTIB PRAKTIKUM

  iii ……………………………………….. Latihan 1. Pengenalan Alat

  1 ……………………………………………

  Latihan 2. Sterilisasi 9 ………………………………………………….

  Latihan 3. Media Pertumbuhan Mikroorganisme...

  14 ……………………

  Latihan 4. Teknik Isolasi Mikroorganisme

  20 ……………………………

  Latihan 5. Teknik Biakan Murni

  26 ………………………………………

  Latihan 6. Uji Aktifitas Enzim Secara Kualitatif

  32 ……………………... Latihan 7. Pengamatan Bakteri Secara Mikroskopis

  35 …………………. Latihan 8. Pengamatan Fungi/Khamir Secara Mikroskopis

  39 ………….. Latihan 9. Penghitungan Jumlah Mikroba Menggunakan Metode Angka Lempeng Total (ALT)

  42 …………………………..….. Latihan 10. Penghitungan Jumlah Mikroba Mengunakan Haemocytometer

  46 ……………………………………………

  Latihan 11. Pengaruh Lingkungan Terhadap Pertumbuhan Mikroba

  49 …. Latihan 12. Peran Mikroba Pada Bahan Pakan Ternak

  54 ………………… Latihan 13.

  57 Mikrobiologi Pada Produk Peternakan …….………………

DAFTAR PUSTAKA

  60

  ……………………………………………………

TATA TERTIB PRAKTIKUM

  1 Praktikan wajib hadir 15 menit sebelum praktikum dimulai, mengenakan jas Lab, masker, sarung tangan, sandal.

  2 Praktikan dan asisten wajib menguasai materi praktikum yang akan dilakukan.

  3 Praktikan tidak diperkenankan memasuki laboratorium sebelum praktikum dimulai.

  4 Meja kerja bebas dari peralatan pribadi seperti tas, hand phone, dompet dll.

  5 Praktikan dan asisten wajib memahami tentang keselamatan kerja (safety) laboratorium.

  6 Cuci tangan sebelum dan sesudah bekerja dengan antiseptic dan/atau sabun

  7 Meja kerja harus disterilisasi sebelum dan sesudah bekerja (tindakan aseptis)

  8 Praktikan yang merusak alat atau bahan kimia, baik dilakukan sengaja atau tidak sengaja, maka kelompok praktikum yang bersangkutan wajib mengganti alat atau bahan kimia tersebut dengan jenis dan kualitas yang sama.

  9 Setiap praktikum harus menjaga kebersihan laboratorium dan mengembalikan alat dan bahan yang telah digunakan ke tempat semula dalam kondisi yang seharusnya.

  10 Praktikan yang tidak mengikuti praktikum selama 3 (tiga) kali tanpa alasan yang dibenarkan tidak boleh mengikuti praktikum selanjutnya dan dianggap mengundurkan diri dari praktikum.

  11 Praktikan wajib menyerahkan laporan praktikum sebelumnya apabila akan mengikuti praktikum berikutnya.

  12 Penilaian dan penentuan nilai akhir menjadi wewenang dosen pengampu praktikum.

  

LATIHAN 1

PENGENALAN ALAT

Tujuan: 1. Mengenal peralatan digunakan dalam praktikum mikrobiologi.

2. Mengetahui fungsi dari peralatan yang digunakan secara benar dalam praktikum mikrobiologi.

  Pendahuluan Berbagai alat/peralatan serta mikroskop sangat penting diketahui sebelum

melakukan kegiatan pengamatan di laboratorium mikrobiologi. Masing-masing alat

mempunyai fungsi tersendiri seperti:

  1. Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube) Di laboratorium mikrobiologi, tabung reaksi berfungsi sebagai wadah

pengenceran, menumbuhkan mikroba dan untuk uji-uji biokimiawi. Tabung reaksi

dapat ditutup dengan kapas, metal, plastik atau aluminium foil. Tabung reaksi dapat

diisi dengan media padat, semi padat dan cair. Tabung reaksi yang diisi media padat

dapat diatur menurut fungsinya dalam dua bentuk, yaitu media agar tegak (deep tube

agar ) dan agar miring (slants agar). Agar miring dibuat dengan memperhatikan

kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu

sempit atau tidak terlalu lebar serta jarak media tidak terlalu dekat dengan mulut

tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Media yang diisi pada tabung reaksi

berkisar +1/3 bagian dari tabung.

  2. Cawan Petri (Petri Dish) Cawan petri berfungsi untuk kegiatan isolasi, pemurnian dan membiakkan

(kultivasi) mikroorganisme. Cawan petri terdiri dari berbagai ukuran diameter.

Cawan dengan diameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml,

sedangkan cawan berdiameter 9 cm dapat diisi media sebanyak 10 ml.

  3. Ose / Jarum Inokulum (inoculating loop) Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan mikroorganisme

untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum terbuat dari kawat

  

nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Jarum inokulasi

ada dalam dua bentuk. Bentuk ujung jarum yang berbentuk lingkaran (loop) dan

disebut ose atau inoculating loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut

inoculating needle/Transfer needle . Inoculating loop cocok untuk melakukan streak

di permukaan agar, sedangkan inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi

secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating).

  4. Mikropipet (Micropippete) dan Tip Mikropipet berfungsi untuk memindahkan cairan yang bervolume kecil,

biasanya kurang dari 1000 μl. Ada beberapa pilihan ukuran volume dalam

mikropipet, misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya

(adjustable volume pipette ) antara 1μl sampai 20 μl, atau mikropipet yang tidak bisa

diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette)

misa lnya mikropipet 5 μl. dalam penggunaannya, mikropipet memerlukan tip.

  5. Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask) Labu erlenmeyar berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan

Labu Erlenmeyer juga dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-

bahan sebagai penyususn komposisi media, menampung akuades, kultivasi mikroba

dalam kultur cair, dll. Ada beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat

ditampungnya yaitu 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb.

  6. Beaker Glass Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Di dalam mikrobiologi, dapat digunakan untuk preparasi media, menampung akuades dll.

  7. Gelas ukur (Graduated Cylinder) Gelas ukur berfungsi untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya.

8. Batang L (L Rod) disebut juga spreader.

  Batang L berfungsi dalam isolasi dan pembiakan mikroba yaitu untuk

menyebarkan cairan di permukaan media supaya mikroba yang tersuspensi dalam

cairan tersebut tersebar merata.

  9. Tabung Durham (Durham Tube) Tabung durham berfungsi untuk menampung hasil fermentasi

mikroorganisme berupa gas. Tabung durham bentuknya seperti tabung reaksi namun

memiliki ukuran lebih kecil dibanding tabung reaksi. Tabung durham itu

ditempatkan terbalik di dalam tabung reaksi yang lebih besar dan tabung ini

kemudian diisi dengan medium cair. Setelah seluruhnya disterilkan dan medium

sudah dingin, maka dapat dilakukan inokulasi. Jika bakteri yang ditumbuhkan dalam

media tersebut memang menghasilkan gas, maka gas akan tampak sebagai

gelembung pada dasar tabung durham.

  10.Termometer (thermometer) Termometer berfungsi untuk mengukur suhu suatu larutan atau ruang

inkubator. Prinsip kerjanya yaitu mengukur suhu sesuai laju air raksa di dalam

thermometer. Termometer adalah batang kaca yang panjangnya 300 mm, diameter 6-

7 mm berisi air raksa dan gas, serta dilengkapi dengan skala derajat Celcius.

  Apparatus

  1. Autoklaf (Autoclave) Autoklaf merupakan alat pemanas yang digunakan untuk mensterilisasi suatu alat atau bahan menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (121

  C, 15 lbs)

selama kurang lebih 15 menit. Suhu yang tinggi akan membunuh microorganisme.

Autoklaf ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi

oleh bakteri, tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Endospora dapat

dibunuh pada suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer

normal. Pada suhu 121 °C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, dimana

sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu 65 °C.

Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf

mencapai 121 °C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer

panas pada bagian dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan

waktu pemanasan total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 °C untuk

waktu 10-15 menit. Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam

volume besar akan diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang

lebih lama untuk mencapai suhu sterilisasi.

  2. Oven Oven berfungsi untuk sterilisasi kering. Alat-alat yang disterilkan

menggunakan oven antara lain peralatan gelas seperti cawan petri, tabung reaksi, dll.

o

  

Sterilisasi kering dengan oven dilakukan dengan cara memanaskan pada suhu 180 C

selama 1 jam.

  3. Hot plate stirrer dan Stirre bar Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk

menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan. Pelat (plate) yang terdapat

dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi.

Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-

100 dari SBS® misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L, dengan kecepatan

sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC.

  4. Pembakar Bunsen (Bunsen Burner) Bunsen adalah salah satu alat yang berfungsi untuk mensteril. Api yang

menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan

diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Dalam

sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk

memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas).

  5. Inkubator (Incubator) Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada

suhu yang terkontrol. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu.

  6. Penangas air (Water bath) Penangas air berfungsi untuk menyimpan media agar (yang digunakan untuk

analisa dengan teknik tuang/pure plate ) supaya media tetap dalam kondisi leleh/cair,

o

bisanya suhu diatur pada kisaran 40-45

  C. Untuk menjaga air pada penangas air

tidak terkontaminasi mikro organisme maka perlu ditambahkan citric acid 0.3% dan

potassium sorbat 0.1%. 7. pH Meter pH meter berfungsi untuk mencek derajat keasaman/pH media, karena derajat keasaman sangan berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroba.

  8. Timbangan digital / neraca digital Neraca digital berfungsi untuk menimbang media dan juga sample atau contoh uji saat preparasi.

  9. Biological Safety Cabinet / Laminar Air Flow Biological Safety Cabinet (BSC) atau disebut juga Laminar Air Flow (LAF)

adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola

pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasisinar UV

beberapa jam sebelum digunakan.

10. Colony counter

  Colony counter adalah alat yang berfungsi untuk mempermudah

perhitungan koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawan karena adanya

kaca pembesar. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran yang sangat

berguna untuk pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah koloni pada

cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset.

  11. Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope) Mikroskop Cahaya merupakan salah satu alat untuk melihat sel

mikroorganisme. Kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan

mata telanjang. Pada umumnya mata tidak mampu membedakan benda dengan

diameter lebih kecil dari 0,1 mm.

  12. Mikroskop stereo (Zoom Stereo Microscope) Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek yang membutuhkan perbesaran

tidak terlalu besar. Di Laboratorium Mikrobiologi, mikroskop stereo biasanya

digunakan untuk mengamati secara detail bentuk koloni dan jamur.

  Alat-alat lain yang perlu diketahui di laboratorium mikrobiologi: pelobang sumuran, haemositometer, kaca obyek, kaca obyek cekung, shaker incubator, shaker resiprok, vortex, glass pin, kaca penutup, pinset, gelas arloji, disk blank, disk antibiotik, filter bakteri, tabung Durham serta

  Bagian-Bagian Mikroskop A.

  Lensa Okuler mikroskop yaitu: lensa mikroskop yang terdapat di bagian ujung atas tabung, berdekatan dengan mata pengamat. Lensa ini berfungsi untuk memperbesar bayangan yang dihasilkan oleh lensa obyektif. Perbesaran bayangan yang terbentuk berkisar antara 4 sampai 25 kali.

  

B. Tabung mikroskop yaitu: di bagian atas tabung melekat lensa okuler, dengan

perbesaran tertentu (15 kali, 10 kali, dan 15 kali). Dibagian bawah tabung terdapat alat yang disebut revolver. Fungsi adalah u ntuk mengatur fokus yang dapat dinaikkan dan diturunkan dan sebagai penghubung antara lensa obyektif dan lensa okuler.

  

C. Revolver yaitu: pada revolver tersebut terdapat lensa objektif. Fungsi revolver

adalah m engatur perbesaran lensa objektif dengan cara memutarnya

D. Lensa obyektif perbesaran lemah yaitu: lensa obyektif mikroskop: bekerja

dalam pembentukan bayangan pertama. Lensa ini menentukan struktur dan bagian renik yang akan terlihat pada bayangan akhir. Ciri penting lensa obyektif adalah memperbesar bayangan obyek dengan perbesaran beraneka macam sesuai dengan model dan pabrik pembuatnya, misalnya 10 kali, 40 kali, dan 100 kali dan mempunyai nilai apertura (NA). Nilai apertura adalah ukuran daya pisah suatu lensa obyektif yang akan menentukan daya pisah spesimen, sehingga mampu menunjukkan struktur renik yang berdekatan sebagai dua benda yang terpisah.

  E. Lensa obyektif perbesaran kuat

  

F. Meja mikroskop yaitu: merupakan tempat meletakkan objek (preparat) yang

akan dilihat. Objek diletakkan di meja dengan dijepit dengan oleh penjepit.

  Dibagian tengah meja terdapat lengan untuk dilewat sinar. Pada jenis mikroskop tertentu, kedudukan meja tidak dapat dinaik atau diturunkan. Pada beberapa mikroskop, terutama model terbaru, meja preparat dapat dinaik- turunkan.

  G. Klip H. Kaki mikroskop.

  

I. Cermin mikroskop yaitu: mempunyai dua sisi, sisi cermin datar dan sisi cermin cekung, berfungsi untuk memantulkan sinar dan sumber sinar. Cermin datar digunakan bila sumber sinar cukup terang, dan cermin cekung digunakan bila sumber sinar kurang. Cermin dapat lepas dan diganti dengan sumber sinar dari lampu. Pada mikroskop model baru, sudah tidak lagi dipasang cermin, karena sudah ada sumber cahaya yang terpasang pada bagian bawah (kaki).

J. Diafragma mikroskop yaitu: berfungsi mengatur banyaknya sinar yang masuk

dengan mengatur bukaan iris. Letak diafragma melekat pada diafragma di bagian bawah. Pada mikroskop sederhana hanya ada diafragma tanpa kondensor.

  

K. Lengan mikroskop yaitu: dengan adanya engsel antara kaki dan lengan, maka

lengan dapat ditegakkan atau direbahkan. Lengan dipergunakan juga untuk memegang mikroskop pada saat memindah mikroskop.

L. Pemutar halus yaitu: komponen ini letaknya pada bagian lengan dan berfungsi

untuk mengatur kedudukan lensa objektif terhadap objek yang akan dilihat.

  Pada mikroskop dengan tabung lurus atau tegak, pengatur kasar dan halus untuk menaikturunkan tabung sekaligus lensa objektif. Pada mikroskop dengan tabung miring, pengatur kasar dan halus untuk menaik turunkan meja preparat. M. Pemutar kasar.

  Gambar 1. Bagian-Bagian Mikroskop

  Lembaran Pengamatan

LATIHAN 1

PENGENALAN PERALATAN LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

  Nama/NIM : Fakultas/Program Studi : Hari/Tanggal : Group/Kelompok :

  No. Nama Alat Gambar Fungsi/Kegunaan

  

LATIHAN 2

STERILISASI

Tujuan:

  1. Untuk mengetahui beberapa metode sterilisasi alat dan bahan yang digunakan dalam pengamatan mikrobiologis.

  2. Untuk mengetahui hal-hal penting sebelum dan sesudah melakukan sterilisasi peralatan dalam pengamatan mikrobiologis menurut metode sterilisasi yang digunakan seperti sterilisasi fisik dan kimiawi.

  Pendahuluan

  Suatu proses pembebasan suatu bahan atau alat dari semua bentuk organism hidup disebut sterilisasi. Sterilasi dapat dilakukan secara fisik mekanik dan kimiawi. Sterilisasi secara fisik adalah sterilisasi yang dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran. Pemanasan (pembakaran) secara langsung seperti pemanasan jarum ose atau pinset, pemanasan kering dengan menggunkan oven, biasanya untuk sterilisasi alat-alat seperti tabung reaksi, cawan petri dll. Sedangkan sterilisasi bahan-bahan yang banyak mengandung air dapat menggunaan autoklaf.

  Sterilisasi menggunakan saringan berpori sangat kecil antara 0.22 mikron sampai 0.45 mikron sehingga mikroba tertahan pada saringan biasa disebut sebagai sterilisasi mekanik. Cara ini biasanya dilakukan untuk sterilisasi bahan yang tidak tahan atau peka terhadap panas seperti antibiotik ataupun senyawa enzim.

  Pembagian Sterilisasi

  1. Sterisasi Fisik

  a. Pemanasan basah

• Autoklaf: pemanasan dengan uap air dengan suhu 121 C dengan tekanan 15 psi / 2 atm selama 15 menit (pada umumnya)
• Merebus (boiling)
• Pasteurisasi - HTST (high temperature short time): pemanasan pada suhu 72 C selama 15 detik

• LTLT (low temperature short time): pemanasan pada suhu 65 C selama 30 menit

  b. Pemanasan kering

• Pembakaran (incenerasi)
• Oven: pemanasan dengan udara panas pada suhu 180 C selama 2 jam atau pada suhu 210 C selama 30 menit

  c. Radiasi (dengan sinar ultra violet)

  2. Secara Kimia

  a. Penggunaan desinfektan dan anti septik

  b. Penggunaan pengawet

  c. Penggunaan antibiotic

  Gambar 2. Sterilkan meja kerja sebelum melakukan kegiatan

  3. Secara Mekanik Filtrasi (penyaringan cairan atau penyaringan udara) Berdasarkan uraian di atas, maka perlu diadakan praktikum sterilisasi alat dan bahan biakkan guna memberikan pemahaman tentang hal-hal yang berkaitan dengan sterilisasi serta menambah pengetahuan dan keterampilan tentang teknik atau tata cara sterilisasi dalam mkrobiologi.

  Bahan dan Alat

  Bahan : Aquadesh, kapas, plastik, alkohol 70%, spritus, aluminium foil, kertas label, lakban bening, kain kasa steril, kapas, kertas minyak/layang-layang, selotip, serbet/lap tangan, tali (benang bola), tisu gulung, wipol (desinfektan). Alat : Batang pengaduk, beaker glas, cawan petri, erlenmeyer, tabung reaksi, jarum ose, mikro pipet, pinset, gelas ukur, rak tabung reaksi, botol aquades, botol semprot/spyer, tabung durham, autoclave, oven.

  Prosedur Kerja

  a. Sterilisasi Kering (menggunakan oven)

  1. Menyiapkan cawan petri dan tabung reaksi yang akan disterilkan 2. Mencuci hingga bersih lalu mengeringkan peralatan dengan kain lap halus.

  3. Membungkus dengan kertas minyak/layang-layang

  4. Diatur suhu 180 C selama 2 jam atau pada suhu 210 C selama 30 menit

  5. Tekan tombol power

  6. Setelah 2 jam atau 30 menit (tergantung suhu yang digunakan), turunkan suhu dan matikan tombol power.

  7. Setelah suhu turun, peralatan yang telah disterilkan tersebut diambil dan dikeluarkan dari dalam oven lalu diletakkan di tempat yang bersih.

  b. Sterilisasi Basah (menggunakan autoklaf)

  1. Menyiapkan cawan petri, tabung reaksi, media agar yang akan disterilkan

  2. Mencuci peralatan hingga bersih lalu mengeringkan peralatan dengan kain lap halus.

  3. Membungkus dengan kertas minyak/layang-layang

  4. Masukkan semua alat yang sudah disiapkan ke dalam keranjang dan masukkan ke dalam autoclave

  5. Tutup dengan rapat dan kunci pintu autoklaf

  6. Tekan tombol On

  7. Atur suhu 121 C pada tekanan 15 psi (2 atm) selama 15 menit 8. Tekan tombol Enter, sterilisasi akan berakhir pada saat alaram berbunyi.

  9. Tekan tombol off, biarkan beberapa menit sampai suhu dalam autoklaf turun.

  10. Buka pintu autoklaf dan keluarkan alat dan bahan yang telah disterilkan tadi.

  c. Sterilisasi Kimiawi

  1. Menyiapkan cawan petri dan gelas obyek (terbuat dari bahan gelas). Mencuci hingga bersih lalu mengeringkan peralatan dengan kain lap halus.

  2. Menyiapkan larutan alkohol (70%).

  3. Menyiapkan kapas steril.

  4. Menuangkan larutan alkohol secukupnya pada kapas steril kemudian menggosokkan pada cawan dan gelas obyek secara merata.

  Kerja Aseptis:

  1. Sebelum mulai kerja tangan disemprot dengan alcohol 70%

  2. Meja dan lingkungan kerja disemprot dengan alcohol

  3. Peralatan dan bahan yang sudah disterilkan seperti tabung/cawan/Erlenmeyer sebaikknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminasi masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.

  4. Pinset, batang L, spider, dan lain-lain dapat disemprot alcohol terlebih dahulu lalu dibakar.

  5. Jarum inoculum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi.

  6. Usahakan bagian alat yang dipakai dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api.

  7. Jika kerja di safety cabinet tidak perlu memakai pembakar Bunsen tapi jika diluar safety cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya

  Pertanyaan:

  1. Apa yang dimaksud dengan sterilisasi, steril dan sterilitas?

  2. Mengapa peralatan yang akan digunakan harus disterilkan?

  3. Jelaskan pengertian aseptic dan bagaimana prinsip kerja secara aseptic!

  Lembaran Pengamatan

LATIHAN 2

STERILISASI

  Nama/NIM : Fakultas/Program Studi : Hari/Tanggal : Group/Kelompok :

  No. Nama Alat Metode Steril Suhu dan Waktu

  

LATIHAN 3

MEDIA PERTUMBUHAN MIKROORGANISME

Tujuan: 1. Mengetahui jenis dan fungsi media.

2. Mengetahui cara membuat media pertumbuhan mikroorganisme.

  Pendahuluan

  Media pertumbuhan mikroorganisme (mikroba) adalah media yang terdiri dari bahan mengandung berbagai zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhan dan perkembangannya. Media pertumbuhan mikroba dibutuhkan mulai dari proses isolasi sampai pada tahap pengamatan pertumbuhan, morfologi, fisiologi serta identifikasi suatu mikrobia. Media pertumbuhan bagi mikrobia ini dapat bentuk media cair ataupun media padat.

  Bahan penyusun media pertumbuhan mikroba umumnya terdiri dari bahan dasar seperti air sebagai pelarut dan agar atau gelatin ataupun silica gel yang berfungsi memadatkan media. Disamping itu, media pertumbuhan mikroba harus mengandung unsur-unsur (senyawa) yang dibutuhkan oleh mikrobia untuk tumbuh dan berkembang. Unsur-unsur tersebut terdiri dari unsur makro (C,H,O, N dan P) dan unsur mikro (Fe, Mg serta vitamin) dan bahan tambahan lainnya seperti phenol red yang berfungsi sebagai indikator kemasaman media dan antibiotik. Macam-Macam Media Pertumbuhan

  1. Media Berdasar Sifat Fisik

  a. Media padat (solid) adalah media yang mengandung agar 1-2% sehingga setelah dingin media menjadi padat.

  b. Media setengah padat (semi solid) adalah media yang mengandung agar 0.3 - 0.4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat dan tidak begitu cair.

  c. Media cair (liquid) adalah media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (nutrient broth), LB (lactose broth).

  2. Media Berdasarkan Komposisi

  a. Media sintesis adalah media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose agar, Mac conkey agar. b. Media semi sintesis adalah media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misalnya PDA (potato dextrose agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang.

  c. Media non sintesis adalah media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalya tomato juice agar, brain heart infution agar, pancreatic.

  3. Media Berdasarkan Tujuan

  a. Media untuk isolasi: Media ini mengandung semua senyawa essensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya nutrient broth, blood agar.

  b. Media selektif/penghambat: Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambahn suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan, seperti Luria bertani medium yang ditambah amphisilin untuk merangsang e.coli, resisten antibiotic dan menghambat kontaminan yang peka.

  c. Media diperkaya (enrichment): Media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang tumbuh pada media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembangbiak, tetapi membutuhkan komponen kompleks: blood tellurite agar, bile agar, serum agar.

  d. Media untuk peremajaan kultur: Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur.

  e. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik: Media ini digunakan untuk mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba.

  f. Media untuk karakterisasi bakteri: Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indicator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia.

  g. Media differsial: bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasakan karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diffential.

  Syarat media biakan: 1 Mengandung nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme yang berkembang.

2 Memiliki kelembaban optimum bagi pertumbuhan mikroorganisme.

  3 Mengandung oksigen (kultur bakteri aerob) dan pH sesuai.

  4 Harus bebas dari mikroba lain dan steril.

  Bahan dan Alat

  Bahan : Aquadesh, Media Nutrien Agar (NA), Media Nutrien Broth (NB), Media PDA, malt ekstrak agar (MEA), kapas, kertas layang, plastik, alkohol 70%, spritus, kapas steril, aluminium foil, tissu, kertas label.

  Alat: Lampu bunsen, cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, timbangan, hot plate, stirer, batang pengaduk, spatula, autoklaf, beaker glas, jarum ose, mikro pipet, pinset, gelas ukur, rak tabung reaksi, botol aquades, botol semprot/spyer, timbangan digital, autoclave, oven, incubator, lemari pendingin/freezer, stirer, vortex.

  Prosedur Kerja

A. Pembuatan Media Umum (cara I):

  1. Timbang media NA (Oxoid) dan NB (Oxoid), PDA, MEA sesuai prosedur di kemasan. Media ditimbang secara hati-hati lalu masukkan kedalam Erlenmeyer

  2. Media yang ada di erlemnmeyer ditambah aquades dan aduk sampai homogen dengan batang 
pengaduk 


  3. Setelah homogen media dipanaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen 
pemanas sambil diaduk sampai media tercampur homogen (ditunjukkan dengan warna yang kuning jernih). Perhatian: pada

  saat pemanasan jangan sampai terbentuk buih berlebihan sampai meluap!

  


  4. Media NA dituangkan ke dalam tabung reaksi dengan volume tertentu menggunakan pipet volume: 5 ml untuk NA miring, 10 ml untuk NA tegak, lalu diautocklaf. Tutup tabung reaksi dengan penutup tabung (penutupan

  jangan terlalu rapat!) 


  5. Media NB dituangkan ke dalam tabung reaksi masing- masing tabung reaksi 8 ml. Tutup tabung reaksi dengan kapas atau penutup tabung (penutupan

  jangan terlalu rapat!) 


  6. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan o autoklaf selama 15 menit, tekanan 1 atm 121

  C. (Pelajari cara

  mengoperasikan autoklaf dengan benar!)

  


  7. Setelah diotoklaf: media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak tabung dan biarkan memadat, media NA 5 ml inkubasikan miring dan biarkan memadat. Media sisa NA tuangkan dalam cawan petri dan o biarkan memadat. Media NA 15 ml dibiarkan sampai suhu 45-50 C (untuk isolasi mikroorganisme ). 


  8. Media NB dalam tabung reaksi biarkan dingin. Seluruh media NA dan NB ini akan digunakan untuk percobaan selanjutnya.

  Gambar 3. Pembuatan media agar

B. Pembuatan Media Umum (cara II):

  Bahan yang diperlukan antara lain: kentang sebanyak 100 gram, dektrosa 5 gram, aga 15 gram dan aquadest sebanyak 500 ml Cara Kerja

  1. Kentang dikupas dan iris, lalu cuci bersih dan selanjutnya direbus dengan aquadest selama 1- 2 jam 


  2. Ekstrak kentang disaring menggunakan penyaring sampai 500 ml

  3. Ekstrak kentang ditambah agar dan dektrosa, aduk hingga 
homogeny serta didihkan diatas kompor atau hot plate stirrer. 


  4. pH diatur hingga 5- 6 dengan 
menambahkan HCl atau NaOH dan ukur dengan pH meter.

  
 5. Masukkan larutan ke dalam erlenmeyer atau dapat langsung 
dibuat agar pinggan atau agar miring 


6. Sterilkan media dengan autoklaf 


C. Pembuatan Media Selektif:

  Media selektif yang dimodifikasi (Yunilas et al., 2013) untuk isolasi bakteri

selulolitik menggunakan: (0,5 g pepton, 0,5 g yeast agar, 0,1 g K2HPO4, 0,02 g

  MgSO4. 7H2O, 1 g Na2CO3, 20 g agar, 0,25 g CMC, 0,25 g xylan, 0,25 g lignin, 0,25 g mannan.

  Media selektif Czapek Dox Agar (CDA) yang dimodifikasi (Yunilas, 2016) untuk isolasi fungi selulolitik yaitu: 0,2% NaNO

  3

  ; 0,05% KCL; 0,05% MgSO

  4 .7H

  2 O; 0.001% FeSO 4 .7H

  Nutrien Broth (NB) Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai pemadat. Proses pembuatannyapun lebih sederhana, tidak memerlukan panas, peptone dan beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk.

2 O; 0,05% KH

  1. Timbang semua bahan sesuai formulasinya, lalu masukkan kedalam Erlenmeyer

  2. Media yang ada di erlemnmeyer ditambah aquades dan aduk sampai homogen dengan batang 
pengaduk 


  3. Setelah homogen media dipanaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen 
pemanas sambil diaduk sampai media tercampur homogen

  4. Media dituangkan ke dalam tabung reaksi dengan volume tertentu menggunakan pipet volume: 5 ml untuk NA miring, 10 ml untuk NA tegak, lalu diautocklaf. Tutup tabung reaksi dengan penutup tabung (penutupan

  jangan terlalu rapat!)

  


  Prosedur Kerja

  2 PO 4 ; 0,04% yeast ekstrak; 2% agar

  dan 1% (masing-masing CMC, xylan, lignin dan manan), streptomisin 0,01 %, pH diatur 4,5.

  5. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan o autoklaf selama 15 menit, tekanan 1 atm 121

  C. (Pelajari cara

  mengoperasikan autoklaf dengan benar!) 
 6.

   Setelah diotoklaf: media dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak tabung dan biarkan memadat atau miring dan biarkan memadat.

  Pertanyaan:

  1. Jelaskan pengertian dan fungsi media pertumbuhan!

  2. Mengapa media pertumbuhan yang akan digunakan harus disterilkan?

  3. Jelaskan cara membuat media umum untuk pertumbuhan bakteri!

  4. Pada pembuatan media selektif ada bahan tertentu dimasukkan, apa tujuan dari penambahan bahan tersebut? Lembaran Pengamatan

  

LATIHAN 3

MEDIA PERTUMBUHAN MIKROORGANISME

  Nama/NIM : Fakultas/Program Studi : Hari/Tanggal : Group/Kelompok :

  No. Nama Bahan Formula Metode Suhu dan Waktu Sterilisasi

  

LATIHAN 4

TEKNIK ISOLASI MIKROORGANISME

Tujuan:

  1. Mengetahui teknik mengisolasi mikroorganisme dengan benar

  2. Mengkarakteristik mikroorganisme yang diisolasi dari lingkungan Pendahuluan

  Mikroorganisme (mikroba) dapat diperoleh dari lingkungan sekitar kita baik

dari air, tanah, udara, substrat berupa bahan pakan ternak serta produk olahannya,

bahan pangan beserta produk olahannya, tanaman maupun hewan. Mikroorganisme

yang diperoleh beragam, dapat berupa bakteri, fungi/kapang, khamir dan sebagainya.

Untuk mendapatkan mikroba murni perlu dilakukan isolasi.

  Penyediaan sampel sebagai sumber isolate mikroba dapat diperoleh dengan berbagai cara. Ada sampel diperoleh langsung dari tanah, kotoran ternak, cairan rumen ternak, dari bagian tanaman. Ada pengambilan sampel dari produk bahan pangan seperti air susu, daging, ikan, terasi dll. Ada pengambilan sampel dengan melakukan proses fermentasi untuk memperoleh mikroorganisme indigenous (MOI) atau indigenous microorganism (IMO) yang bertujuan memacu proses penguraian oleh mikroba. Mikroba yang tumbuh dan berkembang dari media MOI inilah yang akan dijadikan sebagai sumber isolate sesuai tujuan isolasi.

  Isolasi mikroorganisme adalah suatu upaya pemindahan mikroba diluar dari

lingkungan alamiahnya untuk mendapatkan biakan murni. Pemisahan

mikroorganisme dari lingkungan bertujuan untuk memperoleh biakan murni yang

sudah tidak bercampur lagi dengan mikroba lainnya. Prinsip dari isolasi mikroba

adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang terdapat pada

suatu substrat atau lingkungan sekitarnya. Sehingga dalam mempelajari ilmu

  mikroorganisme kita harus mengerti dan memahami bagaimana mendapatkan mikroba murni dengan cara mengisolasi dan memisahkan mikrobia tersebut sesuai dengan tujuannya. Melalui isolasi kita dapat mempelajari morfologi, biologi ataupun karakteristik mikrobia tersebut.

  Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu antara lain:

  1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi.

  2. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut.

  3. Medium pertumbuhan yang sesuai.

  4. Cara menginokulasi mikroba.

  5. Cara menginkubasi mikroba.

  6. Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa kultur murni dan sesuai dengan yang dimaksud.

  7. Cara memelihara agar mikroba yang telah diisolasi tetap merupakan kultur murni.

  Teknik Isolasi Mikroba Teknik pengenceran (dilution method) Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran beragam spesies

diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Pengenceran suspense mikroba pada

umumnya dilakukan dengan teknik pengenceran berseri (series of dilution). Dari

hasil pengenceran ini kemudian diambil kira-kira 1 mL untuk diencerkan lebih

lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada

suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni

yang akan tumbuh dalam medium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan

memperoleh satu koloni saja.

  Teknik micromanipulator Satu ose bakteri dengan mikropipet yang ditempatkan dalam

micromanipulator, kemudian ditempatkan dalam medium encer untuk dibiakkan.

  

Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena

semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme,

memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja.

   1.

   Isolasi pada medium padat Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengecerkan

  

mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari

organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut

setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal.

  2. Isolasi pada medium cair Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat

tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur

cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial

pengenceran. Semakin tinggi pegenceran peluang untuk mendapatkan satu sel

semakin besar. Pada media cair pertumbuhan mikroba ditandai dengan kekeruhan

mikroba.

  3. Isolasi sel tunggal Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme

berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair.

  

Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali.

Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat

halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.

  Bahan dan Alat:

  Bahan : Sampel (sumber isolat), Aquadesh, Media Nutrien Agar (NA), Media Nutrien Broth (NB), PDA (ditambah klorampenikol 10 mg/100mL aquadest), kapas, kertas layang, plastik, alkohol 70%, spritus, kapas, aluminium foil, tissu, kertas label, Sumber isolat (ditentukan saat praktikum).

  Alat: Lampu Bunsen, Cawan petri, Tabung reaksi, Erlenmeyer, Pipet volumetrik, timbangan, hot plate, stirer, batang pengaduk, spatula, autoklaf, ikubator.

  Prosedur Kerja:

  1. Sampel sebanyak 1 gram dimasukkan kedalam tabung reaksi yang telah berisi aquadest steril mengandung 0,9% NaCl fisiologis, lalu kocok menggunakan vortex supaya homogen.

  2. Kemudian dilakukan seri pengenceran dengan cara mengambil 1 ml suspense dan pindahkan ke tabung ke 2 dan demikian selanjutnya.

  Gambar 4. Teknik pengenceran

  3. Hasil seri pengenceran diambil 0,1 mL atau 1 mL, lalu diinokulasi secara aseptic ke dalam cawan petri yang telah dituang media agar (NA, PDA atau media agar selektif) menggunakan metode cawan tuang (pour plate method) atau metode cawan sebar (spread plate method). Diratakan dengan membentuk angka delapan.

  Dibiarkan hingga memadat.

  Gambar 5. Pour Plate Method 
 Gambar 6. Spread Plate Method

  


  4. Media yang sudah diinokulasi, diinkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 37 C untuk pengamatan mikroba yang tumbuh.