PRODUKSI GLUKOSA DARI LIGNOSELULOSA JERAMI PADI YANG DIDELIGNIFIKASI DENGAN ALKALINE-OZONOLYSIS PRETREATMENT

  

PRODUKSI GLUKOSA DARI LIGNOSELULOSA JERAMI

PADI YANG DIDELIGNIFIKASI DENGAN

ALKALINE-OZONOLYSIS PRETREATMENT

  (*)

Novia , Angga Riski Yanto, Andri Saputra

  • Jurusan Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Sriwijaya Jln. Raya Palembang Prabumulih Km. 32 Inderalaya Ogan Ilir (OI) 30662

  

Abstrak

Selama ini limbah biomassa lignoselulosa seperti jerami padi belum dimanfaatkan secara optimal.

  Padahal biomassa itu mengandung selulosa yang cukup tinggi. Selulosa dihidrolisis akan menghasilkan glukosa, kemudian dari glukosa difermentasikan akan menghasilkan bioetanol.. Produksi glukosa dimulai dengan pre-treatment, yaitu delignifikasi.Perlakuan ini bertujuan untuk mengurangi kandungan lignin dan sedikit hemiselulosa yang terdapat pada jerami padi, karena senyawa lignin dan hemiselulosa dapat menghambat dan menjadi inhibitor utama dalam proses hidrolisadari selulosa menjadi glukosa. Apabila tahap pre-treatment yang ditentukan telah dicapai maka biomassa selanjutnya dihidrolisis secara enzimatis, yakni dengan bantuan enzim Aspergillus Niger. Dalam penelitian ini bertujuan untuk mengetahui variabel mana yang paling berpengaruh pada produksi glukosa. Dari hasil analisa dapat disimpulkan bahwa produksi glukosa dengan variabel waktu hidrolisis 25 jam dan volume enzim 10 ml menghasilkan kadar glukosa lebih banyak bila dibandingkan dengan variabel yang lain, yaitu 52,4 mg.

  Kata Kunci: Enzim Aspergillus Niger, Glukosa, delignifikasi, Hidrolisis

Abstract

  All this time lignocellulosic biomass wastes such as rice straws has not been utilized optimally. Meanwhile the biomass contains high cellulose content. Cellulose can be hydrolyzed to produce glucose, when is then can be fermented to produce bioethanol. Glucose production begins with the pre-treatment delignification. This are treatment aims to reduce the content of lignin and hemicellulose on the rice straw because lignin and the hemicellulose compuonds can inhibit and a major inhibotor in the hydrolysis of cellulose to glucose. While pre-treatment stage has been reached then the biomass then has been subsequently hydrolysed enzymatically using Aspergillus Niger enzyme. This research to knowing which is the most influential variable on glucose production. From the analysis of the results it can be concluded that the production of glucose using hydrolysis time variable 25 hours and the volume of 10 ml produce more glucose levels when compared with the other variables, namely 52,4 mg.

  Keywords: Aspergillus Niger Enzym, Glucose, Delignification, Hydrolysis 1.

  bahan bakar dapat terpenuhi. Bahan bakar

   PENDAHULUAN

  Harga minyak dunia dan kebutuhan BBM berbasis nabati juga dapat mengurangi semakin meningkat, sementara cadangan pencemaran lingkungan, sehingga lebih ramah minyak mentah semakin menipis. Untuk lingkungan. Selain itu, usaha ini juga dilakukan menanggulangi krisis kelangkaan bahan bakar dengan tujuan untuk rangka penghematan biaya minyak, maka perlu mencari sumber energi dan devisa negara karena diperkirakan pada alternatif pengganti BBM. tahun 2015 Indonesia akan menjadi negara Net-

  Pemerintah telah mengeluarkan Peraturan Importir bahan baku minyak mentah. Presiden Republik Indonesia Nomor 5 Tahun Bahan bakar berbasis nabati salah satu 2006 tentang Kebijakan Energi Nasional untuk contohnya adalah bioetanol. Bioetanol dapat mengembangkan sumber energi alternatif dibuat dari bahan-bahan bergula, berpati, dan sebagai pengganti BBM. Kebijakan tersebut biomassa lignoselulosa. Bioetanol dapat telah menetapkan sumber daya yang dapat meningkatkan angka oktan bensin apabila diperbaharui seperti bahan bakar nabati sebagai dicampur dalam komposisi tertentu. alternatif pengganti BBM. Bahan bakar berbasis Selama ini limbah biomassa lignoselulosa nabati diharapkan dapat mengurangi terjadinya seperti jerami padi belum dimanfaatkan secara kelangkaan BBM, sehingga kebutuhan akan maksimal. Padahal biomassa itu mengandung Jurnal Teknik Kimia No. 4, Vol. 19, Desember 2013 Jurnal Teknik Kimia No. 4, Vol. 19, Desember 2013 selulosa yang cukup tinggi. Sellulosa dehidrolisis akan menghasilkan glukosa, kemudian dari glukosa difermentasikan akan menghasilkan bioetanol. Melihat kondisi ini maka sangat diperlukan utntuk mengolah jerami padi menjadi suatu bahan yang bermanfaat dan menguntungkan dan bernilai ekonomi yang tinggi, seperti bioetanol. Kandungan jerami padi terdiri dari : hemiselulosa 27%, selulosa 39%, lignin 12% dan abu 11 % (Karimi, 2006).

  Beberapa peneliti terdahulu telah melakukan penelitian pembuatan bioetanol. Namun kandungan lignin dalam jerami padi belum sepenuhnya hilang dan belum ada yang menggunakan metode delignifikasi Ozonolysis- Alkaline Pretreatment. Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dilakukan penelitian de ngan judul “Produksi Glukosa Dari Lignoselulosa Jerami Padi Yang Didelignifikasi dengan Ozonolysis-

  Variabel – variabel penelitian

  0,1 N

  14. Sukrosa 12,5%

  6. PDA

  15. Nutrisi Urea

  7. KH

  4

  0,2%

  16. Oksigen

  8. Aspergillus Niger

  9. Larutan Amylum 0,2% dan 1%

  Rancangan Penelitian

  Pada penelitian ini akan dilakukan studi delignifikasi jerami padi dengan dua tahap pretreatment yaitu dengan menggunakan larutan NaOH 5% dan ozonolisis kemudian dihidrolisis menjadi glukosa dengan Aspergillus niger.

  Pada penelitian ini akan diamati pengaruh beberapa variabel proses untuk menghasilkan produk dengan pelepasan lignin terbanyak. Adapun beberapa variabel yang menjadi fokus pada penelitian ini adalah: 1. waktu ozonisasi dan berat sampel sebagai variabel tetap.

  5. KMnO

  2. Ukuran biomassa dan laju gas oksigen sebagai variabel bebas.

  Persiapan Bahan Baku

  Biomassa berupa jerami padi diperoleh dari ladang sawah di kawasan MUSI 2 Palembang. Jerami padi dihancurkan menggunakan alat pencacah (Crusher). Kemudian dikeringkan di panas matahari selama 10 hari. Lalu dipanaskan di oven bersuhu 45

  o

  C untuk menghilangkan kandungan air dalam biomassa tersebut. Setelah kering, ukurannya diperkecil dengan alat grinder sampai ukuran tertentu lalu diayak untuk memperoleh ukuran jerami 0,177 mm; 0,25 mm; 0,42 mm dan 0,841 mm. Semakin kecil ukuran biomassa, maka penurunan kadar lignin akan semakin besar.

2. METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat

  Deskripsi Proses a.

   Alkaline Pretreatment

  Jerami padi yang telah diukur kadar lignin dan kadar airnya sebanyak 50 gram ke dalam botol bertutup (erlenmeyer bertutup) dan dilarutkan dalam larutan NaOH 5% sebanyak 500 ml ( perbandingan ratio (w/v) jerami padi : NaOH = 1 : 10 ). Selanjutnya sampel dalam wadah diinkubasi dalam water bath pada suhu 85 C selama 1 jam. Setelah 1 jam, sampel disaring dan dicuci menggunakan akuades hingga pH netral. Selanjutnya sampel padatan dikeringkan dalam oven pada suhu 105 C hingga beratnya konstan. kadar lignin sampel akhir dihitung dengan menggunakan metode Kappa.

2 SO

  b.

   Ozonolysis Pretreatment

  Proses pengozonan dilaksanakan pada tegangan konstan, yakni 8500 V. Perlakuan terhadap ukuran sampel masing-masing terdiri dari 0,177 mm; 0,25 mm; 0,42 mm dan 0,841 mm. Sedangkan berat jerami padi yang digunakan tetap, yakni 50 gram dan laju alir 5 liter/menit. Proses diawali dengan menghubungkan kabel listrik dengan generator listrik. Lalu dipastikan bahwa posisi regulator voltase diset pada titik terendah (nol), sehingga generator ozon masih bertegangan rendah (220 V). Gas

  4

  4 N

  Alkaline Pretreatment”.

  b) Bahan

  Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober s/d Desember 2012 di Laboratorium Jurusan Teknik Kimia Universitas Sriwijaya, Inderalaya.

  Alat dan Bahan

  a) Alat

  1. Gelas ukur

  7. Mesh Screening

  2. Termometer

  8. Neraca Analitik

  3. Oven

  9. Erlenmeyer

  4. Blender

  10. Buret Titrasi

  5. Ozon generator

  6. Reaktor ozonolysis

  1. Jerami

  4

  10. Na

  4

  0,2 N

  2. Ragi

  11. Larutan KI 1 N

  3. NaOH 5%

  12. Larutan KI 2%

  4. H

  2 SO

  4

  2 N

  13. H

  2 SO

2 PO

2 SO

2 SO

   Hydrolisis Enzymatik

  4

  .7H

  2 O 0,005 gr dan KH

  2 PO

  4

  0.0023 gr. Selanjutnya menambahkan 80 ml aquadest ke dalam media tersebut. pH diatur hingga mencapai pH = 5, lalu media disterilkan di dalam autoclave pada suhu 120 ºC selama 15 menit. Media yang telah disterilkan kemudian didinginkan. Suspensi spora aspergillus niger ditambahkan sebanyak 10 ml pada media tersebut. Media diinkubasi pada suhu ±30

  o

  C dengan waktu fermentasi 96 jam.

  4) Pengambilan Enzim

  Hasil fermentasi diekstrak dengan aquadest sebanyak 100 ml lalu di letakkan pada rotari shaker 150 rpm selama 1 jam. Cairan hasil fermentasi dipisahkan dengan menggunakan kertas saring. Enzim yang diperoleh kemudian disimpan di lemari pendingin dan siap untuk digunakan.

  d.

  Hasil pretreatment dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml lalu ditambahkan 100 ml aquadest dan mengatur pH 4

  3) Produksi Enzim selulase dalam media cair padat

   Pembuatan Enzim Selulase dari Aspergillus Niger 1) Pembenihan Inokulasi

  c.

  dimasukkan ke dalam tabung analisis ke-2 (tabung atas, setelah keluar dari reaktor). Gas ozon dialirkan ke dalam reaktor ozonisasi selama 6 menit, gas sisa dialirkan ke tabung analisis ke-2. Kandungan ozon sisa reaksi ozonisasi dianalisis sebagaimana pada tabung analisis ke-1 dengan metode Iodometri. Sampel yang telah diozonasi, dianalisa kandungan ligninnya dengan menggunakan metode Kappa.

  4

  Proses ozonisasi jerami padi dilaksanakan di reaktor ozonisasi. 50 gram sampel jerami padi dalam kondisi moisture content ±10% dimasukkan ke dalam reaktor ozonisasi. Larutan KI 2% + larutan H

  3 , dengan indikator kanji.

  2 O

  2 S

  Gas yang mengandung ozon dialirkan ke dalam tabung analisis sampai waktu tertentu (penggelembungan / bubbling). Setelah proses penggelembungan selesai dilakukan, aliran gas yang megandung ozon dihentikan. Larutan di dalam tabung analisis diambil sebagian dan dititrasi dengan larutan Na

  4 (suasana asam).

  Selanjutnya voltase listrik dinaikkan secara perlahan-lahan sampai pada voltase yang diinginkan. Sebelum mengozonisasi biomassa, kadar ozon dianalisis terlebih dahulu dengan metode Iodometri. Larutan KI 2% yang dimasukkan ke dalam tabung analisis ke-1 (tabung bawah, sebelum masuk reaktor) ditambahkan larutan H

  Jerami padi dicacah dan dikeringkan kemudian dihaluskan. Sebanyak 20 gram jerami padi dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml serta ditambahkan nutrisi urea 0,03 gr; MgSO

  • – 5. Kemudian dipanaskan dalam autoclave pada suhu 100

  0,2 %. Lalu pH media cair diatur dengan HCl hingga diperoleh pH = 3. Kemudian ujung kawat ose dicelupkan ke dalam etanol 96 % lalu dipanaskan pada api bunsen sampai berwana merah. Selanjutnya membiakan Aspergillus niger dari media PDA, lalu diambil dengan menggunakan kawat ose dan dicelupkan beberapa saat pada media cair hingga tampak keruh. Pekerjaan ini dilakukan di ruang aseptik. Media cair ditutup dengan kapas dan diinkubasi pada suhu ± 30°C selama 24 jam.

  menggunakan kawat inokulasi di dalam cawan petri secara aseptik. Mikroba diinkubasi pada suhu ± 30°C selama 120 jam.

  Mikroba yang digunakan adalah

  C selama 30 menit. Bubur jerami padi dibiarkan menjadi dingin. Enzim selulase ditambahkan sesuai perlakuan variable kedalam bubur jerami padi tersebut lalu Erlenmeyer ditutup rapat dengan gabus. Perlakuan terhadap waktu hidrolisis masing- masing terdiri dari yaitu 5, 10,15, 20 dan 25 jam, sedangkan perlakuan terhadap konsentrasi enzim yaitu 10% dan 20%. Konsentrasi enzim 10% yaitu penambahan enzim dengan 10% total fraksi enzim ( 5 ml enzim per 50 gram biomassa kering) dan menutup rapat erlenmeyer dengan gabus. Kemudian diletakkan pada rotary shaker 160 rpm selama 25 jam. Glukosa hasil hidrolisis dianalisa dengan metode Luff Schoorl.

  o

  Aspergillus niger . Pembenihan

  dilakukan pada media PDA (Potato

  Dextrose Agar) secara zig-zag dengan

  2) Penyiapan Inokulum

  4

  Membuat 100 ml media cair yang terdiri dari sukrosa 12,5%, (NH

  4

  )

  2 SO

  Jurnal Teknik Kimia No. 4, Vol. 19, Desember 2013 oksigen dialirkan, laju alir diatur sesuai kebutuhan, dan dijaga agar tetap stabil.

  0,25 % dan KH

  2 PO

  4 semakin berkurang kadar lignin dalam delignifikasi, karena luas permukaan jerami

  Jerami Padi semakin besar, sehingga memperluas kontak langsung dengan senyawa alkali dan ozon. Pengecilan Ukuran

  Hasil Analisa Glukosa / pengayakan

  Hasil analisis glukosa yang didapat pada penelitian ini dari hasil proses hidrolisis

  Pretreatment Alkali

  enzimatik berdasarkan luff shcoorl terlihat pada

  dengan NaOH 5%

  Tabel. 2, yaitu :

  Ozonolysys Pretreatment

  Tabel 2. Hasil Analisa Glukosa

  Waktu Volume Enzim Glukosa Aspergillus Niger Hidrolisis enzimatik

   (ml) (mg)

   5 Jam 5 28,68

  Glukosa 10 30,3

  10 Jam 5 32,73 10 33,54

  Gambar 1. Skema alur penelitian

  15 Jam

  5

  33 10 38,5

  20 Jam 5 51,5

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

  10 52,1

  25 Jam 5 51,8

  Pengaruh Ukuran Jerami Dalam 10 52,4

  Delignifikasi Pengaruh waktu hidrolisis dan Konsentrasi

  Tabel 1 Hasil Delignifikasi

  enzim terhadap glukosa Ukuran Vol.Titran (a) ml Bil.Kappa (K) Kadar Lignin

  Pengaruh Waktu Hidrolisis dan Volume Enzim Terhadap Glukosa Sebelum Sesudah Sebelum Sesudah Sebelum Sesudah 20 mesh 4,7 7,6

  58 29 8,526 4,263 40 mesh 4,9 7,9 56 26 8,232 3,822

  60 60 mesh 6 8,1

  45 24 6,615 3,528 80 mesh 7,1 8,4 34 21 4,998 3,087

  50 Volume )

  Enzim 5 g

  40 ml (m

  30 Volume lukosa Perbandingan Kadar Lignin dengan ukuran Jerami

  20 G Enzim 10 10 ml

  14

  12 Sebelum Pre-

  5 Jam 10

  15

  20

  25 n

  10 ni Treatment

  Jam Jam Jam Jam g

  8 Li Setelah Alkali Waktu Hidrolisis

  6 adar

  4 K Setelah

  2 Gambar 3. Pengaruh waktu hidrolisis terhadap Ozonolysis

  glukosa

20 Mesh 40 Mesh 60 Mesh 80 Mesh

  Ukuran Jerami

  Dari gambar 3 terlihat bahwa lamanya waktu hidrolisis dapat meningkatkan kadar glukosa yang dihasilkan seiring dengan

  Gambar. 2 Perbandingan Kadar Lignin dengan banyaknya volume enzim yang ditambahkan.

  ukuran Jerami Hal ini dikarenakan semakin lama waktu yang diberikan maka semakin banyak sisi aktif enzim

  Dilihat dari tabel 1 pengaruh ukuran jerami selulase bekerja untuk memotong rantai karbon sangat berpengaruh penting terhadap pada struktur selulosa menjadi struktur yang delignifikasi. Semakin kecil ukuran jerami maka Jurnal Teknik Kimia No. 4, Vol. 19, Desember 2013 lebih sederhana seperti glukosa atau waktu yang menghasilkan kadar glukosa yg tinggi lama memungkinkan adanya reaksi adalah 25 jam. berkelanjutan dari enzim untuk menghidrolisis c.

  Semakin banyak konsentrasi enzim selulosa menjadi glukosa. Waktu hidrolisis selulase yang digunakan, maka semakin antara 20-25 jam, glukosa yang dihasilkan tinggi kadar glukosa yang dihasilkan. memiliki nilai yang berdekatan atau mendekati Penambahan konsentrasi enzim terbaik konstan. Hal ini disebabkan karena aktivitas adalah sebesar 10 ml dengan kadar glukosa enzim selulase yang sudah konstan dan aktifitas 52,4 mg. tertinggi untuk mendegradasi selulosa pada kisaran waktu hidrolisis tersebut. Begitu juga Saran sebaliknya semakin sedikit waktu yang Saran yang dapat penulis sampaikan demi diberikan untuk melangsungkan proses perbaikan di penelitian selanjutnya adalah hidrolisis makan semakin sedikit pula enzim 1.

  Perlu dilakukan upaya penelitian lanjutan selulase bekerja untuk menghidrolisis selulosa untuk mengetahui kadar glukosa menjadi glukosa, sehingga glukosa yang optimum dari hidrolisis jerami padi. dihasilkan juga semakin kecil.

  2. Dalam pembuatan enzim selulase harus Dari hasil penelitian diperoleh nilai dalam jumlah yang banyak dan tertinggi glukosa sebesar 52,4 mg/L pada waktu melakukan uji aktivitas enzim. hidrolisis 25 jam.Waktu Hidrolisis 25 jam 3.

  Apabila nanti ada penelitian lanjutan merupakan waktu yang paling optimal untuk yang dilakukan oleh mahasiswa, menghasilkan glukosa tertinggi dari proses hendaknya dicoba dalam modifikasi hidrolisis sampel jerami padi. enzim guna menghasilkan kadar glukosa

  Pada gambar 3.3 dapat dilihat bahwa yang tinggi. adanya kenaikan pada setiap garis. Dari gambar 4.

  Hendaknya dalam setiap tahapan dalam 3.3 tersebut, dapat disimpulkan bahwa hasil penelitian perlu diperhatikan lebih lanjut glukosa dipengaruhi oleh banyaknya pemakaian guna menghindari apabila nanti terdapat enzim selulase yang digunakan dalam proses kekurangan pada produk glukosa yang hidrolisis. Pada proses hidrolisis tersebut, dihasilkan. pemakaian enzim selulase sebesar 10 ml dengan waktu hidrolisis 25 jam didapatkan Daftar Pustaka kandungan glukosa dengan nilai tertinggi yaitu Alvira,P., E. Tomas-Pejo.,M. Ballesteros, M.J. sebesar 52,4 mg/L dan glukosa terendah Negro .2009. Bioresource sebesar 28,68 mg/L. Kenaikan glukosa seiring technology: Pretreatment dengan besarnya penambahan volume enzim technologies for an efficient selulase ini mengakibatkan sisi aktif enzim bioethanol production process based untuk memecah rantai selulosa menjadi glukosa on enzymatic hydrolysis: A semakin meningkat sehingga aktivitas enzim review .(11):1-11 pun meningkat. Makin besar aktivitas enzim, Badger, P.C. 2002. Ethanol from cellulose: A makin banyak sisi aktif enzim yang tersedia general review. p. 17-21. In J. Janick untuk memecah selulosa sampai menjadi and A. Whipkey (Ed.). Trends in glukosa.

  New Crops and New Uses. ASHS Press, Alexandria, VA.

4.KESIMPULAN DAN SARAN Fengel, D. and G. Wegener. 1984. Wood: Chemistry,ultrastructure, reactions.

  Kesimpulan Walter de Gruyter & Co ., Berlin.

  Fessenden & Fessenden. 1986. Kimia Organik, Berdasarkan hasil penelitian yang telah Jilid 2 , Jakarta : Gramedia dilakukan , maka dapat disimpulkan sebagai Hormeyer, H.F., W. Schwals, G. Bonn and O. berikut :

  Bobleter, 1988. Hydrothermolysis of a.

  birchwood as pretreatment for

  Semakin kecil ukuran partikel maka semakin kecil kadar lignin hasil proses enzymatic saccharification. delignifikasi. Kadar lignin terkecil Holzforschung , 42: 96-98. DOI: diperoleh sebesar 3,087 pada saat ukuran 10.1515/hfsg.1988.42.295//1988 partikel 80 mesh. Howard RL, Abotsi E, van Rensburg JEL, b.

  Howard S. 2003. Lignocellulose Semakin lama waktu hidrolisis maka semakin banyak kadar glukosa yang Biotechnology: Issues of dihasilkan. Dalam hal ini waktu hidrolisis Bioconversion and Enzyme enzimatis yang paling baik dalam

  Jurnal Teknik Kimia No. 4, Vol. 19, Desember 2013

  Production. J. Biotechnol . 2(12): 602-619.

  Irawati D. 2006. Pemanfaatan Serbuk Kayu Untuk Produksi Etanol . [Tesis].

  Bogor. Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Kaparaju, P., M. Serrano, A.B. Thansen, P.

  Kongian and I. Angelidai, 2009.

  Bioethanol, biohydrogen and biogas production from wheat straw in a biorefinery concept. Bioresour. Technol ., 100: 2562-2568. DOI:

  10.1016/j.biortech.2008.11.011 Karimi, K., S. Kheradmandinia and M.J. Taherzadeh, 2006. Conversion of rice

  straw to sugar by diluteacid hydrolysis. Biomass Bioenergy , 30:

  247-253. DOI: 10.1016/j.biombioe.2005.11.015

  Kim,S.,B.E Dale.2004.Global Potensial

  Bioethanol Production from wasted crops and crop residues. Biomassa

  and Bioenergy.15: 361-275 Kumar, P., Barrett, D.M., Delwiche, M.J., and

  Stroeve, P. 2009. Methods for

  Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production , Ind. Eng. Chem.

  Res., 48(8), 3713-3729. Matissek, R. and G. Steiner, 2006. Lebensmittel

  Analytik: Grundzuge, Methoden, Anwendungen. Speringer-Verlag, ISBN: 978-3-540-62513-1.

  Mc Ginnis, G.D., W.W. Wilson, S.E. prince and C.C. Cheng, 1983. Conversion of biomass into chemicals with high- temperature wet oxidation. Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev., 22: 633-639. DOI: 101021/i300012a22. Sun, Y., dan Cheng, J.,2002.Hydrolysis of

  lignocellulosic material for ethanol production: a review. Bioresource

  Technology 83, 1-11. Wulandari,Annissa.2007.Bioethano Diakses pada tanggal 15 September 2012.

  WWW.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_niger diakses 19 November 2012 Jurnal Teknik Kimia No. 4, Vol. 19, Desember 2013