KALSIUM ALGINAT SEBAGAI PENDUKUNG AMOBILISASI L-ASPARAGINASE DARI BAWANG PUTIH (Allium sativum) | Kusumaningtias | Jurnal Kimia dan Pendidikan Kimia 8756 19111 1 PB
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol.1, No.2, Agustus 2016
Program Studi Pendidikan Kimia Universitas Sebelas Maret
http://jurnal.fkip.uns.ac.id/index.php/jkpk
halaman 7-15
ISSN 2503-4146
ISSN 2503-4154 (online)
KALSIUM ALGINAT SEBAGAI PENDUKUNG AMOBILISASI LASPARAGINASE DARI BAWANG PUTIH (Allium sativum)
Nindy Kusumaningtias*, Nies Suci Mulyani dan Purbowatiningrum Ria
Sarjono
Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro,
Semarang, Indonesia
*Keperluan korespondensi, telp: 081226283898, email: nindykusuma94@gmail.com
Received: July 22 , 2016
Accepted: August 15, 2016
Online Published: August 31, 2016
ABSTRAK
Enzim L-Asparaginase adalah enzim yang mampu menghidrolisis asam amino LAsparagin menjadi L-Aspartat dan amonia. Dalam Industri makanan, L-asparagin merupakan
salah satu asam amino yang mampu bereaksi dengan suatu gugus karbonil dalam bahan
makanan yang dipanaskan. Reaksi tersebut berjalan melalui jalur reaksi Maillard membentuk
senyawa akrilamida yang bersifat karsinogenik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mendapatkan enzim L-Asparaginase serta memperoleh karakter suhu dan pH optimum LAsparaginase dari bawang putih (Allium sativum) dalam bentuk enzim bebas maupun enzim
amobil dengan pendukung kalsium alginat. Tahap pertama penelitian dimulai dari isolasi LAsparaginase dari bawang putih dan pemurnian melalui pengendapan dengan amonium sulfat
dan dialisis. Tahap kedua melakukan uji aktivitas spesifik dan karakterisasi L-Asparaginase
dengan cara menghitung jumlah produk amonia yang terbentuk menggunakan pereaksi Nessler
dan mengukur kadar protein total dengan metode Lowry. Tahap selanjutnya yaitu amobilisasi LAsparaginase dalam matriks alginat dengan metode penjebakan. Tahap terakhir dari penelitian
ini yaitu karakterisasi L-Asparaginase amobil. Hasil penelitian ini menunjukkan aktivitas spesifik
tertinggi L-Asparaginase dari bawang putih ada pada fraksi 5 (80-100%) yaitu 1423,0248 U/mg
protein. Kondisi optimum L-Asparaginase bebas yaitu pada suhu 37°C, pH 8,6. Enzim
LAsparaginase dapat diamobil dalam matriks kalsium alginat dengan aktivitas spesifiik sebesar
1367,6741 U/mg protein yang diukur pada kondisi optimumnya yaitu pada suhu 42°C, pH 8,6.
Kata Kunci: Allium sativum, L-Asparaginase, Amobilisasi, Kalsium Alginat
ABSTRACT
Enzyme L-asparaginase hydrolizes L-asparagine into L-aspartate and ammonia. In the
food industry L-asparagine in one of amino acid that is reactable with a carbonyl group in
heated foodstuffs. The reaction comes through Maillard reactions to form carcinogenic
compound, acrylamide. This study aims to obtain the enzyme L-Asparaginase from garlic
(Allium sativum) as free enzymes and immobilized enzymes using calcium alginate supporters,
and as well as its characterizations of temperature and pH optimum. This research was
conducted into four steps. First step: isolation of L-Asparaginase from garlic and purification by
precipitation with ammonium sulfate and dialysis. Second step: determination of specific activity
of the purified L-Asparaginase based on ammonia product detected by Nessler reagent, protein
concentration were measured using Lowry methods. The third step: immobilization of LAsparaginase into the alginate matrix with trapping methods. The last step of this research is
characterization of L-Asparaginase immobilized. The results showed that the highest specific
activity of L-Asparaginase of garlic were found in fraction 5 (80-100%), 1423.0248 U/mg protein.
Optimum condition of L-Asparaginase as free form is at a temperature of 37 °C and pH 8.6.
That enzymes can be ammobilized into calcium alginate matrix and hahe spesifiik activities of
1367.6741 U/mg protein at a temperature of 42 ° C and pH 8.6.
Keywords: Allium sativum , L - Asparaginase , Immobilization , Calcium Alginate.
7
8
Kusumaningtias dkk., Kalsium Alginat Sebagai Pendukung Amobilisasi
enzim
PENDAHULUAN
L-Asparaginase.
Penelitian
yang
dilakukan Rizki dkk (2009) menunjukkan
Enzim
L-Asparaginase
amidohidrolase,
(L-Asparagin
E.C.3.5.1.1)
merupakan
enzim yang mampu mengkatalisis reaksi
hidrolisis L-Asparagin menjadi asam LAspartat
dan
amonia
Asparaginase
[5].
juga
Enzim
terbukti
L-
dapat
menurunkan kadar akrilamida di dalam
makanan.
Enzim
L-Asparaginase
dapat
bahwa bawang putih mengandung enzim LAsparaginase
asam
amino
L-Asparagin
sebagai prekusornya menjadi bentuk asam
amino lain yaitu asam L-Aspartat yang
umum terdapat dalam makanan [1].
optimum
manusia. Akrilamida dapat muncul pada
makanan
apabila
dipanaskan
sebagai
konsekuensi terjadinya reaksi antara LAsparagin dan sumber karbonil melalui
reaksi Maillard [1]. Beberapa penelitian
membuktikan
bahwa
menggunakan
enzim
terhadap
kentang
mereduksi
pre-treatment
L-Asparaginase
dan
akrilamida
dough
tanpa
[3].
Efektivitas
spesifik
dan
pH
optimum
8,6.
Aktivitas spesifik ini dinilai cukup tinggi untuk
kemudian diteliti dan dilakukan amobilisasi
agar dapat dilakukan pemakaian secara
berulang.
Amobilisasi dilakukan dengan matriks
alginat karena sifatnya yang tidak beracun,
mekanisme kestabilan dan porositasnya
tinggi,
memerlukan
prosedur
untuk
yang
ammobilisasi,
dan
harganya murah untuk diaplikasikan dalam
industri makanan atau farmasi [2].
Dari
bertujuan
uraian
untuk
diatas,
penelitian
memperoleh
enzim
ini
L-
Asparaginase baik bebas maupun amobil
dan memberikan informasi karakter enzim LAsparaginase
bebas
dan
amobil
dari
bawang putih pada matriks kalsium alginat.
efektif
merusak
penampilan dan rasa dari hasil akhir produk
makanan
37°C,
sederhana
Akrilamida bersifat karsinogenik pada
aktivitas
sebesar 506,158 U/mg protein pada suhu
mencegah pembentukan akrilamida dengan
mengkonversi
dengan
enzim
L-
METODE PENELITIAN
Bahan dan Alat
Asparaginase dalam mereduksi akrilamida
Bahan:
juga telah teruji dan dijadikan beberapa
hidroksimetil aminometan p.a., amonium
paten yang berbeda dalam pengolahan
sulfat
makanan seperti camilan, keripik, dough, dll
acetate (TCA) p.a., Bovine serum albumine
[4].
(BSA) p.a., Follin ciocalteau p.a., natrium
Selama
bawang
p.a.,
putih,
L-asparagin
bufer
p.a.,
tris-
Trichloro
putih
(Allium
alginat, kalsium klorida p.a., barium klorida
sebagai
bumbu
p.a., akuades, natrium karbonat p.a., kalium
penyedap makanan dan diekstrak kemudian
natrium tartrat p.a., tembaga sulfat p.a.,
dikapsulkan
reagen Nessler (kalium iodida dan raksa (II)
sativum)
ini,
Bawang
dimanfaatkan
sebagai
suplemen
untuk
memelihara kesehatan tubuh. Di sisi lain,
iodida).
bawang putih juga mengandung enzim L-
Alat:
Asparaginase [7]. Untuk itu, padapenelitian
spektrofotometer
ini digunakan bawang putih sebagai sumber
inkubator, lumpang dan mortar, timbangan,
Sentrifugasi
UV-Vis
(Centrific-228),
(Shimadzu),
9
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 2, Agustus 2016, hal. 7-15
neraca analitik (kern 870), magnetic stirer
2.2 Dialisis Enzim
(Quart), kulkas, membran selofan, kertas
saring,
gunting,
tali,
botol
semprot,
Dialisis dilakukan dengan membran
selofan.Selofan yang telah berisi enzim
aluminium foil, plastic wrap, dan alat-alat
direndam
gelas untuk analisa.
aminometan 0,002 M pH 8,6 dalam keadaan
dalam
bufer
tris-hidroksimetil
dingin. Bufer diaduk dengan magnetic stirrer
Cara Kerja
dan
1. Isolasi Enzim
amonium sulfatnya setiap 2 jam dengan
dilakukan
pengujian
kandungan
Sampel penelitian berupa 250 g umbi
penambahan BaCl2. Dialisis dihentikan jika
bawang putih Allium sativum yang ditumbuk
hasil pengujian tidak lagi menghasilkan
kemudian ditambahkan dengan 125 mL 0,2
endapan putih.
M bufer tris-hidroksimetil aminometan pH
2.3 Penentuan Aktivitas Enzim
8,6 dan dihomogenkan. Homogenat yang
Larutan substrat 1 mL L-asparagin
diperoleh selanjutnya di didiamkan 1-2 jam
ditambahkan dengan 0,05 mL enzim bebas
o
pada suhu 5 C kemudian disaring dan
dan 2,5 bufer tris-hidroksimetil aminometan
filtratnya disentrifugasi. Supernatan yang
0,2 M pH 8,6 diinkubasi pada suhu 37 C
diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim
selama 30 menit kemudian ditambahkan
(EK).
larutan TCA 1,5 M sebanyak 1 mL dan
2. Pemurnian Enzim
disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm
2.1 Fraksinasi Amonium Sulfat
selama
o
15
menit
untuk
memisahkan
garam
endapan. Filtrat diambil sebanyak 0,5 mL
amonium sulfat dilakukan untuk memurnikan
lalu ditambah 4 mL akuades dan 1 mL
enzim
pereaksi Nessler. Campuran ini kemudian
Pengendapan
(enzim
dengan
kasar)
dengan
prinsip
pengendapan. Amonium sulfat ditimbang
diukur
sesuai fraksi yang dikehendaki 0-20% (dari
gelombang
tabel fraksinasi) dimasukkan dalam gelas
spektrofotometer UV-Vis. Aktivitas enzim
beaker berisi ekstrak kasar sambil diaduk
ditentukan secara regresi linier terhadap
dengan magnetic stirer dalam keadaan
kurva standar amonium sulfat.
dingin.
Campuran
didiamkan
semalam
2.4 Penentuan Kadar Protein dengan
dalam
keadaan
dingin
kemudian
Metode Lowry
disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm
absorbansinya
optimum
pada
(402
nm)
panjang
dengan
Sebanyak 9,8 mL larutan Na2CO3
diperoleh
ditambah 0,1 mL larutan kalium natrium
endapan dan filtrat untuk fraksi 0-20% (F1).
tartrat dan 0,1 mL larutan CuSO4 kemudian
Endapan dipisahkan dan disuspensi dengan
dikocok perlahan. Campuran ini kemudian
0,2 M bufer Tris-hidroksimetil aminometan
ditambahkan 0,1 mL larutan ekstrak kasar
pH 8,6. Endapan tersebut merupakan fraksi
atau enzim (F1, F2, F3, F4 dan F5) dan
0-20%. Filtrat diperlakukan sama dengan
diinkubasi selama 10 menit pada suhu
diatas
fraksi-fraksi
kamar. Campuran ini ditambahkan 1 mL
protein dengan tingkat kejenuhan 20-40%,
folin-ciocalteau kemudian diinkubasi kembali
40-60%, 60-80%, 80-100%.
selama 30 menit pada suhu kamar. Larutan
selama
15
menit
sehingga
sehingga
diperoleh
10
Kusumaningtias dkk., Kalsium Alginat Sebagai Pendukung Amobilisasi
tersebut selanjutnya diukur absorbansinya
natrium alginat ditambahkan 0,1 mL enzim
menggunakan
UV-Vis
sambil diaduk hingga homogen. Penetesan
pada panjang gelombang optimum BSA
dilakukan menggunakan pipet tetes ke
(726 nm). Kadar protein ditentukan secara
dalam larutan CaCl2 0,2 M dingin kemudian
regresi linier terhadap kurva standar BSA.
diinkubasi selama 2 jam. Manik-manik enzim
spektrofotometer
yang telah terbentuk disaring menggunakan
3. Karakterisasi Enzim
kertas saring untuk dipisahkan dari larutan
3.2 Penentuan Suhu Optimum
kalsium klorida lalu dicuci menggunakan
Larutan substrat L-Asparagin 1 mL,
akuades sebanyak 3 kali. Larutan kalsium
ditambah 0,05 mL enzim dan 2,5 mL bufer
klorida ini selanjutnya digunakan untuk
tris-hidroksimetil aminometan 0,2 M pH 8,6
mengukur kadar protein teramobil.
dan diinkubasi selama 30 menit dengan
variasi suhu (27, 32, 37, 42, 47)°C. Tahap
4. Karakterisasi Enzim Amobil
selanjutnya ditambahkan larutan TCA 1,5 M
4.1 Penentuan Suhu Optimum
Enzim
sebanyak 1 mL. Campuran ini diambil
amobil
ditambah
larutan
sebanyak 0,5 mL lalu ditambahkan 4 mL
substrat L-Asparagin sebanyak 1 mL dan
akuades
Nessler.
2,5 mL bufer tris-hidroksimetil aminometan
Larutan ini kemudian diukur absorbansinya
0,2 M pH 8,6 dan diinkubasi selama 30
pada panjang gelombang optimum (402 nm)
menit dengan variasi suhu (27, 32, 37, 42,
dengan spektrometer UV-Vis.
47)°C. Campuran ini ditambahkan larutan
3.3 Penentuan pH Optimum
TCA 1,5 M sebanyak 1 mL. Larutan tersebut
dan
1
mL pereaksi
Larutan substrat L-Asparagin 1 mL,
diambil sebanyak 0,5 mL lalu ditambahkan 4
ditambah 0,05 mL enzim dan 2,5 mL bufer
mL akuades dan 1 mL pereaksi Nessler.
tris-hidroksimetil aminometan 0,2 M dengan
Campuran
variasi pH (8,2; 8,4; 8,6; 8,8; 9,0) dan
absorbansinya pada panjang gelombang
diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit.
optimum (402 nm) dengan spektrometer UV-
Campuran ini ditambahkan larutan TCA 1,5
Vis.
M sebanyak 1 mL. Larutan tersebut diambil
4.2 Penentuan pH optimum
Enzim
sebanyak 0,5 mL lalu ditambahkan 4 mL
akuades
dan
1
mL pereaksi
Nessler.
substrat
ini
kemudian
amobil
L-Asparagin
ditambah
sebanyak
diukur
larutan
1
mL,
diukur
ditambah 0,05 mL enzim dan 2,5 mL bufer
absorbansinya pada panjang gelombang
tris-hidroksimetil aminometan 0,2 M dengan
optimum (402 nm) dengan spektrometer UV-
variasi pH (8,2; 8,4; 8,6; 8,8; 9,0) dan
Vis.
diinkubasi selama 30 menit pada suuhu
3.4 Amobilisasi Enzim
37°C. Campuran ini ditambahkan larutan
Campuran
ini
kemudian
Pembuatan larutan Natrium Alginat
TCA 1,5 M sebanyak 1 mL. Selanjutnya
3%. Natrium alginat dilarutkan dalam bufer
filtrat
tris-hidroksimetil aminometan 0,2 M pH 8,6
ditambahkan 4 mL akuades dan 1 mL
dalam keadaan panas dan diaduk hingga
pereaksi Nessler. Campuran ini kemudian
homogen. Suhu diturunkan menjadi 37°C,
diukur
diambil
sebanyak
absorbansinya
0,5
pada
mL
lalu
panjang
11
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 2, Agustus 2016, hal. 7-15
gelombang
optimum
(402
nm)
dengan
spektrometer UV-Vis.
4.3
Penentuan
protein
menggunakan
garam
amonium
sulfat, sentrifugasi dan dialisis.
Kadar
Protein
Enzim
Amobil
Ammonium
digunakan
sulfat
karena
lebih
memiliki
sering
beberapa
Filtrat hasil rendaman (CaCl2) dan
kelebihan dibandingkan garam-garam yang
larutan hasil pencucian (akuades) enzim
lain, yaitu mempunyai kelarutan yang tinggi,
amobil diukur kadar proteinnya dengan
tidak
metode Lowry. Sebanyak 9,8 mL larutan
mempunyai daya pengendapan yang efektif,
Na2CO3 ditambah 0,1 mL larutan kalium
mempunyai
natrium tartrat dan 0,1 mL larutan CuSO4
kebanyakan enzim, dapat digunakan pada
dikocok perlahan. Campuran ini kemudian
berbagai pH dan harganya murah [8].
ditambahkan 1 mL filtrat dan diinkubasi
selama
10
menit
Sebanyak
1
ditambahkan
pada
pada
suhu
mL
kamar.
folin-ciocalteau
campuran
tersebut
mempengaruhi
Hasil
berupa
efek
aktivitas
penstabil
pemurnian
fraksi
endapan
enzim,
terhadap
yang
diperoleh
protein
dengan
berbagai tingkat kemurnian. Penambahan
garam
pada
konsentrasi
tinggi
akan
secara cepat dan diinkubasi pada suhu
menurunkan
kamar selama 30 menit. Larutan tersebut
dikarenakan adanya peningkatan muatan
diukur
listrik di sekitar protein yang akan menarik
absorbansinya
gelombang
optimum
pada
(726
protein.
Hal
ini
nm)
molekul-molekul air dari protein. Interaksi
kemudian ditentukan kadar protein yang
hidrofobik sesama molekul protein pada
terserap
menghitung
suasana ionik tinggi akan menyebabkan
selisih antara kadar protein enzim bebas
pengendapan protein, yang disebut salting
dengan kadar protein filtrat.
out. Protein yang hidrofobisitasnya tinggi
dilakukan
BSA
panjang
kelarutan
dengan
akan mengendap lebih dahulu, sedangkan
protein yang memiliki sedikit residu non
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Isolasi dan Purifikasi L-Asparaginase
dari Bawang Putih.
Isolasi
L-Asparaginase
dilakukan
secara mekanik yaitu dengan mengekstrak
bawang putih melalui pemecahan jaringan
bawang putih.
Ekstrak
kasar
enzim
merupakan
campuran protein enzim dan protein non
enzim yang diperoleh dari proses ekstraksi
bawang putih. Untuk memperoleh enzim LAsparaginase dengan tingkat kemurnian
yang tinggi maka perlu dilakukan pemurnian
terhadap ekstrak kasar. Pemurnian yang
dilakukan
adalah
dengan
pengendapan
polar (lebih hidrofilik) akan tetap larut
meskipun pada konsentrasi garam yang
paling tinggi [8].
Pada tahap pemurnian selanjutnya,
dialisis dilakukan sebagai metode untuk
memisahkan
partikel-partikel
kecil
lebih
dari
partikel-partikel
yang
besar
menggunakan
membran
semipermeabel
berdasarkan
prinsip
difusi,
perpindahan
molekul
dari
larutan
berkonsentrasi
tinggi
ke
larutan
berkonsentrasi
rendah.Enzim
yaitu
yang
merupakan molekul berukuran besar akan
tetap tertahan di dalam membran karena
tidak mampu melewati pori-pori membran
12
Kusumaningtias dkk., Kalsium Alginat Sebagai Pendukung Amobilisasi
selofan. Garam amonium sufat sebagai
penyusun protein enzim L-asparaginase
molekul
yang
kecil
akan
bermigrasi
keluar
bersifat
hidrofil,
sehingga
membran sehingga enzim menjadi lebih
membutuhkan garam amonium sulfat lebih
murni.
banyak untuk mengendapkannya.
2. Uji
Aktivitas
Spesifik
Enzim
L-
spesifik
ini
Asparaginase.
Penentuan
aktivitas
bertujuan untuk mengetahui kemurnian tiap
fraksi enzim. Enzim L-Asparaginase dalam
menghidrolisis
substrat
L-Asparagin
menghasilkan produk asam L-Aspartat dan
amonia. Aktivitas enzim L-Asparaginase
dapat diketahui dari total amonia yang
dihasilkan dari reaksi enzimatis melalui
metode Nessler.
Gambar 1. Grafik hubungan antara fraksi
pemurnian enzim dan aktivitas
spesifik enzim L-Asparaginase
3. Penentuan Karakter Optimum Enzim
Aktivitas
spesifik
enzim
L-
Bebas
Asparaginase dari bawang putih dapat
Karakterisasi
L-Asparaginase
ini
dilihat pada Gambar 1. Satu unit aktivitas
bertujuan
enzim L-Asparaginase didefinisikan sebagai
optimum dari L-Asparginase hasil isolasi.
aktivitas enzim yang menghasilkan 1μmol
Fraksi
produk L-Aspartat maupun amonia per
merupakan
satuan
aktivitas spesifik tertinggi yaitu fraksi 5.
menit
Aktivitas
pada
spesifik
kondisi
enzim
optimum.
untuk
enzim
fraksi
mengetahui
yang
enzim
kondisi
dikarakterisasi
yang
memiliki
L-Asparaginase
ditentukan berdasarkan perhitungan unit
4. Suhu Optimum L-Asparaginase Bebas
aktivitas enzim L-Asparaginase (Unit/mL)
Ditinjau dari struktur protein, suhu
per kadar protein enzim L-Asparaginase
berpengaruh terhadap kerenggangan dan
(mg/mL protein).
kerapatan
ikatan
pada
struktur
protein
Gambar 1 menunjukkan pada setiap fraksi
enzim. Hasil penentuan suhu optimum L-
enzim
Asparaginase bebas dapat dilihat pada
memiliki
berbeda.
Pada
aktivitas
spesifik
fraksi
memiliki
5
yang
nilai
Gambar 2.
aktivitas spesifik tertinggi yaitu sebesar
Berdasarkan Gambar 2 dapat dilihat
1423,0248 U/mg protein. Hasil tersebut
bahwa suhu optimum dari L-Asparaginase
menunjukkan bahwa dalam fraksi 5 terdapat
hasil isolasi adalah 37°C yang ditunjukkan
enzim
dengan meningkatnya aktivitas enzim. Pada
L-Asparaginase
lebih
banyak
dibandingkan dengan fraksi lainnya.
suhu optimum, konformasi dari struktur
Pada fraksi 5 menunjukkan aktivitas spesifik
protein enzim berada tepat untuk mengikat
yang lebih besar dibandingkan dengan fraksi
substrat dalam membentuk produk sehingga
protein sebelumnya. Hal ini menunjukkan
menghasilkan aktivitas tertinggi.
bahwa pada fraksi 5 banyak asam amino
13
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 2, Agustus 2016, hal. 7-15
menyebabkan proses katalisis tidak berjalan
optimal sehingga aktivitas enzim menurun
atau kurang optimal.
Gambar 2. Grafik hubungan antara suhu
dan aktivitas spesifik enzim Lasparaginase.
Enzim merupakan protein yang tersusun
dari
ribuan
asam-asam
amino
dimana
Gambar 3. Grafik hubungan antara pH
lingkungan enzim dan aktivitas
protein dapat mengalami denaturasi pada
spesifik enzim L-Asparaginase
suhu tinggi. Kenaikan aktivitas enzim di
bawah suhu optimum disebabkan karena
kenaikan energi kinetika molekul-molekul
enzim yang bereaksi. Akan tetapi apabila
suhu tetap dinaikkan terus, energi kinetika
molekul-molekul
sehingga
sekunder
enzim
menjadi
memecahkan
yang
besar
Dengan
demikian
perubahan
pH
berpengaruh terhadap efektivitas sisi aktif
enzim dalam membentuk kompleks enzim
substrat.
ikatan-ikatan
mempertahankan
enzim
dalam bentuk aslinya, akibatnya struktur
sekunder dan tersier berubah sehingga
6. Amobilisasi
Enzim
L-Asparaginase
dengan Pendukung Kalsium Alginat
Amobilisasi enzim merupakan suatu
proses dimana pergerakan molekul enzim
aktivitas enzim menurun.
ditahan sedemikian rupa sehingga terbentuk
sistem enzim yang aktif dan tidak larut
5. pH Optimum L-Asparaginase Bebas
Struktur protein enzim salah satunya
dipengaruhi oleh pH [6]. Hasil penentuan pH
optimum
ditunjukkan
pada
Gambar
3.
Berdasarkan Gambar 3 dapat diketahui
bahwa pH optimum enzim L-Asparaginase
dari bawang putih adalah 8,6. Pada pH
tersebut, enzim berada pada konformasi
struktur enzim 3 dimensi yang tepat untuk
mengikat substrat. Pada kondisi di luar pH
optimum, konformasi enzim mulai berubah
menyebabkan posisi substrat berada tidak
tepat
pada
sisi
aktif
enzim.
Hal
ini
dalam air. Hasil amobilisasi L-Asparaginase
pada matriks alginat yaitu berupa manikmanik enzim amobil.
Aktivitas spesifik L-Asparaginase amobil
mengalami
sebesar
penurunan
aktivitas
spesifik
4% jika dibandingkan dengan
aktivitas spesifik enzim bebas (aktivitas
spesifik enzim amobil 1367,6741 U/mg,
aktivitas spesifik enzim bebas 1423,0248
U/mg). Penurunan aktivitas enzim amobil
disebabkan
adanya
menghalangi
substrat
matriks
untuk
yang
berikatan
14
Kusumaningtias dkk., Kalsium Alginat Sebagai Pendukung Amobilisasi
dengan enzim. Amobilisasi enzim dengan
enzim
metode penjebakan akan menyebabkan
bertahan pada suhu yang lebih tinggi
penghambatan kerja enzim [9].
dibandingkan dengan enzim L-Asparaginase
L-Asparaginase
amobil
mampu
bebas.
7. Penentuan
Karakter
Optimum
L-
Asparaginase Amobil.
a. Penentuan
Suhu
b. Penentuan pH Optimum L-Asparaginase
Optimum
L-
Asparaginase Amobil
Amobil.
Penentuan
Penentuan suhu optimum bertujuan
untuk mengetahui kondisi optimum enzim
setelah dilakukan amobil. Hasil penentuan
suhu optimum L-Asparaginase amobil dapat
dilakukan
untuk
pH
optimum
mengetahui
perlu
kondisi
optimum enzim dalam bereaksi dengan
substrat. Hasil karakterisasi pH optimum
dapat dilihat pada Gambar 5.
dilihat pada Gambar 4.
Gambar
Gambar 4. Grafik hubungan antara suhu
dan aktivitas spesifik enzim L-Asparaginase
amobil.
Berdasarkan grafik di atas, dapat dilihat
bahwa suhu optimum dari L-Asparaginase
amobil adalah 42°C. Suhu optimum pada
enzim amobil lebih tinggi dari enzim bebas
dikarenakan matriks kalsium alginat mampu
melindungi enzim L-Asparaginase amobil
terhadap
panas
sehingga
enzim
L-
Asparaginase mampu bertahan pada suhu
yang lebih tinggi dibandingkan dengan
enzim L-Asparaginase bebas. Hal tersebut
menunjukkan bahwa matriks kalsium alginat
mampu melindungi enzim L-Asparaginase
amobil terhadap peningkatan suhu sehingga
5.Grafik
hubungan
lingkungan
dan
antara
pH
aktivitas
spesifik enzim L-Asparaginase
amobil.
Berdasarkan grafik di atas dapat diketahui
bahwa pH optimum L-Asparaginase amobil
dari bawang putih adalah pada pH 8,6.
Kondisi optimum dari enzim bebas dan
amobil adalah sama. Hal ini menunjukkan
bahwa penggunaan matriks alginat dalam
amobilisasi L-Asparaginase dari bawang
putih tidak menyebabkan perubahan muatan
sisi aktif enzim maupun struktur enzim
terutama pada sisi aktif enzim.
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 2, Agustus 2016, hal. 7-15
15
Enzymatic Elimination of Acrylamide in
KESIMPULAN
Berdasarkan
penelitian
yang
Potato-Based
telah
1. L-Asparaginase
dapat
diisolasi
dari
[4]
Dough Food Component Using Water
tertinggi pada fraksi 5 (80-100%) yaitu
Activity, Patent No US20080166450-
1423,0248 U/mg protein.
A1.
2. Kondisi optimum L-Asparaginase bebas
3. L-Asparaginase dapat diamobil pada
[5]
Article of Journal: Lincoln, L., dan More,
S.S., 2014, Isolation and Production of
matriks kalsium alginat 3% dengan
Clinical
penurunan aktivitas sebesar 4% dari
and
Food
Asparaginase
aktivitas L-Asparaginase bebas.
Grade
Enzyme
Lfrom
Fungi,India.
4. Kondisi optimum L-Asparaginase amobil
diperoleh pada suhu 42°C dan pH 8,6.
Article of Journal: Corrigan, P.J., 2008,
Methods for Reducing Asparagine in a
bawang putih dengan aktivitas spesifik
diperoleh pada suhu 37°C dan pH 8,6.
Treated
Foods, Slovak Republic.
dilakukan dapat disimpulkan beberapa hal
sebagai berikut:
Thermally
[6]
Chapter of Book: Lehninger, A.L., 1982,
Principles of Biochemistry: 1st Edition,
UCAPAN TERIMA KASIH
Worth Pub, New York.
Penelitian ini sukses dan berjalan
dengan lancar berkat dukungan dari dosen
[7] Thesis: Rizki, R.A., 2009, Isolasi dan
pembimbing, dosen lab. biokimia, dosen
Karakterisasi
jurusan kimia, laboran jurusan kimia, serta
dari Bawang Putih (Allium sativum),
teman-teman jurusan kimia angkatan 2011.
Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan
Enzim
L-Asparaginase
Matematika, Universitas Diponegoro,
Semarang.
DAFTAR RUJUKAN
[1]
Article of Journal: Anese, M., Quarta,
[8]
B., dan Frias, J.M., 2011, Modelling
Whole Book: Scopes,
Protein
Effect of Asparginase in Reducing
Purification,
Practice, 2
Acrylamide Formation in Biscuits Food
nd
R.K.,
Priciple
1987,
and
ed, Springer Verlag, New
York.
Chemistry, Ireland.
[9]
[2] Article of Journal: Bucke, C., 1987,
Industrial Use of Immobilized Enzyme
and Cells, In: Immobilized Microbial
Enzyme and Cells, Bangkok.
[3]
Article
of
Journal:
Ciesarová,
Z.,
Kukurová, K., dan Benešová, C., 2010,
Whole
Book:
Biotechnology,
Smith,
J.E.,
Diterjemahkan
1990,
oleh
Hartono, A., Penerbit Buku Kedokteran
Indonesia, Jakarta.
Program Studi Pendidikan Kimia Universitas Sebelas Maret
http://jurnal.fkip.uns.ac.id/index.php/jkpk
halaman 7-15
ISSN 2503-4146
ISSN 2503-4154 (online)
KALSIUM ALGINAT SEBAGAI PENDUKUNG AMOBILISASI LASPARAGINASE DARI BAWANG PUTIH (Allium sativum)
Nindy Kusumaningtias*, Nies Suci Mulyani dan Purbowatiningrum Ria
Sarjono
Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro,
Semarang, Indonesia
*Keperluan korespondensi, telp: 081226283898, email: nindykusuma94@gmail.com
Received: July 22 , 2016
Accepted: August 15, 2016
Online Published: August 31, 2016
ABSTRAK
Enzim L-Asparaginase adalah enzim yang mampu menghidrolisis asam amino LAsparagin menjadi L-Aspartat dan amonia. Dalam Industri makanan, L-asparagin merupakan
salah satu asam amino yang mampu bereaksi dengan suatu gugus karbonil dalam bahan
makanan yang dipanaskan. Reaksi tersebut berjalan melalui jalur reaksi Maillard membentuk
senyawa akrilamida yang bersifat karsinogenik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mendapatkan enzim L-Asparaginase serta memperoleh karakter suhu dan pH optimum LAsparaginase dari bawang putih (Allium sativum) dalam bentuk enzim bebas maupun enzim
amobil dengan pendukung kalsium alginat. Tahap pertama penelitian dimulai dari isolasi LAsparaginase dari bawang putih dan pemurnian melalui pengendapan dengan amonium sulfat
dan dialisis. Tahap kedua melakukan uji aktivitas spesifik dan karakterisasi L-Asparaginase
dengan cara menghitung jumlah produk amonia yang terbentuk menggunakan pereaksi Nessler
dan mengukur kadar protein total dengan metode Lowry. Tahap selanjutnya yaitu amobilisasi LAsparaginase dalam matriks alginat dengan metode penjebakan. Tahap terakhir dari penelitian
ini yaitu karakterisasi L-Asparaginase amobil. Hasil penelitian ini menunjukkan aktivitas spesifik
tertinggi L-Asparaginase dari bawang putih ada pada fraksi 5 (80-100%) yaitu 1423,0248 U/mg
protein. Kondisi optimum L-Asparaginase bebas yaitu pada suhu 37°C, pH 8,6. Enzim
LAsparaginase dapat diamobil dalam matriks kalsium alginat dengan aktivitas spesifiik sebesar
1367,6741 U/mg protein yang diukur pada kondisi optimumnya yaitu pada suhu 42°C, pH 8,6.
Kata Kunci: Allium sativum, L-Asparaginase, Amobilisasi, Kalsium Alginat
ABSTRACT
Enzyme L-asparaginase hydrolizes L-asparagine into L-aspartate and ammonia. In the
food industry L-asparagine in one of amino acid that is reactable with a carbonyl group in
heated foodstuffs. The reaction comes through Maillard reactions to form carcinogenic
compound, acrylamide. This study aims to obtain the enzyme L-Asparaginase from garlic
(Allium sativum) as free enzymes and immobilized enzymes using calcium alginate supporters,
and as well as its characterizations of temperature and pH optimum. This research was
conducted into four steps. First step: isolation of L-Asparaginase from garlic and purification by
precipitation with ammonium sulfate and dialysis. Second step: determination of specific activity
of the purified L-Asparaginase based on ammonia product detected by Nessler reagent, protein
concentration were measured using Lowry methods. The third step: immobilization of LAsparaginase into the alginate matrix with trapping methods. The last step of this research is
characterization of L-Asparaginase immobilized. The results showed that the highest specific
activity of L-Asparaginase of garlic were found in fraction 5 (80-100%), 1423.0248 U/mg protein.
Optimum condition of L-Asparaginase as free form is at a temperature of 37 °C and pH 8.6.
That enzymes can be ammobilized into calcium alginate matrix and hahe spesifiik activities of
1367.6741 U/mg protein at a temperature of 42 ° C and pH 8.6.
Keywords: Allium sativum , L - Asparaginase , Immobilization , Calcium Alginate.
7
8
Kusumaningtias dkk., Kalsium Alginat Sebagai Pendukung Amobilisasi
enzim
PENDAHULUAN
L-Asparaginase.
Penelitian
yang
dilakukan Rizki dkk (2009) menunjukkan
Enzim
L-Asparaginase
amidohidrolase,
(L-Asparagin
E.C.3.5.1.1)
merupakan
enzim yang mampu mengkatalisis reaksi
hidrolisis L-Asparagin menjadi asam LAspartat
dan
amonia
Asparaginase
[5].
juga
Enzim
terbukti
L-
dapat
menurunkan kadar akrilamida di dalam
makanan.
Enzim
L-Asparaginase
dapat
bahwa bawang putih mengandung enzim LAsparaginase
asam
amino
L-Asparagin
sebagai prekusornya menjadi bentuk asam
amino lain yaitu asam L-Aspartat yang
umum terdapat dalam makanan [1].
optimum
manusia. Akrilamida dapat muncul pada
makanan
apabila
dipanaskan
sebagai
konsekuensi terjadinya reaksi antara LAsparagin dan sumber karbonil melalui
reaksi Maillard [1]. Beberapa penelitian
membuktikan
bahwa
menggunakan
enzim
terhadap
kentang
mereduksi
pre-treatment
L-Asparaginase
dan
akrilamida
dough
tanpa
[3].
Efektivitas
spesifik
dan
pH
optimum
8,6.
Aktivitas spesifik ini dinilai cukup tinggi untuk
kemudian diteliti dan dilakukan amobilisasi
agar dapat dilakukan pemakaian secara
berulang.
Amobilisasi dilakukan dengan matriks
alginat karena sifatnya yang tidak beracun,
mekanisme kestabilan dan porositasnya
tinggi,
memerlukan
prosedur
untuk
yang
ammobilisasi,
dan
harganya murah untuk diaplikasikan dalam
industri makanan atau farmasi [2].
Dari
bertujuan
uraian
untuk
diatas,
penelitian
memperoleh
enzim
ini
L-
Asparaginase baik bebas maupun amobil
dan memberikan informasi karakter enzim LAsparaginase
bebas
dan
amobil
dari
bawang putih pada matriks kalsium alginat.
efektif
merusak
penampilan dan rasa dari hasil akhir produk
makanan
37°C,
sederhana
Akrilamida bersifat karsinogenik pada
aktivitas
sebesar 506,158 U/mg protein pada suhu
mencegah pembentukan akrilamida dengan
mengkonversi
dengan
enzim
L-
METODE PENELITIAN
Bahan dan Alat
Asparaginase dalam mereduksi akrilamida
Bahan:
juga telah teruji dan dijadikan beberapa
hidroksimetil aminometan p.a., amonium
paten yang berbeda dalam pengolahan
sulfat
makanan seperti camilan, keripik, dough, dll
acetate (TCA) p.a., Bovine serum albumine
[4].
(BSA) p.a., Follin ciocalteau p.a., natrium
Selama
bawang
p.a.,
putih,
L-asparagin
bufer
p.a.,
tris-
Trichloro
putih
(Allium
alginat, kalsium klorida p.a., barium klorida
sebagai
bumbu
p.a., akuades, natrium karbonat p.a., kalium
penyedap makanan dan diekstrak kemudian
natrium tartrat p.a., tembaga sulfat p.a.,
dikapsulkan
reagen Nessler (kalium iodida dan raksa (II)
sativum)
ini,
Bawang
dimanfaatkan
sebagai
suplemen
untuk
memelihara kesehatan tubuh. Di sisi lain,
iodida).
bawang putih juga mengandung enzim L-
Alat:
Asparaginase [7]. Untuk itu, padapenelitian
spektrofotometer
ini digunakan bawang putih sebagai sumber
inkubator, lumpang dan mortar, timbangan,
Sentrifugasi
UV-Vis
(Centrific-228),
(Shimadzu),
9
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 2, Agustus 2016, hal. 7-15
neraca analitik (kern 870), magnetic stirer
2.2 Dialisis Enzim
(Quart), kulkas, membran selofan, kertas
saring,
gunting,
tali,
botol
semprot,
Dialisis dilakukan dengan membran
selofan.Selofan yang telah berisi enzim
aluminium foil, plastic wrap, dan alat-alat
direndam
gelas untuk analisa.
aminometan 0,002 M pH 8,6 dalam keadaan
dalam
bufer
tris-hidroksimetil
dingin. Bufer diaduk dengan magnetic stirrer
Cara Kerja
dan
1. Isolasi Enzim
amonium sulfatnya setiap 2 jam dengan
dilakukan
pengujian
kandungan
Sampel penelitian berupa 250 g umbi
penambahan BaCl2. Dialisis dihentikan jika
bawang putih Allium sativum yang ditumbuk
hasil pengujian tidak lagi menghasilkan
kemudian ditambahkan dengan 125 mL 0,2
endapan putih.
M bufer tris-hidroksimetil aminometan pH
2.3 Penentuan Aktivitas Enzim
8,6 dan dihomogenkan. Homogenat yang
Larutan substrat 1 mL L-asparagin
diperoleh selanjutnya di didiamkan 1-2 jam
ditambahkan dengan 0,05 mL enzim bebas
o
pada suhu 5 C kemudian disaring dan
dan 2,5 bufer tris-hidroksimetil aminometan
filtratnya disentrifugasi. Supernatan yang
0,2 M pH 8,6 diinkubasi pada suhu 37 C
diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim
selama 30 menit kemudian ditambahkan
(EK).
larutan TCA 1,5 M sebanyak 1 mL dan
2. Pemurnian Enzim
disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm
2.1 Fraksinasi Amonium Sulfat
selama
o
15
menit
untuk
memisahkan
garam
endapan. Filtrat diambil sebanyak 0,5 mL
amonium sulfat dilakukan untuk memurnikan
lalu ditambah 4 mL akuades dan 1 mL
enzim
pereaksi Nessler. Campuran ini kemudian
Pengendapan
(enzim
dengan
kasar)
dengan
prinsip
pengendapan. Amonium sulfat ditimbang
diukur
sesuai fraksi yang dikehendaki 0-20% (dari
gelombang
tabel fraksinasi) dimasukkan dalam gelas
spektrofotometer UV-Vis. Aktivitas enzim
beaker berisi ekstrak kasar sambil diaduk
ditentukan secara regresi linier terhadap
dengan magnetic stirer dalam keadaan
kurva standar amonium sulfat.
dingin.
Campuran
didiamkan
semalam
2.4 Penentuan Kadar Protein dengan
dalam
keadaan
dingin
kemudian
Metode Lowry
disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm
absorbansinya
optimum
pada
(402
nm)
panjang
dengan
Sebanyak 9,8 mL larutan Na2CO3
diperoleh
ditambah 0,1 mL larutan kalium natrium
endapan dan filtrat untuk fraksi 0-20% (F1).
tartrat dan 0,1 mL larutan CuSO4 kemudian
Endapan dipisahkan dan disuspensi dengan
dikocok perlahan. Campuran ini kemudian
0,2 M bufer Tris-hidroksimetil aminometan
ditambahkan 0,1 mL larutan ekstrak kasar
pH 8,6. Endapan tersebut merupakan fraksi
atau enzim (F1, F2, F3, F4 dan F5) dan
0-20%. Filtrat diperlakukan sama dengan
diinkubasi selama 10 menit pada suhu
diatas
fraksi-fraksi
kamar. Campuran ini ditambahkan 1 mL
protein dengan tingkat kejenuhan 20-40%,
folin-ciocalteau kemudian diinkubasi kembali
40-60%, 60-80%, 80-100%.
selama 30 menit pada suhu kamar. Larutan
selama
15
menit
sehingga
sehingga
diperoleh
10
Kusumaningtias dkk., Kalsium Alginat Sebagai Pendukung Amobilisasi
tersebut selanjutnya diukur absorbansinya
natrium alginat ditambahkan 0,1 mL enzim
menggunakan
UV-Vis
sambil diaduk hingga homogen. Penetesan
pada panjang gelombang optimum BSA
dilakukan menggunakan pipet tetes ke
(726 nm). Kadar protein ditentukan secara
dalam larutan CaCl2 0,2 M dingin kemudian
regresi linier terhadap kurva standar BSA.
diinkubasi selama 2 jam. Manik-manik enzim
spektrofotometer
yang telah terbentuk disaring menggunakan
3. Karakterisasi Enzim
kertas saring untuk dipisahkan dari larutan
3.2 Penentuan Suhu Optimum
kalsium klorida lalu dicuci menggunakan
Larutan substrat L-Asparagin 1 mL,
akuades sebanyak 3 kali. Larutan kalsium
ditambah 0,05 mL enzim dan 2,5 mL bufer
klorida ini selanjutnya digunakan untuk
tris-hidroksimetil aminometan 0,2 M pH 8,6
mengukur kadar protein teramobil.
dan diinkubasi selama 30 menit dengan
variasi suhu (27, 32, 37, 42, 47)°C. Tahap
4. Karakterisasi Enzim Amobil
selanjutnya ditambahkan larutan TCA 1,5 M
4.1 Penentuan Suhu Optimum
Enzim
sebanyak 1 mL. Campuran ini diambil
amobil
ditambah
larutan
sebanyak 0,5 mL lalu ditambahkan 4 mL
substrat L-Asparagin sebanyak 1 mL dan
akuades
Nessler.
2,5 mL bufer tris-hidroksimetil aminometan
Larutan ini kemudian diukur absorbansinya
0,2 M pH 8,6 dan diinkubasi selama 30
pada panjang gelombang optimum (402 nm)
menit dengan variasi suhu (27, 32, 37, 42,
dengan spektrometer UV-Vis.
47)°C. Campuran ini ditambahkan larutan
3.3 Penentuan pH Optimum
TCA 1,5 M sebanyak 1 mL. Larutan tersebut
dan
1
mL pereaksi
Larutan substrat L-Asparagin 1 mL,
diambil sebanyak 0,5 mL lalu ditambahkan 4
ditambah 0,05 mL enzim dan 2,5 mL bufer
mL akuades dan 1 mL pereaksi Nessler.
tris-hidroksimetil aminometan 0,2 M dengan
Campuran
variasi pH (8,2; 8,4; 8,6; 8,8; 9,0) dan
absorbansinya pada panjang gelombang
diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit.
optimum (402 nm) dengan spektrometer UV-
Campuran ini ditambahkan larutan TCA 1,5
Vis.
M sebanyak 1 mL. Larutan tersebut diambil
4.2 Penentuan pH optimum
Enzim
sebanyak 0,5 mL lalu ditambahkan 4 mL
akuades
dan
1
mL pereaksi
Nessler.
substrat
ini
kemudian
amobil
L-Asparagin
ditambah
sebanyak
diukur
larutan
1
mL,
diukur
ditambah 0,05 mL enzim dan 2,5 mL bufer
absorbansinya pada panjang gelombang
tris-hidroksimetil aminometan 0,2 M dengan
optimum (402 nm) dengan spektrometer UV-
variasi pH (8,2; 8,4; 8,6; 8,8; 9,0) dan
Vis.
diinkubasi selama 30 menit pada suuhu
3.4 Amobilisasi Enzim
37°C. Campuran ini ditambahkan larutan
Campuran
ini
kemudian
Pembuatan larutan Natrium Alginat
TCA 1,5 M sebanyak 1 mL. Selanjutnya
3%. Natrium alginat dilarutkan dalam bufer
filtrat
tris-hidroksimetil aminometan 0,2 M pH 8,6
ditambahkan 4 mL akuades dan 1 mL
dalam keadaan panas dan diaduk hingga
pereaksi Nessler. Campuran ini kemudian
homogen. Suhu diturunkan menjadi 37°C,
diukur
diambil
sebanyak
absorbansinya
0,5
pada
mL
lalu
panjang
11
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 2, Agustus 2016, hal. 7-15
gelombang
optimum
(402
nm)
dengan
spektrometer UV-Vis.
4.3
Penentuan
protein
menggunakan
garam
amonium
sulfat, sentrifugasi dan dialisis.
Kadar
Protein
Enzim
Amobil
Ammonium
digunakan
sulfat
karena
lebih
memiliki
sering
beberapa
Filtrat hasil rendaman (CaCl2) dan
kelebihan dibandingkan garam-garam yang
larutan hasil pencucian (akuades) enzim
lain, yaitu mempunyai kelarutan yang tinggi,
amobil diukur kadar proteinnya dengan
tidak
metode Lowry. Sebanyak 9,8 mL larutan
mempunyai daya pengendapan yang efektif,
Na2CO3 ditambah 0,1 mL larutan kalium
mempunyai
natrium tartrat dan 0,1 mL larutan CuSO4
kebanyakan enzim, dapat digunakan pada
dikocok perlahan. Campuran ini kemudian
berbagai pH dan harganya murah [8].
ditambahkan 1 mL filtrat dan diinkubasi
selama
10
menit
Sebanyak
1
ditambahkan
pada
pada
suhu
mL
kamar.
folin-ciocalteau
campuran
tersebut
mempengaruhi
Hasil
berupa
efek
aktivitas
penstabil
pemurnian
fraksi
endapan
enzim,
terhadap
yang
diperoleh
protein
dengan
berbagai tingkat kemurnian. Penambahan
garam
pada
konsentrasi
tinggi
akan
secara cepat dan diinkubasi pada suhu
menurunkan
kamar selama 30 menit. Larutan tersebut
dikarenakan adanya peningkatan muatan
diukur
listrik di sekitar protein yang akan menarik
absorbansinya
gelombang
optimum
pada
(726
protein.
Hal
ini
nm)
molekul-molekul air dari protein. Interaksi
kemudian ditentukan kadar protein yang
hidrofobik sesama molekul protein pada
terserap
menghitung
suasana ionik tinggi akan menyebabkan
selisih antara kadar protein enzim bebas
pengendapan protein, yang disebut salting
dengan kadar protein filtrat.
out. Protein yang hidrofobisitasnya tinggi
dilakukan
BSA
panjang
kelarutan
dengan
akan mengendap lebih dahulu, sedangkan
protein yang memiliki sedikit residu non
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Isolasi dan Purifikasi L-Asparaginase
dari Bawang Putih.
Isolasi
L-Asparaginase
dilakukan
secara mekanik yaitu dengan mengekstrak
bawang putih melalui pemecahan jaringan
bawang putih.
Ekstrak
kasar
enzim
merupakan
campuran protein enzim dan protein non
enzim yang diperoleh dari proses ekstraksi
bawang putih. Untuk memperoleh enzim LAsparaginase dengan tingkat kemurnian
yang tinggi maka perlu dilakukan pemurnian
terhadap ekstrak kasar. Pemurnian yang
dilakukan
adalah
dengan
pengendapan
polar (lebih hidrofilik) akan tetap larut
meskipun pada konsentrasi garam yang
paling tinggi [8].
Pada tahap pemurnian selanjutnya,
dialisis dilakukan sebagai metode untuk
memisahkan
partikel-partikel
kecil
lebih
dari
partikel-partikel
yang
besar
menggunakan
membran
semipermeabel
berdasarkan
prinsip
difusi,
perpindahan
molekul
dari
larutan
berkonsentrasi
tinggi
ke
larutan
berkonsentrasi
rendah.Enzim
yaitu
yang
merupakan molekul berukuran besar akan
tetap tertahan di dalam membran karena
tidak mampu melewati pori-pori membran
12
Kusumaningtias dkk., Kalsium Alginat Sebagai Pendukung Amobilisasi
selofan. Garam amonium sufat sebagai
penyusun protein enzim L-asparaginase
molekul
yang
kecil
akan
bermigrasi
keluar
bersifat
hidrofil,
sehingga
membran sehingga enzim menjadi lebih
membutuhkan garam amonium sulfat lebih
murni.
banyak untuk mengendapkannya.
2. Uji
Aktivitas
Spesifik
Enzim
L-
spesifik
ini
Asparaginase.
Penentuan
aktivitas
bertujuan untuk mengetahui kemurnian tiap
fraksi enzim. Enzim L-Asparaginase dalam
menghidrolisis
substrat
L-Asparagin
menghasilkan produk asam L-Aspartat dan
amonia. Aktivitas enzim L-Asparaginase
dapat diketahui dari total amonia yang
dihasilkan dari reaksi enzimatis melalui
metode Nessler.
Gambar 1. Grafik hubungan antara fraksi
pemurnian enzim dan aktivitas
spesifik enzim L-Asparaginase
3. Penentuan Karakter Optimum Enzim
Aktivitas
spesifik
enzim
L-
Bebas
Asparaginase dari bawang putih dapat
Karakterisasi
L-Asparaginase
ini
dilihat pada Gambar 1. Satu unit aktivitas
bertujuan
enzim L-Asparaginase didefinisikan sebagai
optimum dari L-Asparginase hasil isolasi.
aktivitas enzim yang menghasilkan 1μmol
Fraksi
produk L-Aspartat maupun amonia per
merupakan
satuan
aktivitas spesifik tertinggi yaitu fraksi 5.
menit
Aktivitas
pada
spesifik
kondisi
enzim
optimum.
untuk
enzim
fraksi
mengetahui
yang
enzim
kondisi
dikarakterisasi
yang
memiliki
L-Asparaginase
ditentukan berdasarkan perhitungan unit
4. Suhu Optimum L-Asparaginase Bebas
aktivitas enzim L-Asparaginase (Unit/mL)
Ditinjau dari struktur protein, suhu
per kadar protein enzim L-Asparaginase
berpengaruh terhadap kerenggangan dan
(mg/mL protein).
kerapatan
ikatan
pada
struktur
protein
Gambar 1 menunjukkan pada setiap fraksi
enzim. Hasil penentuan suhu optimum L-
enzim
Asparaginase bebas dapat dilihat pada
memiliki
berbeda.
Pada
aktivitas
spesifik
fraksi
memiliki
5
yang
nilai
Gambar 2.
aktivitas spesifik tertinggi yaitu sebesar
Berdasarkan Gambar 2 dapat dilihat
1423,0248 U/mg protein. Hasil tersebut
bahwa suhu optimum dari L-Asparaginase
menunjukkan bahwa dalam fraksi 5 terdapat
hasil isolasi adalah 37°C yang ditunjukkan
enzim
dengan meningkatnya aktivitas enzim. Pada
L-Asparaginase
lebih
banyak
dibandingkan dengan fraksi lainnya.
suhu optimum, konformasi dari struktur
Pada fraksi 5 menunjukkan aktivitas spesifik
protein enzim berada tepat untuk mengikat
yang lebih besar dibandingkan dengan fraksi
substrat dalam membentuk produk sehingga
protein sebelumnya. Hal ini menunjukkan
menghasilkan aktivitas tertinggi.
bahwa pada fraksi 5 banyak asam amino
13
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 2, Agustus 2016, hal. 7-15
menyebabkan proses katalisis tidak berjalan
optimal sehingga aktivitas enzim menurun
atau kurang optimal.
Gambar 2. Grafik hubungan antara suhu
dan aktivitas spesifik enzim Lasparaginase.
Enzim merupakan protein yang tersusun
dari
ribuan
asam-asam
amino
dimana
Gambar 3. Grafik hubungan antara pH
lingkungan enzim dan aktivitas
protein dapat mengalami denaturasi pada
spesifik enzim L-Asparaginase
suhu tinggi. Kenaikan aktivitas enzim di
bawah suhu optimum disebabkan karena
kenaikan energi kinetika molekul-molekul
enzim yang bereaksi. Akan tetapi apabila
suhu tetap dinaikkan terus, energi kinetika
molekul-molekul
sehingga
sekunder
enzim
menjadi
memecahkan
yang
besar
Dengan
demikian
perubahan
pH
berpengaruh terhadap efektivitas sisi aktif
enzim dalam membentuk kompleks enzim
substrat.
ikatan-ikatan
mempertahankan
enzim
dalam bentuk aslinya, akibatnya struktur
sekunder dan tersier berubah sehingga
6. Amobilisasi
Enzim
L-Asparaginase
dengan Pendukung Kalsium Alginat
Amobilisasi enzim merupakan suatu
proses dimana pergerakan molekul enzim
aktivitas enzim menurun.
ditahan sedemikian rupa sehingga terbentuk
sistem enzim yang aktif dan tidak larut
5. pH Optimum L-Asparaginase Bebas
Struktur protein enzim salah satunya
dipengaruhi oleh pH [6]. Hasil penentuan pH
optimum
ditunjukkan
pada
Gambar
3.
Berdasarkan Gambar 3 dapat diketahui
bahwa pH optimum enzim L-Asparaginase
dari bawang putih adalah 8,6. Pada pH
tersebut, enzim berada pada konformasi
struktur enzim 3 dimensi yang tepat untuk
mengikat substrat. Pada kondisi di luar pH
optimum, konformasi enzim mulai berubah
menyebabkan posisi substrat berada tidak
tepat
pada
sisi
aktif
enzim.
Hal
ini
dalam air. Hasil amobilisasi L-Asparaginase
pada matriks alginat yaitu berupa manikmanik enzim amobil.
Aktivitas spesifik L-Asparaginase amobil
mengalami
sebesar
penurunan
aktivitas
spesifik
4% jika dibandingkan dengan
aktivitas spesifik enzim bebas (aktivitas
spesifik enzim amobil 1367,6741 U/mg,
aktivitas spesifik enzim bebas 1423,0248
U/mg). Penurunan aktivitas enzim amobil
disebabkan
adanya
menghalangi
substrat
matriks
untuk
yang
berikatan
14
Kusumaningtias dkk., Kalsium Alginat Sebagai Pendukung Amobilisasi
dengan enzim. Amobilisasi enzim dengan
enzim
metode penjebakan akan menyebabkan
bertahan pada suhu yang lebih tinggi
penghambatan kerja enzim [9].
dibandingkan dengan enzim L-Asparaginase
L-Asparaginase
amobil
mampu
bebas.
7. Penentuan
Karakter
Optimum
L-
Asparaginase Amobil.
a. Penentuan
Suhu
b. Penentuan pH Optimum L-Asparaginase
Optimum
L-
Asparaginase Amobil
Amobil.
Penentuan
Penentuan suhu optimum bertujuan
untuk mengetahui kondisi optimum enzim
setelah dilakukan amobil. Hasil penentuan
suhu optimum L-Asparaginase amobil dapat
dilakukan
untuk
pH
optimum
mengetahui
perlu
kondisi
optimum enzim dalam bereaksi dengan
substrat. Hasil karakterisasi pH optimum
dapat dilihat pada Gambar 5.
dilihat pada Gambar 4.
Gambar
Gambar 4. Grafik hubungan antara suhu
dan aktivitas spesifik enzim L-Asparaginase
amobil.
Berdasarkan grafik di atas, dapat dilihat
bahwa suhu optimum dari L-Asparaginase
amobil adalah 42°C. Suhu optimum pada
enzim amobil lebih tinggi dari enzim bebas
dikarenakan matriks kalsium alginat mampu
melindungi enzim L-Asparaginase amobil
terhadap
panas
sehingga
enzim
L-
Asparaginase mampu bertahan pada suhu
yang lebih tinggi dibandingkan dengan
enzim L-Asparaginase bebas. Hal tersebut
menunjukkan bahwa matriks kalsium alginat
mampu melindungi enzim L-Asparaginase
amobil terhadap peningkatan suhu sehingga
5.Grafik
hubungan
lingkungan
dan
antara
pH
aktivitas
spesifik enzim L-Asparaginase
amobil.
Berdasarkan grafik di atas dapat diketahui
bahwa pH optimum L-Asparaginase amobil
dari bawang putih adalah pada pH 8,6.
Kondisi optimum dari enzim bebas dan
amobil adalah sama. Hal ini menunjukkan
bahwa penggunaan matriks alginat dalam
amobilisasi L-Asparaginase dari bawang
putih tidak menyebabkan perubahan muatan
sisi aktif enzim maupun struktur enzim
terutama pada sisi aktif enzim.
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 2, Agustus 2016, hal. 7-15
15
Enzymatic Elimination of Acrylamide in
KESIMPULAN
Berdasarkan
penelitian
yang
Potato-Based
telah
1. L-Asparaginase
dapat
diisolasi
dari
[4]
Dough Food Component Using Water
tertinggi pada fraksi 5 (80-100%) yaitu
Activity, Patent No US20080166450-
1423,0248 U/mg protein.
A1.
2. Kondisi optimum L-Asparaginase bebas
3. L-Asparaginase dapat diamobil pada
[5]
Article of Journal: Lincoln, L., dan More,
S.S., 2014, Isolation and Production of
matriks kalsium alginat 3% dengan
Clinical
penurunan aktivitas sebesar 4% dari
and
Food
Asparaginase
aktivitas L-Asparaginase bebas.
Grade
Enzyme
Lfrom
Fungi,India.
4. Kondisi optimum L-Asparaginase amobil
diperoleh pada suhu 42°C dan pH 8,6.
Article of Journal: Corrigan, P.J., 2008,
Methods for Reducing Asparagine in a
bawang putih dengan aktivitas spesifik
diperoleh pada suhu 37°C dan pH 8,6.
Treated
Foods, Slovak Republic.
dilakukan dapat disimpulkan beberapa hal
sebagai berikut:
Thermally
[6]
Chapter of Book: Lehninger, A.L., 1982,
Principles of Biochemistry: 1st Edition,
UCAPAN TERIMA KASIH
Worth Pub, New York.
Penelitian ini sukses dan berjalan
dengan lancar berkat dukungan dari dosen
[7] Thesis: Rizki, R.A., 2009, Isolasi dan
pembimbing, dosen lab. biokimia, dosen
Karakterisasi
jurusan kimia, laboran jurusan kimia, serta
dari Bawang Putih (Allium sativum),
teman-teman jurusan kimia angkatan 2011.
Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan
Enzim
L-Asparaginase
Matematika, Universitas Diponegoro,
Semarang.
DAFTAR RUJUKAN
[1]
Article of Journal: Anese, M., Quarta,
[8]
B., dan Frias, J.M., 2011, Modelling
Whole Book: Scopes,
Protein
Effect of Asparginase in Reducing
Purification,
Practice, 2
Acrylamide Formation in Biscuits Food
nd
R.K.,
Priciple
1987,
and
ed, Springer Verlag, New
York.
Chemistry, Ireland.
[9]
[2] Article of Journal: Bucke, C., 1987,
Industrial Use of Immobilized Enzyme
and Cells, In: Immobilized Microbial
Enzyme and Cells, Bangkok.
[3]
Article
of
Journal:
Ciesarová,
Z.,
Kukurová, K., dan Benešová, C., 2010,
Whole
Book:
Biotechnology,
Smith,
J.E.,
Diterjemahkan
1990,
oleh
Hartono, A., Penerbit Buku Kedokteran
Indonesia, Jakarta.