PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM KITINASE DARI CAIRAN DIGESTIVE GLAND Achatina fulica SKRIPSI

  PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM KITINASE DARI CAIRAN DIGESTIVE GLAND Achatina fulica SKRIPSI

DWI RESTI NINGRUM DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA 2012

  

Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum

  PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM KITINASE DARI CAIRAN DIGESTIVE GLAND Achatina fulica SKRIPSI

  Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia pada Fakultas Sains Dan Teknologi

  Universitas Airlangga Disetujui Oleh :

  Pembimbing II Pembimbing I

  Dr. Purkan, M.Si

  Dr. Afaf Baktir, MS

  NIP. 19721116 199702 1 001

  NIP. 19561014 19833 2 001 _{Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum} ii iii

  

LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI

  Judul : Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Dysgetive Gland Achatina fulica

  Penyusun : Dwi Resti Ningrum Nim : 080810524 Pembimbing I : Dr. Afaf Baktir, MS Pembimbing II : Dr. Purkan, M.Si Tanggal Seminar : 23 Juli 2012

  Disetujui oleh : Pembimbing I,

  Dr. Afaf Baktir, MS NIP. 19561014 19833 2 001

  Pembimbing II Dr. Purkan, M.Si

  NIP. 19721116 199702 1 001 Mengetahui:

  Ketua Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

  

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA

NIP. 19671115 199102 2 001

Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum

KATA PENGANTAR

  iv

  Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penyusun dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Purifikasi Parsial

  dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina fulica ”.

  Penyusun menyadari bahwa penulisan proposal ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak, untuk itu penyusun menyampaikan terima kasih kepada:

  1. Ibu Dr. Afaf Baktir, MS selaku pembingbing I dan Bapak Dr. Purkan, M.Si selaku pembingbing II yang telah memberikan saran, doa dan bimbingan sampai terselesaikan proposal ini.

  2. Bapak Drs. Handoko Darmokoesomo, DEA selaku Dosen Wali yang senantiasa membimbing serta memberikan banyak masukan.

  3. Ibu Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA selaku Ketua Departemen Kimia sekaligus ketua prodi S-1 kimia yang senantiasa memberikan dukungan.

  4. Bapak, ibu dan adik-adik yang memberikan kasih sayang, doa, kepercayaan, dan dukungan baik secara moril maupun materi.

  5. Teman – teman angkatan 2008 yang senantiasa menemani dalam menuntut ilmu. Penyusun menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan, sehingga penyusun mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi perbaikan skripsi ini selanjutnya. Penyusun berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya ilmu biokimia.

  Surabaya, Juli 2012 Penyusun

  Dwi Resti Ningrum

  

Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum

  Ningrum, Dwi Resti, 2012, Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica , SKRIPSI, dibawah bimbingan Dr. Afaf Baktir, MS dan Dr. Purkan, M.Si , Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya ABSTRAK digestive gland Achatina fulica

  Ekstrak enzim dari diketahui mengandung berbagai jenis enzim hidrolase, salah satunya kitinase. Kitinase memiliki banyak kegunaan dalam berbagai bidang industri, diantaranya makanan, medis dan pertanian. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pemurnian parsial ekstrak enzim kitinase

   Achatina fulica

  dari digestive gland menggunakan aseton . Optimasi prosentase aseton

  dilakukan untuk mendapatkan fraksi dengan aktivitas spesifik tertinggi. Aktivitas spesifik kitinase sesudah fraksinasi dibandingkan dengan ekstrak tanpa fraksinasi . Aktivitas spesifik yang paling banyak terkumpul ada pada fraksi 45-70. Terdapat peningkatan aktivitas spesifik sebesar 6,45 kali dari ekstrak sebelum difraksinasi. o Fraksi ini memiliki suhu optimum pada 37 C dan pH optimum 7.

  Kata kunci: Achatina fulica, kitinase, fraksinasi aseton, pemurnian enzim _{Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum} v

  

Ningrum, Dwi Resti, 2012, Partial Purificaton And Characterization Chitinase Enzyme

From Digestive Gland Fluids Of Achatina fulica , SKRIPSI, under Guidance Dr. Afaf

Baktir, MS and Dr. Purkan , M.Si, Department of Chemistry, Sains and Technology

Faculty, Airlangga University, Surabaya

  

ABSTRACT

  The Enzyme from the digestive gland extracts of Achatina fulica is known contain various types of hydrolase enzymes, one of them is chitinase. Chitinase has many benefit for various industries, they are including food, medicine and agriculture. The objective of reseach to perform a partial purification chitinase enzyme of digestive gland extract of Achatina fulica using acetone. Optimization of the percentage acetone carried out to obtain the highest specific activity from each fraction. Chitinase specific activity after fractination is compared to extracts without fractionation. Specific activity of the most collected there in 45-70 fraction. There is an increase of 6.45 times the specific activity of without fractionation. This fraction has a temperature

  o optimum at 37 C and optimum pH 7.

  Achatina fulica Keyword : , chitinase , acetone fractionation, purification enzyme _{Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum} vi

  DAFTAR ISI

  Halaman KATA PENGANTAR ............................................................................................... iv ABSTRAK ................................................................................................................. v ABSTRACT ............................................................................................................... vi DAFTAR ISI .............................................................................................................. vii DAFTAR TABEL ...................................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR……………………………………………………………… x

  BAB I PENDAHULUAN .......................................................................................... 1

  1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1

  1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 4

  1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 4

  1.4 Manfaat Peneltian..................................................................................... 5

  BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ 7

  2.1 Enzim ....................................................................................................... 7

  2.1.1 Struktur enzim ................................................................................. 8

  2.1.2 Mekanisme kerja enzim .................................................................. 8

  2.2 Kitinase……………………………………………………………….. .. 9

  2.2.1 Tinjauan Umum Kitinase ............................................................... 9

  2.2.2 Pengukuran Aktivitas Kitinase ........................................................ 12

  2.3 Metode Pemurnian Enzim ........................................................................ 13

  2.3.1 Fraksinasi aseton ............................................................................. 13

  2.3.2 Fraksinasi Amonium sulfat ............................................................. 15

  2.3.3 Kromatografi ................................................................................... 16

  2.3.3.1 Kromatografi penukar ion ............................................................ 16

  2.3.3.2 Kromatografi afinitas ................................................................... 17

  2.3.3.3 Kromatografi filtrasi..................................................................... 17

  2.3.3.4 Kromatografi hidrofob ................................................................. 17

  2.4 Koloidal Kitin........................................................................................... 18

  2.6 Bekicot (Achatina fulica) ......................................................................... 19

  2.7 Turbidimetri ............................................................................................. 21 _{Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum} vii

  BAB III M ETODE PENELTIAN .............................................................................. 22

  3.1 Tempat dan Waktu Penelitian .................................................................. 22

  3.2 Alat dan Bahan Penelitian ........................................................................ 22

  3.2.1 Alat-alat penelitian .......................................................................... 22

  3.2.2 Bahan-bahan penelitian ................................................................... 22

  3.3 Diagram Alir Penelitian ........................................................................... 23

  3.4 Prosedur Penelitian................................................................................... 23

  3.4.1 Pembuatan substrat koloidal kitin ................................................... 23

  Achatina fulica

  3.4.2 Karantina ............................................................... 24

  3.4.3Panen cairan digestive gland Achatina fulica .................................. 24

  3.4.4 Pembuatan Kurva Progres ............................................................... 24

  3.4.5 Pembuatan kurva standar koloidal kitin .......................................... 24

  3.4.6 Optimasi fraksinasi asteon ekstrak kasar enzim kitinase ................ 25

  3.4.7 Penentuan kadar protein .................................................................. 25

  3.4.8 Uji Aktivitas setiap fraksi hasil fraksinasi aseton ........................... 26

  3.4.9 Karakterisasi enzim kitinase ........................................................... 27

  3.4.9.1 Suhu optimum ........................................................................... 27 3.4.9.2 pH optimum .............................................................................. 27

  BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN

  4.1 Pembuatan substrat koloidal kitin ...................................................... 28

  Achatina fulica

  4.2 Karantina .................................................................. 29

  4.3 Panen cairan digestive gland Achatina fulica .................................... 30

  4.4 Pembuatan Kurva Progres .................................................................. 31

  4.5 Pembuatan kurva standar koloidal kitin ............................................. 32

  4.6 Optimasi fraksinasi asteon ekstrak kasar enzim kitinase ................... 33

  4.7 Penentuan kadar protein ..................................................................... 35

  4.8 Uji Aktivitas setiap fraksi hasil fraksinasi aseton .............................. 35

  4.9 Karakterisasi enzim kitinase .............................................................. 40

  4.9.1 Suhu optimum .............................................................................. 40 4.9.2 pH optimum ................................................................................. 42

  BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

  5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 43

  5.2 Saran ................................................................................................... 43 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 44 LAMPIRAN _{Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum} viii

  ix

  DAFTAR TABEL

  Nomor Judul Tabel Halaman

  1. Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 1 ...... 37

  2. Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 2 ...... 38

  3. Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 3 ...... 38

  4. Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 4 ...... 39

  

Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum

  x

  7. Denaturasi protein akibat pelarut organik .......................................... 15

  13. Suhu optimum fraksi 45-70 ................................................................ 41 14. pH optimum fraksi 45-70 .................................................................... 42

  12. Mekanisme kerja enzim kitinase terhadap polimer N-asetilglukosamin ................................................. 36

  11. Kurva standar koloidal kitin ................................................................ 32

  10. Kurva progres ekstrak kitinase .......................................................... 31

  9. Anatomi bekicot ................................................................................. 19

  8. Molekul air di sekitar permukaan hidrofobik protein ........................ 16

  6. Agregasi protein akibat interaksi muatan berlawanan dari protein satu dengan protein lain ......................................................... 14

  DAFTAR GAMBAR

  5. Struktur kitin ....................................................................................... 12

  4. Mekanisme kerja enzim eksokitinase dan endokitinase .................... 10

  3. Model Induced Fit ................................................................................ 9

  2. Model Lock and Key ............................................................................ 9

  1. Struktur protein primer, sekunder, tersier dan kuartener ..................... 7

  Nomor Judul Gambar Halaman

  

Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum

BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Masalah

1.1 Indonesia merupakan negara yang memiliki keanekaragaman flora dan

  fauna. Hal ini disebabkan oleh kondisi iklim Indonesia yang tropis, sehingga cocok untuk banyak jenis flora dan fauna untuk berkembang biak. Salah satu hewan yang tingkat perkembangbiakannya tinggi adalah Achatina fulica (bekicot).

  Achatina fulica

  dianggap sebagai hama yang dapat menurunkan kualitas produk panen. Meskipun demikian, Achatina fulica dapat dimanfaatkan untuk makanan dan obat tradisional karena khasiatnya. Namun belum banyak penelitian yang memanfaatkan cairan kelenjar saluran pencernaan (digestive gland) Achatina

  fulica

  . Wheel (1961) menyatakan bahwa ekstrak kelenjar saluran pencernaan (digestive gland) Achatina fulica memiliki campuran enzim karbohidrase, meliputi enzim kitinase, xilanase, selulase, hemiselulase, amilase, maltase, dan sukrase. Namun sejauh ini, informasi tentang karakteristik tiap enzim tersebut masih belum dilaporkan, termasuk karakteristik kitinase.

  Kitinase adalah salah satu enzim yang menarik untuk dikaji, karena memilki kemampuan untuk menghidrolisis kitin menjadi oligomernya yang selama ini dimanfaatkan dalam berbagai bidang. Senyawa oligomer tersebut banyak dimanfaatkan untuk bidang medis dan makanan (Flach dkk., 1992).

  Kitinase menghidrolisis kitin menjadi senyawa oligomer kitin, seperti

  1 karboksimetil kitin, hidroksietil kitin dan etil kitin. Dalam bidang medis, senyawa-senyawa tersebut dapat digunakan sebagai bahan dasar pembuatan benang operasi, yang mempunyai keunggulan dapat diserap dalam jaringan tubuh, tidak toksik dan dapat disimpan dengan waktu yang lama. Monomer lain dari kitin yaitu N-asetil-D-glukosamin, dapat dimanfaatkan dalam bidang farmasi, obat pengontrol kadar gula dalam darah, suplemen, anti inflamasi dan sebagainya (Herdyastuti dkk., 2009).

  Dalam bidang lingkungan, kitinase dimanfaatkan untuk penanganan limbah yang mengandung kitin, seperti pabrik pembekuan udang. Apabila limbah udang dibiarkan mencemari perairan dapat meningkatkan BOD dan COD yang menyebabkan pencemaran lingkungan yang lebih luas. Kitinase menjadi perhatian besar, terutama karena peranannya dalam hidrolisis jamur patogen. Enzim kitinase banyak digunakan untuk pengendalian hayati (Sahai dan Manocha, 1993).

  Kitinase sering dimanfaatkan sebagai agen biokontrol, terutama tanaman yang terserang jamur patogen. Jamur memiliki komponen utama penyusun dinding sel, salah satunya adalah kitin yang dapat dihidrolisis oleh kitinase. Dalam dua dekade terahir banyak dikaji mengenai enzim kitinase sebagai antifungi. Sebagai contoh, kitinase dari Tricodema banyak digunakan sebagai antifungi yang efektif terhadap serangan Rhizoctonia solani pada tanaman kapas dan Fusarium pada tanaman strawberi (Wang dkk., 2003).

  Kitinase juga berperan dalam lisisnya biofilm jamur patogen Candida

  albicans

  . Biofilm adalah matriks polimer ekstraseluler yang terbentuk dari suatu komunitas mikroba terstruktur dan memiliki fenotip yang berbeda dari plantonik dan sel bebasnya (Douglas, 2006). Dinding sel Candida albicans mengandung β- 1,3-glukan, β-1,6-glukan dan kitin (Marti´nez dkk., 1998). Berdasarkan penelitian yang sudah dilakukan Kamiliyah (2011), ekstrak enzim Achatina fulica memiliki daya hambat yang lebih tinggi terhadap biofilm Candida albicans jika dibandingkan dengan perlakuan ekstrak kayu manis yaitu sebesar 22,81%. Dari hasil penelitian tersebut, diketahui bahwa ekstrak enzim Achatina fulica mampu meningkatkan efektivitas daya antifungi ekstrak kayu manis terhadap Candida

  albicans

  sebesar 75%. Hasil ini menunjukkan bahwa di dalam ekstrak enzim siput mengandung enzim-enzim yang mampu menghidrolisis biofilm maupun dinding sel Candida albicans.

  Suatu enzim yang diambil dari alam masih bercampur dengan pengotor lain. Untuk mengurangi atau menghilangkan pengotor tersebut melalui cara pemurnian. Pemurnian dilakukan untuk meningkatkan aktivitas spesifik dari suatu enzim. Aseton merupakan salah satu pelarut organik yang biasa digunakan dalam pemurnian enzim. Di samping pelarut organik, pemurnian juga dapat dilakukan dengan fraksinasi dengan amonium sulfat. Kelebihan fraksinasi aseton dibanding dengan fraksinasi amonium sulfat adalah tidak perlu adanya perlakuan yang rumit untuk menghilangkan garam yang tersisa. Dalam hal ini, fraksinasi aseton

  o dilakukan pada suhu -20 C (Thermo Fisher Scientific, 2009).

  Enzim industri biasanya digunakan dalam keadaan kemurnian parsial. Enzim kitinase pada penelitian ini akan dimurnikan secara parsial dari ekstrak enzim Achatina fulica. Enzim ini akan diuji aktivitasnya dan ditentukan suhu dan pH optimumnya dalam keadaan murni parsial untuk tujuan aplikasi dalam kondisi kemurnian parsial.

  1.2 Rumusan Masalah

  Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka dibuat rumusan masalah sebagai berikut.

  1. Pada fraksi manakah aktivitas kitinase pada ekstrak enzim dari

  digestive gland Achatina fulica

  terkumpul pada proses fraksinasi aseton ?

  2. Berapakah peningkatan kemurnian ekstrak enzim kitinase setelah difraksinasi dengan aseton ?

  3. Bagaimana karekteristik terkait dengan pH dan suhu optimum ekstrak enzim kitinase dari Achatina fulica ?

  Tujuan

  1.3 Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan pemurnian parsial ekstrak

Achatina fulica

enzim kitinase digestive gland menggunakan aseton.

  Adapun tujuan khusus dari penelitian ini adalah sebagai berikut.

  1. Menentukan fraksi aseton yang optimum dari fraksinasi aseton.

  2. Menghitung peningkatan kemurnian ekstrak enzim kitinase setelah fraksinasi aseton.

  3. Menentukan karakteristik terkait pH dan suhu optimum enzim kitinase dari Achatina fulica.

1.2 Manfaat

  Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang aktifitas enzim kitinase setelah dimurnikan secara parsial menggunakan fraksinasi aseton. Selain itu, penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi tentang karakteristik enzim kitinase terkait pH dan suhu optimum. Dengan enzim kitinase dari digestive gland Achatina fulica dapat digunakan untuk berbagai macam kebutuhan industri.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Enzim

  Enzim merupakan unit fungsional yang termasuk dalam protein dari metabolisme sel yang disusun oleh rantai-rantai polipeptida. Enzim berfungsi untuk mempercepat reaksi spesifik tanpa pembentukan produk samping. Enzim tidak mengubah titik kesetimbangan reaksi yang dikatalisis. Enzim memilki berat molekul yang berkisar dari 12.000 sampai lebih dari 1 juta. Enzim memilkiki spesifitas terhadap substrat. Substrat adalah substansi yang mengalami perubahan kimia setelah bereaksi dengan enzim, sedangkan produk adalah substansi baru yang terbentuk setelah setelah reaksi (Voet dan Voet, 2004).

  Enzim mengikat molekul substrat membentuk kompleks enzim-substrat yang bersifat sementara, yang terurai membentuk enzim bebas dan produknya.

  Enzim menyebabkan berlangsungnya reaksi kimia dengan mengarahkan subtrat ke sisi katalitik. Aktifitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu pH, konsentrasi substrat dan enzim, adanya aktivator dan inhibitor (Lehninger, 1998). Reaksi enzimatis hanya bekerja pada suhu dan pH tertentu (Stryer, 2002).

2.1.1 Struktur enzim

  Enzim merupakan protein globular yang memilki struktur primer, sekunder, tersier, dan kuartener. Struktur primer terbentuk dari ikatan kovalen antar residu-residu asam amino yang berurutan membentuk ikatan peptida. Struktur sekunder terbentuk dari ikatan hidrogen antara atom O dari gugus

  6 karbonil (C=O) dengan atom H (N-H) dalam satu rantai polipeptida. Dalam struktur sekunder, struktur protein dibagi menjadi dua yaitu β-sheet dan heliks (Bondanszky, 1998).

  Struktur primer Struktur primer

  Asam amino

  Struktur sekunder

  Ikatan hidrogen Ikatan hidrogen

  Struktur tersier Struktur kuartener

Gambar 2.1 Struktur protein primer, sekunder, tersier dan kuartener

  Struktur tersier merupakan struktur protein yang paling stabil, karena terdapat ikatan yang dapat menstabilkan protein itu sendiri. Jenis ikatan-ikatan tersebut adalah: ikatan hidrogen antara gugus R residu asam amino rantai samping yang berdekatan, ikatan ion diantara gugus R yang berlawanan, interaksi hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik dan ikatan kovalen berupa ikatan disulfida dari sistein (Ottoway dan Apps, 1984)

  Struktur kuartener terbentuk karena adanya interaksi beberapa rantai polipeptida yang membentuk oligomer. Oligomer berinteraksi kembali melalui ikatan ionik, van der waals dan ikatan hidrofobik (Bodanszky, 1998).

2.1.2 Mekanisme kerja enzim

  Proses awal katalisis enzim adalah pembentukan kompleks antara enzim dan substrat. Substrat diikat pada daerah yang dinamakan sisi aktif enzim. Reaksi kimia yang terjadi dalam kompleks enzim substrat tersebut dapat dilanjutkan dengan pelepasan produk dan enzim.

  Mekanisme katalisis enzim melibatkan gugus fungsi yang terdapat pada sisi aktif enzim. Sisi aktif enzim adalah tempat pengikatan substrat yang mengandung residu asam amino yang berperan dalam pembuatan dan pemutusan ikatan selama proses katalisis. Ikatan – ikatan yang terjadi antara enzim dan substrat adalah ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya Van Der Walls ataupun interaksi hidrofobik. Gugus yang terlibat dalam proses pengikatan substrat disebut gugus pengikat (binding group). Gugus yang terlibat dalam proses katalitik antara enzim dan substrat disebut gugus katalitik (catalytic group). Gugus katalitik terletak pada gugus samping enzim (Poedjiadi, 1994).

  Terdapat dua model interaksi enzim dan substrat, yaitu :

  1. Model Lock and Key : dikemukakan oleh Emil Fischer. Pada model ini, substrat memiliki daerah polar (- dan +) dan non polar (H, hidrofobik) diletakkan pada sisi aktif yang memiliki muatan komplementer dari substrat tersebut. Model Lock and Key menerangkan adanya kesesuaian ukuran atau bentuk substrat terhadap sisi aktif enzim. Substrat yang tidak cocok bentuknya dengan sisi aktif enzim, baik karena terlalu besar maupun karena terlalu kecil tidak dapat terikat pada sisi aktif (Marks, 1996).

  2. Pada model Induced Fit : dikemukakan oleh Koshland. Pada model ini, senyawa-senyawa yang lebih besar atau lebih kecil dari substrat yang asli masih dapat berinteraksi dengan sisi aktif enzim. Sisi aktif yang pada awalnya belum sesuai dengan bentuk substrat, akan terinduksi dan menyesuaikan dengan bentuk substrat setelah substrat menempel pada sisi aktif. Sehingga sisi aktif bersifat fleksibel (Marks, 1996).

Gambar 2.2 Model Lock and Key (Marks, 1996). E merupakan simbol untuk

  enzim, S merupakan simbol dari substrat dan P merupakan simbol untuk produk.

Gambar 2.3 Model Induced Fit (Marks, 1996). E merupakan simbol untuk

  enzim, S merupakan simbol dari substrat dan P merupakan simbol untuk produk.

2.2 Kitinase

2.2.1 Tinjauan umum kitinase

  Kitinase adalah enzim yang penting digunakan untuk produksi oligosakarida fisiologis aktif dari berbagai kitin dan kitosan (Flach,1992).

  Oligomer ini memiliki banyak aplikasi medis, dan juga dapat digunakan sebagai pengawet makanan (Flach,1992). Nama kimia dari kitinase adalah {Poli [1,4-(N- acetyl-β-Dglukosamin)] glucanohidrolase}(Fleuri dkk., 2009).

  Enzim kitinase dihasilkan oleh bakteri, fungi, tanaman, dan hewan (Toharisman, 2007). Kitinase juga disintesis oleh protozoa, saluran pencernaan nematode, polikhaeta dan mollusca. Kitinase juga ditemukan dalam lendir pencernaan burung-burung pemakan seranga, lendir pencernaan dan pangkreas ikan, amfibi dan reptil pemakan serangga (Yurnaliza, 2002). Bakteri mengeluarkan kitinase sebagai sarana memperoleh nutrisi dan agen parasitisme, sementara fungi, protozoa dan invertebrata mengeluarkan enzim tersebut untuk proses morfogenesis. Tanaman mengeluarkan kitinase untuk mempertahankan diri dari serangan patogen (Toharisman, 2007).

  Menurut Harman dkk. (1993) dan Manocha (1993) kitinase terbagi dalam tipe endokitinase dan eksokitinase.

  eksokitinase endokitinase GIcNAc _{lokasi hidrolisis ujung reduksi ujung nonreduksi mikrofibril kitin}

Gambar 2.4 Mekanisme kerja enzim eksokitinase dan endokitinase (Sahai & Manocha, 1993).

  Aplikasi kitinase yang banyak digunakan adalah sebagai agen biokontrol. Telah dilaporkan Brurberg dkk. (1996), bahwa ChiA dan ChiB Serratia

  marcescens

  yang telah ditransformasikan ke E.coli memiliki kemampuan untuk mengontrol jamur tanaman yang bersifat patogen, sebagai contoh adalah dapat mengurangi penyakit dari Rhizoctonia solani yang menyebabkan akar tebu membusuk.

  Senyawa- senyawa hasil degradasi kitinase pada kitin membentuk oligomernya seperti karboksimetil kitin, hidroksietil kitin dan etil kitin. Dalam bidang medis, senyawa-senyawa tersebut digunakan sebagai bahan dasar pembuatan benang operasi yang memilki keunggulan dapat diserap dalam jaringan tubuh, tidak toksik dan dapat disimpan dengan waktu yang lama. Monomer kitin, N-asetil-D-glukosamin dapat dimanfaatkan untuk obat pengontrol darah dan suplemen anti inflamasi. Selain itu, N-asetil-D-glukosamin dapat membantu mengurangi hiperpigmentasi aktivitas enzim tirosin yang berperan dalam produksi melanin.

  Kitinase menghidrolisis substansi yang mengandung senyawa kitin. Kitin dibangun oleh unit-unit monomer N-asetilglukosamin (GlcNAc) yang tersusun liniar dengan ikatan β (1,4). Rantai kitin antara satu dengan yang lainnya membentuk ikatan hidrogen antara gugus NH dari satu rantai dan gugus C=O dari rantai lain yang berdekatan. Ikatan hidrogen ini menyebabkan kitin membentuk formasi serabut (fibril) dan tidak dapat larut dalam air. Berikut merupakan gambar unit kitin :

Gambar 2.5 Struktur kitin. Satu unit kitin terdiri dari monomer

  N-asetilglukosamin Di alam, kitin banyak ditemukan pada sel jamur dan eksoskeleton dari serangga dan krustasea (Cohen-Kupiec dan Chet, 1998). Kitin pada jamur berbentuk mikrofibril yang memiliki panjang yang berbeda tergantung pada spesies dan lokasi selnya. Mikrofibril merupakan struktur utama dari struktur dinding sel jamur terdiri atas jalinan rantai-rantai polisakarida yang saling bersilangan membentuk anyaman. Jalinan ini kuat berikatan pada matriks (Cabib, 1987). Dalam hal ini kitinase berperan sebagai penghidrolisis dinding sel jamur dan matriks jamur patogen.

2.2.2 Pengukuran aktivitas kitinase

  Pengukuran aktivitas kitinase dapat dilakukan dengan beberapa cara seperti yang disebutkan dalam Jeaniaux (1966) dan Cabib (1987) : a. Berdasarkan pengurangan substrat. 1). Metode viskosimetri, yaitu aktivitas kitinase terhadap kitosan, glikol kitin atau karboksimetilkitin yang diukur berdasarkan terjadinya pengurangan viskositas substrat.

  2). Metode turbidimetri, yaitu mengukur perbedaan turbiditas suspensi koloidal sebelum dan setelah kitinolisis. Pengukuran ini bersifat cepat dan akurat. Contoh pada pengukuran aktifitas enzim endokitinase.

  b. Berdasarkan pembentukan produk akhir reaksi hidrolilis kitin yaitu GlcNAc. GlcNAc atau N-asetilglukosamin yang dibebaskan dari kitin ditentukan secara kolorimetrik dengan p-dimetilaminobenzaldehida. Satu unit aktivitas kitinase dinyatakan sebagai μmol GlcNAc yang dibebaskan selama 1 jam dalam kondisi yang ditetapkan.

  c. Spectrometer Assay yaitu menggunakan kromogen 3,4, dinitrophenil tetra N- asetilkhitotetraose.

2.3 Metode Pemurnian Enzim

  Ekstrak enzim belum 100 % terdiri atas protein enzim yang diinginkan, sehingga perlu pemurnian untuk memisahkan dari pengotor. Pemurnian dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu : pengendapan protein melalui fraksinasi dengan amonium sulfat atau pelarut organik dan kromatografi (Scopes, 1994).

  Adapun metode kromatografi terdapat berbagai macam, diantaranya kromatografi penukar ion, afinitas, filtrasi, dan hidrofob.

2.3.1 Fraksinasi aseton

  Fraksinasi aseton merupakan salah satu metode pemurnian enzim secara parsial dengan menggunakan pelarut organik. Prinsip pemurnian parsial dengan pelarut organik adalah molekul hidrofobik pada enzim akan berkurang pada saat penambahan pelarut organik. Pelarut organik mengimobilisasi parsial molekul air dari protein. Molekul air di sekitar permukaan hidrofobik protein digantikan oleh molekul pelarut organik. Pada fakta penelitian menggunakan fraksinasi dengan pelarut organik, disimpulkan bahwa aseton sesuai digunakan untuk pemurnian protein.

  bagian hidrofob pelarut organik

Gambar 2.6 Agregasi protein akibat interaksi muatan berlawanan dari molekul protein satu dengan molekul protein lain (Scopes, 1994)

  Faktor utama penyebab agregasi molekul protein oleh aseton adalah ikatan elektrostatik dan kekuatan dipolar. Keberadaan aseton dalam larutan protein menyebabkan agregasi antara muatan yang berlawanan dari permukaan molekul protein satu dan protein yang lain. Proses presipitasi dengan pelarut organik terjadi pada keadaan elektrostatik protein. Molekul protein besar akan lebih mudah beragregasi karena memiliki perbedaan muatan yang tinggi. Molekul yang besar akan segera teragregasi karena terjadi perubahan yang besar dari muatan permukaan protein satu dengan protein yang lain. o

  Dalam fraksinasi aseton, suhu harus di bawah 0 C pada saat sampel

  o

  preparasi maupun pada saat fraksinasi. Pada suhu di atas 10

  C, protein mengalami denaturasi.

  Kestabilan struktur saat suhu naik

Interaksi hidrofob internal

  Molekul pelarut organik berinteraksi dengan residu hidrofob Gangguan akibat interaksi hidrofob Denaturasi

Gambar 2.7 Denaturasi protein akibat pelarut organik (Scopes, 1994)

  Pada saat temperatur tinggi, molekul dari pelarut organik masuk ke dalam protein melalui permukaannya, kemudian berinteraksi dengan residu hidrofobik dari protein. Interaksi tersebut menyebabkan protein mengalami denaturasi.

2.3.2 Fraksinasi amonium sulfat

  Fraksinasi amonium sulfat merupakan salah satu teknik pemurnian protein yang biasa dilakukan. Pemurnian dengan metode ini menggunakan prinsip agregasi protein molekul bagian permukaan hidrofobik dari protein.

  Molekul air Bagian hidrofob dari protein

Gambar 2.8 Molekul air di sekitar permukaan hidrofobik protein (Scopes, 1994)

  Pada saat ion garam terlarut, akan mengurangi pelarut air yang terdapat di antara bagian hidrofobik molekul-molekul protein, sehingga molekul air tersebut menjadi berkurang. Hal ini karena ion garam menarik molekul air yang berada di sekitar bagian hidrofobik. Bagian permukaan hidrofobik protein satu akan berikatan dengan bagian permukaan hidrofobik yang lain, kemudian saling beragregasi dan protein mengendap (Scopes, 1994).

2.3.3 Kromatografi

2.3.3.1 Kromatografi penukar ion

  Berdasar muatannya, kromatografi penukar ion dibagi menjadi dua yaitu penukar kation dan penukar anion. Kromatografi penukar kation menggunakan penukar kation yang bermuatan negatif, sebagai contoh adalah carboxymethyl-

  cellulose

  (CM-cellulose). Sedangkan penukar anion menggunakan resin penukar anion yang bermuatan positif, sebagai contoh adalah diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose). Protein harus memiliki muatan yang berbeda dengan penukar ionnya. Penambahan Tris-Cl meningkatkan kekuatan ion pada bufer yang mengalir pada kolom kromatografi (Scopes, 1994).

  2.3.3.2 Kromatografi afinitas Prinsip kromatografi afinitas adalah ligan terimobilisasi pada kolom.

  Sampel protein yang dilewatkan pada kolom, akan terjadi interaksi spesifik antara protein target dengan ligan, yang menyebabkan protein target dapat terpisah dari protein pengotor. Ligan berikatan kovalen dengan backbone matrix. Hanya enzim dengan afinitas spesifik yang akan terikat pada adsorben melalui interaksi dengan ligannya (Scopes, 1994).

  2.3.3.3 Kromatografi filtrasi

  Pemisahan dengan metode kromatografi filtrasi didasari oleh ukuran molekul protein dan perbedaan ukuran material pembatas pada matriks. Matriks yang biasa digunakan adalah selulosa dan dekstran. Molekul protein berukuran kecil akan terperangkap di dalam matiks, sedangkan molekul yang lebih besar dari ukuran matriks akan bebas dan keluar dari kolom kromatografi (Scopes, 1994).

  2.3.3.4 Kromatografi hidrofob

  Interaksi rantai alifatik pada adsorben dan kesamaan bagian hidrofob permukaan protein. Dalam kromatrografi hidrofobik, agregasi terjadi antara bagian hidrofob protein dan ligan terimobilisasi pada adsorben. Rantai alifatik

  4

  6

  8

  10

  yang cocok digunakan sebagai adsorben adalah C , C , C , dan C , serta rantai yang mengandung gugus amino terminal.

  Interaksi protein dengan adsorben hidrofobik adalah sebuah ikatan hidrogen atau ikatan elektrostatik. Kekuatan ikatan hidrogen menentukan kekuatan interaksi hidrofobik. Jika dibandingkan dengan kromatografi penukar ion, pemisahan protein menggunakan kromatografi hidrofobik akan lebih bagus.

  Kolom kromatografi ini terdiri dari selulosa atau dekstran. Kromatografi hidrofob memiliki kesamaan dengan presipitasi amonium sulfat, yaitu menggunakan prinsip salting-out (Scopes, 1994).

  2.4 Koloidal Kitin

  Koloidal kitin adalah kitin yang banyak digunakan sebagai substrat dalam medium fermentasi. Senyawa ini diperoleh dengan menghidrolisis secara parsial kitin dengan larutan asam klorida (HCl) 10 N (Chernin dkk., 1995). Untuk menetralkan kembali kitin yang sudah dihidrolisis dengan HCl 10 N, ditambahkan NaOH 10 N.

  Achatina fulica

  2.5 Achatina fulica

  merupakan bekicot asli dari Afrika Timur. Berbagai nama sebutan untuk Achatina fulica diantaranya adalah Giant African Snail (GAS),

  Agate snail

  , Schnecke, African snail, African giant, Kalutara, Caracol gigante

  africano

  , Acatina africana, Gran caracol africano, Escargot géant africain,

  Achatine de Madagascar (FAO, 1989).

  Berikut ini merupakan klasifikasi Achatina fulica (Wallace, 2002) Kingdom : Animalia Phylum : Mollusca Class : Gastropoda

  Order : Pulmonata Family : Achatinidae Genus : Achatina Species : Achatina fulica

  Achantina fulica

  merupakan hewan yang tergabung dalam kelas gastropoda. Bagian tubuhnya terbagi atas empat bagian utama yaitu kepala, leher, kaki, serta alat-alat dalam. Kepala Achatina fulica memiliki sepasang tentakel pendek yang berfungsi sebagai indera pembau dan sepasang tentakel panjang yang berfungsi sebagai indera penglihatan. Di bawah kepalanya terdapat kelenjar muksosa yang berfungsi menghasilkan lendir. Anatomi Achatina fulica dapat dilihat pada gambar berikut :

  gonad mata _{digestive gland} mata insang lambung tentakel _ginjal ginjal hati mulut ganglia otak kaki tembolok tali saraf

Gambar 2.9 Anatomi Achatina fulica

  Cangkang Achatina fulica berfungsi sebagai rumah atau pelindung badan untuk mempertahankan diri dari musuh (Santoso, 1989). Achatina fulica berjalan menggunakan otot perutnya. Pada saat kondisi lembab atau basah, Achatina fulica akan aktif. Sedangkan pada kondisi lingkungan yang kering, Achatina fulica cenderung bersembunyi di bawah permukan tanah atau di dalam cangkangnya.

  Hasil panen berupa daun atau bunga merupakan makanan yang cocok bagi perkembangan Achatina fulica. Achatina fulica hidup di kondisi tanah yang bersih dari sampah anorganik. Achatina fulica merupakan hewan invertebrata yang hemaprodit. Achatina fulica bertelur pada saat usia satu tahun. Dalam kondisi optimum, Achatina fulica dapat bertelur hingga empat kali dalam setahun (Mead, 1979).

  Ekstrak

  enzim merupakan gabungan beberapa enzim yang melakukan aktivitas bersama akan tetapi masing-masing enzim yang tergabung didalamnya tetap berdiri sendiri. Achatina fulica yang berasal dari eropa timur (Helix pomatia) dilaporkan memiliki kandungan ekstrak enzim yang terdiri dari enzim β-1,3- glukanase, enzim β-1,4-glukanase dan kitinase (Gabriel dan Kopecka, 1987).

  Helix pomatia

  dan Achatina fulica memiliki kesamaan dalam makanan yang dikonsumsi yaitu berupa dedaunan atau batang pohon yang mengandung glukan, selulosa, dan kitin (Kay, 1986). Sehingga Achatina fulica juga memiliki enzim yang terdapat pada Helix pomatia yaitu β-1,3-glukanase, β-1,4-glukanase dan β- 1,4-glukanhidrolase. β-1,3-glukanase. Wheel (1961) menyatakan bahwa ekstrak kelenjar saluran pencernaan (dygestive gland) Achatina fulica memiliki campuran enzim karbohidrase yaitu berupa enzim kitinase, xilase, selulase, hemiselulase, amilase, maltase, dan sukrase. Disamping itu, dygestive gland Achatina fulica mengandung enzim protease, dan polipeptidase. Enzim kitinase mampu menghidrolisis kandungan kitin yang terdapat dalam biofilm maupun dinding sel jamur patogen.

2.7 Turbidimetri

  Teknik spektroskopi dapat digunakan dalam menentukan struktur molekul suatu senyawa. Terdapat banyak teknik spektroskopi yang sering digunakan dalam pengukuran aktivitas enzim diantatanya adalah spektrofotometri UV-Vis dan turbidimetri (Eisenthal, 2002).

  Turbidimetri adalah pengukuran analit secara tidak langsung yang analisisnya berdasarkan berkas sinar yang diteruskan (seperti spektrofotometri UV-Vis). Turbidimetri mengukur kekeruhan sebagai sebab terjadinya perubahan sistem OD. Metode ini digunakan untuk mengukur aktivitas enzim yang kerjanya menghidrolisis polimer. Prinsip dasar metode turbidimetri adalah jika cahaya mengenai larutan, maka cahaya tersebut akan dihamburkan. Sedangkan cahaya yang tidak mengenai larutan akan diteruskan. Jumlah cahaya yang diteruskan berbanding lurus dengan transmitan, sedangkan cahaya yang dihamburkan berbanding terbalik dengan transmitan atau berbanding lurus dengan absorbansi (Kosim, 2010). Turbidimetri mengukur variasi turbiditas suspensi koloidal kitin selama kitinolisis. Pengukuran ini bersifat cepat dan akurat, contoh pada pengukuran aktivitas enzim endokitinase.

BAB III METODE PENELITIAN

  3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di laboratorium Biokimia Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, mulai bulan Februari 2012 sampai dengan bulan Juni 2012.

  3.2 Alat dan Bahan Penelitian

  3.2.1 Alat-alat penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat gelas yang biasa digunakan di laboratorium kimia, pHmeter dan termometer.

  Sedangkan instrumen yang digunakan adalah timbangan analitik (Ohaus), lemari o pendingin (Toshiba Glasio), lemari pendingin -20 C (Royal), sentrifuga (Universal 320R Zentrifugen), dan spektrofotometer UV-VIS (Pharmaspec UV- 1700 Shimadzu).

  3.2.2 Bahan-bahan penelitian Achatina fulica

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah , kitin, akuades, aseton, HCl 10N, NaOH 10N, NaH

  2 PO 4.

  2H

  2 O, asam sitrat,

  Na

2 HPO 4 .2H 2 O.

  22

  3.3 Diagram Alir Penelitian Achatina fulica _fulica

  Achatina Karantina

  Achatina fulica Perlakuan terhadap Panen cairan disgestive gland Achatina fulica

  Penentuan kadar Uji aktivitas protein

  Ekstrak

  enzim dygestive gland

  Achatina fulica

  Optimasi fraksinasi Data uji aktivitas

  Data kadar aseton protein

  Penentuan kadar Uji aktivitas protein

  Kitinase dengan kemurnian parsial Data uji aktivitas

  Data kadar Karakterisasi enzim protein kitinase pH optimum Suhu optimum enzim kitinase enzim kitinase

  3.4 Prosedur Penelitian