Pengaruh Pemberian Curcuminoid Terhadap Konsentrasi Hidrogen Peroksida (H2O2) Serum Dan Ekspresi Malondialdehid (MDA) Fibroblas Koklea Pada Rattus Norvegicus Model Diabetes Mellitus Chapter III VI
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian adalah eksperimental laboratorik ex vivo, yang dipilih
karena baik sampel maupun perlakuan lebih terkendali, terukur dan
pengaruh perlakuan dapat lebih dipercaya. Rancangan penelitian ini
menggunakan rancangan randomized post test only control group
laboratory experimental design untuk mengetahui efek pemberian
curcuminoid terhadap konsentrasi H2O2 serum dan ekspresi MDA fibroblas
koklea setiap unit eksperimen dengan pengukuran variabel yang hanya
dilakukan setelah pemberian perlakuan. Pengambilan sampel dilakukan
secara acak dan ada kontrol pembanding.
3.2 Tempat dan Teknik Pengambilan Data Penelitian
3.2.1 Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di laboratorium terstandardisasi dan mempunyai
peralatan lengkap serta pengalaman memadai. Pemeliharaan hewan coba
dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas
Airlangga Surabaya, pembuatan sediaan dan teknik pemeriksaan
imunohistokimia dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi RSUD dr.
Soetomo Surabaya, pemeriksaan ELISA dikerjakan di Laboratorium
Patologi Klinik RSUD dr. Soetomo Surabaya.
3.2.2 Teknik Pengambilan Data
Data yang dianalisis dalam penelitian ini merupakan data sekunder
dari sebuah penelitian besar yang dilakukan oleh Tengku Siti Hajar
Haryuna dan dibiayai oleh DIPA Direktorat Penelitian Pengabdian kepada
Masyarakat Tahun Anggaran 2015, sesuai dengan Surat Perjanjian
Penugasan Pelaksanaan Hibah Penelitian bagi Dosen Perguruan Tinggi
Batch I Universitas Sumatera No. 120/SP2H/PL/Dit.Litabmas/II/2015
tanggal 05 Februari 2015 dan Penelitian PUPT tahun 2016.
58
Universitas Sumatera Utara
59
3.3 Variabel Penelitian
3.3.1 Variabel bebas
Variabel bebas adalah stres hiperglikemik yang didapatkan melalui
injeksi streptozotocin 60 mg/kgbb/ekor dosis tunggal serta pemberian
curcuminoid dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/ekor/hari selama 5 dan
10 hari.
3.3.2 Variabel terikat
Respon molekuler pada fibroblas berupa konsentrasi H2O2 dan ekspresi
MDA.
3.3.3 Variabel terkendali
Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin tikus, kandang tikus
terpisah, berat badan tikus, makanan dan minuman tikus, cara pemberian
perlakuan injeksi streptozotocin serta curcuminoid, prosedur penelitian
dan cara pemeliharaan hewan coba.
3.4 Sampel
Tikus dipilih menjadi sampel penelitian karena memiliki kemiripan
struktur telinga dalam dengan manusia. Tikus telah digunakan sebagai
model hewan coba untuk penelitian penyakit ketulian genetik manusia dan
terbukti bermanfaat dalam membantu mengidentifikasi gen yang sesuai
pada manusia yang berperan dalam perkembangan sistem auditorius.
Melalui identifikasi genetik dan sekuensnya, tikus dinyatakan homolog
(>70%) dengan manusia (Van de Water, 1996).
Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin jantan, kondisi
sehat, umur dewasa (2-3 bulan), dengan berat badan 150-250 gram agar
perubahan berat selama penelitian relatif kecil (Hume, et al.,1977).
Sampel penelitian ini menggunakan tikus dengan galur populasi yang
sama, homogen dalam jenis kelamin dan umur, tikus tersebut merupakan
hasil pembiakan (breeding) di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran
Universitas Airlangga. Perlakuan pada tikus dengan injeksi streptozotocin
Universitas Sumatera Utara
60
dengan dosis tertentu, kemudian diukur variabel penelitian hanya setelah
pemberian perlakuan.
Rancangan penelitian memiliki kriteria; pengambilan sampel dilakukan
secara acak, streptozotocin diberikan dalam dosis tertentu sesuai berat
badan tikus, ada kontrol pembanding, dan bersifat double blind.
Selanjutnya data yang diperoleh dianalisis untuk mencapai tujuan
penelitian.
3.4.1 Besar sampel
Besar sampel ditentukan berdasarkan jumlah ulangan yang
dianggap telah cukup baik (Federer, 1955), dengan rumus sebagai
berikut:
(k-1) (r-1) ≥ 15)
Keterangan:
k = jumlah kelompok subyek penelitian (k=6)
r = jumlah ulangan
Perhitungan:
(6-1) (r-1) ≥ 15;
5r-5 ≥ 15;
5r ≥ 20;
n = r x k;
n = 4 x 6 = 24
r≥4
ditetapkan besar sampel secara keseluruhan yaitu minimal 24 ekor tikus.
3.4.2 Pengelompokan sampel
Berdasarkan rumus di atas maka besar sampel adalah tikus yang
diambil peneliti secara random untuk tiap kelompok perlakuan, sehingga
sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 24 ekor tikus yang
dibagi menjadi 6 kelompok sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
61
Subyek
K1
R
P0 (tanpa perlakuan = kontrol)
K1 (Kelompok 1)
P1 (Perlakuan 1)
K2 (Kelompok 2)
P2 (Perlakuan 2)
K3 (Kelompok 3)
P3 (Perlakuan 3)
K4 (Kelompok 4)
P4 (Perlakuan 4)
K5 (Kelompok 5)
P5 (Perlakuan 5)
K6 (Kelompok 6)
: Kelompok kontrol, diberikan injeksi buffer natrium sitrat dan
CMC.
K2
: Kelompok
perlakuan
diberikan
injeksi
streptozotocin
60
injeksi
streptozotocin
60
mg/kgbb/ekor dosis tunggal.
K3
: Kelompok
perlakuan
dengan
mg/kgbb/ekor dosis tunggal dan pemberian curcuminoid 200
mg/kgbb/ekor/hari selama 5 hari.
K4
: Kelompok
perlakuan
dengan
injeksi
streptozotocin
60
mg/kgbb/ekor dosis tunggal dan pemberian curcuminoid 400
mg/kgbb/ekor/hari selama 5 hari.
K5
: Kelompok
perlakuan
dengan
injeksi
streptozotocin
60
mg/kgbb/ekor dosis tunggal dan pemberian curcuminoid 200
mg/kgbb/ekor/hari selama 10 hari.
K6
: Kelompok
perlakuan
dengan
injeksi
streptozotocin
60
mg/kgbb/ekor dosis tunggal dan pemberian curcuminoid 400
mg/kgbb/ekor/hari selama 10 hari.
3.4.3 Teknik pengambilan sampel
Tikus Rattus norvegicus galur Wistar didapat dari institusi penyedia
yang memiliki kualifikasi standar. Sebelum digunakan sebagai subyek
penelitian, hewan coba dilakukan evaluasi klinis dan dikondisikan dalam
lingkungan yang sesuai (selama 14x24 jam) untuk meyakinkan bahwa
Universitas Sumatera Utara
62
hewan tersebut tidak berpenyakit atau tidak berpotensi menularkan
penyakit.
Sebelum mendapatkan perlakuan penelitian, dilakukan skrining dengan
beberapa kriteria, yaitu:
1. Kriteria inklusi: hewan coba berusia 2-3 bulan, jenis kelamin jantan
dan berat badan 150-250 gram.
2. Kriteria eksklusi:
a. Hewan dinyatakan berpenyakit oleh dokter hewan konsultan, baik
penyakit menular atau tidak menular atau cedera fisik atau berpotensi
menularkan penyakit dalam kurun waktu evaluasi klinis di dalam kondisi
lingkungan yang sesuai (selama 14 x 24 jam).
b. Hewan terdeteksi memiliki kelainan bawaan yang dinyatakan oleh dokter
hewan konsultan.
c. Hewan berperilaku agresif, dalam pengamatan sering menyerang
anggota kelompok lain.
Setelah didapatkan sampel yang homogen melalui skrining dengan
kriteria inklusi dan eksklusi di atas, dilakukan pembagian kelompok
sampel yang homogen secara alokasi random sehingga setiap anggota
sampel mempunyai kesempatan sama untuk menempati kelompoknya.
Penelitian berlangsung dengan prosedur pelakuan hewan secara
benar ditinjau dari prinsip 3R (Reduction, Replacement, Refinement) serta
prinsip 5F (Freedom from Hunger and Thirst, Freedom from Discomfort,
Freedom from Pain, Injury or Disease, Freedom to Express Normal
Behaviour, Freedom from Fear and Distress) (FAO, 2011) dan
diberlakukan kriteria Putus Uji apabila subyek penelitian mengalami sakit
atau kematian sehingga tidak bisa memenuhi prosedur penelitian yang
membutuhkan waktu 5 - 10 hari. Selanjutnya tikus diterminasi dan diambil
darah prekordial untuk dilakukan pemeriksaan ELISA yang bertujuan
untuk menilai aktivitas H2O2 serta dilakukan pengambilan jaringan koklea
untuk dibuat sediaan dan pengecatan imunohistokimia untuk menganalisis
ekspresi MDA.
Universitas Sumatera Utara
63
3.5
Definisi Operasional Penelitian
1. Induksi Diabetes: injeksi Streptozotocin dengan dosis 60 mg/kg
berat badan tikus (single dose) secara intraperitoneal, kemudian
kadar gula darah diukur 2 hari pasca injeksi, sampai terjadi
kondisi hiperglikemia (KGD >200 mg/dl).
2. Hiperglikemia adalah keadaan dimana kadar gula darah tikus
mencapai >200 mg/dl yang diukur menggunakan strip pengukur
kadar gula darah merk Gluko DR® Bio Sensor dari allmedicus.
3. Fibroblas: sel yang terdapat pada jaringan dinding lateral koklea.
Sel berinti tunggal dalam bentuk yang panjang.
4. Konsentrasi H2O2 diukur dengan metode ELISA menggunakan
darah prekordial tikus yang telah dilakukan sentrifugasi 3000 rpm
(rounds per minute) selama 10 menit. Serum yang diperoleh dari
proses sentrifugasi pada tiap kelompok dilabel dengan antibodi
spesifik terhadap H2O2. Konsentrasi H2O2 pada tiap sampel
ditentukan dengan cara membandingkan optical density (OD)
tiap sampel terhadap kurva standar. Pemeriksaan aktivitas H2O2
dilakukan sesuai petunjuk pelaksanaan pada package insert
yang terdapat dalam rat hydrogenperoxide ELISA kit (Glory
Science Co., Ltd catalog #:34647). Pembacaan nilai OD diukur
pada panjang gelombang 450 nm pada plate reader ELISA
reader. Hasil penghitungan akhir dinyatakan dalam pg/ml (skala
numerik/angka).
5. Ekspresi MDA diidentifikasi dengan pengecatan imunohistokimia
dan dilakukan penghitungan secara kuantitatif terhadap total
jumlah rata-rata distribusi unit sel fibroblas berinti tunggal dalam
bentuk panjang yang mengekspresikan MDA (memperlihatkan
warna coklat) pada jaringan dinding lateral koklea tiap kelompok
di bawah mikroskop cahaya yang dilengkapi mikrometer okuler
dengan perbesaran 40x oleh 2 orang pemeriksa (peneliti dan
pemeriksa ahli (dokter spesialis Patologi Anatomi)) untuk
Universitas Sumatera Utara
64
kemudian dilakukan penghitungan skor imunoreaktif. Skor
imunoreaktif diperoleh dengan mengalikan skor luas dengan skor
intensitas.
Hasil ukur skor imunoreaktif: 0-9.
Dalam penelitian ini digunakan Malondialdehyde Antibody
NB100-62737 dari Novus Biological (www.novusbio.com).
6. Curcuminoid: zat pigmen kuning yang diekstraksi dari tumbuhan
Curcuma domestica Val. atau Curcuma longa L. Pada penelitian
ini yang digunakan adalah curcuminoid serbuk dengan kadar
(16.62 ± 0.14)% w/w dibandingkan dengan standar, yang diukur
dengan metode thin layer chromatography dan densitometri.
Sediaan yang diberikan berupa curcuminoid serbuk dengan
dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari per ekor tikus karena
berdasarkan literatur dan penelitian terdahulu dosis tersebut
dapat menurunkan konsentrasi H2O2 dan ekspresi MDA.
3.6 Alat dan Bahan Penelitian
3.6.1 Hewan coba yang dikenai perlakuan
Tikus putih jantan Rattus norvegicus galur Wistar yang memenuhi
kriteria inklusi dan eksklusi akan mendapatkan pembagian kelompok
sesuai hasil randomisasi.
3.6.2 Bahan perlakuan
a. Streptozotocin
Streptozotocin disimpan pada suhu 20 0C. Konsentrasi
streptozotocin adalah 22,5 mg/l, disimpan dalam tabung reaksi
yang ditutup dengan aluminium foil (karena sensitif terhadap
cahaya).
b. Curcuminoid
Curcuminoid yang dipakai berasal dari Curcuma longa L. dengan
kadar curcuminoid (16.62 ± 0.14)% w/w dibandingkan dengan
standar, yang diukur dengan metode thin layer chromatography
Universitas Sumatera Utara
65
dan densitometri. Sediaan yang diberikan berupa curcuminoid
serbuk dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari perekor tikus.
c. Buffer natrium sitrat
dibuat dengan melarutkan 1,47 gram
Natrium sitrat dalam 50 ml dH2O.
d. Carboxy
Methyl
Cellulose
(CMC)
dibuat
dengan
mensuspensikan 0.5 gram CMC dalam 100 cc larutan akuades.
e. Eter inhalan sebagai zat anestesi.
3.6.3 Bahan pemeriksaan laboratorium
Alat yang digunakan pada penelitian ini, antara lain: kandang tikus,
gunting bedah, disposible syringe, mikroskop binokuler, gelas obyek dan
cover glass, mikrotom, tabung reaksi, pipet pasteur steril, tabung silikon,
pipet mikro, beker gelas, spuit 1 cc, spuit 3 cc, spuit 5 cc dan lemari es,
glukoDR.
Untuk Hematoxillin Eosin dan Imunohistokimia meliputi H2O2 3%, xylol,
alkohol 100%, PBS, HCL 0.5 M, antibodi primer rat hydrogenperoxide
(H2O2) ELISA kit (Glory Science Co., Ltd catalog #: 34647), antibody
Malondialdehyde NB 100-62737 (Novusbio) dan biotinylated secondary
Ab (anti rabbit), streptavidin berlabel peroksidase, pewarna Meyerhematoxilen, TrisHCl pH 6.8, entelen, akuades steril, parafin lunak, poli-Dlysin, BSA 3%, tripsin 0.025%, substrat DAB.
3.7 Prosedur Penelitian
3.7.1 Tahap persiapan
Untuk menjamin bahwa semua prosedur yang dilakukan pada
penelitian ini laik etik, maka sebelum dilakukan penelitian proposal
diajukan terlebih dahulu pada komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas
Sumatera Utara untuk mendapatkan penilaian dan pengesahan kelaikan
etik.
3.7.2 Prosedur induksi diabetes menggunakan streptozotocin.
a. Tikus dipuasakan selama 4 jam untuk mengosongkan lambung dan
mengurangi risiko aspirasi.
Universitas Sumatera Utara
66
b. Hitung
dosis
induksi
streptozotocin
dengan
kebutuhan
60
mg/kgbb/ekor tikus.
c.
Hitung kebutuhan dapar sitrat yang dibutuhkan demgan konsentrasi
streptozotocin 22,5 mg/ml dalam dapar sitrat.
d. Siapkan tabung dan bungkus dengan aluminium foil pada bagian
luarnya.
e. 15 – 20 menit sebelum induksi, timbang streptozotocin yang
dibutuhkan kemudian larutkan ke dalam dapar sitrat dengan volume
yang telah ditentukan.
f.
Masukan larutan streptozotocin yang diperoleh kedalam tabung
berbungkus aluminium foil.
g. 30 detik – 1 menit sebelum induksi pindahkan larutan streptozotocin
ke dalam spuit 1 ml.
h. Injeksikan larutan streptozotocin melalui intraperitoneal tikus sesuai
dengan kebutuhan dosis per ekor. Induksi dilakukan hanya satu kali.
i.
Berikan larutan sukrosa 10% atau dekstrosa 10% sepanjang malam
pertama setelah induksi untuk menghindari sudden hypoglycemic post
injection.
j.
Setiap pagi tikus diperiksa kadar glukosa darah puasa (tikus
dipuasakan dengan cara tidak diberi pakan dan kandang dikosongkan
dari sekam selama 6 jam). Hiperglikemia yang bermakna akan dijumpai
2 hari setelah induksi.
3.7.3 Prosedur pemberian curcuminoid
Curcuminoid (kadar curcuminoid 80%) dosis 200 mg dan 400 mg
disuspensikan dalam carboxymethylcellulose (CMC) 0.5% (CMC dibuat
dengan mensuspensikan 0.5 gram CMC dalam 100 cc larutan akuades).
Setelah disuspensikan, diberikan langsung ke lambung tikus dengan
menggunakan nasogastric tube (NGT).
Universitas Sumatera Utara
67
3.7.4 Perlakuan pada tikus
Setelah tikus putih beradaptasi terhadap lingkungan kandang di
laboratorium selama 2 minggu, selanjutnya perlakuan diberikan sesuai
dengan kelompok yang direncanakan.
3.7.5 Prosedur pengambilan jaringan koklea tikus
Tikus dikorbankan dengan inhalasi eter, dilakukan nekropsi jaringan
tulang temporal kepala tikus. Sampel jaringan diambil, difiksasi dengan
larutan buffer formalin 10% dan dilakukan dekalsifikasi dengan EDTA
selama 4 minggu. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan laboratorium.
3.7.6 Pemeriksaan laboratorium
a.
Fiksasi jaringan dengan pembuatan paraffin block jaringan.
Jaringan tulang didekalsifikasi dengan menggunakan EDTA selama
4 minggu. Jaringan selanjutnya dicuci dengan PBS 3-5 kali untuk
membersihkannya dari kontaminan. Kemudian jaringan difiksasi
pada larutan formalin 10%. Setelah itu dilakukan dehidrasi dengan
alkohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolut)
masing-masing selama 60 menit. Dilakukan clearing menggunakan
xylol sebanyak 2 kali masing-masing 60 menit. Kemudian dilakukan
impregnasi dengan parafin lunak selama 60 menit pada suhu 480C.
Selanjutnya dilakukan blocking preparat dalam parafin keras pada
cetakan dan didiamkan selama sehari.
b.
Proses deparafinisasi
Dilakukan pemotongan blok parafin setebal 4 µm dengan rotary
microtome. Jaringan yang sudah dipotong dimasukkan dalam air
hangat, lalu diletakkan pada kaca.
c.
Proses pewarnaan Hematoxilin Eosin
Dimasukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak 2 kali masingmasing selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan
alkohol berseri (absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masingmasing selama 5 menit, kemudian bilas dalam dH2O selama 5
Universitas Sumatera Utara
68
menit. Warnai sediaan dengan Hematoxilin selama 10 menit,
setelah itu direndam dalam tap water selama 10 menit lalu dibilas
dengan dH2O. Sediaan selanjutnya diwarnai kembali dengan
larutan Eosin selama 3 menit lalu didehidrasi dengan alkohol
berseri 30% dan 50% masing-masing selama 5 menit, cuci dengan
dH2O selama 5 menit dan dikering-anginkan. Inkubasi kembali
dengan xylol sebanyak 2 kali masing-masing selama 2 menit
kemudian dilakukan mounting dengan entelan dan tutup dengan
cover glass.
d.
Pemeriksaan konsentrasi H2O2 dengan teknik ELISA
Darah prekordial tikus diambil dan dilakukan sentrifugasi 3.000 rpm
(revolutions per minute) selama 10 menit sampai didapatkan serum
sampel. Supernatan yang diperoleh dari proses sentrifugasi
diperiksa aktivitas H2O2-nya sesuai petunjuk pelaksanaan pada
package insert yang terdapat dalam rat hydrogenperoxide (H2O2)
ELISA
kit
(Glory
Science
Co.,
Ltd
cat#34647).
Rat
hydrogenperoxide ELISA kit dirancang untuk mengukur H2O2
secara kuantitatif dalam berbagai sampel.
e.
Pemeriksaan ekspresi MDA dengan teknik imunohistokimia.
Masukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak 2 kali masing-masing
selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan alkohol
berseri (absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masing-masing
selama 5 menit, kemudian dibilas dalam dH2O selama 5 menit.
Masukkan kembali ke dalam H2O2 3% selama 20 menit, lalu cuci
menggunakan PBS pH 7.4 sebanyak 3 kali selama 5 menit.
Blocking protein non-spesifik dilakukan dengan menggunakan 5%
FBS yang mengandung 0.25% Triton X-100. lalu cuci kembali
dengan PBS pH 7.4 sebanyak 3 kali, selama 5 menit. Inkubasi
dengan menggunakan antibodi primer antibody Malondialdehyde
NB 100-62737 (Novusbio) selama 60 menit lalu cuci dengan PBS
Universitas Sumatera Utara
69
pH 7.4 sebanyak 3 kali selama 5 menit. Selanjutnya, sediaan
direaksikan dengan antibodi sekunder (biotinylated secondary
antibody) selama 60 menit, lalu cuci kembali dengan PBS pH 7.4
sebanyak 3 kali selama 5 menit. Inkubasi dengan dengan
steptavidin-HRP selama 60 menit, lalu cuci menggunakan PBS pH
7.4 sebanyak 3 kali selama 5 menit. Tetesi dengan DAB dan
inkubasi selama 30 menit, lalu cuci menggunakan dH2O selama 5
menit. Masukkan sediaan ke dalam larutan Mayer Hematoxylin
sebagai counterstaining dan diinkubasi selama 10 menit, lalu cuci
menggunakan tap water. Selanjutnya, sediaan dibilas dengan dH2O
dan dikering-anginkan. Kemudian dilakukan proses mounting
menggunakan entelan lalu ditutup dengan cover glass.
3.7.7 Penghitungan sel pada pemeriksaan imunohistokimia
Menggunakan mikroskop Olympus XC 10 dengan pembesaran 40x
Penghitungan jumlah fibroblas terekspresi dilakukan oleh peneliti dan
pemeriksa ahli.
1. Penghitungan dilakukan terhadap semua slide yang ada dengan
rincian:
a. Jumlah hewan coba yang termasuk kriteria masukan 40 sampel
b. Setiap hewan coba diambil sampel jaringan, difiksasi dengan 10%
formalin, dilakukan dekalsifikasi dengan EDTA selama 4 minggu.
c. Masing-masing sampel jaringan dibuat sediaan irisan setebal 4 µm,
kemudian diwarnai dengan Hematoxilin Eosin (HE).
2. Semua slide yang sudah berkode ditutup nomor kodenya dan diberi
nomor baru secara acak sehingga pemeriksa dan peneliti yang ikut
memeriksa tidak mengetahui slide yang diperiksa milik sampel yang
mana (double blind).
3. Pemeriksa terdiri dari 2 orang, masing-masing yaitu peneliti dan
pemeriksa ahli (dokter spesialis patologi anatomi).
Universitas Sumatera Utara
70
4. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan secara terpisah diantara
ke 2 pemeriksa, disesuaikan dengan kemampuan/kesediaan waktu
pemeriksa.
5. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan terhadap masingmasing slide pada bidang pandang di dinding lateral koklea yaitu
daerah yang ditandai dengan adanya fibroblas dengan pembesaran
40x.
6. Hasil penghitungan sel sesuai dengan slide yang diperiksa ditulis di
lembar kerja pada kotak yang sesuai.
7. Analisis statistik dilakukan bila semua hasil sudah dikembalikan ke
nomor kode.
Universitas Sumatera Utara
71
3.8 Alur Penelitian
Populasi Hewan
Randomisasi
Kelompok 1 / Kontrol (Injeksi
Buffer Na-Sitrat (1x),
dilanjutkan pemberian CMC
(setiap hari)
Kelompok Perlakuan
Kelompok 2 /
Perlakuan 1
Kelompok 3 /
Perlakuan 2
Kelompok 4 /
Perlakuan 3
Kelompok 5 /
Perlakuan 4
Kelompok 6 /
Perlakuan 5
Injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single dose
Injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single dose
Injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single dose
Injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single dose
Injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single dose
Curcuminoid
200
mg/kgbb/hari
selama 5 hari
Curcuminoid
400
mg/kgbb/hari
selama 5 hari
Curcuminoid
200
mg/kgbb/hari
selama 10 hari
Curcuminoid
400
mg/kgbb/hari
selama 10 hari
Terminasi hari ke 5
Terminasi hari ke 10
Pemeriksaan
ELISA untuk mengukur
konsentrasi H2O2 serum dan
pemeriksaan imunohistokimia
fibroblas koklea untuk melihat
ekspresi MDA
Universitas Sumatera Utara
72
3.9
Analisis Statistik
Data penelitian yang diperoleh akan diolah dan dianalisis secara
univariat, bivariat dan multivariat dengan menggunakan SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences). Analisis univariat dilakukan untuk
memperoleh nilai rata-rata hitung dan standar deviasi untuk tiap kelompok
penelitian sehingga dapat diketahui deskripsi masing-masing variabel
dalam penelitian. Analisis bivariat dilakukan untuk menguji hubungan
antara variabel independen terhadap variabel dependen, menganalisis
kesetaraan antara masing-masing kelompok dan mengetahui perbedaan
(penurunan atau peningkatan) yang terjadi pada masing-masing kelompok
setelah
diadakan
intervensi.
Untuk
menganalisis
perbedaan
atau
peningkatan pada masing-masing kelompok penelitian ini digunakan uji t.
Normalitas data dinilai dengan uji Shapiro-Wilk. Apabila data penelitian
yang diperoleh tidak terdistribusi normal, akan dilakukan pengujian
dengan uji Mann-Whitney. Analisis multivariat dengan uji ANOVA dan uji
Post-Hoc Bonferroni dilakukan untuk mengetahui kelompok perlakuan
mana
yang memiliki perbedaan
yang
bermakna dari perubahan
konsentrasi H2O2 serta ekspresi MDA setelah mengalami hiperglikemia
(variabel dependen) dan curcuminoid (variabel independen). Perlakuan
diuji pada taraf nyata 5%. Data penelitian juga diolah dengan uji korelasi
Pearson bila terdistribusi normal atau uji korelasi Spearman bila tidak
terdistribusi normal, untuk melihat korelasi antara konsentrasi H2O2 serum
dengan ekspresi MDA fibroblas koklea, dengan taraf nyata 1%.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL PENELITIAN
4.1 Profil Konsentrasi H2O2 Serum dan Ekspresi MDA Fibroblas
Koklea Tikus Model Diabetes Mellitus
Hasil penelitian yang didapatkan berdasarkan pemeriksaan enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) untuk memeriksa konsentrasi H2O2
dan imunohistokimia untuk melihat ekspresi MDA pada setiap kelompok,
yaitu kelompok kontrol (kelompok 1) dan kelompok model DM (kelompok
2,3,4,5 dan 6). Gambaran konsentrasi H2O2 dan ekspresi MDA keenam
kelompok penelitian ditampilkan pada tabel 4.1 dan gambar 4.1 dibawah
ini:
Tabel 4.1 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Konsentrasi H2O2 Serum dan
Ekspresi MDA Fibroblas Koklea.
Kelompok
(n=6)
Konsentrasi H2O2
Nilai Rerata
Standar
Ekspresi MDA
Nilai Rerata
Deviasi
Standar
Deviasi
1
2.7250
0.20616
2.00
1.000
2
4.1250
0.52520
7.80
1.643
3
3.5675
0.32999
5.40
2.510
4
3.1500
0.38730
4.00
1.871
5
3.6000
0.43205
1.60
0.548
6
2.6750
0.28723
1.40
0.548
73
Universitas Sumatera Utara
74
Gambar 4.1 Nilai Rerata Konsentrasi H2O2 Serum dan Ekspresi MDA
Fibroblas Koklea Tiap Kelompok Perlakuan
Keterangan:
A. Konsentrasi H2O2
Terjadi peningkatan konsentrasi H2O2 pada kelompok 2 dibanding
kelompok lainnya. Penurunan konsentrasi H2O2 terjadi pada kelompok
yang mendapatkan curcuminoid, terutama dosis besar yaitu kelompok 4
dan 6, dibandingkan kelompok 2.
B. Ekspresi MDA
Terjadi peningkatan ekspresi MDA pada kelompok 2 dibanding
kelompok lainnya. Penurunan ekspresi MDA terjadi pada kelompok
yang mendapatkan curcuminoid, terutama dengan durasi pemberian
yang lebih lama yaitu kelompok 5 dan 6, dibandingkan kelompok 2.
Gambar 4.1 tersebut diatas secara umum menunjukkan terjadinya
peningkatan konsentrasi H2O2 serum dan ekspresi MDA fibroblas koklea
tikus model DM yang tidak mendapatkan curcuminoid. Pemberian
curcuminoid menurunkan konsentrasi H2O2 dan ekspresi MDA tikus model
DM. Pada kelompok 4 dan 6 didapatkan perbedaan konsentrasi H2O2
Universitas Sumatera Utara
75
yang lebih rendah, yang menunjukkan bahwa dosis curcuminoid yang
lebih tinggi (400 mg/kgbb/hari/ekor) lebih baik dibanding dosis yang lebih
rendah (200 mg/kgbb/hari/ekor) dalam menurunkan konsentrasi H2O2
pada serum tikus yang diinduksi DM. Pada kelompok 5 dan 6 didapatkan
ekspresi MDA yang lebih rendah, yang menunjukkan bahwa pemberian
curcuminoid dengan durasi yang lebih lama (10 hari) lebih baik
dibandingkan dengan durasi pemberian yang lebih singkat (5 hari).
Universitas Sumatera Utara
76
4.2 Hasil Uji Curcuminoid dalam Menurunkan Konsentrasi H2O2
pada Serum Tikus Model Diabetes Melitus
Data hasil penelitian yang didapatkan berdasarkan pemeriksaan ELISA
selanjutnya diolah dan dianalisis secara statistik.
Tabel 4.2 Hasil Uji ANOVA terhadap Konsentrasi H2O2 pada Setiap
Kelompok
Kelompok
Kelompok 1
Kelompok 2
Kelompok 3
Kelompok 4
Kelompok 5
Perbedaan rerata ± Standar error
Nilai p
Kelompok 2
1.4000 ± 0.265
.001*
Kelompok 3
.8425 ± 0.265
.079
Kelompok 4
.4250 ± 0.265
1.000
Kelompok 5
.8750 ± 0.265
.060
Kelompok 6
.0500 ± 0.265
1.000
Kelompok 3
.5575 ± 0.265
.753
Kelompok 4
.9750 ± 0.265
.026*
Kelompok 5
.5250 ± 0.265
.954
Kelompok 6
1.4500 ± 0.265
.001*
Kelompok 4
.4175 ± 0.265
1.000
Kelompok 5
.0325 ± 0.265
1.000
Kelompok 6
.8925 ± 0.265
.052
Kelompok 5
.4500 ± 0.265
1.000
Kelompok 6
.4750 ± 0.265
1.000
Kelompok 6
.9520 ± 0.265
.040*
*Bermakna secara statistik (p
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian adalah eksperimental laboratorik ex vivo, yang dipilih
karena baik sampel maupun perlakuan lebih terkendali, terukur dan
pengaruh perlakuan dapat lebih dipercaya. Rancangan penelitian ini
menggunakan rancangan randomized post test only control group
laboratory experimental design untuk mengetahui efek pemberian
curcuminoid terhadap konsentrasi H2O2 serum dan ekspresi MDA fibroblas
koklea setiap unit eksperimen dengan pengukuran variabel yang hanya
dilakukan setelah pemberian perlakuan. Pengambilan sampel dilakukan
secara acak dan ada kontrol pembanding.
3.2 Tempat dan Teknik Pengambilan Data Penelitian
3.2.1 Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di laboratorium terstandardisasi dan mempunyai
peralatan lengkap serta pengalaman memadai. Pemeliharaan hewan coba
dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas
Airlangga Surabaya, pembuatan sediaan dan teknik pemeriksaan
imunohistokimia dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi RSUD dr.
Soetomo Surabaya, pemeriksaan ELISA dikerjakan di Laboratorium
Patologi Klinik RSUD dr. Soetomo Surabaya.
3.2.2 Teknik Pengambilan Data
Data yang dianalisis dalam penelitian ini merupakan data sekunder
dari sebuah penelitian besar yang dilakukan oleh Tengku Siti Hajar
Haryuna dan dibiayai oleh DIPA Direktorat Penelitian Pengabdian kepada
Masyarakat Tahun Anggaran 2015, sesuai dengan Surat Perjanjian
Penugasan Pelaksanaan Hibah Penelitian bagi Dosen Perguruan Tinggi
Batch I Universitas Sumatera No. 120/SP2H/PL/Dit.Litabmas/II/2015
tanggal 05 Februari 2015 dan Penelitian PUPT tahun 2016.
58
Universitas Sumatera Utara
59
3.3 Variabel Penelitian
3.3.1 Variabel bebas
Variabel bebas adalah stres hiperglikemik yang didapatkan melalui
injeksi streptozotocin 60 mg/kgbb/ekor dosis tunggal serta pemberian
curcuminoid dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/ekor/hari selama 5 dan
10 hari.
3.3.2 Variabel terikat
Respon molekuler pada fibroblas berupa konsentrasi H2O2 dan ekspresi
MDA.
3.3.3 Variabel terkendali
Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin tikus, kandang tikus
terpisah, berat badan tikus, makanan dan minuman tikus, cara pemberian
perlakuan injeksi streptozotocin serta curcuminoid, prosedur penelitian
dan cara pemeliharaan hewan coba.
3.4 Sampel
Tikus dipilih menjadi sampel penelitian karena memiliki kemiripan
struktur telinga dalam dengan manusia. Tikus telah digunakan sebagai
model hewan coba untuk penelitian penyakit ketulian genetik manusia dan
terbukti bermanfaat dalam membantu mengidentifikasi gen yang sesuai
pada manusia yang berperan dalam perkembangan sistem auditorius.
Melalui identifikasi genetik dan sekuensnya, tikus dinyatakan homolog
(>70%) dengan manusia (Van de Water, 1996).
Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin jantan, kondisi
sehat, umur dewasa (2-3 bulan), dengan berat badan 150-250 gram agar
perubahan berat selama penelitian relatif kecil (Hume, et al.,1977).
Sampel penelitian ini menggunakan tikus dengan galur populasi yang
sama, homogen dalam jenis kelamin dan umur, tikus tersebut merupakan
hasil pembiakan (breeding) di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran
Universitas Airlangga. Perlakuan pada tikus dengan injeksi streptozotocin
Universitas Sumatera Utara
60
dengan dosis tertentu, kemudian diukur variabel penelitian hanya setelah
pemberian perlakuan.
Rancangan penelitian memiliki kriteria; pengambilan sampel dilakukan
secara acak, streptozotocin diberikan dalam dosis tertentu sesuai berat
badan tikus, ada kontrol pembanding, dan bersifat double blind.
Selanjutnya data yang diperoleh dianalisis untuk mencapai tujuan
penelitian.
3.4.1 Besar sampel
Besar sampel ditentukan berdasarkan jumlah ulangan yang
dianggap telah cukup baik (Federer, 1955), dengan rumus sebagai
berikut:
(k-1) (r-1) ≥ 15)
Keterangan:
k = jumlah kelompok subyek penelitian (k=6)
r = jumlah ulangan
Perhitungan:
(6-1) (r-1) ≥ 15;
5r-5 ≥ 15;
5r ≥ 20;
n = r x k;
n = 4 x 6 = 24
r≥4
ditetapkan besar sampel secara keseluruhan yaitu minimal 24 ekor tikus.
3.4.2 Pengelompokan sampel
Berdasarkan rumus di atas maka besar sampel adalah tikus yang
diambil peneliti secara random untuk tiap kelompok perlakuan, sehingga
sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 24 ekor tikus yang
dibagi menjadi 6 kelompok sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
61
Subyek
K1
R
P0 (tanpa perlakuan = kontrol)
K1 (Kelompok 1)
P1 (Perlakuan 1)
K2 (Kelompok 2)
P2 (Perlakuan 2)
K3 (Kelompok 3)
P3 (Perlakuan 3)
K4 (Kelompok 4)
P4 (Perlakuan 4)
K5 (Kelompok 5)
P5 (Perlakuan 5)
K6 (Kelompok 6)
: Kelompok kontrol, diberikan injeksi buffer natrium sitrat dan
CMC.
K2
: Kelompok
perlakuan
diberikan
injeksi
streptozotocin
60
injeksi
streptozotocin
60
mg/kgbb/ekor dosis tunggal.
K3
: Kelompok
perlakuan
dengan
mg/kgbb/ekor dosis tunggal dan pemberian curcuminoid 200
mg/kgbb/ekor/hari selama 5 hari.
K4
: Kelompok
perlakuan
dengan
injeksi
streptozotocin
60
mg/kgbb/ekor dosis tunggal dan pemberian curcuminoid 400
mg/kgbb/ekor/hari selama 5 hari.
K5
: Kelompok
perlakuan
dengan
injeksi
streptozotocin
60
mg/kgbb/ekor dosis tunggal dan pemberian curcuminoid 200
mg/kgbb/ekor/hari selama 10 hari.
K6
: Kelompok
perlakuan
dengan
injeksi
streptozotocin
60
mg/kgbb/ekor dosis tunggal dan pemberian curcuminoid 400
mg/kgbb/ekor/hari selama 10 hari.
3.4.3 Teknik pengambilan sampel
Tikus Rattus norvegicus galur Wistar didapat dari institusi penyedia
yang memiliki kualifikasi standar. Sebelum digunakan sebagai subyek
penelitian, hewan coba dilakukan evaluasi klinis dan dikondisikan dalam
lingkungan yang sesuai (selama 14x24 jam) untuk meyakinkan bahwa
Universitas Sumatera Utara
62
hewan tersebut tidak berpenyakit atau tidak berpotensi menularkan
penyakit.
Sebelum mendapatkan perlakuan penelitian, dilakukan skrining dengan
beberapa kriteria, yaitu:
1. Kriteria inklusi: hewan coba berusia 2-3 bulan, jenis kelamin jantan
dan berat badan 150-250 gram.
2. Kriteria eksklusi:
a. Hewan dinyatakan berpenyakit oleh dokter hewan konsultan, baik
penyakit menular atau tidak menular atau cedera fisik atau berpotensi
menularkan penyakit dalam kurun waktu evaluasi klinis di dalam kondisi
lingkungan yang sesuai (selama 14 x 24 jam).
b. Hewan terdeteksi memiliki kelainan bawaan yang dinyatakan oleh dokter
hewan konsultan.
c. Hewan berperilaku agresif, dalam pengamatan sering menyerang
anggota kelompok lain.
Setelah didapatkan sampel yang homogen melalui skrining dengan
kriteria inklusi dan eksklusi di atas, dilakukan pembagian kelompok
sampel yang homogen secara alokasi random sehingga setiap anggota
sampel mempunyai kesempatan sama untuk menempati kelompoknya.
Penelitian berlangsung dengan prosedur pelakuan hewan secara
benar ditinjau dari prinsip 3R (Reduction, Replacement, Refinement) serta
prinsip 5F (Freedom from Hunger and Thirst, Freedom from Discomfort,
Freedom from Pain, Injury or Disease, Freedom to Express Normal
Behaviour, Freedom from Fear and Distress) (FAO, 2011) dan
diberlakukan kriteria Putus Uji apabila subyek penelitian mengalami sakit
atau kematian sehingga tidak bisa memenuhi prosedur penelitian yang
membutuhkan waktu 5 - 10 hari. Selanjutnya tikus diterminasi dan diambil
darah prekordial untuk dilakukan pemeriksaan ELISA yang bertujuan
untuk menilai aktivitas H2O2 serta dilakukan pengambilan jaringan koklea
untuk dibuat sediaan dan pengecatan imunohistokimia untuk menganalisis
ekspresi MDA.
Universitas Sumatera Utara
63
3.5
Definisi Operasional Penelitian
1. Induksi Diabetes: injeksi Streptozotocin dengan dosis 60 mg/kg
berat badan tikus (single dose) secara intraperitoneal, kemudian
kadar gula darah diukur 2 hari pasca injeksi, sampai terjadi
kondisi hiperglikemia (KGD >200 mg/dl).
2. Hiperglikemia adalah keadaan dimana kadar gula darah tikus
mencapai >200 mg/dl yang diukur menggunakan strip pengukur
kadar gula darah merk Gluko DR® Bio Sensor dari allmedicus.
3. Fibroblas: sel yang terdapat pada jaringan dinding lateral koklea.
Sel berinti tunggal dalam bentuk yang panjang.
4. Konsentrasi H2O2 diukur dengan metode ELISA menggunakan
darah prekordial tikus yang telah dilakukan sentrifugasi 3000 rpm
(rounds per minute) selama 10 menit. Serum yang diperoleh dari
proses sentrifugasi pada tiap kelompok dilabel dengan antibodi
spesifik terhadap H2O2. Konsentrasi H2O2 pada tiap sampel
ditentukan dengan cara membandingkan optical density (OD)
tiap sampel terhadap kurva standar. Pemeriksaan aktivitas H2O2
dilakukan sesuai petunjuk pelaksanaan pada package insert
yang terdapat dalam rat hydrogenperoxide ELISA kit (Glory
Science Co., Ltd catalog #:34647). Pembacaan nilai OD diukur
pada panjang gelombang 450 nm pada plate reader ELISA
reader. Hasil penghitungan akhir dinyatakan dalam pg/ml (skala
numerik/angka).
5. Ekspresi MDA diidentifikasi dengan pengecatan imunohistokimia
dan dilakukan penghitungan secara kuantitatif terhadap total
jumlah rata-rata distribusi unit sel fibroblas berinti tunggal dalam
bentuk panjang yang mengekspresikan MDA (memperlihatkan
warna coklat) pada jaringan dinding lateral koklea tiap kelompok
di bawah mikroskop cahaya yang dilengkapi mikrometer okuler
dengan perbesaran 40x oleh 2 orang pemeriksa (peneliti dan
pemeriksa ahli (dokter spesialis Patologi Anatomi)) untuk
Universitas Sumatera Utara
64
kemudian dilakukan penghitungan skor imunoreaktif. Skor
imunoreaktif diperoleh dengan mengalikan skor luas dengan skor
intensitas.
Hasil ukur skor imunoreaktif: 0-9.
Dalam penelitian ini digunakan Malondialdehyde Antibody
NB100-62737 dari Novus Biological (www.novusbio.com).
6. Curcuminoid: zat pigmen kuning yang diekstraksi dari tumbuhan
Curcuma domestica Val. atau Curcuma longa L. Pada penelitian
ini yang digunakan adalah curcuminoid serbuk dengan kadar
(16.62 ± 0.14)% w/w dibandingkan dengan standar, yang diukur
dengan metode thin layer chromatography dan densitometri.
Sediaan yang diberikan berupa curcuminoid serbuk dengan
dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari per ekor tikus karena
berdasarkan literatur dan penelitian terdahulu dosis tersebut
dapat menurunkan konsentrasi H2O2 dan ekspresi MDA.
3.6 Alat dan Bahan Penelitian
3.6.1 Hewan coba yang dikenai perlakuan
Tikus putih jantan Rattus norvegicus galur Wistar yang memenuhi
kriteria inklusi dan eksklusi akan mendapatkan pembagian kelompok
sesuai hasil randomisasi.
3.6.2 Bahan perlakuan
a. Streptozotocin
Streptozotocin disimpan pada suhu 20 0C. Konsentrasi
streptozotocin adalah 22,5 mg/l, disimpan dalam tabung reaksi
yang ditutup dengan aluminium foil (karena sensitif terhadap
cahaya).
b. Curcuminoid
Curcuminoid yang dipakai berasal dari Curcuma longa L. dengan
kadar curcuminoid (16.62 ± 0.14)% w/w dibandingkan dengan
standar, yang diukur dengan metode thin layer chromatography
Universitas Sumatera Utara
65
dan densitometri. Sediaan yang diberikan berupa curcuminoid
serbuk dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari perekor tikus.
c. Buffer natrium sitrat
dibuat dengan melarutkan 1,47 gram
Natrium sitrat dalam 50 ml dH2O.
d. Carboxy
Methyl
Cellulose
(CMC)
dibuat
dengan
mensuspensikan 0.5 gram CMC dalam 100 cc larutan akuades.
e. Eter inhalan sebagai zat anestesi.
3.6.3 Bahan pemeriksaan laboratorium
Alat yang digunakan pada penelitian ini, antara lain: kandang tikus,
gunting bedah, disposible syringe, mikroskop binokuler, gelas obyek dan
cover glass, mikrotom, tabung reaksi, pipet pasteur steril, tabung silikon,
pipet mikro, beker gelas, spuit 1 cc, spuit 3 cc, spuit 5 cc dan lemari es,
glukoDR.
Untuk Hematoxillin Eosin dan Imunohistokimia meliputi H2O2 3%, xylol,
alkohol 100%, PBS, HCL 0.5 M, antibodi primer rat hydrogenperoxide
(H2O2) ELISA kit (Glory Science Co., Ltd catalog #: 34647), antibody
Malondialdehyde NB 100-62737 (Novusbio) dan biotinylated secondary
Ab (anti rabbit), streptavidin berlabel peroksidase, pewarna Meyerhematoxilen, TrisHCl pH 6.8, entelen, akuades steril, parafin lunak, poli-Dlysin, BSA 3%, tripsin 0.025%, substrat DAB.
3.7 Prosedur Penelitian
3.7.1 Tahap persiapan
Untuk menjamin bahwa semua prosedur yang dilakukan pada
penelitian ini laik etik, maka sebelum dilakukan penelitian proposal
diajukan terlebih dahulu pada komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas
Sumatera Utara untuk mendapatkan penilaian dan pengesahan kelaikan
etik.
3.7.2 Prosedur induksi diabetes menggunakan streptozotocin.
a. Tikus dipuasakan selama 4 jam untuk mengosongkan lambung dan
mengurangi risiko aspirasi.
Universitas Sumatera Utara
66
b. Hitung
dosis
induksi
streptozotocin
dengan
kebutuhan
60
mg/kgbb/ekor tikus.
c.
Hitung kebutuhan dapar sitrat yang dibutuhkan demgan konsentrasi
streptozotocin 22,5 mg/ml dalam dapar sitrat.
d. Siapkan tabung dan bungkus dengan aluminium foil pada bagian
luarnya.
e. 15 – 20 menit sebelum induksi, timbang streptozotocin yang
dibutuhkan kemudian larutkan ke dalam dapar sitrat dengan volume
yang telah ditentukan.
f.
Masukan larutan streptozotocin yang diperoleh kedalam tabung
berbungkus aluminium foil.
g. 30 detik – 1 menit sebelum induksi pindahkan larutan streptozotocin
ke dalam spuit 1 ml.
h. Injeksikan larutan streptozotocin melalui intraperitoneal tikus sesuai
dengan kebutuhan dosis per ekor. Induksi dilakukan hanya satu kali.
i.
Berikan larutan sukrosa 10% atau dekstrosa 10% sepanjang malam
pertama setelah induksi untuk menghindari sudden hypoglycemic post
injection.
j.
Setiap pagi tikus diperiksa kadar glukosa darah puasa (tikus
dipuasakan dengan cara tidak diberi pakan dan kandang dikosongkan
dari sekam selama 6 jam). Hiperglikemia yang bermakna akan dijumpai
2 hari setelah induksi.
3.7.3 Prosedur pemberian curcuminoid
Curcuminoid (kadar curcuminoid 80%) dosis 200 mg dan 400 mg
disuspensikan dalam carboxymethylcellulose (CMC) 0.5% (CMC dibuat
dengan mensuspensikan 0.5 gram CMC dalam 100 cc larutan akuades).
Setelah disuspensikan, diberikan langsung ke lambung tikus dengan
menggunakan nasogastric tube (NGT).
Universitas Sumatera Utara
67
3.7.4 Perlakuan pada tikus
Setelah tikus putih beradaptasi terhadap lingkungan kandang di
laboratorium selama 2 minggu, selanjutnya perlakuan diberikan sesuai
dengan kelompok yang direncanakan.
3.7.5 Prosedur pengambilan jaringan koklea tikus
Tikus dikorbankan dengan inhalasi eter, dilakukan nekropsi jaringan
tulang temporal kepala tikus. Sampel jaringan diambil, difiksasi dengan
larutan buffer formalin 10% dan dilakukan dekalsifikasi dengan EDTA
selama 4 minggu. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan laboratorium.
3.7.6 Pemeriksaan laboratorium
a.
Fiksasi jaringan dengan pembuatan paraffin block jaringan.
Jaringan tulang didekalsifikasi dengan menggunakan EDTA selama
4 minggu. Jaringan selanjutnya dicuci dengan PBS 3-5 kali untuk
membersihkannya dari kontaminan. Kemudian jaringan difiksasi
pada larutan formalin 10%. Setelah itu dilakukan dehidrasi dengan
alkohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolut)
masing-masing selama 60 menit. Dilakukan clearing menggunakan
xylol sebanyak 2 kali masing-masing 60 menit. Kemudian dilakukan
impregnasi dengan parafin lunak selama 60 menit pada suhu 480C.
Selanjutnya dilakukan blocking preparat dalam parafin keras pada
cetakan dan didiamkan selama sehari.
b.
Proses deparafinisasi
Dilakukan pemotongan blok parafin setebal 4 µm dengan rotary
microtome. Jaringan yang sudah dipotong dimasukkan dalam air
hangat, lalu diletakkan pada kaca.
c.
Proses pewarnaan Hematoxilin Eosin
Dimasukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak 2 kali masingmasing selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan
alkohol berseri (absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masingmasing selama 5 menit, kemudian bilas dalam dH2O selama 5
Universitas Sumatera Utara
68
menit. Warnai sediaan dengan Hematoxilin selama 10 menit,
setelah itu direndam dalam tap water selama 10 menit lalu dibilas
dengan dH2O. Sediaan selanjutnya diwarnai kembali dengan
larutan Eosin selama 3 menit lalu didehidrasi dengan alkohol
berseri 30% dan 50% masing-masing selama 5 menit, cuci dengan
dH2O selama 5 menit dan dikering-anginkan. Inkubasi kembali
dengan xylol sebanyak 2 kali masing-masing selama 2 menit
kemudian dilakukan mounting dengan entelan dan tutup dengan
cover glass.
d.
Pemeriksaan konsentrasi H2O2 dengan teknik ELISA
Darah prekordial tikus diambil dan dilakukan sentrifugasi 3.000 rpm
(revolutions per minute) selama 10 menit sampai didapatkan serum
sampel. Supernatan yang diperoleh dari proses sentrifugasi
diperiksa aktivitas H2O2-nya sesuai petunjuk pelaksanaan pada
package insert yang terdapat dalam rat hydrogenperoxide (H2O2)
ELISA
kit
(Glory
Science
Co.,
Ltd
cat#34647).
Rat
hydrogenperoxide ELISA kit dirancang untuk mengukur H2O2
secara kuantitatif dalam berbagai sampel.
e.
Pemeriksaan ekspresi MDA dengan teknik imunohistokimia.
Masukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak 2 kali masing-masing
selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan alkohol
berseri (absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masing-masing
selama 5 menit, kemudian dibilas dalam dH2O selama 5 menit.
Masukkan kembali ke dalam H2O2 3% selama 20 menit, lalu cuci
menggunakan PBS pH 7.4 sebanyak 3 kali selama 5 menit.
Blocking protein non-spesifik dilakukan dengan menggunakan 5%
FBS yang mengandung 0.25% Triton X-100. lalu cuci kembali
dengan PBS pH 7.4 sebanyak 3 kali, selama 5 menit. Inkubasi
dengan menggunakan antibodi primer antibody Malondialdehyde
NB 100-62737 (Novusbio) selama 60 menit lalu cuci dengan PBS
Universitas Sumatera Utara
69
pH 7.4 sebanyak 3 kali selama 5 menit. Selanjutnya, sediaan
direaksikan dengan antibodi sekunder (biotinylated secondary
antibody) selama 60 menit, lalu cuci kembali dengan PBS pH 7.4
sebanyak 3 kali selama 5 menit. Inkubasi dengan dengan
steptavidin-HRP selama 60 menit, lalu cuci menggunakan PBS pH
7.4 sebanyak 3 kali selama 5 menit. Tetesi dengan DAB dan
inkubasi selama 30 menit, lalu cuci menggunakan dH2O selama 5
menit. Masukkan sediaan ke dalam larutan Mayer Hematoxylin
sebagai counterstaining dan diinkubasi selama 10 menit, lalu cuci
menggunakan tap water. Selanjutnya, sediaan dibilas dengan dH2O
dan dikering-anginkan. Kemudian dilakukan proses mounting
menggunakan entelan lalu ditutup dengan cover glass.
3.7.7 Penghitungan sel pada pemeriksaan imunohistokimia
Menggunakan mikroskop Olympus XC 10 dengan pembesaran 40x
Penghitungan jumlah fibroblas terekspresi dilakukan oleh peneliti dan
pemeriksa ahli.
1. Penghitungan dilakukan terhadap semua slide yang ada dengan
rincian:
a. Jumlah hewan coba yang termasuk kriteria masukan 40 sampel
b. Setiap hewan coba diambil sampel jaringan, difiksasi dengan 10%
formalin, dilakukan dekalsifikasi dengan EDTA selama 4 minggu.
c. Masing-masing sampel jaringan dibuat sediaan irisan setebal 4 µm,
kemudian diwarnai dengan Hematoxilin Eosin (HE).
2. Semua slide yang sudah berkode ditutup nomor kodenya dan diberi
nomor baru secara acak sehingga pemeriksa dan peneliti yang ikut
memeriksa tidak mengetahui slide yang diperiksa milik sampel yang
mana (double blind).
3. Pemeriksa terdiri dari 2 orang, masing-masing yaitu peneliti dan
pemeriksa ahli (dokter spesialis patologi anatomi).
Universitas Sumatera Utara
70
4. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan secara terpisah diantara
ke 2 pemeriksa, disesuaikan dengan kemampuan/kesediaan waktu
pemeriksa.
5. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan terhadap masingmasing slide pada bidang pandang di dinding lateral koklea yaitu
daerah yang ditandai dengan adanya fibroblas dengan pembesaran
40x.
6. Hasil penghitungan sel sesuai dengan slide yang diperiksa ditulis di
lembar kerja pada kotak yang sesuai.
7. Analisis statistik dilakukan bila semua hasil sudah dikembalikan ke
nomor kode.
Universitas Sumatera Utara
71
3.8 Alur Penelitian
Populasi Hewan
Randomisasi
Kelompok 1 / Kontrol (Injeksi
Buffer Na-Sitrat (1x),
dilanjutkan pemberian CMC
(setiap hari)
Kelompok Perlakuan
Kelompok 2 /
Perlakuan 1
Kelompok 3 /
Perlakuan 2
Kelompok 4 /
Perlakuan 3
Kelompok 5 /
Perlakuan 4
Kelompok 6 /
Perlakuan 5
Injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single dose
Injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single dose
Injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single dose
Injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single dose
Injeksi STZ 60
mg/kgbb/ekor
single dose
Curcuminoid
200
mg/kgbb/hari
selama 5 hari
Curcuminoid
400
mg/kgbb/hari
selama 5 hari
Curcuminoid
200
mg/kgbb/hari
selama 10 hari
Curcuminoid
400
mg/kgbb/hari
selama 10 hari
Terminasi hari ke 5
Terminasi hari ke 10
Pemeriksaan
ELISA untuk mengukur
konsentrasi H2O2 serum dan
pemeriksaan imunohistokimia
fibroblas koklea untuk melihat
ekspresi MDA
Universitas Sumatera Utara
72
3.9
Analisis Statistik
Data penelitian yang diperoleh akan diolah dan dianalisis secara
univariat, bivariat dan multivariat dengan menggunakan SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences). Analisis univariat dilakukan untuk
memperoleh nilai rata-rata hitung dan standar deviasi untuk tiap kelompok
penelitian sehingga dapat diketahui deskripsi masing-masing variabel
dalam penelitian. Analisis bivariat dilakukan untuk menguji hubungan
antara variabel independen terhadap variabel dependen, menganalisis
kesetaraan antara masing-masing kelompok dan mengetahui perbedaan
(penurunan atau peningkatan) yang terjadi pada masing-masing kelompok
setelah
diadakan
intervensi.
Untuk
menganalisis
perbedaan
atau
peningkatan pada masing-masing kelompok penelitian ini digunakan uji t.
Normalitas data dinilai dengan uji Shapiro-Wilk. Apabila data penelitian
yang diperoleh tidak terdistribusi normal, akan dilakukan pengujian
dengan uji Mann-Whitney. Analisis multivariat dengan uji ANOVA dan uji
Post-Hoc Bonferroni dilakukan untuk mengetahui kelompok perlakuan
mana
yang memiliki perbedaan
yang
bermakna dari perubahan
konsentrasi H2O2 serta ekspresi MDA setelah mengalami hiperglikemia
(variabel dependen) dan curcuminoid (variabel independen). Perlakuan
diuji pada taraf nyata 5%. Data penelitian juga diolah dengan uji korelasi
Pearson bila terdistribusi normal atau uji korelasi Spearman bila tidak
terdistribusi normal, untuk melihat korelasi antara konsentrasi H2O2 serum
dengan ekspresi MDA fibroblas koklea, dengan taraf nyata 1%.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL PENELITIAN
4.1 Profil Konsentrasi H2O2 Serum dan Ekspresi MDA Fibroblas
Koklea Tikus Model Diabetes Mellitus
Hasil penelitian yang didapatkan berdasarkan pemeriksaan enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) untuk memeriksa konsentrasi H2O2
dan imunohistokimia untuk melihat ekspresi MDA pada setiap kelompok,
yaitu kelompok kontrol (kelompok 1) dan kelompok model DM (kelompok
2,3,4,5 dan 6). Gambaran konsentrasi H2O2 dan ekspresi MDA keenam
kelompok penelitian ditampilkan pada tabel 4.1 dan gambar 4.1 dibawah
ini:
Tabel 4.1 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Konsentrasi H2O2 Serum dan
Ekspresi MDA Fibroblas Koklea.
Kelompok
(n=6)
Konsentrasi H2O2
Nilai Rerata
Standar
Ekspresi MDA
Nilai Rerata
Deviasi
Standar
Deviasi
1
2.7250
0.20616
2.00
1.000
2
4.1250
0.52520
7.80
1.643
3
3.5675
0.32999
5.40
2.510
4
3.1500
0.38730
4.00
1.871
5
3.6000
0.43205
1.60
0.548
6
2.6750
0.28723
1.40
0.548
73
Universitas Sumatera Utara
74
Gambar 4.1 Nilai Rerata Konsentrasi H2O2 Serum dan Ekspresi MDA
Fibroblas Koklea Tiap Kelompok Perlakuan
Keterangan:
A. Konsentrasi H2O2
Terjadi peningkatan konsentrasi H2O2 pada kelompok 2 dibanding
kelompok lainnya. Penurunan konsentrasi H2O2 terjadi pada kelompok
yang mendapatkan curcuminoid, terutama dosis besar yaitu kelompok 4
dan 6, dibandingkan kelompok 2.
B. Ekspresi MDA
Terjadi peningkatan ekspresi MDA pada kelompok 2 dibanding
kelompok lainnya. Penurunan ekspresi MDA terjadi pada kelompok
yang mendapatkan curcuminoid, terutama dengan durasi pemberian
yang lebih lama yaitu kelompok 5 dan 6, dibandingkan kelompok 2.
Gambar 4.1 tersebut diatas secara umum menunjukkan terjadinya
peningkatan konsentrasi H2O2 serum dan ekspresi MDA fibroblas koklea
tikus model DM yang tidak mendapatkan curcuminoid. Pemberian
curcuminoid menurunkan konsentrasi H2O2 dan ekspresi MDA tikus model
DM. Pada kelompok 4 dan 6 didapatkan perbedaan konsentrasi H2O2
Universitas Sumatera Utara
75
yang lebih rendah, yang menunjukkan bahwa dosis curcuminoid yang
lebih tinggi (400 mg/kgbb/hari/ekor) lebih baik dibanding dosis yang lebih
rendah (200 mg/kgbb/hari/ekor) dalam menurunkan konsentrasi H2O2
pada serum tikus yang diinduksi DM. Pada kelompok 5 dan 6 didapatkan
ekspresi MDA yang lebih rendah, yang menunjukkan bahwa pemberian
curcuminoid dengan durasi yang lebih lama (10 hari) lebih baik
dibandingkan dengan durasi pemberian yang lebih singkat (5 hari).
Universitas Sumatera Utara
76
4.2 Hasil Uji Curcuminoid dalam Menurunkan Konsentrasi H2O2
pada Serum Tikus Model Diabetes Melitus
Data hasil penelitian yang didapatkan berdasarkan pemeriksaan ELISA
selanjutnya diolah dan dianalisis secara statistik.
Tabel 4.2 Hasil Uji ANOVA terhadap Konsentrasi H2O2 pada Setiap
Kelompok
Kelompok
Kelompok 1
Kelompok 2
Kelompok 3
Kelompok 4
Kelompok 5
Perbedaan rerata ± Standar error
Nilai p
Kelompok 2
1.4000 ± 0.265
.001*
Kelompok 3
.8425 ± 0.265
.079
Kelompok 4
.4250 ± 0.265
1.000
Kelompok 5
.8750 ± 0.265
.060
Kelompok 6
.0500 ± 0.265
1.000
Kelompok 3
.5575 ± 0.265
.753
Kelompok 4
.9750 ± 0.265
.026*
Kelompok 5
.5250 ± 0.265
.954
Kelompok 6
1.4500 ± 0.265
.001*
Kelompok 4
.4175 ± 0.265
1.000
Kelompok 5
.0325 ± 0.265
1.000
Kelompok 6
.8925 ± 0.265
.052
Kelompok 5
.4500 ± 0.265
1.000
Kelompok 6
.4750 ± 0.265
1.000
Kelompok 6
.9520 ± 0.265
.040*
*Bermakna secara statistik (p