LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA MOLEKULER ISOL
LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA MOLEKULER
ISOLASI PLASMID MENGGUNAKAN METODE SOL
PARNI ASTUTI
P051160281
PROGRAM MULTIDISPLIN BIOTEKNOLOGI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus
yang disebut sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain DNA
kromosomal, bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan
DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal.
Bentuk plasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran dan berat sekitar 1-300
kb (Snustad dan Simmons, 2003). Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki
bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid. Plasmid bisa saja
tidak terdapat pada bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi
ketahanan hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan sifat istimewa yang
dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik. Beberapa
karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat bereplikasi secara
terpisah dari DNA kromosomal, dapat ditransfer ke bakteri lain, dan memiliki ORI
(Origin of replication) (Hayati dan Fajri, 2010).
Isolasi merupakan proses yang sangat penting dalam genetika molekuler dan
merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika. Dalam
genetika molekuler, isolasi umumnya dilakukan pada plasmid. Plasmid merupakan
salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui
teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan
DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya (Suharsono, 2006).
Keberhasilan tahapan isolasi bergantung pada sumber dan konsentrasi bahan,
stabilitas, dan kadar kemurnian produk akhir. Isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan
kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan pemanenan atau harvesting, tahap lisis dan tahap
pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu proses reproduksi bakteri sehingga pada
saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Perusakan (lisis)
dinding sel bakteri dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan
tinggi, beku leleh maupun dengan cara kimiawi menggunakan larutan lisis. Plasmid
yang diperoleh dimurnikan dari berbagai kontaminan dengan penambahan fenol
(Brown, 2003).
Prinsip dasar elektroforesis adalah pergerakan molekul bermuatan atau ion
melalui medium semisolid di bawah pengaruh suatu medan listrik. Elektroforesis
dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker
yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi sebagai pembanding
sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA sampel. Medium yang sering
digunakan dalam elektroforesis DNA adalah gel agarosa (Stansfield et al. 2003). Jika
molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui gel agarose, kemudian
dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Sehingga
elektroforesis dapat memisahkan DNA berdasarkan ukuran panjangnya (Yuwono,
2005). Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid tersebut dari yang paling cepat adalah
supercoiled, supercoiled denaturated, relaxed circular, linear, dan nicked open
circular. Bentuk plasmid yang semakin kecil atau ramping akan lebih mudah
bergerak melalui pori gel agarose sehingga akan mencapai bagian bawah terlebih
dahulu. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika,
plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Alasan utama pengunaan
plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga
dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang
besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu (Lodish et. al. 2004).
Tujuan
Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga
semua organel sel dapat keluar dan didapatkan DNA ekstrakromosomal (plasmid).
Secara umum, isolasi plasmid bertujuan mengekstrak plasmid dan memisahkannya
dari berbagai komponen selular bakteri lainnya, seperti protein, lemak, RNA, dan
DNA kromosomal.
METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam isolasi metode sol adalah sentrifuge, vortex, tube,
mikro tube, pipet tip, mikropipet, microwave, piranti elektroforesis, vacuum dryer,
stirrer, dan freezer. Bahan yang digunakan adalah kultur Escherichia coli 1,5 mL,100
µL sol I (SDS dan NaOH), 200 µL sol II, 150 µL sol III, 1 x volume supernatan
larutan PCI (asam organik Phenol Chloroform Isoamilalkohol), EtOH 100%, EtOH
70%, 20 µL – 50 µL ddH2O, dan enzim RNAse. Pada elektroforesis gel digunakan
agarose (komposisi 0,4 gr agarose dan TAE 40 mL), loading dye, ethidium bromide,
dan marker lamda 1 µL dan 3 µL.
Metode Pelaksanaan
Isolasi Plasmid
Sebanyak 1.5 mL kultur Escherichia coli dipipet ke dalam tube dan
disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit pada temperatur ruang.
Supernatan yang diperoleh dipisahkan dengan pelet. Pelet yang terdiri dari endapan
bakteri kemudian disuspensikan dengan sol I, diresuspensi dan ditambahkan 200 µL
sol II dan dibolak balik kurang lebih 10x, dibiarkan selama 5 menit, ditambahkan 150
µL sol III (neutralization sol), di bolak balik kurang lebih 10 kali, dibiarkan 10 menit
di es. Sampel disentifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dengan
suhu 4ºC. Supernatan yang terbentuk dimasukkan ke dalam tube baru dan
ditambahkan PCI sebanyak 1 kali volume supernatan. Tube disentrifugasi kembali
dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit, lalu ditambahkan EtOH 100%
sebanyak 2 kali volume dan dibolak balik dan difreezer selama 5 menit. Supernatan
kembali disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4ºC,
dikeringkan dengan vacuum dryer selama 30 menit, ditambahkan 20 µL sampai 50
µL ddH2O. Langkah selanjutnya ditambahkan enzim RNAse, di inkubasi pada suhu
37ºC selama 10 menit dan disimpan dalam freezer overnight serta dilakukan uji
kualitas DNA.
Uji Kualitas DNA
Gel agarosa 1 % dibuat dengan cara melarutkan 0,4 gr serbuk agarosa dengan
40 mL bufer TAE 1x. Campuran dipanaskan dalam microwave agar larut sempurna.
Campuran kemudian dikocok perlahan dan dituang ke dalam cetakan gel yang telah
disiapkan sesuai dengan jumlah sampel. Gel dibiarkan memadat kurang lebih 30
menit. Gel yang sudah memadat diletakkan ke dalam chamber elektroforesis dan
direndam dalam bufer TAE 1x hingga setinggi 1-2 mm di atas gel. Larutan stok
sampel DNA yang sudah diencerkan diambil sebanyak 5 μL dan dicampurkan dengan
1 μL loading dye. Campuran sampel dan loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel
dan perangkat disambungkan pada power supply. Elektroforesis dilakukan selama 30
menit. Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan ethidium bromida. Hasil
elektroforesis divisualisasikan dengan gel documentation untuk difoto dan
dibandingkan fragmen DNA yang terlihat.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Plasmid Escherichia coli
Isolasi plasmid adalah salah satu aktivitas yang rutin dilakukan di
laboratorium-laboratorium biologi molekular yang melakukan aktivitas pengklonan
gen. Salah satu metode yang banyak digunakan dalam isolasi plasmid saat ini adalah
metode alkaline lysis. Metode ini pertama kali dipublikasikan oleh Birnboim dan
Dolly tahun 1979 (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) (Davis, 2010). Metode isolasi
alkaline lysis bersandar pada sifat DNA plasmid yang berukuran kecil dan berbentuk
sirkular. Metode alkaline lysis secara garis besar terbagi ke dalam enam tahap, yakni
tahap kultivasi bakteri dan pemanenan sel, tahap resuspensi sel, tahap lisis sel dan
denaturasi DNA, tahap netralisasi, tahap purifikasi, dan tahap pemekatan DNA.
Prosedur isolasi diawali dengan kultivasi bakteri yang mengandung plasmid
yang akan diisolasi. Tahap kedua adalah resuspensi sel dalam larutan yang
mengandung Tris-EDTA dan glukosa. Larutan ini umumnya dikenal sebagai larutan
atau solution I. EDTA (ethilendiamin tetraasetat) dalam larutan I berfungsi
mengkhelat (mengikat) kation-kation divalen seperti Mg2+ dan Ca2+. Kedua ion ini
berfungsi sebagai kofaktor yang esensial bagi aktivitas Dnase dalam mencacah
molekul DNA. Selain itu, ion Mg dan Ca diketahui berperan penting dalam
memelihara integritas dan kestabilan membran plasma bakteri sehingga kerja EDTA
juga berfungsi membantu destabilisasi membran. Glukosa berfungsi menjaga tekanan
osmotik sel agar tidak pecah. Keutuhan sel pada tahap ini penting untuk tetap
terpelihara, Dnase yang ada di dalam sel tidak bertemu dengan DNA plasmid yang
akan diisolasi. Menurut (Davis, 2012), Penelitian Qiagen menyimpulkan tanpa
glukosa pun, metode alkalin lisis dapat bekerja dengan baik dalam mengisolasi
plasmid.
Tahap ketiga adalah lisis sel dan denaturasi DNA dengan pemberian larutan II
yang terdiri dari SDS dan NaOH. SDS (sodium dodesil sulfat) merupakan garam
deterjen anionik, yang ketika dilarutkan dalam air akan berdisosiasi menjadi ion Na +
dan dan dodesil sulfat. Dodesil sulfat adalah molekul deterjen berantai hidrofobik
panjang dengan gugus sulfat bermuatan negatif pada salah satu ujungnya. Dodesil
sulfat akan berikatan dengan bagian interior lipid bilayer pada membran sehingga
mengakibatkan lisis sel. Komponen selular bakteri termasuk DNA dan RNA akan
keluar dan larut dalam. Ion deterjen dodesil sulfat juga mendenaturasi protein yang
ada dalam lisat, dengan jalan memutuskan ikatan-katan non kovalen (terutama ikatan
hidrogen) pada protein, sehingga kembali ke struktur primernya, sebagai rantai linier
polipeptida. Hal ini membuat protein-protein enzim kehilangan aktivitas
enzimatiknya , termasuk enzim Dnase yang dikhawatirkan merusak DNA plasmid.
Pada tahap ini larutan akan berisi asam nukleat (DNA dan RNA) dan debris sel yang
terdapat dalam kompleks dodesil sulfat-lipid-protein. Sementara itu, NaOH yang
bersifat basa membuat seluruh molekul DNA berutas ganda baik DNA kromosomal
maupun plasmid mengalami denaturasi menjadi utas-utas tunggal. Itulah mengapa
metode ini disebut sebagai metode lisis basa (alkaline lysis). Pada tahapan ini, DNA
kromosomal terpisah sempurna menjadi utas-utas tunggal terpisah; sedangkan utas
tunggal plasmid yang berbentuk lingkaran tetap terhubung, seperti dua cincin yang
saling bertautan. Karakter ukuran dan struktur kedua jenis DNA inilah yang menjadi
dasar pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosomal.
Tahap keempat adalah adalah penambahan sol III (netralisasi). Sol III adalah
sodium asetat pH ~5,5. Ion K+ bebas yang berasal dari potasium asetat pada larutan
III akan menetralkan muatan negatif dari kompleks kompleks dodesil sulfat-lipidprotein terdenaturasi, membentuk potasium dodesil sulfat (KDS) yang tidak larut dan
terpresipitasi bersama lipid membran dan protein yang terdenaturasi. Laju presipitasi
KDS dapat ditingkatkan dengan inkubasi pada suhu es (4oC).
Sol III adalah sodium asetat yang diatur pHnya ke 5,5 menggunakan asam
asetat. Asam asetat berfungsi menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh ion
hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya. Ketika pH larutan
kembali netral, ikatan-ikatan hidrogen antar basa utas tunggal DNA terbentuk
kembali, sehingga molekul tersebut dapat berenaturasi menjadi DNA berutas ganda.
Proses renaturasi inilah yang menjadi tahap seleksi bagi plasmid. Utas-utas tunggal
sirkular DNA plasmid yang yang berukuran kecil dan tetap saling bertautan dapat
berenaturasi sempurna membentuk utas ganda yang tetap berada dalam larutan;
sedangkan DNA kromosomal yang berukuran jauh lebih besar dari plasmid tidak
dapat berenaturasi sempurna, membentuk struktur kusut tak beraturan yang
terperangkap dan ikut terpresipitasi bersama kompleks KDS-lipid-protein. Oleh
karena itu, pencampuran pada tahap lisis sel harus dilakukan dengan perlahan.
Pengocokan yang kuat (misalnya vortex) akan mengakibatkan molekul DNA
kromosom akan terpotong menjadi fragmen-fragmen yang kecil yang dapat ikut
berenaturasi seperti halnya DNA plasmid, dan mengkontaminasi DNA plasmid.
Tahap kelima adalah purifikasi dengan penambahan PCI (Phenol Chloroform
Isoamilalkohol). Purifikasi bertujuan untuk membersihkan isolat dari kontaminasi
bahan selain DNA. Pada larutan suspensi sebelum ekstraksi terdapat senyawasenyawa DNA plasmid, RNA, protein, dan komponen lipid. Penambahan PCI
berfungsi untuk mengekstraksi larutan suspensi untuk mempurifikasi kontaminan
protein yang tersisa. Dengan penambahan PCI maka terbenntuk 3 fase yaitu yang
pertama fase aquos adalah fase air yang paling atas, pada fase ini masih ada plasmid
tetapi sudah terpurifikasi. Fase putih yang berada di tengah yaitu berisi protein yang
terdenaturasi, kemudian fase PCI yang berada paling bawah.
Jumlah fenol-kloroform yang ditambahkan umumnya satu kali volume larutan
yang akan dipurifikasi. Umumnya fenol-kloroform disiapkan dalam bentuk campuran
fenol-kloroform-isoamil alkohol dengan perbandingan volume 25:24:1. Campuran
fenol-kloroform adalah campuran yang homogen. Fenol-kloroform dan air tidak
dapat bersatu sehingga akan terbentuk dua fase yakni fase air (fase aqueous) dan fase
fenol-kloroform. Fenol-kloroform lebih ‘berat’ daripada air sehingga fasenya berada
di bawah fase air. Kedua fase kemudian dicampur dengan cara vorteks. Pencampuran
akan membuat fenol merangsek ke dalam lapisan air dan membentuk emulsi droplet.
Protein akan terdenaturasi dan terperangkap dalam fase fenol-kloroform, sedangkan
DNA tetap berada di air. Kedua fase kemudian dapat dipisahkan dengan baik dengan
sentrifugasi. Fase atas yang berisi DNA akan dapat dengan mudah diambil dengan
pemipetan, dan fase fenol-kloroform dapat dibuang.
Tahap keenam adalah pemekatan DNA yang bertujuan untuk memisahkan
DNA dari larutan sehingga diperoleh konsentrasi yang lebih tinggi umumnya
menggunakan presipitasi etanol. Fase aquos diambil kemudian dilakukan presipitasi
alkohol dengan menambahkan etanol absolut untuk memisahkan DNA dari larutan
sehingga di dapat DNA dalam bentuk solid (pelet). Pelet tersebut kemudian
dimurnikan dengan penambahan etanol 70% dan disentrifugasi. Kemudian pelet
dikeringkan dan setelah itu dilarutkan kembali ke dalam air (ddH 2O) dan
ditambahkan RNAse untuk menghilangkan sisa-sisa RNA dan mendapatkan DNA
yang murni dan disimpan dalam freezer overnight.
Elektroforesis Gel
Proses elektroforesis adalah analisis menggunakan gel agarose untuk menandakan
kualitas DNA yang telah di isolasi. DNA penanda yang digunakan adalah DNA
lambda 1 ng dan 3 ng. Pada elektroforesis digunakan loading dye yang berfungsi
untuk pemberat DNA dan perendaman pada Ethidium Bromida bertujuan untuk
memberi warna pada DNA. Elektroforesis dilakukan sampai penanda menjauhi
sumuran. Untuk analisis kualitatif, jarak migrasi yang ditempuh tidak perlu terlalu
jauh dan untuk menganalisis bentuk DNA. Berikut adalah foto dari hasil
elektroforesis yang telah dilakukan.
Gambar 1. Elektroforegram DNA hasil isolasi plasmid Escerichia coli (kiri-kanan:
marker λ 1 ng, marker λ 3 ng, sampel kelompok 1 sampai 8).
Gambar diatas menunjukkan hasil running dari plasmid-plasmid yang telah di
isolasi. Terlihat pada gambar di atas plasmid yang berhasil migrasi hanya pada sumur
ke 3, 4, 7, dan 10. Hal ini membuktikan jika plasmid berhasil di isolasi dikarenakan
terdapat pergerakan pita. Namun demikian terdapat smear pada pita tersebut yang
menunjukkan bahwa DNA yang diperoleh belum murni atau masih terdapat zat-zat
lain yang ikut tercampur. Smear terbentuk akibat degradasi DNA menjadi potonganpotongan pendek. Hal ini dapat terjadi karena perlakuan DNA selama isolasi. Smear
juga dapat disebabkan oleh volume DNA yang terlalu banyak saat elektroforesis atau
penggunaan tegangan yang terlalu besar (Ausubel, 1990). Fragmen DNA yang tipis
pada gel agarosa dapat disebabkan oleh beberapa hal seperti rendahnya konsentrasi
DNA.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan diperoleh plasmid pada isolasi plasmid dari
Escherichia coli yang dibuktikan dengan adanya pita-pita DNA pada visualisasi
elektroforesis dan ada beberapa sampel yang tidak didapatkan plasmid yaitu 3, 4, 6,
dan 7.
DAFTAR PUSTAKA
Ausubel FM. 1990. Current Protocols in Molecular Biology. Kanada (CA): John
Willey & Sons.
Brown TA. 2003. Pengantar Kloning Gen. Muhammad SA, penerjemah. Terjemahan
dari: Gene Cloning an Introduction.Yogyakarta (ID): Yayasan Essentia
Medika.
Davis, M. 2010. [Internet]. Isolasi DNA plasmid metode alkaline lysis prinsip dasar
dan tips _ muchdar davis's blog.htm. [Diunduh tanggal 10 November 2016].
Hayati dan Fajri. 2010. [Internet]. http://ekor07.student.ipb.ac.id/2010/06/20/isolasiplasmid-elekroforesis-kuantifikasi-dna/. [Diunduh 9 November 2016].
Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B, James D. 2000. Molecular Cell
Biology. New York: Wh. Freeman Company.
Snustad DP & MJ Simmons. 2003. Principles of Genetic. Hoboken (US): Wiley &
Sons Inc.
Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ. 2003. Theory and Problems of Molecular and
Cell Biology. New York: McGraw-Hill Companies.
Suharsono WU. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Bogor
(ID): Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi IPB.
Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.
ISOLASI PLASMID MENGGUNAKAN METODE SOL
PARNI ASTUTI
P051160281
PROGRAM MULTIDISPLIN BIOTEKNOLOGI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus
yang disebut sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain DNA
kromosomal, bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan
DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal.
Bentuk plasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran dan berat sekitar 1-300
kb (Snustad dan Simmons, 2003). Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki
bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid. Plasmid bisa saja
tidak terdapat pada bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi
ketahanan hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan sifat istimewa yang
dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik. Beberapa
karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat bereplikasi secara
terpisah dari DNA kromosomal, dapat ditransfer ke bakteri lain, dan memiliki ORI
(Origin of replication) (Hayati dan Fajri, 2010).
Isolasi merupakan proses yang sangat penting dalam genetika molekuler dan
merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika. Dalam
genetika molekuler, isolasi umumnya dilakukan pada plasmid. Plasmid merupakan
salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui
teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan
DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya (Suharsono, 2006).
Keberhasilan tahapan isolasi bergantung pada sumber dan konsentrasi bahan,
stabilitas, dan kadar kemurnian produk akhir. Isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan
kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan pemanenan atau harvesting, tahap lisis dan tahap
pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu proses reproduksi bakteri sehingga pada
saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Perusakan (lisis)
dinding sel bakteri dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan
tinggi, beku leleh maupun dengan cara kimiawi menggunakan larutan lisis. Plasmid
yang diperoleh dimurnikan dari berbagai kontaminan dengan penambahan fenol
(Brown, 2003).
Prinsip dasar elektroforesis adalah pergerakan molekul bermuatan atau ion
melalui medium semisolid di bawah pengaruh suatu medan listrik. Elektroforesis
dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker
yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi sebagai pembanding
sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA sampel. Medium yang sering
digunakan dalam elektroforesis DNA adalah gel agarosa (Stansfield et al. 2003). Jika
molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui gel agarose, kemudian
dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Sehingga
elektroforesis dapat memisahkan DNA berdasarkan ukuran panjangnya (Yuwono,
2005). Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid tersebut dari yang paling cepat adalah
supercoiled, supercoiled denaturated, relaxed circular, linear, dan nicked open
circular. Bentuk plasmid yang semakin kecil atau ramping akan lebih mudah
bergerak melalui pori gel agarose sehingga akan mencapai bagian bawah terlebih
dahulu. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika,
plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Alasan utama pengunaan
plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga
dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang
besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu (Lodish et. al. 2004).
Tujuan
Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga
semua organel sel dapat keluar dan didapatkan DNA ekstrakromosomal (plasmid).
Secara umum, isolasi plasmid bertujuan mengekstrak plasmid dan memisahkannya
dari berbagai komponen selular bakteri lainnya, seperti protein, lemak, RNA, dan
DNA kromosomal.
METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam isolasi metode sol adalah sentrifuge, vortex, tube,
mikro tube, pipet tip, mikropipet, microwave, piranti elektroforesis, vacuum dryer,
stirrer, dan freezer. Bahan yang digunakan adalah kultur Escherichia coli 1,5 mL,100
µL sol I (SDS dan NaOH), 200 µL sol II, 150 µL sol III, 1 x volume supernatan
larutan PCI (asam organik Phenol Chloroform Isoamilalkohol), EtOH 100%, EtOH
70%, 20 µL – 50 µL ddH2O, dan enzim RNAse. Pada elektroforesis gel digunakan
agarose (komposisi 0,4 gr agarose dan TAE 40 mL), loading dye, ethidium bromide,
dan marker lamda 1 µL dan 3 µL.
Metode Pelaksanaan
Isolasi Plasmid
Sebanyak 1.5 mL kultur Escherichia coli dipipet ke dalam tube dan
disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit pada temperatur ruang.
Supernatan yang diperoleh dipisahkan dengan pelet. Pelet yang terdiri dari endapan
bakteri kemudian disuspensikan dengan sol I, diresuspensi dan ditambahkan 200 µL
sol II dan dibolak balik kurang lebih 10x, dibiarkan selama 5 menit, ditambahkan 150
µL sol III (neutralization sol), di bolak balik kurang lebih 10 kali, dibiarkan 10 menit
di es. Sampel disentifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dengan
suhu 4ºC. Supernatan yang terbentuk dimasukkan ke dalam tube baru dan
ditambahkan PCI sebanyak 1 kali volume supernatan. Tube disentrifugasi kembali
dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit, lalu ditambahkan EtOH 100%
sebanyak 2 kali volume dan dibolak balik dan difreezer selama 5 menit. Supernatan
kembali disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4ºC,
dikeringkan dengan vacuum dryer selama 30 menit, ditambahkan 20 µL sampai 50
µL ddH2O. Langkah selanjutnya ditambahkan enzim RNAse, di inkubasi pada suhu
37ºC selama 10 menit dan disimpan dalam freezer overnight serta dilakukan uji
kualitas DNA.
Uji Kualitas DNA
Gel agarosa 1 % dibuat dengan cara melarutkan 0,4 gr serbuk agarosa dengan
40 mL bufer TAE 1x. Campuran dipanaskan dalam microwave agar larut sempurna.
Campuran kemudian dikocok perlahan dan dituang ke dalam cetakan gel yang telah
disiapkan sesuai dengan jumlah sampel. Gel dibiarkan memadat kurang lebih 30
menit. Gel yang sudah memadat diletakkan ke dalam chamber elektroforesis dan
direndam dalam bufer TAE 1x hingga setinggi 1-2 mm di atas gel. Larutan stok
sampel DNA yang sudah diencerkan diambil sebanyak 5 μL dan dicampurkan dengan
1 μL loading dye. Campuran sampel dan loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel
dan perangkat disambungkan pada power supply. Elektroforesis dilakukan selama 30
menit. Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan ethidium bromida. Hasil
elektroforesis divisualisasikan dengan gel documentation untuk difoto dan
dibandingkan fragmen DNA yang terlihat.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Plasmid Escherichia coli
Isolasi plasmid adalah salah satu aktivitas yang rutin dilakukan di
laboratorium-laboratorium biologi molekular yang melakukan aktivitas pengklonan
gen. Salah satu metode yang banyak digunakan dalam isolasi plasmid saat ini adalah
metode alkaline lysis. Metode ini pertama kali dipublikasikan oleh Birnboim dan
Dolly tahun 1979 (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) (Davis, 2010). Metode isolasi
alkaline lysis bersandar pada sifat DNA plasmid yang berukuran kecil dan berbentuk
sirkular. Metode alkaline lysis secara garis besar terbagi ke dalam enam tahap, yakni
tahap kultivasi bakteri dan pemanenan sel, tahap resuspensi sel, tahap lisis sel dan
denaturasi DNA, tahap netralisasi, tahap purifikasi, dan tahap pemekatan DNA.
Prosedur isolasi diawali dengan kultivasi bakteri yang mengandung plasmid
yang akan diisolasi. Tahap kedua adalah resuspensi sel dalam larutan yang
mengandung Tris-EDTA dan glukosa. Larutan ini umumnya dikenal sebagai larutan
atau solution I. EDTA (ethilendiamin tetraasetat) dalam larutan I berfungsi
mengkhelat (mengikat) kation-kation divalen seperti Mg2+ dan Ca2+. Kedua ion ini
berfungsi sebagai kofaktor yang esensial bagi aktivitas Dnase dalam mencacah
molekul DNA. Selain itu, ion Mg dan Ca diketahui berperan penting dalam
memelihara integritas dan kestabilan membran plasma bakteri sehingga kerja EDTA
juga berfungsi membantu destabilisasi membran. Glukosa berfungsi menjaga tekanan
osmotik sel agar tidak pecah. Keutuhan sel pada tahap ini penting untuk tetap
terpelihara, Dnase yang ada di dalam sel tidak bertemu dengan DNA plasmid yang
akan diisolasi. Menurut (Davis, 2012), Penelitian Qiagen menyimpulkan tanpa
glukosa pun, metode alkalin lisis dapat bekerja dengan baik dalam mengisolasi
plasmid.
Tahap ketiga adalah lisis sel dan denaturasi DNA dengan pemberian larutan II
yang terdiri dari SDS dan NaOH. SDS (sodium dodesil sulfat) merupakan garam
deterjen anionik, yang ketika dilarutkan dalam air akan berdisosiasi menjadi ion Na +
dan dan dodesil sulfat. Dodesil sulfat adalah molekul deterjen berantai hidrofobik
panjang dengan gugus sulfat bermuatan negatif pada salah satu ujungnya. Dodesil
sulfat akan berikatan dengan bagian interior lipid bilayer pada membran sehingga
mengakibatkan lisis sel. Komponen selular bakteri termasuk DNA dan RNA akan
keluar dan larut dalam. Ion deterjen dodesil sulfat juga mendenaturasi protein yang
ada dalam lisat, dengan jalan memutuskan ikatan-katan non kovalen (terutama ikatan
hidrogen) pada protein, sehingga kembali ke struktur primernya, sebagai rantai linier
polipeptida. Hal ini membuat protein-protein enzim kehilangan aktivitas
enzimatiknya , termasuk enzim Dnase yang dikhawatirkan merusak DNA plasmid.
Pada tahap ini larutan akan berisi asam nukleat (DNA dan RNA) dan debris sel yang
terdapat dalam kompleks dodesil sulfat-lipid-protein. Sementara itu, NaOH yang
bersifat basa membuat seluruh molekul DNA berutas ganda baik DNA kromosomal
maupun plasmid mengalami denaturasi menjadi utas-utas tunggal. Itulah mengapa
metode ini disebut sebagai metode lisis basa (alkaline lysis). Pada tahapan ini, DNA
kromosomal terpisah sempurna menjadi utas-utas tunggal terpisah; sedangkan utas
tunggal plasmid yang berbentuk lingkaran tetap terhubung, seperti dua cincin yang
saling bertautan. Karakter ukuran dan struktur kedua jenis DNA inilah yang menjadi
dasar pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosomal.
Tahap keempat adalah adalah penambahan sol III (netralisasi). Sol III adalah
sodium asetat pH ~5,5. Ion K+ bebas yang berasal dari potasium asetat pada larutan
III akan menetralkan muatan negatif dari kompleks kompleks dodesil sulfat-lipidprotein terdenaturasi, membentuk potasium dodesil sulfat (KDS) yang tidak larut dan
terpresipitasi bersama lipid membran dan protein yang terdenaturasi. Laju presipitasi
KDS dapat ditingkatkan dengan inkubasi pada suhu es (4oC).
Sol III adalah sodium asetat yang diatur pHnya ke 5,5 menggunakan asam
asetat. Asam asetat berfungsi menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh ion
hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya. Ketika pH larutan
kembali netral, ikatan-ikatan hidrogen antar basa utas tunggal DNA terbentuk
kembali, sehingga molekul tersebut dapat berenaturasi menjadi DNA berutas ganda.
Proses renaturasi inilah yang menjadi tahap seleksi bagi plasmid. Utas-utas tunggal
sirkular DNA plasmid yang yang berukuran kecil dan tetap saling bertautan dapat
berenaturasi sempurna membentuk utas ganda yang tetap berada dalam larutan;
sedangkan DNA kromosomal yang berukuran jauh lebih besar dari plasmid tidak
dapat berenaturasi sempurna, membentuk struktur kusut tak beraturan yang
terperangkap dan ikut terpresipitasi bersama kompleks KDS-lipid-protein. Oleh
karena itu, pencampuran pada tahap lisis sel harus dilakukan dengan perlahan.
Pengocokan yang kuat (misalnya vortex) akan mengakibatkan molekul DNA
kromosom akan terpotong menjadi fragmen-fragmen yang kecil yang dapat ikut
berenaturasi seperti halnya DNA plasmid, dan mengkontaminasi DNA plasmid.
Tahap kelima adalah purifikasi dengan penambahan PCI (Phenol Chloroform
Isoamilalkohol). Purifikasi bertujuan untuk membersihkan isolat dari kontaminasi
bahan selain DNA. Pada larutan suspensi sebelum ekstraksi terdapat senyawasenyawa DNA plasmid, RNA, protein, dan komponen lipid. Penambahan PCI
berfungsi untuk mengekstraksi larutan suspensi untuk mempurifikasi kontaminan
protein yang tersisa. Dengan penambahan PCI maka terbenntuk 3 fase yaitu yang
pertama fase aquos adalah fase air yang paling atas, pada fase ini masih ada plasmid
tetapi sudah terpurifikasi. Fase putih yang berada di tengah yaitu berisi protein yang
terdenaturasi, kemudian fase PCI yang berada paling bawah.
Jumlah fenol-kloroform yang ditambahkan umumnya satu kali volume larutan
yang akan dipurifikasi. Umumnya fenol-kloroform disiapkan dalam bentuk campuran
fenol-kloroform-isoamil alkohol dengan perbandingan volume 25:24:1. Campuran
fenol-kloroform adalah campuran yang homogen. Fenol-kloroform dan air tidak
dapat bersatu sehingga akan terbentuk dua fase yakni fase air (fase aqueous) dan fase
fenol-kloroform. Fenol-kloroform lebih ‘berat’ daripada air sehingga fasenya berada
di bawah fase air. Kedua fase kemudian dicampur dengan cara vorteks. Pencampuran
akan membuat fenol merangsek ke dalam lapisan air dan membentuk emulsi droplet.
Protein akan terdenaturasi dan terperangkap dalam fase fenol-kloroform, sedangkan
DNA tetap berada di air. Kedua fase kemudian dapat dipisahkan dengan baik dengan
sentrifugasi. Fase atas yang berisi DNA akan dapat dengan mudah diambil dengan
pemipetan, dan fase fenol-kloroform dapat dibuang.
Tahap keenam adalah pemekatan DNA yang bertujuan untuk memisahkan
DNA dari larutan sehingga diperoleh konsentrasi yang lebih tinggi umumnya
menggunakan presipitasi etanol. Fase aquos diambil kemudian dilakukan presipitasi
alkohol dengan menambahkan etanol absolut untuk memisahkan DNA dari larutan
sehingga di dapat DNA dalam bentuk solid (pelet). Pelet tersebut kemudian
dimurnikan dengan penambahan etanol 70% dan disentrifugasi. Kemudian pelet
dikeringkan dan setelah itu dilarutkan kembali ke dalam air (ddH 2O) dan
ditambahkan RNAse untuk menghilangkan sisa-sisa RNA dan mendapatkan DNA
yang murni dan disimpan dalam freezer overnight.
Elektroforesis Gel
Proses elektroforesis adalah analisis menggunakan gel agarose untuk menandakan
kualitas DNA yang telah di isolasi. DNA penanda yang digunakan adalah DNA
lambda 1 ng dan 3 ng. Pada elektroforesis digunakan loading dye yang berfungsi
untuk pemberat DNA dan perendaman pada Ethidium Bromida bertujuan untuk
memberi warna pada DNA. Elektroforesis dilakukan sampai penanda menjauhi
sumuran. Untuk analisis kualitatif, jarak migrasi yang ditempuh tidak perlu terlalu
jauh dan untuk menganalisis bentuk DNA. Berikut adalah foto dari hasil
elektroforesis yang telah dilakukan.
Gambar 1. Elektroforegram DNA hasil isolasi plasmid Escerichia coli (kiri-kanan:
marker λ 1 ng, marker λ 3 ng, sampel kelompok 1 sampai 8).
Gambar diatas menunjukkan hasil running dari plasmid-plasmid yang telah di
isolasi. Terlihat pada gambar di atas plasmid yang berhasil migrasi hanya pada sumur
ke 3, 4, 7, dan 10. Hal ini membuktikan jika plasmid berhasil di isolasi dikarenakan
terdapat pergerakan pita. Namun demikian terdapat smear pada pita tersebut yang
menunjukkan bahwa DNA yang diperoleh belum murni atau masih terdapat zat-zat
lain yang ikut tercampur. Smear terbentuk akibat degradasi DNA menjadi potonganpotongan pendek. Hal ini dapat terjadi karena perlakuan DNA selama isolasi. Smear
juga dapat disebabkan oleh volume DNA yang terlalu banyak saat elektroforesis atau
penggunaan tegangan yang terlalu besar (Ausubel, 1990). Fragmen DNA yang tipis
pada gel agarosa dapat disebabkan oleh beberapa hal seperti rendahnya konsentrasi
DNA.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan diperoleh plasmid pada isolasi plasmid dari
Escherichia coli yang dibuktikan dengan adanya pita-pita DNA pada visualisasi
elektroforesis dan ada beberapa sampel yang tidak didapatkan plasmid yaitu 3, 4, 6,
dan 7.
DAFTAR PUSTAKA
Ausubel FM. 1990. Current Protocols in Molecular Biology. Kanada (CA): John
Willey & Sons.
Brown TA. 2003. Pengantar Kloning Gen. Muhammad SA, penerjemah. Terjemahan
dari: Gene Cloning an Introduction.Yogyakarta (ID): Yayasan Essentia
Medika.
Davis, M. 2010. [Internet]. Isolasi DNA plasmid metode alkaline lysis prinsip dasar
dan tips _ muchdar davis's blog.htm. [Diunduh tanggal 10 November 2016].
Hayati dan Fajri. 2010. [Internet]. http://ekor07.student.ipb.ac.id/2010/06/20/isolasiplasmid-elekroforesis-kuantifikasi-dna/. [Diunduh 9 November 2016].
Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B, James D. 2000. Molecular Cell
Biology. New York: Wh. Freeman Company.
Snustad DP & MJ Simmons. 2003. Principles of Genetic. Hoboken (US): Wiley &
Sons Inc.
Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ. 2003. Theory and Problems of Molecular and
Cell Biology. New York: McGraw-Hill Companies.
Suharsono WU. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Bogor
(ID): Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi IPB.
Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.