Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Selulolitik Simbion Usus Rayap Macrotermes gilvus.
KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
SELULOLITIK SIMBION USUS BELAKANG RAYAP
PEKERJA Macrotermes gilvus
ANDRI FERBIYANTO
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi, Karakterisasi,
dan Identifikasi Bakteri Selulolitik Simbion Usus Belakang Rayap Macrotermes
gilvus adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan ataupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2013
Andri Ferbiyanto
NIM G34080088
ABSTRAK
ANDRI FERBIYANTO. Karakterisasi, dan Identifikasi Bakteri Selulolitik
Simbion Usus Rayap Pekerja Macrotermes gilvus. Dibimbing oleh IMAN
RUSMANA dan RIKA RAFFIUDIN.
Rayap adalah serangga sosial yang memiliki morfologi beragam dan
terdiri atas tiga kasta: reproduktif, tentara, dan pekerja. Macrotermes gilvus
merupakan rayap pembuat gundukan tanah. Dalam pencernaannya, rayap
menggunakan dua sumber enzim selulolitik, yaitu enzim selulase yang dihasilkan
oleh rayap itu sendiri dan enzim selulase yang dihasilkan oleh mikroba simbion
rayap. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi bakteri selulolitik simbon
usus rayap pekerja M. gilvus, serta mengidentifikasinya berdasarkan gen 16S
rRNA. Bakteri yang berasal dari usus rayap diisolasi dan dikulturkan di media
CMC. Isolat bakteri diuji sifat biokimianya dengan menggunakan kit Microbact
12A dan 12B. Bakteri dengan indeks zona bening tertinggi dianalisis sekuen gen
16S rRNA-nya. Sebanyak empat isolat selulolitik berhasil diisolasi dari bagian
usus rayap M. gilvus dengan sifat aerob dan anaerob fakultatif. Indeks selulolitik
terbesar ditunjukkan oleh isolat RA6 sebesar 2.5. Hasil analisis BLAST-N sekuen
gen 16S rRNA-nya menunjukkan bahwa isolat RA 6 memiliki kemiripan 99%
dengan Paracoccus yeei. Hasil ini mengindikasikan bahwa isolat RA 6 adalah
bakteri selulolitik P. yeei yang bersimbiosis dengan M. gilvus di usus
belakangnya.
Kata kunci: usus rayap, Terminidae, Macrotermes gilvus, selulase, 16S rRNA, P.
yeei
ABSTRACT
ANDRI FERBIYANTO. Characterization, and Identification of Cellulolytic
Bacteria of Termite Gut Symbionts of worker Macrotermes gilvus. Under
direction of IMAN RUSMANA and RIKA RAFFIUDIN.
Termites are social insect that have diverse morphology. They have three
castes that are reproductives, soldiers, and workers. Macrotermes gilvus belongs
to mound builder termite. In their role to digest cellulose, termites use two sources
of cellulolytic enzyme, i.e. cellulases produced by the termite , and cellulases
produced by the guts symbions. This study was aimed to characterise cellulolytic
bacteria of termite hindgut symbionts of worker M. gilvus and to identify the
cellulolityc bacteria based on sequences of 16S rRNA gene. Cellulolitic bacteria
of termite gut symbionts were isolated and cultured in CMC media. The
biochemical characters of bacteria isolats were assayed using Microbact 12A and
12B. Cellulolitic activity was determined based on formation of clear zone index
in CMC media bacterial isolats and were tested for biochemical test as well as its
cellulase activity based on clear zone. The highest clear zone index isolats genome
sequence were analyzed. Four isolates of cellulolitic bacteria were successfully
isolated from gut of M. gilvus with aerobic and anaerobic status. The highest
formation of clear zone index (2.5) was showed by isolat RA6 isolat. BLAST-N
result of 16S rRNA gene sequences of RA6 isolat showed 99% similarity with
Paracoccus yeei. This result indicated that RA6 isolat was P. yeei, a cellulolitic
bacterium of a termite hindgut of M. gilvus.
Keyword: hindgut, Terminidae, cellulase, 16S rRNA
KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
SELULOLITIK SIMBION USUS BELAKANG RAYAP
PEKERJA Macrotermes gilvus
ANDRI FERBIYANTO
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Selulolitik Simbion Usus
Rayap Macrotermes gilvus.
Nama
NIM
: Andri Ferbiyanto
: G34080088
Disetujui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Pembimbing I
Dr Ir Rika Rafiudin, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya yang telah memberikan saya keempatan untuk menjejakkan
kaki di dunia ilmu pengetahuan. Penulis mengucapkan rasa terima kasih yang
terdalam kepada orang-orang yang telah membantu dan membimbing penulis
dalam penelitian ini sehingga penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik.
Skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa adanya bantuan, arahan, dan nasehat
dari para pembimbing penulis, yaitu Dr Ir Iman Rusmana MSi, dan Dr Ir Rika
Raffiudin MSi, yang penulis sangat bersyukur dapat dibimbing oleh beliau, serta
Bapak Dr Ir Ence Darmo Jaya Supena Msi sebagai Ketua Departemen selama
penulis berada di Departemen Biologi, penulis ucapkan terima kasih sebesarbesarnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada staff mikrobiologi (Pak
Jaka, Bu Heni, dan Aldian) yang telah membantu penulis selama masa penelitian.
Tidak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Ibu Alina Akhdiya MSi dan
Bapak Sipri Yadi MSi yang telah memberikan nasehat, dorongan, dan bantuannya
kepada penulis, kepada teman-teman di pasca Mikrobiologi (Kak Mafri, Kak
Fendi, dan Kak Yessy) dan Biologi (Kak Sari, Afnan, Wathri, Whendi, Esa,
Chusna, Widyo) yang telah membantu penulis untuk tetap berjuang dalam
membangun minat dan mengejar mimpi. Secara khusus, penulis mengucapkan
terima kasih kepada bibi penulis yang telah memberikan dukungan dana sehingga
penulis dapat menyelesaikan pendidikan sarjana. Tidak lupa juga pada seseorang
yang telah memberikan warna pada hati penulis.
Terakhir bukan berarti berakhir, untuk mereka yang telah saya temui, semua
peristiwa yang telah saya lewati, kalian yang membentuk saya sekarang. Tanpa
kalian,saya tidak mungkin berada disini sekarang. Penulis berharap skripsi ini
dapat berguna bagi dunia ilmu pengetahuan.
Bogor, September 2013
Andri Ferbiyanto
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
1
Bahan
1
Alat
2
Isolasi Bakteri dan Pemurnian Isolat
2
Pewarnaan Gram
2
Uji Biokimia Isolat Bakteri
2
Uji Aktivitas Selulolitik
3
Isolasi DNA
3
Amplifikasi Gen 16S rRNA
3
Analisis dan Konstruksi Pohon Filogenetik
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
4
4
Karakteristik Isolat Bakteri Selulolitik asal Usus Rayap
4
Karakteristik Biokimia Isolat Hasil Isolasi
5
Aktivitas Selulolitik Isolat Hasil Isolasi
6
Identifikasi dan Filogenetik Bakteri Hasil Isolasi
6
Pembahasan
10
SIMPULAN
11
Simpulan
11
DAFTAR PUSTAKA
12
RIWAYAT HIDUP
10
DAFTAR TABEL
1 Jumlah Bakteri Selulolitik yang Berhasil Diisolasi dari Usus Rayap
4
Karakteristik dan Morfologi Isolat Bakteri Selulolitk Asal Usus
Belakang Rayap Pekerja M. gilvus
5
3
Karakterisik biokimia isolat bakteri hasil isolasi
6
4
Hasil Identifikasi Menggunakan Perangkat Lunak Microgen 2.0
7
2
5 Aktivitas selulolitik isolat bakteri hasil isolasi dari usus kasta pekerja M.
gilvus
7
6
9
Hasil BLAST-N berdasarkan sekuen 16S rRNA dari isolat RA6
DAFTAR GAMBAR
1
Pewarnaan Gram isolat bakteri hasil isolasi
6
2
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA isolat RA6
8
3
Daerah contig hasil sekuen gen 16S rRNA dari isolat RA 2
9
4
Pohon filogenetik isolat RA6 menggunakan piranti lunak MEGA 5.0
10
PENDAHULUAN
Rayap adalah serangga sosial yang memiliki morfologi beragam yang hidup
di dalam koloni. Berdasarkan kemampuan reproduksinya, rayap dibagi menjadi
dua tipe, yaitu: reproduktif (kasta ratu) dan non reproduktif (kasta pekerja dan
kasta prajurit). Ratu hanya bertugas untuk reproduksi. Pekerja memiliki tugas
yang beragam, yatu: mengumpulkan makanan dan air, memangun dan
memperbaiki sarang, dan merawat larva, ratu dan raja. Tugas prajurit hanya
menjaga sarang (Eggleton 2011). Salah satu rayap yang umum dijumpai di
Indonesia berasal dari genus Macrotermes (Tambunan dan Nandika 1987).
Macrotermes gilvus (Isoptera: Macrotermininae) merupakan rayap pembuat
gundukan yang hidup di wilayah Malaya dan Indo-China hingga Indonesia dan
Philipina (Roonowal dan Chhotani 1961). Imago pada spesies ini memiliki ciriciri seperti oseli oval, antena memiliki 19 segmen, dan pronotum berbentuk
setengah lingkaran. Kasta prajurit mayor M. gilvus memiliki ciri-ciri seperti meso
dan metanotal datar melingkar, kepala berwarna merah-kecoklatan, dan antena
memiliki 17 segmen. Kasta prajurit minor memiliki ciri-ciri seperti metanotum
lebih lebar dari mesonotum dan segmen ketiga pada antena sama panjang dengan
segmen keempat, tetapi lebih panjang dari segmen kedua (Ahmad 1958). Kasta
pekerja M. gilvus memiliki ciri-ciri seperti kepala coklat kekuningan, oselli
tereduksi, warna pada abdomen dan toraks lebih pucat dari kepala, dan pronotum
berbentuk seperti sadel (Roonwal dan Chhotani 1961).
Rayap pekerja mencerna lignoselulosa dengan menggunakan dua sumber
enzim selulolitiknya, yaitu selulase yang dihasilkan oleh rayap itu sendiri dan
selulase yang dihasilkan oleh simbion rayap (Nakashima et al. 2002), salah
satunya adalah bakteri endogenus usus rayap (Ohkuma dan Brune 2011). Selulosa
merupakan polimer linear dari banyak molekul glukosa yang saling berikatan
dengan tipe ikatan β-1,4-glikosidik. Ikatan tersebut dihidrolisis oleh enzim
selulase yang juga berperan dalam daur ulang polisakarida tersebut. Selulase
dengan enzim lainnya bekerja sama untuk mendegradasi sel tumbuhan (Morana et
al. 2011). Contoh beberapa bakteri simbion pada saluran pencernaan rayap adalah
Enterobacter aerogens, E. cloacae, Serattia marcescens, dan Citrobacter farmeri
yang merupakan bakteri indigenus dari usus rayap Coptotermes formosanus
(Adams dan Boopathy 2005). Bakteri-bakteri tersebut merupakan bakteri
indigenus usus rayap yang belum dikarakterisasi enzim selulasenya. Oleh karena
itu penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi bakteri simbion usus rayap
penghasil enzim selulase dan mengidentifikasinya berdasarkan gen 16S rRNA.
METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain rayap pekerja M.
gilvus yang dikoleksi dari hutan belakang Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
(FPIK) Intitut Pertanian Bogor (IPB), media Carboxyl-Methyl-Cellulose (CMC),
gas generating kit (Oxoid anaerobic system BR0038B), Microbact 12A dan 12B
2
(Microgen Bioproducts), larutan Merah Kongo, Larutan NaCl 2M, reagen VogesProskauer, reagent nitrit, Xprep Soil DNA mini kit (Phile Korea Technology Inc.),
dan PCR kit (Takara).
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain toples anaerobik,
set pipet mikro beserta tipnya, mesin PCR, alat elektroforesis, UV TransIluminator, dan peralatan umum lainnya di laboratorium mikrobiologi.
Isolasi Bakteri dan Pemurnian Isolat
Sterilisasi permukaan pada rayap yang akan digunakan dilakukan dengan
cara dicelupkan ke dalam alkohol 70% selama 30 detik. Rektum rayap ditusuk
menggunakan jarum inokulasi (rektum dicocokkan dengan buku Biology of
Termites (Eggleton 2011)), kemudian digoreskan ke media agar cawan CMC dan
agar cawan CMC diinkubasi pada keadaan aerob dan anaerob. Koloni bakteti
yang tumbuh kemudian dimurnikan dengan cara digores pada media agar-agar
CMC dengan menggunakan metode kuadran. Koloni bakteri yang sudah murni
disimpan pada media agar miring CMC. Koloni bakteri murni diamati bentuknya
dengan menggunakan buku Microbial Applications Laboratory manual in
General Microbiology 8th Ed (Benson 2001).
Pewarnaan Gram
Isolat bakteri yang ditumbuhkan di media agar-agar CMC diambil dan
digores di atas gelas obyek yang memiliki genangan akuades, dan dikeringudarakan. Fiksasi preparat dilakukan dengan menggunakan panas. Larutan kristal
violet digenangkan di atas gelas objek selama dua menit, kemudian dibilas dengan
akuades. Setelah itu, iodin digenangkan di bekas bilasan selama satu menit
sebelum dibilas kembali. Alkohol 96% diteteskan di atas bekas bilasan Iodin, dan
dibilas kembali. Safranin digenangkan selama 30 detik sebelum dibilas kembali
(Benson 2001). Gelas objek hasil perwarnaan gram diamati dengan menggunakan
mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000×.
Uji Biokimia Isolat Bakteri
Uji biokimia isolat dilakukan dengan menggunakan Microbact Kit 12A-12B
(Medvet Diagnositics, Thebarton, SA, Australia). Isolat bakteri yang digunakan
untuk uji fisiologis diremajakan menggunakan media agar-agar miring CMC.
Sebanyak 6 mL garam fisiologis dituang ke agar miring lalu dihomogenkan
dengan menggunakan vorteks. Selanjutnya, sebanyak 0.1 mL larutan ditambahkan
ke dalam sumur di kit Microbact 12A dan 12B dan diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 37ºC (Butt et al. 1988). Profil hasil uji dicocokkan dengan profil di buku
MicrogenTM GnA+B-ID System dan perangkat lunak Microgen 2.0 untuk
mendapatkan hasil uji biokimia dan nama spesies dari isolat bakteri yang diuji.
3
Uji Aktivitas Selulolitik
Seluruh isolat bakteri ditumbuhkan pada media agar-cawan CMC dan
diinkubasi selama tiga hari pada suhu ruang. Larutan merah Kongo diteteskan ke
koloni bakteri kemudian dibilas menggunakan larutan NaCl 2M sebanyak tiga
kali. Zona bening yang terbentuk diukur dengan menggunakan penggaris dan
Indeks selulolitik (IS) aktivitas selulolitik dihitung dengan menggunakan rumus:
Isolasi DNA
DNA genom isolat bakteri diisolasi menggunakan Xprerp Soil DNA Mini
Kit (PhileKoerea Technology). Langkah pertama, pelet sel isolat bakteri dicuci
sebanyak tiga kali dengan cara 750 µL bufer Tris-EDTA (TE) dituang ke dalam
tabung mikro, disuspensi, dan dipusingkan dengan kecepatan 10000 rpm selama
lima menit. Sebanyak 250 µL XPSDE bufer 1, 20 µL proteinase-K (2 mg/mL),
dan 2 mg glass beads ditambahkan ke pelet sel, lalu diinkubasi pada suhu 70ºC
selama sepuluh menit. Sampel ditambah 100 µL XPSDE bufer 2 dan diinkubasi di
es selama lima menit. Selama lima menit, sampel dipusingkan dengan kecepatan
10000 rpm. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro baru dan ditambah 200 µL
XPSDE bufer 3. Langkah berikutnya, sampel diinkubasi pada suhu ruang selama
dua menit. Supernatan hasil pemusingan dipindahkan ke tabung mikro baru, dan
ditambahkan 250 µL XPSDE bufer 4 dan ethanol 100% ke dalam supernatan.
Setelah dihomogenkan, sampel dipindahkan ke tabung mikro kolom dan
dipusingkan. Kemudian, sebanyak 750 µL bufer elusi ditambahkan dan
dipusingkan. Selanjutnya tabung mikro kolom dipindahkan ke tabung mikro baru
dan ditambahkan 50 µL bufer elusi, lalu dipusingkan. DNA genom hasil isolasi
kemudian digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA. Hasil isolasi diperiksa
dengan dimigrasikan pada gel agarosa 1% dengan kondisi voltase 75V selama 1
jam.
Amplifikasi Gen 16S rRNA
Takara LaTaq GC Buffer PCR merupakan resep komposisi PCR yang
digunakan untuk proses amplifikasi pada penelitian ini. Komposisi larutan untuk
amplifikasi terdiri atas primer forward 20F (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG3’) (10 pm) 0.5 µL, primer reverse 1500R ((5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)
(10 pm) 0.5 µL, 10× Long Polymerase Taq (5U/ µL) 0.2 µL, GC bufer (5 mM) 10
µL, dNTP (2.5 mM) 3.2 µL, DNA template (1.76 ng/mL) 2 µL, dan ddH2O hingga
volume total mencapai 20 µL. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan
menggunakan mesin PCR dengan 30 siklus dengan kondisi PCR: pre-denaturasi
(94°C, 4 menit), denaturasi (94°C, 40 detik), annealing (55ºC, 1 menit), elongasi
(72ºC, 1 menit 10 detik), dan post-elongasi (72ºC, 10 menit). Selanjutnya
amplikon dielektroforesis dengan gel agarosa 1% dan divisualisasi menggunakan
UV Trans-Iluminator.
4
Analisis dan Konstruksi Pohon Filogenetik
Sekuen nukleotida hasil analisis dari perusahaan sekuensing disejajarkan
dengan menggunakan ClustalW (Thompson et al. 1994). Hasil pensejajaran dicari
homologinya dengan database Genbank menggunakan program BLAST-N
(www.ncbi.mlm.niv.gov) dan disejajarkan kembali dengan menggunakan
ClustalW. Selanjutnya pohon filogenetik dikonstruksi menggunakan program
Neighbor-Joining Tree Method dengan nilai bootstrap 1000× (Tamura et al.
2011).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Karakteristik Isolat Bakteri Selulolitik Asal Usus Rayap
Total isolat bakteri selulolitik asal usus rayap yang berhasil diisolasi dari
keempat rayap M. gilvus hasil koleksi asal hutan FPIK IPB yaitu sebanyak tujuh
isolat. Ketujuh isolat tersebut diisolasi dalam keadaan aerob dan anaerob.
Sebanyak lima isolat berhasil diisolasi secara aerob, sedangkan dua isolat lainnya
berhasil diisolasi secara anaerob (Tabel 1).
Tabel 1 Jumlah Bakteri Selulolitik yang Berhasil Diisolasi dari Usus Rayap
Rayap
1
Aerob
2
2
3
4
1
1
1
Jumlah Isolat
Kode
Anaerob
RU 1
1
RU 2
RU 3
1
RU 4
RU 5
-
Kode
RA 1
RA 2
Morfologi koloni semua bakteri selulolitik manunjukkan karakteristik
yang beragam (Tabel 2). Total isolat bakteri selulolitik yang berhasil diisolasi dari
usus rayap yaitu sebanyak tujuh isolat. Empat isolat dari tujuh isolat bakteri
selulolitik (RU 1, RU 3, RU 4 dan RA 2) yang mampu tumbuh dengan baik pada
media agar-CMC. Keempat isolat tersebut terdiri atas tiga isolat yang diisolasi
secara aerob (RU) dan satu isolat yang diisolasi secara anaerob (RA) (Tabel 1).
Berdasarkan hasil pewarnaan Gram, seluruh isolat merupakan bakteri Gram
negatif (Gambar 1). Selanjutnya dilakukan pewarnaan Gram. Berdasarkan hasil
pewarnaan Gram, keempat isolat bakteri meiliki sifat pewarnaan Gram negatif
yang ditandai dengan warna merah muda, dengan bentuk sel kokus dan batang
pendek.
5
Tabel 2 Morfologi dan karakteristik keutuhan atas oksigen isolat bakteri
selulolitik asal usus belakang rayap
Empat isolat dari tujuh isolat bakteri selulolitik terisolasi (RU 1 RU 3 RU
Kondisi
Isolat
Morfologi Koloni
Karakteristik
Saat Isolasi
RU 1
Aerob
Bundar
Permukaan licin
Cembung
Beraroma
Berwarna putih krem
Aerob
RU 2
Aerob
Bundar
Permukaan licin
Cembung
Beraroma
Berwarna putih krem
Anaerob
RU 3
Aerob
Bundar
Permukaan licin
Cembung
Beraroma
Berwarna putih krem
Anaerob fakultatif
RU 4
Aerob
Bundar
Permukaan licin
Berwarna Putih
Permukaan Rata
Anaerob fakultatif
RU 5
Aerob
Bundar
Permukaan licin
Berwarna Kuning
Cembung
Anerob fakultatif
RA 1
Anaerob
Bundar
Permukaan licin
Cembung
Beraroma
Berwarna putih krem
Anerob fakultatif
RA 2
Anaerob
Bundar
Permukaan licin
Berwarna Putih
Cembung
Beraroma
Anerob fakultatif
6
A
B
C
D
Gambar 1 Pewarnaan Gram isolat bakteri hasil isolasi dengan hasil perwarnaan
Gram negatif, (A) isolat RU 1 berbentuk kokus, (B) isolat RU 3
berbentuk batang pendek, (C) isolat RU 4 berbentuk kokus, dan (D)
isolat RA 6 berbentuk kokus.
Karakteristik Biokimia Isolat Hasil Isolasi
Hasil karakterisasi biokimia bakteri hasil isolasi menunjukkan seluruh isolat
memiliki hasil positif pada oksidase, protease, dan produksi β-galaktosidase. Tiap
isolat memiliki karakteristik biokimia yang tidak dimiliki oleh isolat lainnya,
seperti reduksi nitrat dan fermentasi arabinosa hanya bisa dilakukan oleh RU4 dan
RA6. Isolat RU3 yang dapat memfermentasi glukosa, xilol, dan sukrosa
Tabel 3 Karakterisik biokimia isolat bakteri hasil isolasi
Isolat
Mot
Oxi
Nit
Lys
Or
H2
Glu
Man
Xyl
RU 1
RU 3
RU 4
RA 6
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
-
+
-
Isolat
OP
Ind
Ure
VP
Cit
TDA
Gel
Mal
Ino
RU 1
RU 3
RU 4
RA 6
+
+
+
+
-
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
+
7
Lanjutan Tabel 3 Karakterisik biokimia isolat bakteri hasil isolasi
Isolat
Sor
Rha
Suc
Lac
Ara
Ado
Raf
Sal
Arg
RU 1
RU 3
RU 4
RA 6
-
-
+
-
-
+
+
-
-
-
-
Keterangan:
Mot
Oxi
Nit
Lys
Or
H2
Glu
Man
Xyl
OP
Ind
Ure
VP
: Motilitas
: Oxidase
: reduksi nitrat
: Lysine
: Ornithine
: H 2S
: Glukosa
: Manitol
: Xilosa
: β-galaktosidase
: Indole
: Uerase
: Produksi Acetoin
Cit : Citrat
TDA :Tryptophan deaminase
Gel : Protease
Mal : Malonat
Ino : Inositol
Sor : Sorbitol
Rha : Rhamnosa
Suc : Sucrosa
Lac : Lactosa
Ara : Arabinosa
Sal : Salicin
Arg : Arginin
.
Berdasarkan hasil uji identifikasi menggunakan sifat biokimianya,
didapatkan spesies yang beragam dengan persentase tertinggi pada isolat RU 4,
yaitu 96,68% dan terendah pada RA 2, yaitu 69,77 %. Berikut adalah hasil
identifikasi menggunakan perangkat lunak Microgen 2.0 (Tabel X)
Tabel 4 Hasil Identifikasi Menggunakan Perangkat Lunak Microgen 2.0
Kode
Isolat
RU 1
RU 3
RU 4
RA 2
Persentasi
(persen)
92.13
92.83
96.68
69.77
Hasil Identifiksi
Moraxella
Bulkhoderia cepacia
Actinobacillus
Mannhemia haemolytica
Aktivitas Selulolitik Isolat Hasil Isolasi
Isolat bakteri selulolitik hasil isolasi dari usus belakang rayap ditunjukkan
dengan adanya zona bening di sekitar koloni bakteri. Hasil uji zona bening
menunjukkan bahwa isolat RA 6 memiliki IS terbesar dengan nilai 2,5 dan isolat
RU 3 memiliki IS terkecil dengan nilai 0,75 (Tabel 3). Berdasarkan IS isolat RA6
merupakan isolat bakteri potensial untuk diuji lebih lanjut.
Tabel 5 Aktivitas selulolitik isolat bakteri hasil isolasi dari usus kasta
pekerja M. gilvus
Isolat
RU 1
RU 3
RU 4
RA 6
Diameter
Koloni (mm)
3.5
6.0
8.0
2.0
Diameter Zona
Bening (mm)
6.5
10.5
14.5
5.0
Indeks
Selulolitik
0.875
0.750
0.813
2.500
8
Identifikasi dan Filogenetik Isolat Bakteri Hasil Isolasi
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA yang dielektroforesis pada gel agarosa
1% menunjukkan amplikon berukuran sekitar 1500 pasang basa (Gambar 2). Hasil
BLAST-N sekuen gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat RA6 memiliki
kedekatan dengan Paracoccus yeei yang ditunjukkan dengan nilai kemiripan
sebesar 99% (NR_029038.1) dengan e.value 0.0 (tabel 4). Berdasarkan hasil
konstruksi menggunakan Neighbour Joining Method (Bootstrap 1000x)
menunjukkan hasil konstruksi pohon filogenetik sampel RA6 yang diperoleh dari
usus rayap seperti terlihat (Gambar 3).
Marker
1000 bp
1500 bp
RA 6
1500 bp
1000 bp
500 bp
200 bp
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA isolat RA 2
Hasil daerah contig menunjukkan basa adenin sebanyak 168 basa, sitosin
sebanyak 149 basa, guanine sebanyak 209 basa, dan timin sebanyak 131 basa dari
total sebanyak 657 basa. Berikut adalah gambar daerah contig hasil sekuen gen
16S rRNA isolat RA6.
RA6_20F.
RA6_1500R.
CAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCC-GGCTAACTC 399
------------TAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCCGGCTAAATC 38
**************************** ****** **
RA6_20F
RA6_1500R
CGTGCCAGC-AGCCGCGG-TAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAAT 447
CGTGCCAGCCAGCCGCGGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAAT 88
********* ******** *******************************
RA6_20F
RA6_1500R
TACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACCGGAAAGTCAGAGGTGAAATC 497
TACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACCGGAAAGTCAGAGGTGAAATC 138
**************************************************
RA6_20F
RA6_1500R
CC-AGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTGAAACTATCGGTCTGGAGTTCG 546
CCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTGAAACTATCGGTCTGGAGTTCG 188
** ***********************************************
RA6_20F
RA6_1500R
AGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCG 596
AGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCG 238
**************************************************
9
RA6_20F
RA6_1500R
GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAG 646
GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAG 288
**************************************************
RA6_20F
RA6_1500R
GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC 696
GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC 338
RA6_20F
RA6_1500R
**************************************************
GTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTGACACAC 746
CGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTGACACAC 388
**************************************************
RA6_20F
RA6_1500R
CTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACT 796
CTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACT 438
**************************************************
RA6_20F
RA6_1500R
CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT 846
CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT 488
**************************************************
RA6_20F
RA6_1500R
CGAAGCAACGCG-------------------------------------- 858
CGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCGCAGGACAGCCCG 538
************
Gambar 3 Daerah contig hasil sekuen gen 16S rRNA dari isolat RA6
Tabel 6 Hasil BLAST-N gen sekuen 16S rRNA dari isolat RA6
Nomor Assesi
Spesies
Skor
Maksimun
1127
Skor
Total
1127
query
cover
100%
e
value
0
max
ident
99%
NR_029038.1
Paracoccus yeei strain G1212
NR_025858.1
P. thiocyanatus strain THI 011
1061
1061
100%
0
98%
NR_026456.1
P. denitrificans strain 381
1055
1055
100%
0
97%
NR_042715.1
P. aminophilus strain ATCC 49673
Rhodobacter changlensis strain
JA139
Haemobacter missourensis strain
CCUG 52307
1048
1048
100%
0
97%
941
941
99%
0
93%
931
931
99%
0
93%
Rugeria atlantica strain IAM14463
911
911
99%
0
92%
NR_025440.1
NR_044545.1
NR_044315.1
Hasil konstruksi pohon filogenetik mengambarkan kedudukan isolat RA6
berada satu clade dengan bakteri Paracoccus yeei (NR 026456.1) dengan nilai
bootstrap sebesar 100. Hal ini menegaskan bahwa isolat RA6 merupakan P. yeei
10
.
Gambar 4 Pohon filogenetik isolat RA6 menggunakan piranti lunak MEGA 5.0
Pembahasan
Bakteri yang berasal dari usus rayap memiliki sifat aerob, anaerob fakultatif,
dan mikroaerofil (Wenzel et al. 2002). Berdasarkan karakterisasi pertumbuhan
pada kondisi aerob dan anaerob, diperoleh bahwa seluruh isolat bakteri selulolitik
dari usus rayap pekerja M. gilvus adalah bakteri yang bersifat anaerob fakultatif,
kecuali isolat RU1 yang bersifat aerob. Pewarnaan Gram pada isolat menunjukkan
bahwa seluruh isolat memiliki pewarnaan Gram negatif, jika dibandingkan dengan
Enterobacter aerogens, E. cloacae, Serattia marcescens, dan Citrobacter farmeri
bakteri hasil isolasi memiliki kesamaan sebagai bakteri Gram negatif dan dapat
ditemukan berasosiasi dengan makhluk hidup (Holt et al. 1994). Pewarnaan Gram
dilakukan pada isolat RU 1, RU 3, RU 4 dan RA 2 karena isolat lainnya diduga
memiliki viabilitas rendah.
Uji karakteristik biokimia isolat hasil isolasi menggunakan kit
MicrobactTM 12A dan 12B menunjukkan hasil yang bervariasi, kecuali untuk
beberapa uji, seperti positif pada protease dan negatif pada fermentasi gula
(arginin, salisilat, adonitol, laktosa, rhamonsa, dan sorbitol), ornithine, dan
produksi triptofan deaminase. Hasil uji biokimia yang terpisah menunjukkan
bahwa seluruh isolat memiliki persamaan pada uji motilitas (negatif) dan uji
oxidase (positif). Perbandingan dengan isolat bakteri selulolitik hasil isolasi dari
masterfeed menunjukkan bahwa hasil uji biokimia positif pada reaksi oksidase
dan fermentasi, dan hasil negative pada sitrat, produksi indol, reduksi nitrat, dan
produksi acetoin (Azman 2009). Isolat tersebut memiliki kesamaan dengan isolat
RU3. Isolat RU1 memiliki perbedaan dengan isolat tersebut pada kemampuan
untuk fermentasi, sedangkan RU4 dan RU6 memiliki perbedaan pada kemampuan
reduksi nitrat. Hasil identifikasi menggunakan Microbact 2.0 menunjukkan nilai
yang rendah pada isolat RA 2 sehingga diperlukan uji lebih lanjut pada isolat
tersebut.
Aktivitas selulolitik isolat ditunjukkan dengan adanya zona bening pada
media agar-cawan CMC yang telah diwarnai dengan larutan merah Kongo. Isolat
RA6 memiliki zona bening terbesar (2.5) dan isolat RU3 memiliki indeks zona
bening terendah (0.75). Jika dibandingkan dengan bakteri selulolitik rayap hasil
penelitian Gupta et al. (2012) dengan nilai indeks zona bening 4.29 hingga 5.49,
bakteri selulolitik hasil isolasi cukup rendah.
11
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer 20F dan 1500R
menunjukkan ukuran amplikon berukuran 1500 pasang basa. Hal ini sesuai
dengan pernyataan Weissburg (1991) yang mengemukakan bahwa amplikon yang
menggunakan primer 20F dan 1500R memiliki ukuran amplikon sekitar 1500
pasang basa. Berdasarkan identifikasi molekuler gen 16S rRNA, isolat bakteri
RA6 memiliki kemiripan 99% dengan Paracoccus yeei dengan nilai E.value
sebesar 0.0. P. yeei adalah bakteri gram negatif, berbentuk kokus-basil dan
memiliki sifat biokimia seperti katalase dan oksidase positif, non-motil, reaksi
positif pada uji reduksi nitrat, arginin dihidrolase, asimilasi pada arabinosa dan
malat, dan reaksi negatif pada urease, indol, eskulin hidrolisis, gelatinase, βgalaktosidase, penggunaan substrat glukosa, manosa, N-asetilglukosamin, maltosa,
glukonat, kaprat, sitrat, dan fenil-asetat (Funke et al. 2004). Jika dibandingkan
dengan isolat RA6, didapatkan perbedaan pada uji arginin, arabinosa, gelatinase,
glukosa, indol, dan β-galaktosidase.
Habitat dari P. yeei sangat beragam. P. yeei dapat dijumpai pada
sedimentasi di laut India dan Kosta Rika, pada buku tua di perputakaan Korea,
insektisida yang tercampur tanah di Cina, produk fermentasi peternakan (Burd dan
Sharp 2012), dan umum dijumpai di tanah (Wallet et al. 2010). Oleh karena itu, P.
yeei diduga masuk ke dalam pencernaan rayap melalui proses anal feeding.
Bakteri E. aerogens, E. cloacae, dan S. marcescens memiliki beberapa
kesamaan proses biokimia, yaitu hasil positif pada reduksi nitrat, metabolisme
dengan menggunakan substrat sorbitol, manitol, sitrat, sukrosa, laktosa, dan
salisin, dan menghasilkan β-galaktosidase, dan hasil negatif pada produksi gas
H2S (Holt et al. 1994). Isolat RA6 yang diduga P.yeei, jika dibandingkan dengan
beberapa bakteri simbion usus rayap, secara fisiologis memiliki beberapa
persamaan dan perbedaan. Beberapa persamaan yang ditunjukkan diantaranya
yaitu dapat mereduksi nitrat, menghasilkan β-galaktosidase, dan tidak
menghasilkan gas H2S, sedangkan beberapa perbedaannya antara lain
metabolisme ornithin, manitol, sitrat, sorbitol, sukrosa, laktosa, dan salisin.
SIMPULAN
Simpulan
Sebanyak empat isolat bakteri selulolitik berhasil diisolasi dari usus rayap
pekerja Macrotermes gilvus. Isolat tersebut memiliki karakteristik anaerob
fakultatif kecuali untuk isolat RU1. Isolat bakteri dengan kode RA6 memiliki
indeks aktivitas selulolitik terbesar. Bakteri tersebut memiliki kemiripan 99%
dengan Paracocus yeei berdasarkan gen 16S rRNA-nya. Bakteri tersebut diduga
merupakan bakteri selulolitik simbion usus rayap pekerja Macrotermes gilvus.
12
DAFTAR PUSTAKA
Adams L, Booptahy R. 2005. Isolation and characterization of enteric bacteria
from the hindgut of Formosan termite. Bioresource Technol 96:1592-1598.
doi:10.1016/j.biotech.2004.12.020.
Ahmad M. 1958. Key to the Indomalayan termites. Biologia 4:33-198.
Azman NB. 2009. Isolation and Characterization of potential cellulolytic bacteria
from masterfeed using 16S rRNA and biochemicals methods [thesis].
Fakultas Biosains dan Bioteknik, Universitas Teknologi Malaysia.
Benson HJ. 2001. Microbiological Applications Labolatory Maual in General
Microbiology. Brown AE, editor. New York (AS): McGraw-Hill.
Burd EM, Sharp SE. 2012. Answer to photo quiz: Paracoccus yeei. J Clin
Microbiol 50: 543. doi: 10.1128/JCM06021-11.
Butt HL, Taylor DC, Crippst AW, Clancy RL, Murree-Allen K, Hensley MJ,
Saunders NA, Shuterland DC. 1998. Biotyping respiratory Haemophilus
species with the microbact system. Pathology 20: 253-255.
Eggleton P. 2011. An Introduction of Termites: Biology, Taxonomy, and
Functional Morphology. Di dalam Bignell, DE, Roisin Y, Lo N, editor.
Biology of Termites: A Moderns Synthesis. New York (US): Springer
Dordcreht Heidelberg. Halaman:1-26. doi:10.1007/978-90-481-3977-4_1.
Funke G, Frodl R, Sommer H. 2004. First comprehensively documented case of
Paracoccus yeei infection in a human. J Clin Microbiol 42:3366-3368.
doi: 10.1128/JCM.42.7.3366-3388.2004.
Gethartd P, Costilow RN, Krieg RGE, Nester EW, Phillips GB, Wood WA. 1981.
Manual of Methods for General Bacteriology. Washington (AS): ASM
Press.
Gupta P, Samant T, Sahu A. 2012. Isolation of cellulose-degrading bacteria and
determination of their cellulolytic potential. Int J Microbiol 2012:1-5.
doi:10.1155/2012/578925.
Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology 9th Edition. Baltimore (US): Lippincott
Williams & Wilkins. Halaman : 175-274
Morana A, Murelli L, Ionata E, La Cara F, Rossi M. 2011. Cellulase from Fungi
and Bacteria and their Biotechonological Applications. Di dalam: Golan
AE, editor. Cellulase: Types and Action, Mechanism, and Uses. New York
(US): Nova Science Publisher. Halaman:1-79.
Nakashima K, Watanabe H, Saitoh H, Tokuda G, Azuma JI. 2002. Dual cellulosedigesting system of the wood-feeding Coptotermes formosanus Shiraki.
Insect Biochem Mol Biol 32:777-784.
Ohkuma M, Brune A. 2011. Diversity,Structure, and Evolution of the Termite Gut
Microbial Community. Di dalam: Bignell, DE, Roisin Y, Lo N, editor.
Biology of Termites: A Moderns Synthesis. New York (US): Springer
Dordcreht Heidelberg. Halaman:413-438. doi:10.1007/978-90-481-39774_1.
Roonwal ML, Chhotani OB. 1961. The termite Macrotermes gilvus malayanus
(Haviland) (Termitidae) in Burma. Proc Nat Inst Sci India 27:308-316.
13
Tambunan B, Nandika D. 1987. Deteriorasi Kayu oleh Faktor Biologis. Bogor
(ID): PAU IPB.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5:
Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,
evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol
10:2731-2739. doi: 10.1093/molbev/msr121.
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. CLUSTAL W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice.
Nucleic Acids Res 22:4673-4680.
Wallet F, Blondiaux N, de Sainte Foy CL, Loïez C, Armand S, Pagniez D,
Courcol RJ. 2010. Paracoccus yeei: a new unusual opportunistic
bacterium in ambulatory peritoneal. Int J Infect Dis 4: 173-174
Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 1991. 16S ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study. J Bacteriol 173:697-703.
Wenzel M, Schönig M, Berchtold M, Kämpfer P, König H. 2002. Aerobic and
facultatively anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of termite
Zootermopsis angusticollis. J App Microbiol 92:32-40.
14
RIWAYAT HIDUP
Penulis merupakan anak kedua dari pasangan Arief Murdiman dan Siti
Rodiyah yang lahir pada tanggal 22 Februari 1990 di Bogor. Penulis menjalani
pendidikan resmi pada SDN Cibuluh 1 Bogor (1996-2002), SMPN 5 Bogor
(2002-2005), dan SMAN 3 Bogor (2005-2008). Pada 2008, penulis diterima di
Departemen Biologi, Fakultas Mtamatika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB).
Selama pendidikan di IPB, penulis aktif di beberapa organisasi, seperti
Forum Silaturahmi Alumni (FSA) SMA Negeri 3 Bogor sebagai anggota infokom
(2008-2009), Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) dan anggota Bioworld
(2009-2010). Selain itu, penulis juga aktif dalam acara kemahasiswaan seperti
Pesta Sains Nasional, Biology On Xperiment (BOX), Pemilihan Raya (Pemira)
Himabio 2009, dan lain-lain. Selama pendidikan, penulis mendapatkan bantuan
beasiswa Bantuan Belajar Mahasiswa (BBM).
Selama pendidikan, penulis aktif dalam asistensi kelas praktikum seperti
Ekologi Dasar, Mikrobiologi Dasar, Fisiologi Prokariot, Perkembangan Hewan,
dan Fisiologi Tumbuhan. Pada Juli 2010, penulis melakukan kegiatan studi lapang
dengan judul Lumut Epifil di Taman Nasional Pananjung Pangandaran. Pada Juli
2011, penulis melakukan praktik lapang dengan judul Analisis Aktivitas Enzim
Pektinase Trichoderma sp. di Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu
Pengetahuan (LIPI) Cibinong.
SELULOLITIK SIMBION USUS BELAKANG RAYAP
PEKERJA Macrotermes gilvus
ANDRI FERBIYANTO
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi, Karakterisasi,
dan Identifikasi Bakteri Selulolitik Simbion Usus Belakang Rayap Macrotermes
gilvus adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan ataupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2013
Andri Ferbiyanto
NIM G34080088
ABSTRAK
ANDRI FERBIYANTO. Karakterisasi, dan Identifikasi Bakteri Selulolitik
Simbion Usus Rayap Pekerja Macrotermes gilvus. Dibimbing oleh IMAN
RUSMANA dan RIKA RAFFIUDIN.
Rayap adalah serangga sosial yang memiliki morfologi beragam dan
terdiri atas tiga kasta: reproduktif, tentara, dan pekerja. Macrotermes gilvus
merupakan rayap pembuat gundukan tanah. Dalam pencernaannya, rayap
menggunakan dua sumber enzim selulolitik, yaitu enzim selulase yang dihasilkan
oleh rayap itu sendiri dan enzim selulase yang dihasilkan oleh mikroba simbion
rayap. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi bakteri selulolitik simbon
usus rayap pekerja M. gilvus, serta mengidentifikasinya berdasarkan gen 16S
rRNA. Bakteri yang berasal dari usus rayap diisolasi dan dikulturkan di media
CMC. Isolat bakteri diuji sifat biokimianya dengan menggunakan kit Microbact
12A dan 12B. Bakteri dengan indeks zona bening tertinggi dianalisis sekuen gen
16S rRNA-nya. Sebanyak empat isolat selulolitik berhasil diisolasi dari bagian
usus rayap M. gilvus dengan sifat aerob dan anaerob fakultatif. Indeks selulolitik
terbesar ditunjukkan oleh isolat RA6 sebesar 2.5. Hasil analisis BLAST-N sekuen
gen 16S rRNA-nya menunjukkan bahwa isolat RA 6 memiliki kemiripan 99%
dengan Paracoccus yeei. Hasil ini mengindikasikan bahwa isolat RA 6 adalah
bakteri selulolitik P. yeei yang bersimbiosis dengan M. gilvus di usus
belakangnya.
Kata kunci: usus rayap, Terminidae, Macrotermes gilvus, selulase, 16S rRNA, P.
yeei
ABSTRACT
ANDRI FERBIYANTO. Characterization, and Identification of Cellulolytic
Bacteria of Termite Gut Symbionts of worker Macrotermes gilvus. Under
direction of IMAN RUSMANA and RIKA RAFFIUDIN.
Termites are social insect that have diverse morphology. They have three
castes that are reproductives, soldiers, and workers. Macrotermes gilvus belongs
to mound builder termite. In their role to digest cellulose, termites use two sources
of cellulolytic enzyme, i.e. cellulases produced by the termite , and cellulases
produced by the guts symbions. This study was aimed to characterise cellulolytic
bacteria of termite hindgut symbionts of worker M. gilvus and to identify the
cellulolityc bacteria based on sequences of 16S rRNA gene. Cellulolitic bacteria
of termite gut symbionts were isolated and cultured in CMC media. The
biochemical characters of bacteria isolats were assayed using Microbact 12A and
12B. Cellulolitic activity was determined based on formation of clear zone index
in CMC media bacterial isolats and were tested for biochemical test as well as its
cellulase activity based on clear zone. The highest clear zone index isolats genome
sequence were analyzed. Four isolates of cellulolitic bacteria were successfully
isolated from gut of M. gilvus with aerobic and anaerobic status. The highest
formation of clear zone index (2.5) was showed by isolat RA6 isolat. BLAST-N
result of 16S rRNA gene sequences of RA6 isolat showed 99% similarity with
Paracoccus yeei. This result indicated that RA6 isolat was P. yeei, a cellulolitic
bacterium of a termite hindgut of M. gilvus.
Keyword: hindgut, Terminidae, cellulase, 16S rRNA
KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
SELULOLITIK SIMBION USUS BELAKANG RAYAP
PEKERJA Macrotermes gilvus
ANDRI FERBIYANTO
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Selulolitik Simbion Usus
Rayap Macrotermes gilvus.
Nama
NIM
: Andri Ferbiyanto
: G34080088
Disetujui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Pembimbing I
Dr Ir Rika Rafiudin, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya yang telah memberikan saya keempatan untuk menjejakkan
kaki di dunia ilmu pengetahuan. Penulis mengucapkan rasa terima kasih yang
terdalam kepada orang-orang yang telah membantu dan membimbing penulis
dalam penelitian ini sehingga penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik.
Skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa adanya bantuan, arahan, dan nasehat
dari para pembimbing penulis, yaitu Dr Ir Iman Rusmana MSi, dan Dr Ir Rika
Raffiudin MSi, yang penulis sangat bersyukur dapat dibimbing oleh beliau, serta
Bapak Dr Ir Ence Darmo Jaya Supena Msi sebagai Ketua Departemen selama
penulis berada di Departemen Biologi, penulis ucapkan terima kasih sebesarbesarnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada staff mikrobiologi (Pak
Jaka, Bu Heni, dan Aldian) yang telah membantu penulis selama masa penelitian.
Tidak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Ibu Alina Akhdiya MSi dan
Bapak Sipri Yadi MSi yang telah memberikan nasehat, dorongan, dan bantuannya
kepada penulis, kepada teman-teman di pasca Mikrobiologi (Kak Mafri, Kak
Fendi, dan Kak Yessy) dan Biologi (Kak Sari, Afnan, Wathri, Whendi, Esa,
Chusna, Widyo) yang telah membantu penulis untuk tetap berjuang dalam
membangun minat dan mengejar mimpi. Secara khusus, penulis mengucapkan
terima kasih kepada bibi penulis yang telah memberikan dukungan dana sehingga
penulis dapat menyelesaikan pendidikan sarjana. Tidak lupa juga pada seseorang
yang telah memberikan warna pada hati penulis.
Terakhir bukan berarti berakhir, untuk mereka yang telah saya temui, semua
peristiwa yang telah saya lewati, kalian yang membentuk saya sekarang. Tanpa
kalian,saya tidak mungkin berada disini sekarang. Penulis berharap skripsi ini
dapat berguna bagi dunia ilmu pengetahuan.
Bogor, September 2013
Andri Ferbiyanto
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
1
Bahan
1
Alat
2
Isolasi Bakteri dan Pemurnian Isolat
2
Pewarnaan Gram
2
Uji Biokimia Isolat Bakteri
2
Uji Aktivitas Selulolitik
3
Isolasi DNA
3
Amplifikasi Gen 16S rRNA
3
Analisis dan Konstruksi Pohon Filogenetik
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
4
4
Karakteristik Isolat Bakteri Selulolitik asal Usus Rayap
4
Karakteristik Biokimia Isolat Hasil Isolasi
5
Aktivitas Selulolitik Isolat Hasil Isolasi
6
Identifikasi dan Filogenetik Bakteri Hasil Isolasi
6
Pembahasan
10
SIMPULAN
11
Simpulan
11
DAFTAR PUSTAKA
12
RIWAYAT HIDUP
10
DAFTAR TABEL
1 Jumlah Bakteri Selulolitik yang Berhasil Diisolasi dari Usus Rayap
4
Karakteristik dan Morfologi Isolat Bakteri Selulolitk Asal Usus
Belakang Rayap Pekerja M. gilvus
5
3
Karakterisik biokimia isolat bakteri hasil isolasi
6
4
Hasil Identifikasi Menggunakan Perangkat Lunak Microgen 2.0
7
2
5 Aktivitas selulolitik isolat bakteri hasil isolasi dari usus kasta pekerja M.
gilvus
7
6
9
Hasil BLAST-N berdasarkan sekuen 16S rRNA dari isolat RA6
DAFTAR GAMBAR
1
Pewarnaan Gram isolat bakteri hasil isolasi
6
2
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA isolat RA6
8
3
Daerah contig hasil sekuen gen 16S rRNA dari isolat RA 2
9
4
Pohon filogenetik isolat RA6 menggunakan piranti lunak MEGA 5.0
10
PENDAHULUAN
Rayap adalah serangga sosial yang memiliki morfologi beragam yang hidup
di dalam koloni. Berdasarkan kemampuan reproduksinya, rayap dibagi menjadi
dua tipe, yaitu: reproduktif (kasta ratu) dan non reproduktif (kasta pekerja dan
kasta prajurit). Ratu hanya bertugas untuk reproduksi. Pekerja memiliki tugas
yang beragam, yatu: mengumpulkan makanan dan air, memangun dan
memperbaiki sarang, dan merawat larva, ratu dan raja. Tugas prajurit hanya
menjaga sarang (Eggleton 2011). Salah satu rayap yang umum dijumpai di
Indonesia berasal dari genus Macrotermes (Tambunan dan Nandika 1987).
Macrotermes gilvus (Isoptera: Macrotermininae) merupakan rayap pembuat
gundukan yang hidup di wilayah Malaya dan Indo-China hingga Indonesia dan
Philipina (Roonowal dan Chhotani 1961). Imago pada spesies ini memiliki ciriciri seperti oseli oval, antena memiliki 19 segmen, dan pronotum berbentuk
setengah lingkaran. Kasta prajurit mayor M. gilvus memiliki ciri-ciri seperti meso
dan metanotal datar melingkar, kepala berwarna merah-kecoklatan, dan antena
memiliki 17 segmen. Kasta prajurit minor memiliki ciri-ciri seperti metanotum
lebih lebar dari mesonotum dan segmen ketiga pada antena sama panjang dengan
segmen keempat, tetapi lebih panjang dari segmen kedua (Ahmad 1958). Kasta
pekerja M. gilvus memiliki ciri-ciri seperti kepala coklat kekuningan, oselli
tereduksi, warna pada abdomen dan toraks lebih pucat dari kepala, dan pronotum
berbentuk seperti sadel (Roonwal dan Chhotani 1961).
Rayap pekerja mencerna lignoselulosa dengan menggunakan dua sumber
enzim selulolitiknya, yaitu selulase yang dihasilkan oleh rayap itu sendiri dan
selulase yang dihasilkan oleh simbion rayap (Nakashima et al. 2002), salah
satunya adalah bakteri endogenus usus rayap (Ohkuma dan Brune 2011). Selulosa
merupakan polimer linear dari banyak molekul glukosa yang saling berikatan
dengan tipe ikatan β-1,4-glikosidik. Ikatan tersebut dihidrolisis oleh enzim
selulase yang juga berperan dalam daur ulang polisakarida tersebut. Selulase
dengan enzim lainnya bekerja sama untuk mendegradasi sel tumbuhan (Morana et
al. 2011). Contoh beberapa bakteri simbion pada saluran pencernaan rayap adalah
Enterobacter aerogens, E. cloacae, Serattia marcescens, dan Citrobacter farmeri
yang merupakan bakteri indigenus dari usus rayap Coptotermes formosanus
(Adams dan Boopathy 2005). Bakteri-bakteri tersebut merupakan bakteri
indigenus usus rayap yang belum dikarakterisasi enzim selulasenya. Oleh karena
itu penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi bakteri simbion usus rayap
penghasil enzim selulase dan mengidentifikasinya berdasarkan gen 16S rRNA.
METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain rayap pekerja M.
gilvus yang dikoleksi dari hutan belakang Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
(FPIK) Intitut Pertanian Bogor (IPB), media Carboxyl-Methyl-Cellulose (CMC),
gas generating kit (Oxoid anaerobic system BR0038B), Microbact 12A dan 12B
2
(Microgen Bioproducts), larutan Merah Kongo, Larutan NaCl 2M, reagen VogesProskauer, reagent nitrit, Xprep Soil DNA mini kit (Phile Korea Technology Inc.),
dan PCR kit (Takara).
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain toples anaerobik,
set pipet mikro beserta tipnya, mesin PCR, alat elektroforesis, UV TransIluminator, dan peralatan umum lainnya di laboratorium mikrobiologi.
Isolasi Bakteri dan Pemurnian Isolat
Sterilisasi permukaan pada rayap yang akan digunakan dilakukan dengan
cara dicelupkan ke dalam alkohol 70% selama 30 detik. Rektum rayap ditusuk
menggunakan jarum inokulasi (rektum dicocokkan dengan buku Biology of
Termites (Eggleton 2011)), kemudian digoreskan ke media agar cawan CMC dan
agar cawan CMC diinkubasi pada keadaan aerob dan anaerob. Koloni bakteti
yang tumbuh kemudian dimurnikan dengan cara digores pada media agar-agar
CMC dengan menggunakan metode kuadran. Koloni bakteri yang sudah murni
disimpan pada media agar miring CMC. Koloni bakteri murni diamati bentuknya
dengan menggunakan buku Microbial Applications Laboratory manual in
General Microbiology 8th Ed (Benson 2001).
Pewarnaan Gram
Isolat bakteri yang ditumbuhkan di media agar-agar CMC diambil dan
digores di atas gelas obyek yang memiliki genangan akuades, dan dikeringudarakan. Fiksasi preparat dilakukan dengan menggunakan panas. Larutan kristal
violet digenangkan di atas gelas objek selama dua menit, kemudian dibilas dengan
akuades. Setelah itu, iodin digenangkan di bekas bilasan selama satu menit
sebelum dibilas kembali. Alkohol 96% diteteskan di atas bekas bilasan Iodin, dan
dibilas kembali. Safranin digenangkan selama 30 detik sebelum dibilas kembali
(Benson 2001). Gelas objek hasil perwarnaan gram diamati dengan menggunakan
mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000×.
Uji Biokimia Isolat Bakteri
Uji biokimia isolat dilakukan dengan menggunakan Microbact Kit 12A-12B
(Medvet Diagnositics, Thebarton, SA, Australia). Isolat bakteri yang digunakan
untuk uji fisiologis diremajakan menggunakan media agar-agar miring CMC.
Sebanyak 6 mL garam fisiologis dituang ke agar miring lalu dihomogenkan
dengan menggunakan vorteks. Selanjutnya, sebanyak 0.1 mL larutan ditambahkan
ke dalam sumur di kit Microbact 12A dan 12B dan diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 37ºC (Butt et al. 1988). Profil hasil uji dicocokkan dengan profil di buku
MicrogenTM GnA+B-ID System dan perangkat lunak Microgen 2.0 untuk
mendapatkan hasil uji biokimia dan nama spesies dari isolat bakteri yang diuji.
3
Uji Aktivitas Selulolitik
Seluruh isolat bakteri ditumbuhkan pada media agar-cawan CMC dan
diinkubasi selama tiga hari pada suhu ruang. Larutan merah Kongo diteteskan ke
koloni bakteri kemudian dibilas menggunakan larutan NaCl 2M sebanyak tiga
kali. Zona bening yang terbentuk diukur dengan menggunakan penggaris dan
Indeks selulolitik (IS) aktivitas selulolitik dihitung dengan menggunakan rumus:
Isolasi DNA
DNA genom isolat bakteri diisolasi menggunakan Xprerp Soil DNA Mini
Kit (PhileKoerea Technology). Langkah pertama, pelet sel isolat bakteri dicuci
sebanyak tiga kali dengan cara 750 µL bufer Tris-EDTA (TE) dituang ke dalam
tabung mikro, disuspensi, dan dipusingkan dengan kecepatan 10000 rpm selama
lima menit. Sebanyak 250 µL XPSDE bufer 1, 20 µL proteinase-K (2 mg/mL),
dan 2 mg glass beads ditambahkan ke pelet sel, lalu diinkubasi pada suhu 70ºC
selama sepuluh menit. Sampel ditambah 100 µL XPSDE bufer 2 dan diinkubasi di
es selama lima menit. Selama lima menit, sampel dipusingkan dengan kecepatan
10000 rpm. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro baru dan ditambah 200 µL
XPSDE bufer 3. Langkah berikutnya, sampel diinkubasi pada suhu ruang selama
dua menit. Supernatan hasil pemusingan dipindahkan ke tabung mikro baru, dan
ditambahkan 250 µL XPSDE bufer 4 dan ethanol 100% ke dalam supernatan.
Setelah dihomogenkan, sampel dipindahkan ke tabung mikro kolom dan
dipusingkan. Kemudian, sebanyak 750 µL bufer elusi ditambahkan dan
dipusingkan. Selanjutnya tabung mikro kolom dipindahkan ke tabung mikro baru
dan ditambahkan 50 µL bufer elusi, lalu dipusingkan. DNA genom hasil isolasi
kemudian digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA. Hasil isolasi diperiksa
dengan dimigrasikan pada gel agarosa 1% dengan kondisi voltase 75V selama 1
jam.
Amplifikasi Gen 16S rRNA
Takara LaTaq GC Buffer PCR merupakan resep komposisi PCR yang
digunakan untuk proses amplifikasi pada penelitian ini. Komposisi larutan untuk
amplifikasi terdiri atas primer forward 20F (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG3’) (10 pm) 0.5 µL, primer reverse 1500R ((5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)
(10 pm) 0.5 µL, 10× Long Polymerase Taq (5U/ µL) 0.2 µL, GC bufer (5 mM) 10
µL, dNTP (2.5 mM) 3.2 µL, DNA template (1.76 ng/mL) 2 µL, dan ddH2O hingga
volume total mencapai 20 µL. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan
menggunakan mesin PCR dengan 30 siklus dengan kondisi PCR: pre-denaturasi
(94°C, 4 menit), denaturasi (94°C, 40 detik), annealing (55ºC, 1 menit), elongasi
(72ºC, 1 menit 10 detik), dan post-elongasi (72ºC, 10 menit). Selanjutnya
amplikon dielektroforesis dengan gel agarosa 1% dan divisualisasi menggunakan
UV Trans-Iluminator.
4
Analisis dan Konstruksi Pohon Filogenetik
Sekuen nukleotida hasil analisis dari perusahaan sekuensing disejajarkan
dengan menggunakan ClustalW (Thompson et al. 1994). Hasil pensejajaran dicari
homologinya dengan database Genbank menggunakan program BLAST-N
(www.ncbi.mlm.niv.gov) dan disejajarkan kembali dengan menggunakan
ClustalW. Selanjutnya pohon filogenetik dikonstruksi menggunakan program
Neighbor-Joining Tree Method dengan nilai bootstrap 1000× (Tamura et al.
2011).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Karakteristik Isolat Bakteri Selulolitik Asal Usus Rayap
Total isolat bakteri selulolitik asal usus rayap yang berhasil diisolasi dari
keempat rayap M. gilvus hasil koleksi asal hutan FPIK IPB yaitu sebanyak tujuh
isolat. Ketujuh isolat tersebut diisolasi dalam keadaan aerob dan anaerob.
Sebanyak lima isolat berhasil diisolasi secara aerob, sedangkan dua isolat lainnya
berhasil diisolasi secara anaerob (Tabel 1).
Tabel 1 Jumlah Bakteri Selulolitik yang Berhasil Diisolasi dari Usus Rayap
Rayap
1
Aerob
2
2
3
4
1
1
1
Jumlah Isolat
Kode
Anaerob
RU 1
1
RU 2
RU 3
1
RU 4
RU 5
-
Kode
RA 1
RA 2
Morfologi koloni semua bakteri selulolitik manunjukkan karakteristik
yang beragam (Tabel 2). Total isolat bakteri selulolitik yang berhasil diisolasi dari
usus rayap yaitu sebanyak tujuh isolat. Empat isolat dari tujuh isolat bakteri
selulolitik (RU 1, RU 3, RU 4 dan RA 2) yang mampu tumbuh dengan baik pada
media agar-CMC. Keempat isolat tersebut terdiri atas tiga isolat yang diisolasi
secara aerob (RU) dan satu isolat yang diisolasi secara anaerob (RA) (Tabel 1).
Berdasarkan hasil pewarnaan Gram, seluruh isolat merupakan bakteri Gram
negatif (Gambar 1). Selanjutnya dilakukan pewarnaan Gram. Berdasarkan hasil
pewarnaan Gram, keempat isolat bakteri meiliki sifat pewarnaan Gram negatif
yang ditandai dengan warna merah muda, dengan bentuk sel kokus dan batang
pendek.
5
Tabel 2 Morfologi dan karakteristik keutuhan atas oksigen isolat bakteri
selulolitik asal usus belakang rayap
Empat isolat dari tujuh isolat bakteri selulolitik terisolasi (RU 1 RU 3 RU
Kondisi
Isolat
Morfologi Koloni
Karakteristik
Saat Isolasi
RU 1
Aerob
Bundar
Permukaan licin
Cembung
Beraroma
Berwarna putih krem
Aerob
RU 2
Aerob
Bundar
Permukaan licin
Cembung
Beraroma
Berwarna putih krem
Anaerob
RU 3
Aerob
Bundar
Permukaan licin
Cembung
Beraroma
Berwarna putih krem
Anaerob fakultatif
RU 4
Aerob
Bundar
Permukaan licin
Berwarna Putih
Permukaan Rata
Anaerob fakultatif
RU 5
Aerob
Bundar
Permukaan licin
Berwarna Kuning
Cembung
Anerob fakultatif
RA 1
Anaerob
Bundar
Permukaan licin
Cembung
Beraroma
Berwarna putih krem
Anerob fakultatif
RA 2
Anaerob
Bundar
Permukaan licin
Berwarna Putih
Cembung
Beraroma
Anerob fakultatif
6
A
B
C
D
Gambar 1 Pewarnaan Gram isolat bakteri hasil isolasi dengan hasil perwarnaan
Gram negatif, (A) isolat RU 1 berbentuk kokus, (B) isolat RU 3
berbentuk batang pendek, (C) isolat RU 4 berbentuk kokus, dan (D)
isolat RA 6 berbentuk kokus.
Karakteristik Biokimia Isolat Hasil Isolasi
Hasil karakterisasi biokimia bakteri hasil isolasi menunjukkan seluruh isolat
memiliki hasil positif pada oksidase, protease, dan produksi β-galaktosidase. Tiap
isolat memiliki karakteristik biokimia yang tidak dimiliki oleh isolat lainnya,
seperti reduksi nitrat dan fermentasi arabinosa hanya bisa dilakukan oleh RU4 dan
RA6. Isolat RU3 yang dapat memfermentasi glukosa, xilol, dan sukrosa
Tabel 3 Karakterisik biokimia isolat bakteri hasil isolasi
Isolat
Mot
Oxi
Nit
Lys
Or
H2
Glu
Man
Xyl
RU 1
RU 3
RU 4
RA 6
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
-
+
-
Isolat
OP
Ind
Ure
VP
Cit
TDA
Gel
Mal
Ino
RU 1
RU 3
RU 4
RA 6
+
+
+
+
-
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
+
7
Lanjutan Tabel 3 Karakterisik biokimia isolat bakteri hasil isolasi
Isolat
Sor
Rha
Suc
Lac
Ara
Ado
Raf
Sal
Arg
RU 1
RU 3
RU 4
RA 6
-
-
+
-
-
+
+
-
-
-
-
Keterangan:
Mot
Oxi
Nit
Lys
Or
H2
Glu
Man
Xyl
OP
Ind
Ure
VP
: Motilitas
: Oxidase
: reduksi nitrat
: Lysine
: Ornithine
: H 2S
: Glukosa
: Manitol
: Xilosa
: β-galaktosidase
: Indole
: Uerase
: Produksi Acetoin
Cit : Citrat
TDA :Tryptophan deaminase
Gel : Protease
Mal : Malonat
Ino : Inositol
Sor : Sorbitol
Rha : Rhamnosa
Suc : Sucrosa
Lac : Lactosa
Ara : Arabinosa
Sal : Salicin
Arg : Arginin
.
Berdasarkan hasil uji identifikasi menggunakan sifat biokimianya,
didapatkan spesies yang beragam dengan persentase tertinggi pada isolat RU 4,
yaitu 96,68% dan terendah pada RA 2, yaitu 69,77 %. Berikut adalah hasil
identifikasi menggunakan perangkat lunak Microgen 2.0 (Tabel X)
Tabel 4 Hasil Identifikasi Menggunakan Perangkat Lunak Microgen 2.0
Kode
Isolat
RU 1
RU 3
RU 4
RA 2
Persentasi
(persen)
92.13
92.83
96.68
69.77
Hasil Identifiksi
Moraxella
Bulkhoderia cepacia
Actinobacillus
Mannhemia haemolytica
Aktivitas Selulolitik Isolat Hasil Isolasi
Isolat bakteri selulolitik hasil isolasi dari usus belakang rayap ditunjukkan
dengan adanya zona bening di sekitar koloni bakteri. Hasil uji zona bening
menunjukkan bahwa isolat RA 6 memiliki IS terbesar dengan nilai 2,5 dan isolat
RU 3 memiliki IS terkecil dengan nilai 0,75 (Tabel 3). Berdasarkan IS isolat RA6
merupakan isolat bakteri potensial untuk diuji lebih lanjut.
Tabel 5 Aktivitas selulolitik isolat bakteri hasil isolasi dari usus kasta
pekerja M. gilvus
Isolat
RU 1
RU 3
RU 4
RA 6
Diameter
Koloni (mm)
3.5
6.0
8.0
2.0
Diameter Zona
Bening (mm)
6.5
10.5
14.5
5.0
Indeks
Selulolitik
0.875
0.750
0.813
2.500
8
Identifikasi dan Filogenetik Isolat Bakteri Hasil Isolasi
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA yang dielektroforesis pada gel agarosa
1% menunjukkan amplikon berukuran sekitar 1500 pasang basa (Gambar 2). Hasil
BLAST-N sekuen gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat RA6 memiliki
kedekatan dengan Paracoccus yeei yang ditunjukkan dengan nilai kemiripan
sebesar 99% (NR_029038.1) dengan e.value 0.0 (tabel 4). Berdasarkan hasil
konstruksi menggunakan Neighbour Joining Method (Bootstrap 1000x)
menunjukkan hasil konstruksi pohon filogenetik sampel RA6 yang diperoleh dari
usus rayap seperti terlihat (Gambar 3).
Marker
1000 bp
1500 bp
RA 6
1500 bp
1000 bp
500 bp
200 bp
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA isolat RA 2
Hasil daerah contig menunjukkan basa adenin sebanyak 168 basa, sitosin
sebanyak 149 basa, guanine sebanyak 209 basa, dan timin sebanyak 131 basa dari
total sebanyak 657 basa. Berikut adalah gambar daerah contig hasil sekuen gen
16S rRNA isolat RA6.
RA6_20F.
RA6_1500R.
CAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCC-GGCTAACTC 399
------------TAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCCGGCTAAATC 38
**************************** ****** **
RA6_20F
RA6_1500R
CGTGCCAGC-AGCCGCGG-TAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAAT 447
CGTGCCAGCCAGCCGCGGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAAT 88
********* ******** *******************************
RA6_20F
RA6_1500R
TACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACCGGAAAGTCAGAGGTGAAATC 497
TACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACCGGAAAGTCAGAGGTGAAATC 138
**************************************************
RA6_20F
RA6_1500R
CC-AGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTGAAACTATCGGTCTGGAGTTCG 546
CCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTGAAACTATCGGTCTGGAGTTCG 188
** ***********************************************
RA6_20F
RA6_1500R
AGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCG 596
AGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCG 238
**************************************************
9
RA6_20F
RA6_1500R
GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAG 646
GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAG 288
**************************************************
RA6_20F
RA6_1500R
GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC 696
GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC 338
RA6_20F
RA6_1500R
**************************************************
GTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTGACACAC 746
CGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTGACACAC 388
**************************************************
RA6_20F
RA6_1500R
CTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACT 796
CTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACT 438
**************************************************
RA6_20F
RA6_1500R
CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT 846
CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT 488
**************************************************
RA6_20F
RA6_1500R
CGAAGCAACGCG-------------------------------------- 858
CGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCGCAGGACAGCCCG 538
************
Gambar 3 Daerah contig hasil sekuen gen 16S rRNA dari isolat RA6
Tabel 6 Hasil BLAST-N gen sekuen 16S rRNA dari isolat RA6
Nomor Assesi
Spesies
Skor
Maksimun
1127
Skor
Total
1127
query
cover
100%
e
value
0
max
ident
99%
NR_029038.1
Paracoccus yeei strain G1212
NR_025858.1
P. thiocyanatus strain THI 011
1061
1061
100%
0
98%
NR_026456.1
P. denitrificans strain 381
1055
1055
100%
0
97%
NR_042715.1
P. aminophilus strain ATCC 49673
Rhodobacter changlensis strain
JA139
Haemobacter missourensis strain
CCUG 52307
1048
1048
100%
0
97%
941
941
99%
0
93%
931
931
99%
0
93%
Rugeria atlantica strain IAM14463
911
911
99%
0
92%
NR_025440.1
NR_044545.1
NR_044315.1
Hasil konstruksi pohon filogenetik mengambarkan kedudukan isolat RA6
berada satu clade dengan bakteri Paracoccus yeei (NR 026456.1) dengan nilai
bootstrap sebesar 100. Hal ini menegaskan bahwa isolat RA6 merupakan P. yeei
10
.
Gambar 4 Pohon filogenetik isolat RA6 menggunakan piranti lunak MEGA 5.0
Pembahasan
Bakteri yang berasal dari usus rayap memiliki sifat aerob, anaerob fakultatif,
dan mikroaerofil (Wenzel et al. 2002). Berdasarkan karakterisasi pertumbuhan
pada kondisi aerob dan anaerob, diperoleh bahwa seluruh isolat bakteri selulolitik
dari usus rayap pekerja M. gilvus adalah bakteri yang bersifat anaerob fakultatif,
kecuali isolat RU1 yang bersifat aerob. Pewarnaan Gram pada isolat menunjukkan
bahwa seluruh isolat memiliki pewarnaan Gram negatif, jika dibandingkan dengan
Enterobacter aerogens, E. cloacae, Serattia marcescens, dan Citrobacter farmeri
bakteri hasil isolasi memiliki kesamaan sebagai bakteri Gram negatif dan dapat
ditemukan berasosiasi dengan makhluk hidup (Holt et al. 1994). Pewarnaan Gram
dilakukan pada isolat RU 1, RU 3, RU 4 dan RA 2 karena isolat lainnya diduga
memiliki viabilitas rendah.
Uji karakteristik biokimia isolat hasil isolasi menggunakan kit
MicrobactTM 12A dan 12B menunjukkan hasil yang bervariasi, kecuali untuk
beberapa uji, seperti positif pada protease dan negatif pada fermentasi gula
(arginin, salisilat, adonitol, laktosa, rhamonsa, dan sorbitol), ornithine, dan
produksi triptofan deaminase. Hasil uji biokimia yang terpisah menunjukkan
bahwa seluruh isolat memiliki persamaan pada uji motilitas (negatif) dan uji
oxidase (positif). Perbandingan dengan isolat bakteri selulolitik hasil isolasi dari
masterfeed menunjukkan bahwa hasil uji biokimia positif pada reaksi oksidase
dan fermentasi, dan hasil negative pada sitrat, produksi indol, reduksi nitrat, dan
produksi acetoin (Azman 2009). Isolat tersebut memiliki kesamaan dengan isolat
RU3. Isolat RU1 memiliki perbedaan dengan isolat tersebut pada kemampuan
untuk fermentasi, sedangkan RU4 dan RU6 memiliki perbedaan pada kemampuan
reduksi nitrat. Hasil identifikasi menggunakan Microbact 2.0 menunjukkan nilai
yang rendah pada isolat RA 2 sehingga diperlukan uji lebih lanjut pada isolat
tersebut.
Aktivitas selulolitik isolat ditunjukkan dengan adanya zona bening pada
media agar-cawan CMC yang telah diwarnai dengan larutan merah Kongo. Isolat
RA6 memiliki zona bening terbesar (2.5) dan isolat RU3 memiliki indeks zona
bening terendah (0.75). Jika dibandingkan dengan bakteri selulolitik rayap hasil
penelitian Gupta et al. (2012) dengan nilai indeks zona bening 4.29 hingga 5.49,
bakteri selulolitik hasil isolasi cukup rendah.
11
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer 20F dan 1500R
menunjukkan ukuran amplikon berukuran 1500 pasang basa. Hal ini sesuai
dengan pernyataan Weissburg (1991) yang mengemukakan bahwa amplikon yang
menggunakan primer 20F dan 1500R memiliki ukuran amplikon sekitar 1500
pasang basa. Berdasarkan identifikasi molekuler gen 16S rRNA, isolat bakteri
RA6 memiliki kemiripan 99% dengan Paracoccus yeei dengan nilai E.value
sebesar 0.0. P. yeei adalah bakteri gram negatif, berbentuk kokus-basil dan
memiliki sifat biokimia seperti katalase dan oksidase positif, non-motil, reaksi
positif pada uji reduksi nitrat, arginin dihidrolase, asimilasi pada arabinosa dan
malat, dan reaksi negatif pada urease, indol, eskulin hidrolisis, gelatinase, βgalaktosidase, penggunaan substrat glukosa, manosa, N-asetilglukosamin, maltosa,
glukonat, kaprat, sitrat, dan fenil-asetat (Funke et al. 2004). Jika dibandingkan
dengan isolat RA6, didapatkan perbedaan pada uji arginin, arabinosa, gelatinase,
glukosa, indol, dan β-galaktosidase.
Habitat dari P. yeei sangat beragam. P. yeei dapat dijumpai pada
sedimentasi di laut India dan Kosta Rika, pada buku tua di perputakaan Korea,
insektisida yang tercampur tanah di Cina, produk fermentasi peternakan (Burd dan
Sharp 2012), dan umum dijumpai di tanah (Wallet et al. 2010). Oleh karena itu, P.
yeei diduga masuk ke dalam pencernaan rayap melalui proses anal feeding.
Bakteri E. aerogens, E. cloacae, dan S. marcescens memiliki beberapa
kesamaan proses biokimia, yaitu hasil positif pada reduksi nitrat, metabolisme
dengan menggunakan substrat sorbitol, manitol, sitrat, sukrosa, laktosa, dan
salisin, dan menghasilkan β-galaktosidase, dan hasil negatif pada produksi gas
H2S (Holt et al. 1994). Isolat RA6 yang diduga P.yeei, jika dibandingkan dengan
beberapa bakteri simbion usus rayap, secara fisiologis memiliki beberapa
persamaan dan perbedaan. Beberapa persamaan yang ditunjukkan diantaranya
yaitu dapat mereduksi nitrat, menghasilkan β-galaktosidase, dan tidak
menghasilkan gas H2S, sedangkan beberapa perbedaannya antara lain
metabolisme ornithin, manitol, sitrat, sorbitol, sukrosa, laktosa, dan salisin.
SIMPULAN
Simpulan
Sebanyak empat isolat bakteri selulolitik berhasil diisolasi dari usus rayap
pekerja Macrotermes gilvus. Isolat tersebut memiliki karakteristik anaerob
fakultatif kecuali untuk isolat RU1. Isolat bakteri dengan kode RA6 memiliki
indeks aktivitas selulolitik terbesar. Bakteri tersebut memiliki kemiripan 99%
dengan Paracocus yeei berdasarkan gen 16S rRNA-nya. Bakteri tersebut diduga
merupakan bakteri selulolitik simbion usus rayap pekerja Macrotermes gilvus.
12
DAFTAR PUSTAKA
Adams L, Booptahy R. 2005. Isolation and characterization of enteric bacteria
from the hindgut of Formosan termite. Bioresource Technol 96:1592-1598.
doi:10.1016/j.biotech.2004.12.020.
Ahmad M. 1958. Key to the Indomalayan termites. Biologia 4:33-198.
Azman NB. 2009. Isolation and Characterization of potential cellulolytic bacteria
from masterfeed using 16S rRNA and biochemicals methods [thesis].
Fakultas Biosains dan Bioteknik, Universitas Teknologi Malaysia.
Benson HJ. 2001. Microbiological Applications Labolatory Maual in General
Microbiology. Brown AE, editor. New York (AS): McGraw-Hill.
Burd EM, Sharp SE. 2012. Answer to photo quiz: Paracoccus yeei. J Clin
Microbiol 50: 543. doi: 10.1128/JCM06021-11.
Butt HL, Taylor DC, Crippst AW, Clancy RL, Murree-Allen K, Hensley MJ,
Saunders NA, Shuterland DC. 1998. Biotyping respiratory Haemophilus
species with the microbact system. Pathology 20: 253-255.
Eggleton P. 2011. An Introduction of Termites: Biology, Taxonomy, and
Functional Morphology. Di dalam Bignell, DE, Roisin Y, Lo N, editor.
Biology of Termites: A Moderns Synthesis. New York (US): Springer
Dordcreht Heidelberg. Halaman:1-26. doi:10.1007/978-90-481-3977-4_1.
Funke G, Frodl R, Sommer H. 2004. First comprehensively documented case of
Paracoccus yeei infection in a human. J Clin Microbiol 42:3366-3368.
doi: 10.1128/JCM.42.7.3366-3388.2004.
Gethartd P, Costilow RN, Krieg RGE, Nester EW, Phillips GB, Wood WA. 1981.
Manual of Methods for General Bacteriology. Washington (AS): ASM
Press.
Gupta P, Samant T, Sahu A. 2012. Isolation of cellulose-degrading bacteria and
determination of their cellulolytic potential. Int J Microbiol 2012:1-5.
doi:10.1155/2012/578925.
Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology 9th Edition. Baltimore (US): Lippincott
Williams & Wilkins. Halaman : 175-274
Morana A, Murelli L, Ionata E, La Cara F, Rossi M. 2011. Cellulase from Fungi
and Bacteria and their Biotechonological Applications. Di dalam: Golan
AE, editor. Cellulase: Types and Action, Mechanism, and Uses. New York
(US): Nova Science Publisher. Halaman:1-79.
Nakashima K, Watanabe H, Saitoh H, Tokuda G, Azuma JI. 2002. Dual cellulosedigesting system of the wood-feeding Coptotermes formosanus Shiraki.
Insect Biochem Mol Biol 32:777-784.
Ohkuma M, Brune A. 2011. Diversity,Structure, and Evolution of the Termite Gut
Microbial Community. Di dalam: Bignell, DE, Roisin Y, Lo N, editor.
Biology of Termites: A Moderns Synthesis. New York (US): Springer
Dordcreht Heidelberg. Halaman:413-438. doi:10.1007/978-90-481-39774_1.
Roonwal ML, Chhotani OB. 1961. The termite Macrotermes gilvus malayanus
(Haviland) (Termitidae) in Burma. Proc Nat Inst Sci India 27:308-316.
13
Tambunan B, Nandika D. 1987. Deteriorasi Kayu oleh Faktor Biologis. Bogor
(ID): PAU IPB.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5:
Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,
evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol
10:2731-2739. doi: 10.1093/molbev/msr121.
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. CLUSTAL W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice.
Nucleic Acids Res 22:4673-4680.
Wallet F, Blondiaux N, de Sainte Foy CL, Loïez C, Armand S, Pagniez D,
Courcol RJ. 2010. Paracoccus yeei: a new unusual opportunistic
bacterium in ambulatory peritoneal. Int J Infect Dis 4: 173-174
Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 1991. 16S ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study. J Bacteriol 173:697-703.
Wenzel M, Schönig M, Berchtold M, Kämpfer P, König H. 2002. Aerobic and
facultatively anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of termite
Zootermopsis angusticollis. J App Microbiol 92:32-40.
14
RIWAYAT HIDUP
Penulis merupakan anak kedua dari pasangan Arief Murdiman dan Siti
Rodiyah yang lahir pada tanggal 22 Februari 1990 di Bogor. Penulis menjalani
pendidikan resmi pada SDN Cibuluh 1 Bogor (1996-2002), SMPN 5 Bogor
(2002-2005), dan SMAN 3 Bogor (2005-2008). Pada 2008, penulis diterima di
Departemen Biologi, Fakultas Mtamatika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB).
Selama pendidikan di IPB, penulis aktif di beberapa organisasi, seperti
Forum Silaturahmi Alumni (FSA) SMA Negeri 3 Bogor sebagai anggota infokom
(2008-2009), Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) dan anggota Bioworld
(2009-2010). Selain itu, penulis juga aktif dalam acara kemahasiswaan seperti
Pesta Sains Nasional, Biology On Xperiment (BOX), Pemilihan Raya (Pemira)
Himabio 2009, dan lain-lain. Selama pendidikan, penulis mendapatkan bantuan
beasiswa Bantuan Belajar Mahasiswa (BBM).
Selama pendidikan, penulis aktif dalam asistensi kelas praktikum seperti
Ekologi Dasar, Mikrobiologi Dasar, Fisiologi Prokariot, Perkembangan Hewan,
dan Fisiologi Tumbuhan. Pada Juli 2010, penulis melakukan kegiatan studi lapang
dengan judul Lumut Epifil di Taman Nasional Pananjung Pangandaran. Pada Juli
2011, penulis melakukan praktik lapang dengan judul Analisis Aktivitas Enzim
Pektinase Trichoderma sp. di Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu
Pengetahuan (LIPI) Cibinong.