Ekstraksi DNA Amplifikasi PCR Polymerase Chain Reaction Elektroforesis

b. Ekstraksi DNA

Deteksi gen PhGH dilakukan pada bagian sirip ekor benih ikan lele. DNA masing-masing sampel diekstraksi menggunakan Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purifica tion Kit dengan prosedur sesuai dengan protokol dari produk tersebut. Prinsip kerja ekstraksi DNA secara ringkas terdiri dari lisis sel, presipitasi DNA, pengikatan DNA pada column, pencucian DNA dan pelarutan DNA.

c. Amplifikasi PCR Polymerase Chain Reaction

Amplifikasi PCR pada DNA genom hasil ekstraksi dilakukan menggunakan fast start PCR master kit Roche, Germany dengan menggunakan mesin Thermal Cycler. Komposisi bahan yang digunakan untuk amplifikasi PCR yaitu Nuclease Free Water 49 µL, Master mix kit fast start PCR 175 µL 10 pmolµL, primer for ward ACT 107 28 µL, primer reverse PhGH2 28 µL. Maka total volume 280 µL dibagi 14 sampel sehingga masing-masing larutan terdiri dari 20 µL dan kemudian ditambahkan DNA genom sebanyak 5 µL pada masing-masing larutan. Primer yang digunakan adalah ACTPhGH-F 5’- GTG TGT GAC GCT GGA CCA ATC - 3’ dan ACTPhGH2-R 5’- CGA TAA GCA CGC CGA TGC CCA TTT - 3’ Marnis dkk., 2013 dengan ukuran fragmen 1500-bp. Proses PCR dilakukan dengan tahapan persiapan enzim pre-denaturation pada suhu 95 C selama 3 menit, tahap denaturasi denaturation pada suhu 94 C selama 30 detik, tahap penepelan primer annealing pada suhu 60 C selama 1 menit, tahap pemanjangan rantai DNA extention pada suhu 72 C selama 1 menit dengan Universitas Sumatera Utara masing-masing tahap sebanyak 35 siklus. Tahapan terakhir yaitu final PCR pada suhu 72 C selama 10 menit.

d. Elektroforesis

Hasil PCR amplikon dielektroforesis dengan Marker 100-3000 bp vivantis dan volume amplikon sebanyak 10 µL dicampurkan dengan loading dye sebanyak 2 µL, kemudian di-running menggunakan gel agarose vivantis 2 dalam TAE Buffer 1x yang diberi pewarna DNA yaitu gel red Nulceid acid stra in dan di-running selama 50 menit dengan tegangan 100 volt. Kemudian hasil elektroforesis divisualisasi menggunakan Gel Doc UV Transilluminator. Proses kegiatan penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1. Analisis Data Hasil elektroforesis divisualisasi Gel Doc UV Transilluminator untuk melihat sampel positif pembawa transgen PhGH. Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan menggunakan software EOS Utility dan ZoomBr owser a plica tion dan selanjutnya data diolah menggunakan program Excel MS. Office 2007 untuk mengetahui tingkat transmisi transgen dari lele transgenik F2 ke lele transgenik F3. Performa Pertumbuhan Pemeliharaan Ikan Ikan yang digunakan pada penelitian ini ialah ikan lele Clarias ga riepinus transgenik F3 hasil pemijahan ikan lele transgenik F2 yang merupakan koleksi dari Balai Penelitian Pemuliaan Ikan Sukamandi Subang, Jawa Barat. Pemeliharaan ikan dilakukan di kolam penelitian Balai Penelitian Universitas Sumatera Utara Pemuliaan Ikan Sukamandi, Subang, Jawa Barat. Larva hasil pemijahan dipelihara dalam wadah akuarium dengan kepadatan 870 ekorakuarium. Wadah berupa akuarium dengan ukuran 60x40x40 cm 3 serta ketinggian efektif air 15 cm volume air 24 liter. Ikan dipelihara selama 21 hari dengan sistem aerasi dan pemberian pakan diberikan pada pagi, sore dan malam hari secara ad libitum sekenyangnya menggunakan pakan komersial berbentuk tepung dan remah halus dengan kadar protein 40 HI-PRO-VITE PS-P dan BINTANG 581, PT Centralproteina Prima, Mojokerto. Akuarium disifon setiap pagi sebelum peberian pakan dan air diganti sebanyak 50 setip 3 hari sekali. Penyifonan bertujuan untuk mempertahankan kualitas air agar tetap optimal teruama dari sisa pakan yang dapat memicu peningkatan kadar amonia dalam wadah pemeliharaan. Sampling dilakukan setiap 10 hari sekali dengan menghitung bobot total ikan. Setelah 21 hari masa pemeliharaan, ikan dipindahkan kedalam media kolam terpal. Pemeliharaan selanjutnya dilakukan pada kolam terpal dengan ukuran 1 m 2 dengan kepadatan 110 ekorkolam. Ikan dipelihara selama 30 hari dengan pemberian pakan pada pagi, sore dan malam secara ad libitum sekenyangnya dengan menggunakan pakan komersial berbentuk butiran kasar dengan kadar protein berkisar 38-41 PF800 dan PF 1000, PT. Matahari Sakti, Margomulyo. Sampling dilakukan setiap 15 hari sekali. Pada akhir pemeliharaan dihitung biomassa total ikan, tingkat konsumsi pakan dan kelangsungan hidup. Pengamatan terhadap performa pertumbuan ikan dilakukan selama 50 hari masa pemeliharaan. Universitas Sumatera Utara Parameter Perumbuhan a. Derajat Pembuahan dan Derajat Penetasan Untuk mengetahui derajat pembuahan dan derajat nenetasan maka dihitung dengan menggunakan rumus Wang dkk., 2011: FR = ℎ �� �� ℎ� ℎ �� � x 100 HR = ℎ �� � � ℎ �� �� ℎ� x 100

b. Laju Pertumbuhan Bobot