38
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1. Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian pada penelitian ini merupakan penelitian deskriptif dengan pendekatan secara cross sectional.
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian
3.2.1. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium Patologi Anatomi RS H Adam MalikFakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan.
3.2.2. Waktu Penelitian
Penelitian ini dimulai dari bulan September 2011 sampai dengan bulan Juni 2012, yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel,
penelitian, serta pengolahan data dan hasil penelitian.
3.3. Subjek Penelitian
3.3.1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin yang berasal dari
biopsi kelenjar limfoid yang didagnosa sebagai limfoma pada Laboratorium Patologi Anatomi RSUP. H. Adam MalikFakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
Medan tahun 2011
3.3.2. Sampel Penelitian
Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari jaringan biopsi limfoid yang sesuai dengan kriteria inklusi dan consecutive sampling tahun 2011
Universitas Sumatera Utara
39
3.4. Kriteria Penelitian
3.4.1. Kriteria Inklusi
Kriteria inklusi dalam penelitian ini adalah sediaan blok paraffin dari jaringan biopsi kelenjar limfoid dengan slaid pewarnaan Hematoksilin Eosin yang terdiagnosa
sebagai limfoma.
3.4.2. Kriteria Eksklusi
1. Sediaan blok parafin yang didiagnosa ulang bukan sebagai limfoma. 2. Sediaan blok paraffin dengan pengambilan sample yang tidak representative
untuk didiagnosa 3. Sediaan blok parafin yang rusak dan tidak dapat diproses lebih lanjut dengan
pulasan imunohistokimia CD20
3.5. Kerangka Operasional
Keterangan:
= Kriteria eksklusi Slide biopsi kelanjar limfoid
sebagai limfoma pewarnaan HE
Pembacaan Ulang
Limfoma Sediaan rusak atau tidak
representatif Bukan Limfoma
Potong Ulang blok parafin
Pewarnaan immunohistokimia CD20
Universitas Sumatera Utara
40
3.6. Variabel Penelitian
Variabel yang diteliti di dalam penelitian ini adalah: Variabel independent bebas yaitu Limfoma
Variabel dependent terikat yaitu Limfoma sel-B dengan pewarnaan
imunohistokimia CD20
3.7. Definisi operasional
Limfoma adalah keganasan primer pada sel limfoid akibat berhentinya proses diferensiasi limfosit pada clone atau fase tertentu .
Limfoma Non Hodgkin adalah keganasan pada sel limfoid primer tanpa dijumpai sel Reed Stenberg RS cell
Limfoma Hodgkin adalah kegansan pada sel limfoid dengan ditemukannya sel Reed Stenberg yang mirip dengan mata burung hantu
C20 positive terwarnainya membrane sel limfoid dengan immunohistokimia
Pewarnaan imunohistokimia CD 20 adalah pewarnaan menggunakan antibodi Rabbit Polyclonal Human antibody CD 20 DAKO, pengenceran 1 :
100.
3.8. Cara Kerja
Semua slaid yang berasal dari biopsi jaringan limfoid yang telah didiagnosa sebagai limfoma dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin.
Dilakukan pembacaan ulang oleh dua orang ahli patologi bersamaan dengan peneliti untuk menyingkirkan diagnosa lesi bukan limfoma, tidak
representative dan sediaan rusak. Sediaan limfoma dilakukan pemotongan ulang blok parafin untuk
dilanjutkan pewarnaan imunohistokimia CD20.
Universitas Sumatera Utara
41
3.8.1. Cara pembuatan sediaan mikroskopis untuk pewarnaan imunohistokimia CD20.
Blok parafin yang telah dikumpulkan disimpan dalam freezer sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan mnggunakan mikrotom dengan
tebal 4μm. Setiap blok parafin dipotong ulang satu kali untuk persiapan imunohistokimia CD20
Sampel blok parafin yang sudah dipotong tipis 4μm ditempelkan pada kaca
objek yang telah di coating dengan poly-L-Lysine atau Silanized slide agar dapat menempel pada kaca objek selama proses pulasan imunohistokimia.
Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek coated adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing. Potongan tipis
dipisahkan dan diratakan dengan memasukkannya ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan ke atas kaca objek. Selanjutnya, kaca objek
diletakkan di atas alat pemanas hot plate 50-60
o
C. Setelah parafin melunak, kaca objek dikeringkan dan potongan jaringan siap
untuk dipulas.
3.8.2. Prosedur sebelum pulasan antibodi primer
Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4μm yang sudah
ditempelkan pada kaca objek silanized. Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan Xylol sebanyak
3 kali, masing-masing 5 menit. Rehidrasi dengan mencelupkan ke dalam Etanol 98 secara berturut-turut
sebanyak 3 kali, masing-masing dilakukan selama 5 menit, kemudian Alkohol 90, 80 dan 70, masing-masing selama 5 menit.
Bilas dengan air mengalir selama 5 menit. Blocking preparat dengan mencelupkannya ke dalam Endogen Peroxidase
0,5 Methanol + H2O2 selama 30 menit. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit.
Masukkan preparat ke dalam buffer sitrat dan dipanaskan ke dalam
microwave:
Universitas Sumatera Utara
42
o Cook I, power level 8, selama 5 menit.
o Cook II, power level 1, selama 5 menit.
Dinginkan selama ± 30 menit dalam suhu ruangan. Bilas dalam cairan PBS pH 7,4 selama 3 menit dan keringkan air di sekitar
potongan jaringan. Tandai dengan Pap pen di sekeliling jaringan yang ingin dipulas.
Blocking preparat dengan meneteskan Normal Horse Serum 5 dan
dibiarkan selama 15 menit di dalam bak inkubasi.
3.8.3. Protokol pemulasan CD20 dengan menggunakan The Envision + Dual Link
System dari Dako
Bersihkan preparat dari Normal Horse Serum. Teteskan preparat dengan antibodi primer dan dibiarkan selama 60 menit
dalam rak inkubasi. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 3 menit.
Teteskan preparat dengan Dako REAL En Vision secukupnya dan dibiarkan
selama 30 menit dalam rak inkubasi. Cuci dalam PBS pH 7,4 + Tween 20.
Teteskan preparat dengan DAB + substrat buffer Dako dan biarkan selama
2-5 menit. Bilas dengan air mengalir selama 10 menit.
Counterstain preparat dengan pewarnaan Hematoksilin selama 1-2 menit. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit.
Masukkan preparat ke dalam larutan Lithium Carbonat jenuh 5 dalam
aquadest selama 2 menit. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit.
Dehidrasi dengan cara mencelupkan preparat secara berurutan dalam Etanol
70, 80, 96, dan Etanol absolute masing-masing selama 5 menit. Clearing dengan cara mencelupkan preparat ke dalam larutan Xylol
sebanyak 3 kali, amsing-masing selama 5 menit.
Universitas Sumatera Utara
43
Lakukan mounting dan tutup dengan kaca penutup.
3.9. Alat dan Bahan Penelitian
3.9.1. Alat-alat penelitian
Alat-alat yang diperlukan dalam penelitian ini adalah mikrotom, waterbath, hot plate, freezer, inkubator, staining jar, rak kaca objek, kaca objek, rak inkubasi,
Pap pen, pipet mikro, timbangan bahan kimia, kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung sentrifuge, microwave, thermolyte stirrer,
entelen dan mikroskop cahaya.
3.9.2. Bahan penelitian
Blok parafin yang telah terdiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai Limfoma
Pulasan imunohistokimia menggunakan metode The En Vision + Dual Link System kit, teknik pulasan imunohistokimia dua langkah.
Antibodi yang digunakan adalah Rabbit Polyclonal Human antibody CD20 dengan pengenceran 1 : 100.
Detection kit terdiri dari: o
1 botol endogenous enzyme block o
1 botol Normal Horse Serum 5 o
1 botol Dako REAL En VISION o
1 botol DAB + substrat chromogen Larutan Buffer sitrat
Larutan PBS pH 7,4 yang terdiri dari:
o Natrium chroride 80 gram
o Kalium chloride 2 gram
o Na2HPO4
11 gram o
KH2PO4 2 gram
o Tambahkan aquadest
1000 ml Larutan Tween 20
Larutan DAB + substrat buffer 1ml larutan cukup untuk 10 jaringan
Universitas Sumatera Utara
44
o Langkah 1: masukkan 1ml aliquot substrat buffer secukupnya ke
dalam container tergantung dari jumlah specimen yang akan dikerjakan.
o Langkah 2: untuk setiap 1ml buffer
, tambahkan satu tetes β0μl cairan DAB + substrat chromogen dan campurkan segera.
Larutan counterstain Mayers Hematoksilin Larutan Lithium karbonas 50 gram Lithium carbonas + aquadest 1000mL
Ethanol absolute 96, 80, dan 70. Larutan Xylol.
3.10. Instrumen penelitian
Instrumen penelitian yang digunakan adalah imunohistokimia CD20 terhadap sampel sediaan jaringan biopsi limfoma. .
Untuk penilaian terhadap pulasan imunohistokimia CD 20 adalah sebagai berikut:
Kontrol positif adalah menggunakan jaringan yang telah diketahui positif terhadap CD20 pada penelitian terdahulu.
Kontrol negatif adalah menggunakan jaringan yang sama tanpa diberikan antibodi primer.
Hasil positif bila tertampil warna coklat pada membran sel
3.11. Analisa Data
Untuk melihat gambaran karakteristik penderita limfoma disajikan dalam bentuk tabulasi dan dideskripsikan.
Universitas Sumatera Utara
45
BAB 4 HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
Dari data rekam medik di Instalasi Patologi Anatomi RS Adam Malik tahun 2011 didapatkan 36 pasien dengan diagnosa Limfoma tapi hanya 16 yang diperiksa
Histopatologinya , sedangkan 20 pasien hanya didiagnosa dengan aspirasi biopsi jarum halus. Diagnosa Limfoma pada rekam medik belum memakai klasifikasi WHO tapi
hanya membedakan Limfoma Hodgkin dan non Hodgkin. Peneliti tidak mendapatkan hasil pemeriksaan immunohistokimia dari kasus- kasus limfoma pada rekam medik.
Profil penderita tersebut ditampilkan dalam bentuk tabel-tabel di bawah ini:
4.1.1 Karakteristik Penderita
Berdasarkan jenis kelamin, perbandingan jenis kelamin penderita laki-laki dengan perempuan hamper berimbang. Yaitu : laki-laki sebanyak 9 orang 56 dan
perempuan sebanyak 7 orang 44. Karakteristik jenis kelamin dapat dilihat pada tabel 4.1.
Tabel 4.1 Distribusi Penderita berdasarkan jenis kelamin No
Jenis Kelamin Jumlah
Persentase 1
Laki-laki 9
56 2
Perempuan 7
44 Jumlah Total
16 100
Berdasarkan umur dijumpai gambaran sebagai berikut : 0-10 tahun : 2 orang 12,5, 11-20 tahun 1orang 6,25, 21-40 tahun 4 orang 25, 41-50 tahun 2 orang
12,5 dan lebih dari 50 tahun 7 orang 43,75. Dapat dilihat di table 4.2
Universitas Sumatera Utara
Kategori