BAB 3 BAHAN DAN METODA
3.1. Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian berupa penelitian deskriptif analitik dengan pendekatan secara cross sectional.
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian
3.2.1 Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas
Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Instalasi Patologi Anatomi RS. H. Adam Malik Medan dan Laboratorium Patologi Anatomi swasta dan
pribadi di Medan.
3.2.2 Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan mulai mulai bulan Juli 2010 sampai April
2011 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel, penelitian dan hasil penelitian.
Universitas Sumatera Utara
3.3. Subjek Penelitian
3.3.1. Populasi Populasi dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin yang
berasal dari jaringan nasofaring yang didiagnosa sebagai karsinoma nasofaring pada sentra diagnosis Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran
USU, Instalasi Patologi Anatomi RS. H. Adam Malik Medan dan Laboratorium Patologi Anatomi Swasta dan Pribadi kota Medan.
3.3.2. Sampel Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari
jaringan nasofaring yang sesuai dengan kriteria inklusi dan sesuai dengan besar sampel penelitian.
3.4. Jumlah Sampel
Jumlah sampel yang diperlukan adalah berdasarkan hasil perhitungan dengan melihat proporsi yang digunakan pada kasus ini sebesar 50
karena belum ada penelitian mengenai tampilan matrix metalloproteinase-9
MMP-9 pada
undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schimncke. Dengan tingkat
Universitas Sumatera Utara
kemaknaan yang dipergunakan pada penelitian ini adalah 0,05 dengan interval kepercayaan 95. Dari tabel didapat Z
α
= 1,96
Jumlah sampel dihitung dengan rumus :
n = besar sampel p = proporsi penelitian
q = 100 - p α = tingkat kemaknaan
Tingkat kemaknaan yang dipergunakan pada penelitian ini adalah 0,05 dengan interval kepercayaan 95. Dari tabel didapat
Z
α
= 1,96 d = tingkat kesalahan 15
Sehingga : 1,96
2
0,5 0,5 0,15
2
= 42,68 ≈ 43
Jumlah sampel minimal 43 sampel 53 sampel.
z
α 2
PQ d
2
n =
n =
Universitas Sumatera Utara
3.5. Kriteria Penelitian
3.5.1. Kriteria Inklusi: Yang termasuk kriteria inklusi adalah sediaan blok parafin jaringan
nasofaring dengan slide pulasan Hematoksilin Eosin yang didiagnosa dengan undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe
Schmincke.
3.5.2. Kriteria Eksklusi: 1.Sediaan blok parafin yang didiagnosa dengan keratinizing squamous cell
carcinoma, differentiated type nonkeratinizing squamous cell carcinoma dan basaloid squamous cell carcinoma.
2. Sediaan blok paraffin dari undifferentiated carcinoma yang tidak bisa dibedakan tipenya.
3..Sediaan blok parafin yang rusak dan tidak dapat diproses lebih lanjut dengan pulasan Matrix metalloproteinase 9.
3.6. Cara Kerja
1. Semua slide yang berasal dari nasofaring yang telah didiagnosa sebagai
carcinoma. 2.
Dilakukan pembacaan ulang oleh dua orang pathologist bersamaan dengam peneliti untuk memisahkan antara keratinizing squamous cell
Universitas Sumatera Utara
carcinoma, differentiated type non keratinizing squamous cell carcinoma, undifferentiated type non keratinizing squamous cell
carcinoma undifferentiated carcinoma dan basaloid squamous cell carcinoma Diagnosa berdasarkan pada klasifikasi WHO tahun 2005.
3. Kemudian undifferentiated carcinoma nasofaring dipisahkan kembali
menjadi tipe Regaud dan tipe Schmincke pembagian Ackerman 4.
Dilakukan pemotongan ulang blok paraffin. 5.
Pewarnaan dengan imunohistokimia Matrix Metalloproteinase-9. 6.
Tampilan dari Matrix Metalloproteinase-9.
3.6.1. Pembuatan Sediaan Mikroskopis
Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut :
1.Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom
dengan tebal 4 µm. Setiap blok parafin, dipotong ulang 1 kali untuk pulasan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9 MMP-9.
2.Sampel blok parafin yang sudah dipotong tipis 4 µm ditempelkan pada kaca objek.
Universitas Sumatera Utara
Pada pulasan imunohistokimia MMP-9 digunakan kaca objek yang telah dicoating dengan poly-L-lysine atau Silanized slide agar jaringan dapat
menempel pada kaca objek selama proses pulasan imunohistokimia. Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek coated adalah menggunakan
ujung pisau atau pinset yang runcing. Potongan tipis dipisahkan dan diratakan dengan memasukkannya ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan
ke atas kaca objek. Selanjutnya, kaca objek diletakkan di atas alat pemanas hot plate 50-60
⁰C. Setelah parafin melunak, kaca objek dikeringkan dan potongan jaringan siap untuk dipulas.
3.6.2. Prosedur sebelum pulasan antibodi primer. 1.Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4 µm yang sudah
ditempelkan pada kaca objek silanized. 2.Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan xylol sebanyak
3 kali, masing-masing 5 menit. 3.Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam etanol 98
sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, kemudian alkohol 90, 80 dan 70 masing-masing selama 5 menit.
4.Bilas dengan air mengalir selama 5 menit. 5. Blocking preparat dengan mencelupkannya kedalam Endogen Peroksidase
0,5 Methanol + H2O2 selama 30 menit. 6. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit.
Universitas Sumatera Utara
7. Masukkan preparat ke dalam buffer sitrat dan dipanaskan kedalam microwave:
• Cook I, power level 8 selama 5 menit.
• Cook II, power level 1 selama 5 menit.
8. Dinginkan ± 30 menit dalam suhu ruangan. 9. Bilas dalam PBS pH 7,4 selama 3 menit dan keringkan air disekitar
potongan jaringan. 10. Tandai di sekeliling jaringan yang ingin dipulas dengan Pap Pen.
11. Blocking preparat dengan meneteskan Normal Horse Serum 5 dan dibiarkan selama 15 menit didalam bak inkubasi.
3.6.3. Protokol Pemulasan Matrix Metalloproteinase-9 MMP-9 dengan menggunakan The Envision+ Dual Link System dari Dako
• Bersihkan preparat dari Normal Horse Serum.
• Teteskan preparat dengan antibodi primer matrix metalloproteinase-9
dan biarkan selama 60 menit dalam rak inkubasi. •
Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 3 menit. •
Teteskan preparat dengan Dako REAL En Visison secukupnya dan dibiarkan selama 30 menit dalam rak inkubasi.
• Cuci dalam PBS ph 7,4 + Tween 20.
Universitas Sumatera Utara
• Teteskan preparat dengan DAB + substrat buffer Dako dan biarkan
selama 2-5 menit. •
Bilas dengan air mengalir selama 10 menit. •
Countrstain preparat dengan pewarnaan Hematoxillin selama 1-2 menit. •
Bilas dengan air mengalir selama 5 menit. •
Masukkan preparat kedalam larutan lithium carbonat jenuh 5 dalam aquadest selama 2 menit.
• Bilas dengan air mengalir selama 5 menit.
• Dehidrasi dengan cara mencelupkan preparat secara berurutan dalam
etanol 70,80,96 dan etanol absolut, masing-masing selama 5 menit.
• Clearing dengan cara mencelupkan preparat ke dalam larutan xylol
sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit. •
Lakukan mounting dan tutp dengan kaca penutup.
3.7.Alat dan Bahan Penelitian
3.7.1. Alat-Alat Penelitian Alat-alat yang diperlukan dalam penelitian ini adalah : mikrotom,
waterbath, hot plate, freezer, inkkubator, staining jar, rak kaca objek, kaca objek, rak inkubasi, Pap Pen, pipet miro, timbangan bahan kimia, kertas
Universitas Sumatera Utara
saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung sentrifuge, microwave, thermolyte stirrer, entelan dan mikroskop cahaya.
3.7.2.Bahan Penelitian •
Blok parafin yang telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe
Schmincke •
Pulasan imunohistokimia menggunakan metode The EnVision+ Dual Link System kit, teknik pulasan imunohistokimia 2 langkah. Antibodi
primer yang digunakan adalah Rabbit Polyclonal Hu-antibody MMP-9 dengan pengenceran 1 : 100.
• Detection kit terdiri dari :
1 botol endogenous enzyme block 1 botol Normal Horse Serum 5
1 botol Dako REAL En VISION 1 botol DAB+ substrat chromogen
• Larutan Buffer sitrat
• Larutan PBS pH7,4 :
Natrium Chloride : 80 gram Kalium chloride : 2 gram
Na2HPO4 : 11gram
Universitas Sumatera Utara
KH2PO4 : 2 gram Tambahkan aquadest : 1000 ml
• Larutan Tweet 20
• Larutan DAB + substrat buffer 1 ml larutan cukup untuk 10
jaringan Langakah 1: masukkan 1 ml aliquot substrat buffer secukupnya
kedalam countainer tergantung dari jumlah spesimen yang akan dikerjakan
Langkah 2 : untuk setiap 1 ml buffer, tambahkan satu tetes 20 mikroliter cairan DAB + substrat chromogen dan campurkan segera.
• Larutan couterstain Mayers Haematoxillin
• Larutan lithium karbonas
50 gram lithium karbonas ditambah dengan aquadest 1000 ml
• Etanol absolute 96,80,70
• Larutan xylol.
Universitas Sumatera Utara
3.8.Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunohistokimia MMP-9 terhadap sampel sediaan jaringan nasofaring. Untuk
penilaian terhadap pulasan imunohistokimia MMP-9 adalah sebagai berikut : •
Kontrol positif : jaringan yang telah diketahui positif terhadap MMP- 9 pada penelitian terdahulu dalam hal ini limfoma
• Kontrol negatif : omit primary antibody
• Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma sel epitel maupun
stroma.
Universitas Sumatera Utara
3.9. Kerangka Operasional
Potong ulang blok parafin
Pewarnaan Imunohistokimia
MMP 9 Keratinizing squamous
cell carcinoma
Distribusi Ekspresi MMP-9
Slide dari nasofaring yang didiagnosa dengan carcinoma
Pembacaan ulang
Potong ulang blok parafin
Tipe Regaud Tipe Schmincke
Differentiated type Basaloid
squamous cell carcinoma
Undifferentiated type
Keterangan :
Kriteria ekslusi
Non Keratinizing Squamous Cell Carcinoma
Universitas Sumatera Utara
3.10. Variabel Penelitian Variabel yang diteliti adalah :
a. Variabel bebas adalah undifferentiated carcinoma nasofaring : tipe Regaud
dan tipe Schmincke. b.Variabel terikat adalah tampilan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9
MMP-9 pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipeSchmincke.
3.11. Definisi Operasional
1.Karsinoma nasofaring adalah tumor yang berasal dari sel-sel epitelial yang menutupi permukaan nasofaring.
3. Undifferentiated carcinoma nasofaring terdiri dari sel-sel yang uniform dengan inti vesikuler, inti yang menonjol dan batas sel yang tidak jelas
sehingga membentuk pola pertumbuhan syncitial dengan stroma yang diinfiltrasi oleh sel-sel radang.
4. Tipe Regaud yaitu tipe dari undifferentiated carcinoma yang terdiri dari kelompokan sel-sel epithelial neoplastik dengan batas yang jelas yang
dikelilingi oleh jaringan ikat fibrous dan sel-sel radang. 5. Tipe Schmincke adalah tipe dari undifferentiated carcinoma yang terdiri dari
sel-sel epitelial neoplastik yang tumbuh difus dan bercampur dengan sel-sel radang.
Universitas Sumatera Utara
6.Imunohistokimia adalah metoda pewarnaan dengan perpaduan antara reaksi imunologi dan kimiawi, dimana reaksi imunologi ditandai adanya reaksi
antara antigen dengan antibodi, dan reaksi kimiawi ditandai dengan adanya reaksi antara enzim dengan substrat.
7.Matrix metalloproteinase-9 adalah ZN
2+
dependent endopeptidase yang memediasi degradasi dari protein matrix extracellular dan berhubungan
dengan invasi tumor dan metastase. 8.Hasil pulasan immunohistokimia MMP-9 adalah tampilan pulasan warna
coklat pada sitoplasma sel epitel dan stroma yang dinyatakan dengan : •
Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana pada saat proses yang sama kontrol + menampilkan warna coklat dengan
pewarnaan kromogen DAB. •
Positif, bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel epitel ataupun stroma dengan menggunakan mikroskop cahaya
pembesaran 400X pada 5 lokasi lapangan pandang dan pada saat yang sama kontrol + juga menampilkan warna yang sama.
Yang dinilai pada jaringan yaitu : o
Skor tampilan warna coklat : +1 = lemah
+2 = sedang +3 = kuat
Universitas Sumatera Utara
o Skor jumlah sel yang terwarnai
0 = Tidak ada sel yang terwarnai +1 = 25 sel yang terwarnai
+2 = 25-75 sel yang terwarnai +3 = 75 sel yang terwarnai
o Skor intensitas warna = skor jumlah sel yang terwarnai x skor tampilan
warna Interpretasi skor intensitas warna :
Lemah : 1-3 Sedang : 4-6
Kuat : 7-9 Adapun cara menginterpretasikan tampilan imunohistokimia tersebut diatas
adalah modifikasi dari Q score.
42
3.12. Analisis Data.
1. Untuk melihat gambaran karakteristik penderita undifferentiated carcinoma
nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke disajikan dalam bentuk tabulasi dan dideskripsikan.
2. Untuk menganalisa perbedaan tampilan imunohistokimia matrix
metalloproteinase-9 MMP-9 antara undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke peneliti menggunakan uji Chi-
square.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori