BAB III METODE PEMBUATAN 3.1 FORMULA DAN PENIMBANGAN Tabel 3.1 Formula mikroemulsi vitamin E dan Bobot Penimbangan Formula Fungsi Prosentase
BAB III
METODE PEMBUATAN
3.1 FORMULA DAN PENIMBANGAN
Tabel 3.1 Formula mikroemulsi vitamin E dan Bobot Penimbangan
Formula
Fungsi
Prosentase
Bobot/
Bobot
Bobot
Bobot
(%)
kapsul
skala
skala
skala
(mg)
lab (g)
pilot
produksi
(kg)
25
Asam oleat
Fase minyak
2
75
0,25
(kg)
2,5
PVP
Bahan pengikat
1
35
0,1
1
10
Vitamin E
Bahan Aktif
8
10
10
10
100
MCT ( medium
Mempertahanka
42
35
5
50
500
chaintryglicerida)
n tekstur lemak
Egg Lecitin
Emulsifier
13
20
1,5
15
150
Poloxamer 188
Surfaktan
34
25
4
40
400
100%
200mg
(polyvinylpirrolidone)
Jumlah
Skala lab 1.000 tablet
Skala pilot 10.000 tablet
Skala produksi 100.000 tablet
3.2 SKEMA KERJA SKALA PRODUKSI
3.2.1 NANOEMULSION
Poses produksi dilakukan di ruang produksi kelas E. Sedangkan in process
control (IPC) yang dilakukan sebelum sebelum proses formulasi obat dilakukan yaitu
melakukan pengujian awal pada bahan baku obat. Pengujian awal yang dilakukan
meliputi identifikasi kebenaran bahan, kualitas, kuantitas, dan kemurnian dari masingmasing bahan baku yang akan digunakan dalam proses formulasi obat.
Vitamin E (100 kg), Egg lecithin (150 kg),
Asam oleat (25 kg), Medium chain
triglyceride (500 kg)
34
Fase minyak
Didispersikan ke
dalam larutan
alkohol
Polyvinylpirrolidone (10 kg),
poloxamer 188 (400 kg),
purified water
Diaduk dengan
menggunakan stirrer
moderat
Fase air
Dipanaskan dengan suhu 60 ° C
IPC: Homogenitas
Larutan tersebut dipindahkan ke
dalam high-shear mixer hingga
terbentuk emulsi
IPC: ukuran partikel
Untuk membentuk nanoemulsi
larutan tersebut di sonifikasi
dengan probe selama 480 detik
EPC: Uji keseragaman
bobot, uji kebocoran
kapsul, uji disolusi
IPC: Inspeksi kemasan
primer dan sekunder
Filling nanoemulsi kedalam
soft capsule
Packaging
(Blister Pack Machine)
Gambar 2.17 Alur Proses Produksi
3.3
Pengukuran Ukuran Partikel dan Zeta Potensi Alam
Vitamin E Nanoemulsi Ukuran partikel rata-rata dari vitamin E nanoemulsion
diukur dengan analisa partikel (Zetasizer-3000 HSA, Malvern Instrumen, Inggris).
Sebelum pengukuran,vitamin E nanoemulsion diencerkan sepuluh kali lipat dengan air
purified water. Sampel diencerkan dilakukan pada suhu 25 ° C.
35
Potensi zeta vitamin E nanoemulsion dianalisis menggunakan analisa partikel.
Potensial zeta dihitung dari mobilitas elektroforesis oleh persamaan HelmholtzSmoluchowski. pengukuran,vitamin E nanoemulsion diencerkan sepuluh kali lipat
dengan air purified water. Sampel diencerkan dilakukan pada suhu 25 ° C. Pengukuran
diulang tiga kali tiap sample.
3.4
Studi Stabilitas Awal
Stabilitas sterilisasi dilakukan dengan memonitor perubahan dalam ukuran
partikel, potensial zeta, nilai pH, dan konsentrasi vitamin E nanoemulsion pra dan pasca
aliran uap sterilisasi pada 100 ° C selama 30 menit.
Sentrifugasi Stabilitas dilakukan evaluasi dengan pemisahan fasa vitamin E
nanoemulsion setelah sentrifugasi pada 4.000 rpm selama 15 menit.
3.5
UJI STABILITAS PRODUK
Stabilitas merupakan kemampuan suatu produk untuk mempertahankan sifat dan
karakteristiknya selama waktu penyimpanan dan penggunaan (Departemen Kesehatan
RI, 1995). Stabilitas merupakan syarat sediaan bermutu selain aman, efektif, dan dapat
diterima. Stabilitas sediaan meliputi stabilitas kimia, stabilitas fisika, stabilitas
mikrobiologi, stabilitas farmakologi, dan stabilitas toksikologi (USP 36, 2013). Pada
penelitian ini uji stabilitas Softkapsul vitamin E nanoemulsi yang dilakukan seperti yang
ada pada Tabel 3.2. Softkapsul Vitamin E nanoemulsi disimpan dalam climatic
chamber.
Tabel 3.2 Uji Stabilitas Softkapsul Vitamin E nanoemulsi
Penelitian
Waktu sesungguhnya
(Real time)
Waktu dipercepat
Kondisi Penyimpanan
pada climatic chamber
30º C ± 2º C
RH 70% ± 5%
40º C ± 2º C
RH 75% ± 5%
Periode Waktu
12 bulan (0, 3, 6, 9, 12),
kemudian diperpanjang menjadi
24 bulan (12, 18, 24), ditambah
bulan ke 36
6 bulan ( 0, 1 , 3, dan 6)
3.3 UJI BIOAVAILABILITAS-BIOEKIVALENSI (BA-BE)
Uji bioekivalensi adalah uji bioavailabilitas komparatif yang dirancang untuk
menunjukkan bioekivalensi antar prosuk uji dengan prosuk obat pembanding. Caranya
dengan membandingkan profil kadar obat dalam darah atau urin antara produk-produk
36
obat yang dibandingkan pada subyek manusia. Karena itu desain dan pelaksanaan studi
BE harus mengikuti Pedoman Cara Uji Klinik yang Baik (CUKB) termasuk harus lolos
Kaji Etik (BPOM, 2004).
Uji Bioekivalensi (BPOM, 2004)
Desain dan pelaksanaan studi bioekivalensi:
1. Kaji etik
2. Desain
3. Subyek (kriteria seleksi, jumlah subyek, standardisasi kondisi studi, genetik
phenotyping)
4. Produk obat uji (Paracetamol ODT)
5. Dosis obat uji
6. Uji disolusi in vitro (UDT)
7. Pengambilan sampel darah (12-18 sampel darah)
8. Kadar yang diukur
9. Metode bioanalitik
10. Parameter bioavailabilitas dari sampel darah (AUCt, AUC∞, Cmax, tmax, t1/2)
11. Analsisi data (analisis statistik, kriteria bioekivalen, catatan untuk bioekivalen
individual dan populasi)
Studi Farmakokinetik
Pemilihan Subyek : Tikus laki-laki Sprague Dawley sehat dengan berat 250±10 g,
yang dibeli dari Eksperimental Hewan Pusat Cina Farmasi Universitas.
Rancangan Penelitian
Sebelum digunakan penelitian tikus disimpan dalam suhu 25 0Cdan kelembaban
55-60% yang terkontrol untuk ruang observasi hewan dengan tujuan supaya tikus dapat
beradaptasi dengan kondisi laboratotium selama 5 hari. Semua tikus disimpan untuk
dipuasakan semalam (selama 24 jam) tetapi memungkinkan diberi asupan air.
Macam Cuplikan dan waktu pengambilan sampel
Tikus secara acak dibagi menjadi 3 kelompok yaitu
1. Nanoemulsi untuk kelompok injeksi intravena
2. Nanoemulsi untuk kelompok pemberian oral
3. Kapsul lunak untuk kelompok pemberian oral
37
Masing-masing tikus kelompok nanoemulsi dan kapsul lunak diberikan vitamin-e
alami dosis tunggal 40mg/kg. Sekitar 0,5 ml sampel darah dari vena jugularis
dimasukkan tabung sampai 1,0 ml untuk disentrifuge dengan rentang waktu 0,5, 1, 1,5,
2, 3, 4, 6, 8, 10, dan 12 jam setelah pemberian oral. Kemudian 0,5 ml sampel darah
dikumpulkan dalam tabung sampai 1,0 ml untuk disentrifuge dengan rentang waktu
0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, dan 12 jam setelah pemberian intravena. Plasma darah dipisahkan
segera dengan sentrifugasi pada 4.000 rpm, selama 15 menit dan disimpan dibawah suhu -20 0C
sampai sampel dianalisis.
Penentuan Konsentrasi Vitamin-E alami dalam plasma
Semua analisis vitamin E alami dilakukan pada system kromatografi cair kinerja
tinggi Shimadzu Promience (HPLC) (Shimadzu, Kyoto, Jepang), yang termasuk unit
pengiriman pelarut LC-20A dengan tekanan tinggi katup pilihan flowline, sampler auto
SIL -20A, dan kolom oven CTO-20A, terhubung dengan perangkat lunak solusi LC.
Vitamin E alami dideteksi menggunakan Waters Symmetry C18 (4,6 mm x 150 mm, 5
mm) kolom terhubung dengan kolom 4,6 × 20 mm guard (Waters, USA), dan suhu
dijaga pada 30°C.
Seratus mikroliter (100 µl) sampel plasma deproteinized dengan penambahan 300
ml etil alkohol. Sampel kemudian divortex dicampur selama 2 menit, diikuti dengan
penambahan 500 ml heksana. Setelah sentrifugasi selama 10 menit pada 15.000 rpm,
supernatan dipindahkan ke vial-botol kaca. Proses ekstraksi heksana diulang. Bagian
organik dipisahkan dan diuapkan sampai kering di bawah aliran dari nitrogen pada suhu
kamar. Sebelum analisis HPLC residu kemudian dilarutkan dalam 100 ml metanol.
Sebuah alikuot (20 µl) sampel diinjeksikan ke dalam kolom HPLC untuk analisis (14,
15).
Dilakukan analisis HPLC. Baku standart dan sampel dipisahkan menggunakan fase
gerak yang terdiri dari 100% methanol. Laju aliran ditetapkan pada 1 ml/menit
Parameter farmakokinetik diperkirakan menggunakan metode Model non kompartemen.
Setelah memberikan dosis yang sama dari oral dan intravena, nilai-nilai bioavailabilitas
plasma (F) dari vitamin E alami di nanoemulsi dan kapsul lunak dihitung sesuai dengan
persamaan berikut:
38
Analisis Statistik
Untuk perbandingan statistik, semua data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dan
dianalisis untuk perbedaan yang signifikan secara statistik menggunakan uji independent sample
T.
Hasil
Profil konsentrasi-waktu plasma vitamin E alami pada tikus setelah pemberian
oral pada bentuk sediaan dari kedua nanoemulsi dan kapsul lunak yang ditunjukkan
pada Gambar. dan parameter farmakokinetik yang dirangkum dalam Tabel. Perbedaan
yang nyata antara profil farmakokinetik dari vitamin E alami nanoemulsi dan kapsul
lunak. Hasil menunjukkan Cmax yang lebih tinggi dan Tmax pendek untuk pemberian
oral dari nanoemulsion dan kapsul lunak. Daerah di bawah kurva (AUC) nilai dari
vitamin E alami nanoemulsi dan kapsul lunak yang masing-masing 1,482 ± 0,03 dan
0,907 ± 0,02 mg hml-1. Dengan demikian, ada peningkatan 1,6 kali lipat dalam AUC
alami vitamin E menggunakan teknik emulsifikasi yang dimodifikasi.
Gambar profil plasma nanoemulasi dan kapsul lunak
39
Tabel 3.3 Parameter Farmakokinetik
40
METODE PEMBUATAN
3.1 FORMULA DAN PENIMBANGAN
Tabel 3.1 Formula mikroemulsi vitamin E dan Bobot Penimbangan
Formula
Fungsi
Prosentase
Bobot/
Bobot
Bobot
Bobot
(%)
kapsul
skala
skala
skala
(mg)
lab (g)
pilot
produksi
(kg)
25
Asam oleat
Fase minyak
2
75
0,25
(kg)
2,5
PVP
Bahan pengikat
1
35
0,1
1
10
Vitamin E
Bahan Aktif
8
10
10
10
100
MCT ( medium
Mempertahanka
42
35
5
50
500
chaintryglicerida)
n tekstur lemak
Egg Lecitin
Emulsifier
13
20
1,5
15
150
Poloxamer 188
Surfaktan
34
25
4
40
400
100%
200mg
(polyvinylpirrolidone)
Jumlah
Skala lab 1.000 tablet
Skala pilot 10.000 tablet
Skala produksi 100.000 tablet
3.2 SKEMA KERJA SKALA PRODUKSI
3.2.1 NANOEMULSION
Poses produksi dilakukan di ruang produksi kelas E. Sedangkan in process
control (IPC) yang dilakukan sebelum sebelum proses formulasi obat dilakukan yaitu
melakukan pengujian awal pada bahan baku obat. Pengujian awal yang dilakukan
meliputi identifikasi kebenaran bahan, kualitas, kuantitas, dan kemurnian dari masingmasing bahan baku yang akan digunakan dalam proses formulasi obat.
Vitamin E (100 kg), Egg lecithin (150 kg),
Asam oleat (25 kg), Medium chain
triglyceride (500 kg)
34
Fase minyak
Didispersikan ke
dalam larutan
alkohol
Polyvinylpirrolidone (10 kg),
poloxamer 188 (400 kg),
purified water
Diaduk dengan
menggunakan stirrer
moderat
Fase air
Dipanaskan dengan suhu 60 ° C
IPC: Homogenitas
Larutan tersebut dipindahkan ke
dalam high-shear mixer hingga
terbentuk emulsi
IPC: ukuran partikel
Untuk membentuk nanoemulsi
larutan tersebut di sonifikasi
dengan probe selama 480 detik
EPC: Uji keseragaman
bobot, uji kebocoran
kapsul, uji disolusi
IPC: Inspeksi kemasan
primer dan sekunder
Filling nanoemulsi kedalam
soft capsule
Packaging
(Blister Pack Machine)
Gambar 2.17 Alur Proses Produksi
3.3
Pengukuran Ukuran Partikel dan Zeta Potensi Alam
Vitamin E Nanoemulsi Ukuran partikel rata-rata dari vitamin E nanoemulsion
diukur dengan analisa partikel (Zetasizer-3000 HSA, Malvern Instrumen, Inggris).
Sebelum pengukuran,vitamin E nanoemulsion diencerkan sepuluh kali lipat dengan air
purified water. Sampel diencerkan dilakukan pada suhu 25 ° C.
35
Potensi zeta vitamin E nanoemulsion dianalisis menggunakan analisa partikel.
Potensial zeta dihitung dari mobilitas elektroforesis oleh persamaan HelmholtzSmoluchowski. pengukuran,vitamin E nanoemulsion diencerkan sepuluh kali lipat
dengan air purified water. Sampel diencerkan dilakukan pada suhu 25 ° C. Pengukuran
diulang tiga kali tiap sample.
3.4
Studi Stabilitas Awal
Stabilitas sterilisasi dilakukan dengan memonitor perubahan dalam ukuran
partikel, potensial zeta, nilai pH, dan konsentrasi vitamin E nanoemulsion pra dan pasca
aliran uap sterilisasi pada 100 ° C selama 30 menit.
Sentrifugasi Stabilitas dilakukan evaluasi dengan pemisahan fasa vitamin E
nanoemulsion setelah sentrifugasi pada 4.000 rpm selama 15 menit.
3.5
UJI STABILITAS PRODUK
Stabilitas merupakan kemampuan suatu produk untuk mempertahankan sifat dan
karakteristiknya selama waktu penyimpanan dan penggunaan (Departemen Kesehatan
RI, 1995). Stabilitas merupakan syarat sediaan bermutu selain aman, efektif, dan dapat
diterima. Stabilitas sediaan meliputi stabilitas kimia, stabilitas fisika, stabilitas
mikrobiologi, stabilitas farmakologi, dan stabilitas toksikologi (USP 36, 2013). Pada
penelitian ini uji stabilitas Softkapsul vitamin E nanoemulsi yang dilakukan seperti yang
ada pada Tabel 3.2. Softkapsul Vitamin E nanoemulsi disimpan dalam climatic
chamber.
Tabel 3.2 Uji Stabilitas Softkapsul Vitamin E nanoemulsi
Penelitian
Waktu sesungguhnya
(Real time)
Waktu dipercepat
Kondisi Penyimpanan
pada climatic chamber
30º C ± 2º C
RH 70% ± 5%
40º C ± 2º C
RH 75% ± 5%
Periode Waktu
12 bulan (0, 3, 6, 9, 12),
kemudian diperpanjang menjadi
24 bulan (12, 18, 24), ditambah
bulan ke 36
6 bulan ( 0, 1 , 3, dan 6)
3.3 UJI BIOAVAILABILITAS-BIOEKIVALENSI (BA-BE)
Uji bioekivalensi adalah uji bioavailabilitas komparatif yang dirancang untuk
menunjukkan bioekivalensi antar prosuk uji dengan prosuk obat pembanding. Caranya
dengan membandingkan profil kadar obat dalam darah atau urin antara produk-produk
36
obat yang dibandingkan pada subyek manusia. Karena itu desain dan pelaksanaan studi
BE harus mengikuti Pedoman Cara Uji Klinik yang Baik (CUKB) termasuk harus lolos
Kaji Etik (BPOM, 2004).
Uji Bioekivalensi (BPOM, 2004)
Desain dan pelaksanaan studi bioekivalensi:
1. Kaji etik
2. Desain
3. Subyek (kriteria seleksi, jumlah subyek, standardisasi kondisi studi, genetik
phenotyping)
4. Produk obat uji (Paracetamol ODT)
5. Dosis obat uji
6. Uji disolusi in vitro (UDT)
7. Pengambilan sampel darah (12-18 sampel darah)
8. Kadar yang diukur
9. Metode bioanalitik
10. Parameter bioavailabilitas dari sampel darah (AUCt, AUC∞, Cmax, tmax, t1/2)
11. Analsisi data (analisis statistik, kriteria bioekivalen, catatan untuk bioekivalen
individual dan populasi)
Studi Farmakokinetik
Pemilihan Subyek : Tikus laki-laki Sprague Dawley sehat dengan berat 250±10 g,
yang dibeli dari Eksperimental Hewan Pusat Cina Farmasi Universitas.
Rancangan Penelitian
Sebelum digunakan penelitian tikus disimpan dalam suhu 25 0Cdan kelembaban
55-60% yang terkontrol untuk ruang observasi hewan dengan tujuan supaya tikus dapat
beradaptasi dengan kondisi laboratotium selama 5 hari. Semua tikus disimpan untuk
dipuasakan semalam (selama 24 jam) tetapi memungkinkan diberi asupan air.
Macam Cuplikan dan waktu pengambilan sampel
Tikus secara acak dibagi menjadi 3 kelompok yaitu
1. Nanoemulsi untuk kelompok injeksi intravena
2. Nanoemulsi untuk kelompok pemberian oral
3. Kapsul lunak untuk kelompok pemberian oral
37
Masing-masing tikus kelompok nanoemulsi dan kapsul lunak diberikan vitamin-e
alami dosis tunggal 40mg/kg. Sekitar 0,5 ml sampel darah dari vena jugularis
dimasukkan tabung sampai 1,0 ml untuk disentrifuge dengan rentang waktu 0,5, 1, 1,5,
2, 3, 4, 6, 8, 10, dan 12 jam setelah pemberian oral. Kemudian 0,5 ml sampel darah
dikumpulkan dalam tabung sampai 1,0 ml untuk disentrifuge dengan rentang waktu
0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, dan 12 jam setelah pemberian intravena. Plasma darah dipisahkan
segera dengan sentrifugasi pada 4.000 rpm, selama 15 menit dan disimpan dibawah suhu -20 0C
sampai sampel dianalisis.
Penentuan Konsentrasi Vitamin-E alami dalam plasma
Semua analisis vitamin E alami dilakukan pada system kromatografi cair kinerja
tinggi Shimadzu Promience (HPLC) (Shimadzu, Kyoto, Jepang), yang termasuk unit
pengiriman pelarut LC-20A dengan tekanan tinggi katup pilihan flowline, sampler auto
SIL -20A, dan kolom oven CTO-20A, terhubung dengan perangkat lunak solusi LC.
Vitamin E alami dideteksi menggunakan Waters Symmetry C18 (4,6 mm x 150 mm, 5
mm) kolom terhubung dengan kolom 4,6 × 20 mm guard (Waters, USA), dan suhu
dijaga pada 30°C.
Seratus mikroliter (100 µl) sampel plasma deproteinized dengan penambahan 300
ml etil alkohol. Sampel kemudian divortex dicampur selama 2 menit, diikuti dengan
penambahan 500 ml heksana. Setelah sentrifugasi selama 10 menit pada 15.000 rpm,
supernatan dipindahkan ke vial-botol kaca. Proses ekstraksi heksana diulang. Bagian
organik dipisahkan dan diuapkan sampai kering di bawah aliran dari nitrogen pada suhu
kamar. Sebelum analisis HPLC residu kemudian dilarutkan dalam 100 ml metanol.
Sebuah alikuot (20 µl) sampel diinjeksikan ke dalam kolom HPLC untuk analisis (14,
15).
Dilakukan analisis HPLC. Baku standart dan sampel dipisahkan menggunakan fase
gerak yang terdiri dari 100% methanol. Laju aliran ditetapkan pada 1 ml/menit
Parameter farmakokinetik diperkirakan menggunakan metode Model non kompartemen.
Setelah memberikan dosis yang sama dari oral dan intravena, nilai-nilai bioavailabilitas
plasma (F) dari vitamin E alami di nanoemulsi dan kapsul lunak dihitung sesuai dengan
persamaan berikut:
38
Analisis Statistik
Untuk perbandingan statistik, semua data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dan
dianalisis untuk perbedaan yang signifikan secara statistik menggunakan uji independent sample
T.
Hasil
Profil konsentrasi-waktu plasma vitamin E alami pada tikus setelah pemberian
oral pada bentuk sediaan dari kedua nanoemulsi dan kapsul lunak yang ditunjukkan
pada Gambar. dan parameter farmakokinetik yang dirangkum dalam Tabel. Perbedaan
yang nyata antara profil farmakokinetik dari vitamin E alami nanoemulsi dan kapsul
lunak. Hasil menunjukkan Cmax yang lebih tinggi dan Tmax pendek untuk pemberian
oral dari nanoemulsion dan kapsul lunak. Daerah di bawah kurva (AUC) nilai dari
vitamin E alami nanoemulsi dan kapsul lunak yang masing-masing 1,482 ± 0,03 dan
0,907 ± 0,02 mg hml-1. Dengan demikian, ada peningkatan 1,6 kali lipat dalam AUC
alami vitamin E menggunakan teknik emulsifikasi yang dimodifikasi.
Gambar profil plasma nanoemulasi dan kapsul lunak
39
Tabel 3.3 Parameter Farmakokinetik
40