HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Isolasi dan Pemurnian Senyawa dari Kulit Akar Nyamplung

(Calophyllum inophyllum Linn.)

Sebanyak 40 gram ekstrak metanol difraksinasi menggunakan kromatografi vakum cair (KVC) yang dilakukan 2 kali fraksinasi, KVC I dan KVC II. Variasi eluen yang digunakan adalah n-heksana : EtOAc (10:0); (9,5:0,5) (2x); (9:1) (4x); (8,5:1,5) (4x); (8:2) (2x); (5:5); (0:10). Hasil KVC I dan II yang memiliki pola pemisahan sama digabung, sehingga diperoleh 7 fraksi (A–G) dengan berat masing-masing adalah: fraksi A (3,179 g), fraksi B (1,877 g), fraksi C (3,753 g), fraksi D (6,113 g), fraksi E (5,256 g), fraksi F (6,015 g) dan fraksi G (3,287 g). Kromatogram KLT dengan eluen n -Heksana : EtOAc (9,5 : 0,5) ditunjukkan gambar berikut :

Gambar 11. Kromatogram hasil kromatografi vakum cair fraksi A–G dengan eluen n-

Heksana : EtOAc (9,5 : 0,5)

Untuk mengisolasi senyawa A1 Santon, Rf kromatogram dibandingkan dengan Rf dari senyawa A1 santon (Handayani, 2010), sebagai berikut :

S ABCDE F G

commit to user

Gambar 12. Perbandingan Rf fraksi A–G dan Rf A1 Santon (X) dengan eluen n-

Heksana : EtOAc (9,5 : 0,5)

Hasil dari kromatogram terlihat bahwa fraksi B mengandung senyawa A1 Santon. Selain itu, fraksi B memiliki pemisahan spot yang cukup baik dan berat yang memadai, sehingga dilakukkan pemurnian terhadap fraksi B. Pemurnian dilakukan dua kali dengan kolom kromatografi sephadex LH-20 berdiameter 1 cm dengan eluen metanol. Pada sephadex I, sampel sebanyak 0,223 g dimurnikan dan hasil pemurnian

yang memiliki pola pemisahan sama digabung sehingga diperoleh 6 fraksi utama (B 1 -

B 6 ). Berat masing-masing hasil sephadex I adalah fraksi B 1 (0,050 g), fraksi B 2 (0,017 g), fraksi B 3 (0,009 g), fraksi B 4 (0,005 g), fraksi B 5 (0,007 g) dan fraksi B 6 (0,010). Kromatogram KLT dengan eluen n-Heksana : EtOAc (9 : 1) ditunjukkan gambar berikut :

Gambar 13. Kromatogram hasil kromatografi sephadex I fraksi B 1 -B 6 dengan eluen

n -Heksana : EtOAc (9 : 1)

Pada sephadex II, sampel sebanyak 0,182 g dimurnikan dan hasil pemurnian yang memiliki pola pemisahan sama digabung sehingga diperoleh 4 fraksi utama (B a -

commit to user

B d ) dengan berat masing-masing yaitu, fraksi B a (0,014 g), fraksi B b (0,009 g), fraksi

B c (0,007 g), dan fraksi B d (0,010 g). Kromatogram KLT dengan eluen n-Heksana : EtOAc (9 : 1) ditunjukkan gambar berikut :

Gambar 14. Kromatogram hasil kromatografi sephadex II fraksi B a -B d dengan eluen

n -Heksana : EtOAc (9 : 1)

Dari gambar 12 dan gambar 13 terlihat bahwa fraksi B 5 ,B 6 ,B c dan B d menunjukkan pola pemisahan yang sama, maka dilakukkan KLT untuk keempat fraksi tersebut dengan eluen n-Heksana : EtOAc (9 : 1). Kromatogram KLT dengan eluen n-Heksana : EtOAc (9 : 1) ditunjukkan gambar berikut :

Gambar 15. Kromatogram fraksi B 5 ,B 6 ,B c dan B d dengan eluen n-Heksana : EtOAc

Untuk mengetahui kemurnian senyawa dilakukkan KLT dengan variasi eluen berbeda yaitu n-heksana : EtOAc (9 : 1), n-heksana : CHCl 3 (9 : 1), dan n-heksana : aseton (9 : 1). Hasil kromatogram KLT dengan variasi eluen berbeda ditunjukkan oleh gambar berikut :

commit to user

(a)

(b)

(c) Gambar 16. Kromatogram KLT dengan variasi eluen berbeda

(a) n-Heksana : EtOAc (9 : 1) (b) n-Heksana : CHCl 3 (9 : 1) (c) n-Heksana : aseton (9 : 1)

Noda yang dihasilkan dari KLT dengan variasi eluen berbeda menunjukkan satu spot, sehingga senyawa hasil isolasi diduga sudah murni. Hasil isolasi dari fraksi B tersebut

kemudian diidentifikasi struktur molekulnya dengan spektroskopi UV, IR, 1 H NMR, dan LC-MS.

B. Elusidasi Senyawa Hasil Isolasi

1. Analisis data UV

Data yang diperoleh dengan metode spektroskopi UV dalam pelarut metanol menunjukkan adanya 2 serapan pada daerah λ max 209,5 nm dan 290,5 nm yang menunjukkan adanya sistem aromatik. Penambahan pereaksi geser NaOH 1M menunjukkan adanya 3 serapan pada daerah λ max 213 nm, 280,5 nm dan 300,5 nm.

Panjang gelombang bergeser ke panjang gelombang yang lebih besar. Pergeseran tersebut menunjukkan adanya pergeseran bathokromik yang menunjukkan adanya hidroksi fenol pada cincin aromatik.

commit to user

(a)

(b)

Gambar 17. Hasil analisis UV A1 santon (a) Spektrum UV dengan pelarut metanol (b) Spektrum UV dengan pelarut metanol setelah penambahan pereaksi

geser (NaOH)

Dari data analisis UV dapat diketahui bahwa terdapat hidroksi fenol pada cincin aromatik.

2. Analisis data IR

Hasil analisis IR menunjukkan adanya serapan-serapan dari beberapa gugus fungsi pada panjang gelombang tertentu. Keberadaan gugus hidroksil pada sistem aromatik dari analisis UV diperkuat dengan hasil analisis IR. Serapan gugus fungsi dari hasil isolasi yang muncul pada spektra IR dapat dilihat pada gambar 18. Tabel 4. Data IR Hasil Isolasi dan Senyawa A1 Santon

Gugus fungsi

λ (cm -1 )

A1 santon Handayani (2010)

Hasil isolasi O–H

3442,94 dan 3417,86

C – H alifatik

2854,65 dan 2924,09

2931,80 dan 2852,72 C=C

280,5 nm 300,5 nm

213 nm

commit to user

Gambar 18. Spektrum analisis IR A1 santon

Dari hasil analisis dapat diketahui bahwa terdapat gugus aromatik yang proton- protonnya terdistribusi oleh gugus hidroksil dan gugus alifatik. Seperti yang terlihat pada tabel 4, serapan gugus-gugus fungsi yang muncul pada spektra hasil isolasi memiliki kemiripan dengan spektra A1 santon (Handayani, 2010).

3. Analisis data 1 H NMR

Berdasarkan spektrum 1 H NMR dapat ditentukan jumlah dan jenis proton yang muncul dari setiap geseran kimia proton.

Tabel 5. Jenis Proton pada Data 1 H NMR Senyawa Hasil Isolasi

δ H (ppm) Multiplisitas (J)

∑H

Jenis proton

13,44

1H OH terkelasi

7,71

dd (J=3,2; 5,2)

1H

7,26 Aromatik d (J= 1,8) 1H

7,24

d (J= 7,8)

1H

6,79

d (J= 9,75)

1H

6,73 = CH dd (J=10,35; 17,5) 1H

5,64

d (J= 9,75)

1H

5,24

d (J= 17,5)

d (J= 10,35)

Metil (CH 3 )

1,52

6H ∑ H = 21

Data analisis 1 H NMR (gambar 18) menunjukkan adanya 21 sinyal proton yang dapat dianalisis. (table 5)

Gugus OH

C-H alifatik

C=C aromatik

commit to user

Gambar 19. Spektrum 1 H NMR A1 santon

Daerah aromatik biasanya berada pada geseran kimia proton 6-8 ppm. Dari spektrum 1 H NMR memperlihatkan adanya 4 sinyal proton aromatik. Pada daerah δ H 7,71 ppm menunjukkan doubleduplet (dd) dengan tetapan kopling 3,2 dan 5,2 (J=3,2; 5,2). Pergeseran pada daerah δ H 7,26 ppm dan 7,24 ppm berada saling berdekatan, dimana keduanya memiliki multiplisitas sama yaitu duplet (d) namun memiliki tetapan kopling yang berbeda yaitu J=1,8 dan J=7,8. Pergeseran kimia proton pada daerah δ H 6,79 ppm menunjukkan duplet dengan tetapan kopling J=9,75. Perbesaran spektrum

1 H NMR dapat dilihat pada gambar 20.

(a)

OH terkelasi

H Aromatik

H Alkana

H Alkena

d (J=1,8) d (J=7,8)

dd (J=3,2; 5,2)

commit to user

(b)

(c)

Gambar 20. Perbesaran spektrum 1 H NMR (a). Perbesaran 1 H NMR pada δ 7.70-7.20 (b). Perbesaran 1 H NMR pada δ 6.90-5.00 (c). Perbesaran 1 H NMR pada δ 1.70-0.90

Pergeseran pada daerah δ H 6,73 menunjukkan doubleduplet dengan tetapan kopling 10,35 dan 17,5 (J=10,35; 17,5). Selanjutnya multiplisitas duplet ditunjukkan pada daerah δ H 5,64 ppm dengan tetapan kopling J=9,75. Sinyal pada daerah δ H 13,44 ppm menunjukkan adanya sinyal proton singlet dari gugus hidroksil yang membentuk ikatan hidrogen dengan atom O dari gugus karbonil. Pada geseran kimia 1,65 ppm dan 1,52 ppm muncul sinyal proton metil identik (3H, s). Proton metilen menunjukkan

sinyal pada daerah δ H 5,24 ppm dan 5,08 ppm dengan tetapan kopling J=17,5 dan J=10,35. Sinyal-sinyal yang muncul pada spektrum 1 H NMR hasil isolasi menunjukkan spektrum yang hampir sama dengan spektrum 1 H NMR A1 santon (Handayani, 2010). Data tersebut memperlihatkan bahwa senyawa yang diperoleh merupakan senyawa

d (J= 9,75)

dd (J=10,35; 17,5)

d (J= 9,75)

d (J= 17,5)

d (J= 17,5)

ss

commit to user

A1 santon. Perbandingan data 1 H NMR hasil isolasi dengan senyawa A1 santon (Handayani, 2010) terlihat pada tabel 6.

Tabel 6. Data 1 H NMR Hasil Isolasi dan Senyawa A1 Santon

∑H

Jenis proton

A1 santon (Handayani, 2010)

Hasil Isolasi

1H OH terkelasi

7,70 (dd, J=1,8; 7,95)

7,71 (dd, J=3,2; 5,2)

1H 7,26 (d, J= 1,8)

7,26 (d, J= 1,8)

1H 7,24 (d, J= 7,95)

7,24 (d, J= 7,8)

1H

= CH

6,78 (d, J= 10)

6,79 (d, J= 9,75)

1H 6,70 (dd, J=10,4; 17,7)

6,73 (dd, J=10,35; 17,5)

1H 5,63 (d, J= 9,75)

5,64 (d, J= 9,75)

1H

= CH 2

5,23 (d, J= 17,4)

5,24 (d, J= 17,5)

1H 5,11 (d, J= 10,4)

5,08 (d, J= 10,35)

6H

Metil (CH 3 )

1,65 (s)

1,65 (s)

6H 1,52 (s)

1,52 (s)

∑ H = 21

Proton aromatik pada A1 santon menunjukkan adanya sistem ABX, dimana tiga sinyal proton tersebut berada pada δ H 7,70 (dd, J=1,8; 7,95); 7,26 (d, J= 1,8) dan 7,24 (d, J= 7,95). Multiplisitas dari sinyal ini merupakan ciri adanya sistem ABX dari cincin aromatik yaitu proton pada δ H 7,70 (dd, J=1,8; 7,95) berkopling dengan proton δ H 7,24 (d, J= 7,95). Sedangkan hasil isolasi, tiga sinyal proton yang muncul pada sistem ABX adalah δ H 7,71 (dd, J=3,2; 5,2); 7,26 (d, J= 1,8); dan 7,24 (d, J= 7,8). Terlihat bahwa hasil isolasi masih terdapat pengotor yang dapat mengganggu geseran kimia.

4. Analisis data LC-MS

Berdasarkan spektrum LC-MS dapat ditentukan massa molekul relatif dari suatu senyawa. LC-MS dapat dipakai untuk sebagian besar senyawa tak atsiri dan senyawa berbobot molekul tinggi.

commit to user

Gambar 21. Spektrum LC-MS A1 santon

Dari struktur yang telah diketahui, A1 santon memiliki rumus molekul

C 23 H 22 O 5 dengan bobot molekul berdasar perhitungan sebesar 378,14676 Da. Penentuan bobot molekul didasarkan pada jumlah massa-massa isotop atom (C=12,0000; H=1,00783; O=15,9949). Penampakan spektrum pada LC-MS berupa serangkaian puncak massa yang sesuai dengan ion molekul yang kurang satu proton [M-H] - dengan menggunakan pengukuran High Resolution-Mass Spektroscopy (HR- MS).

Spektrum LC-MS menunjukkan bahwa bobot molekul senyawa A1 santon sebesar 377,1345 Da, dimana pada m/z tersebut menunjukkan intensitas relatif massa yang tinggi. Sedangkan, bobot molekul senyawa A1 santon [M-H] - berdasar perhitungan jumlah masa-masa isotop atom yaitu sebesar 377,13893 Da. Simpangan dari massa perhitungan sebesar 4,43 mDa yang menunjukkan bahwa hasil spektrum sesuai dengan struktur yang disarankan. Hasil spektrum dapat dikatakan sesuai dengan struktur yang disarankan jika simpangan massa perhitungan kurang dari 5 mDa.

O H OH

HO

A1 santon

commit to user

Sehingga menurut data LC-MS yang ada, senyawa A1 santon diatas memiliki berat molekul sebesar 378,1345 Da.

Simpangan perhitungan (dalam [M-H] - ):

Massa molekul relatif yang disarankan = 377,13893 Da Massa molekul relatif berdasar spektrum LC-MS = 377,1345 Da Selisih simpangan perhitungan

= 0,00443 Da (4,43 mDa)

commit to user