ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN PENENTUAN BOBOT MOLEKUL SENYAWA A1 SANTON DARI KULIT AKAR NYAMPLUNG (CALOPHYLLUM INOPHYLLUM LINN.)

Disusun oleh : MAULIA WARDANI

M 0306010

SKRIPSI Diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan mendapatkan gelar Sarjana Sains Kimia

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA Januari, 2012

commit to user

HALAMAN PENGESAHAN

Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta Telah Mengesahkan Skripsi Mahasiswa:

Maulia Wardani M0306010, dengan judul “Isolasi, Identifikasi, dan Penentuan Bobot Molekul Senyawa A1 Santon dari Kulit Akar Nyamplung (Calophyllum Inophyllum

Linn.)” Skripsi ini dibimbing oleh:

Pembimbing I

M. Widyo Wartono, M.Si NIP. 19760822 200501 1001

Pembimbing II

Soerya Dewi Marliyana, M.Si NIP. 19690313 199902 2001 Dipertahankan di depan Tim Penguji Skripsi pada:

Anggota Tim Penguji:

1. Dr. Eddy Heraldy, M.Si 1............................. NIP. 19640305 200003 1002

2. Ahmad Ainurofiq, M.Si., Apt 2.............................. NIP. 19780319 200501 1003

Disahkan Oleh Ketua Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Sebelas Maret Surakarta

Dr. Eddy Heraldy, M.Si NIP. 19640305 200003 1002

commit to user

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi saya yang berjudul “ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN PENENTUAN BOBOT MOLEKUL SENYAWA A1 SANTON DARI KULIT AKAR NYAMPLUNG (CALOPHYLLUM INOPHYLLUM LINN.)” adalah benar-benar hasil penelitian sendiri dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat kerja atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta, 31 Januari 2012

MAULIA WARDANI

commit to user

ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN PENENTUAN BOBOT MOLEKUL SENYAWA A1 SANTON DARI KULIT AKAR NYAMPLUNG

(CALOPHYLLUM INOPHYLLUM LINN)

MAULIA WARDANI

Jurusan Kimia. Fakultas MIPA. Universitas Sebelas Maret

ABSTRAK

Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan membuktikan struktur senyawa A1 santon dari kulit akar tumbuhan nyamplung (Calophyllum inophyllum Linn.). Ekstrak metanol pekat difraksinasi menggunakan KVC (silika gel 60 G), pemurnian menggunakan kromatografi kolom dengan sephadex LH-20. Senyawa hasil isolasi

dikarakterisasi dengan spektroskopi UV, IR, dan 1 H NMR. Data dibandingkan dengan data yang telah dilaporkan sebelumnya dan bobot molekul dianalisis dengan LC-MS. Dari hasil analisa data diperoleh senyawa A1 santon dengan rumus molekul C 23 H 22 O 5 dan bobot molekul 378.1345 Da.

Kata Kunci : Callophyllum inophyllum Linn., Kulit akar, bobot molekul, dan A1 santon

commit to user

ISOLATION, IDENTIFICATION, AND DETERMINATION OF A MOLECULAR WEIGHT A1 XANTHONE FROM ROOT BARK OF NYAMPLUNG (Calophyllum inophyllum Linn) MAULIA WARDANI

Department of Chemistry. Mathematic and Science Faculty. Sebelas Maret University

ABSTRACT

This research was done to isolate and prove the structure of A1 xanthone from root bark of nyamplung (Calophyllum inophyllum Linn.). Methanol extract was fractionated using VLC (silica gel 60 G), purification using column chromatography

with Sephadex LH-20. Isolation of compound was characterized by UV, IR, and 1 H NMR spectroscopy. Data was compared with the previously reported data and molecul weight was analyzed by LC-MS. This compound was identified as A1 xanthone with

molecular formula C 23 H 22 O 5 and molecular weight of 378.1345 Da.

Keywords : Callophyllum inophyllum Linn., Root bark, molecular weight, and A1 Xanthone

commit to user

MOTTO

Sesungguhnya setiap kesulitan tersimpan hikmah dan sesudahnya pasti ada kemudahan, karenanya bersabarlah karena sabar itu indah. Allah tidak membebani seseorang, melainkan sesuai dengan kesanggupannya.

(QS. Al-Baqarah : 286)

Pengalaman pahit adalah jalan menuju kedewasaan, kalau kita berhasil melewatinya maka hal-hal yang menakjubkan akan muncul.

(Aya Kito)

Pahitnya kehidupan seperti pengaruh garam. Besar kecilnya penderitaan tergantung pada wadah dimana kita meletakkannya. Jadi, bila kau merasa menderita maka lapangkanlah dada. Berhenti menjadi gelas, jadilah kau telaga.

(Anonim)

Akan ada suatu saat pada setiap kehidupan manusia, kapan mereka harus memutuskan. Apakah akan mengikuti apa yang mereka inginkan dalam

kehidupannya, atau mengikuti apa yang diinginkan orang lain untuk

kehidupannya. (Chris Widener)

Aku tidak akan menyerah demi melihat orang yang kucintai tersenyum dan akan

kujaga senyuman itu selama hidupku.

(Paya)

commit to user

PERSEMBAHAN

Karya kecil ini kupersembahkan untuk : Bapak dan Mamah tercinta atas doa yang tak pernah putus, dukungan yang tak pernah surut, dan kepercayaan yang tiada henti. Bagas Anzas Kara atas dorongan semangat yang membuat kakakmu ini selalu dapat bangkit dan bangkit lagi. Bapak Sutarjo, Ibu Misri , Nurul Fariana dan Abu Bakar Sidiq atas kesediaannya menjadi keluarga bagiku. Para Pembaca semoga dapat bermanfaat.

commit to user

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas segala limpahan nikmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa dalam menyelesaikan skripsi yang berjudul “Isolasi, Identifikasi, dan Penentuan Bobot Molekul Senyawa A1 Santon dari Kulit Akar Nyamplung (Calophyllum Inophyllum Linn.)” ini banyak pihak yang telah membantu. Untuk itu, penulis menyampaikan terima kasih kepada:

1. Dr. Eddy Heraldy, M.Si selaku ketua jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

2. M. Widyo Wartono, M.Si selaku pembimbing I yang telah memberikan bimbingan, arahan dan kesabaran selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

3. Soerya Dewi Marliyana, M.Si selaku pembimbing II yang telah memberikan bimbingan dan arahannya.

4. Prof. Dra. Neng Sri Suharty, MS, PhD, selaku pembimbing akademik yang telah memberikan bimbingan dan arahannya.

5. I.F. Nurcahyo, M.Si., selaku Ketua Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret.

6. Seluruh Dosen di Jurusan Kimia, Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret atas ilmu yang berguna dalam menyusun skripsi ini.

7. Para Laboran di Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret atas bantuan dan kerjasama yang baik.

8. Sahabat-sahabatku; Teguh Budi Haryanto, Rahma Yulmi Ahtika dan Risqi Karlina atas segala motivasi, dukungan dan bantuan yang mengalir selama ini.

9. Sahabat-sahabat ajaibku; Cupu, Ndut Umma, Ah Toon, dan Bibi’. Bahagia dapat mengenal kalian dan terima kasih telah menjadi pelipur dukaku selama ini.

commit to user

10. Muhammad Faizul Umam, teman-teman kost Barokah Permai (termasuk Nopi dan Ma’ruf) serta teman-teman kost Virgo (terutama Rizqi dan Icha). Terima kasih atas bantuannya selama ini.

11. Teman-teman kimia angkatan 2006 yang tidak mungkin disebutkan satu persatu, serta kakak dan adik tingkat atas semua dukungan dan persahabatannya selama ini.

12. Semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Semoga Allah SWT membalas segala bantuan dan pengorbanan yang telah diberikan dengan balasan yang lebih baik.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak dalam rangka untuk menyempurnakan skripsi ini. Akhirnya penulis berharap, semoga karya kecil ini dapat memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan dan bagi pembaca.

Surakarta, 31 Januari 2012

Maulia Wardani

commit to user

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Karakteristik tanaman .................................................................................

4 Tabel 2. Serapan yang spesifik pada spektra IR berdasarkan gugus fungsional ...... 14 Tabel 3. Pergeseran kimia 1 H yang khas .................................................................

15 Tabel 4. Data IR hasil isolasi dan senyawa A1 santon ............................................. 31 Tabel 5. Jenis proton pada data 1 H NMR senyawa hasil isolasi ..............................

32 Tabel 6. Data 1 H NMR hasil isolasi dengan senyawa A1 santon ............................

commit to user

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Tumbuhan Nyamplung .........................................................................

Gambar 2. Kerangka Dasar Senyawa .....................................................................

Gambar 3. Turunan santon pada bagian heartwood C. inophyllum .......................

Gambar 4. Turunan santon pada bagian heartwood akar C. inophyllum ...............

Gambar 5. Turunan santon pada kulit batang C. inophyllum .................................

Gambar 6. Turunan santon pada ranting C. inophyllum .........................................

Gambar 7. Turunan santon pada kulit akar C. Inophyllum .....................................

Gambar 8. Senyawa inosanton dan A1 santon .......................................................

Gambar 9. Sistem AMX dan ABX .........................................................................

Gambar 10. Skema time-of-flight spektrometer massa ..........................................

Gambar 11. Kromatogram hasil kromatografi vakum cair .....................................

Gambar 12. Perbandingan Rf fraksi A–G dan Rf A1 Santon (X) ..........................

Gambar 13. Kromatogram hasil kromatografi sephadex I .....................................

Gambar 14. Kromatogram hasil kromatografi sephadex II ....................................

29 Gambar 15. Kromatogram fraksi B 5 ,B 6 ,B c dan B d ...............................................

Gambar 16. Kromatogram KLT dengan variasi eluen berbeda ..............................

Gambar 17. Hasil analisis UV A1 santon ...............................................................

Gambar 18. Spektrum analisis IR A1 santon ..........................................................

32 Gambar 19. Spektrum 1 H NMR A1 santon ............................................................

33 Gambar 20. Perbesaran spektrum 1 H NMR ............................................................

34 Gambar 21. Spektrum LC-MS A1 santon ............................................................... 36

commit to user

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Spektrum 1 H NMR perbesaran pada δ H 13,00-1,00 ppm ...................

42 Lampiran 2. Spektrum 1 H NMR perbesaran pada δ H 8,00-4,00 ppm .....................

42 Lampiran 3. Spektrum 1 H NMR perbesaran pada δ H 4,70-3,60 ppm .....................

43 Lampiran 4. Data analisis LC-MS ........................................................................... 43

commit to user

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Indonesia merupakan negara kepulauan dengan berbagai macam flora hayati yang memiliki potensi besar dalam bidang kesehatan, pertanian, dan industri. Nyamplung (Calophyllum inophyllum Linn.) merupakan salah satu jenis tumbuhan kehutanan yang mempunyai banyak kegunaan baik dari kayu maupun buahnya. Nyamplung termasuk dalam genus Calophyllum dari family Clusiaceae yang

mempunyai sebaran cukup luas di dunia. Penyebaran pohon nyamplung paling umum berada di daerah Asia tropis. Tanaman ini banyak tumbuh di sepanjang daerah tropis, termasuk pulau-pulau Pasifik Selatan dan Tengah, Kepulauan Hawaii, dan pulau-pulau Karibia (Allen, 1989). Nyamplung juga dapat tumbuh subur di Indonesia, seperti Sumatera, Jawa, Maluku, Nusa Tenggara, Sulawesi, dan Bali. (Heyne, 1987)

Genus Calophyllum terdiri dari 180–200 spesies berbeda yang terkenal kaya akan senyawa bioaktif. Genus Calophyllum memiliki aktivitas sitotoksik, anti-HIV, anti-tumor, antimalaria, dan antibakteri (Su, 2008). Kelompok senyawa bahan alam yang telah diisolasi dari tumbuhan genus Calophyllum cukup beragam, seperti golongan santon, benzodipiranon, kumarin, flavonoid dan triterpenoid. Salah satu spesies dari genus Calophyllum adalah Calophyllum inophyllum Linn. Penelitian yang telah dilakukkan pada spesies C. inophyllum seperti senyawa turunan kumarin menunjukkan anti-HIV (Patil, 1993), aktivitas sitotoksik dan antimikroba (Yimdjo, 2004) dan antitumor (Itoigawa, 2001); aktivitas anti-HIV (Laure, 2008). Senyawa turunan santon menunjukkan aktivitas antimikroba (Yimdjo, 2004); antitumor (Noldin, 2006); antivitas sitotoksik (Dai, 2010).

Isolasi dan elusidasi struktur dua senyawa santon dari kulit akar nyamplung (Calopyllum inophyllum Linn.) (Handayani, 2010) menyarankan struktur senyawa “A1 santon”. A1 santon memiliki struktur yang mirip dengan inosanton, yaitu senyawa yang telah diisolasi dari kulit akar C.inophyllum dari Kamerun (Yimdjo, 2004). Perbedaan antara “A1 santon” dengan “inosanton” adalah letak posisi gugus fungsi hidroksi, pada senyawa A1 santon berada pada posisi C-6 sedangkan inosanton

commit to user commit to user

Penelitian tentang isolasi senyawa kimia khususnya dari kulit akar C. inophyllum masih jarang dilakukan di Indonesia. Penelitian ini dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai metode. Perbedaan sampel, metode pemisahan, dan sistem pelarut yang digunakan akan mempengaruhi jenis senyawa kimia yang dihasilkan. Dalam penelitian sebelumnya, identifikasi yang dilakukan menggunakan spektroskopi

1 H NMR dan 13 C NMR. 1 H NMR dapat memberi informasi struktural mengenai atom- atom hidrogen dalam sebuah molekul organik, sedangkan 13 C NMR memberikan

informasi tentang kerangka karbon dalam molekul. Dari struktur yang disarankan, A1 santon memiliki rumus molekul C 23 H 22 O 5 . Dalam hal ini, jumlah atom oksigen belum diketahui secara pasti sehingga perlu adanya pembuktian struktur senyawa A1 santon dengan mengetahui bobot molekul dari senyawa A1 santon. Selain itu, perlu adanya identifikasi senyawa menggunakan Liquid Chromatography-Mass spectroscopy (LC- MS) untuk mengetahui bobot molekul relatif dan rumus molekul dari A1 santon.

B. Perumusan Masalah

1. Identifikasi Masalah

Dari struktur yang disarankan yaitu A1 santon (Handayani, 2010) memiliki rumus molekul C 23 H 22 O 5 . Dalam hal ini, jumlah atom oksigen belum diketahui secara pasti karena hanya dilakukkan identifikasi dengan 1 H NMR dan 13 C NMR. Oleh karena itu, perlu adanya pembuktian struktur senyawa A1 santon dengan mengetahui bobot molekul dari senyawa A1 santon. Sehingga senyawa A1 santon perlu adanya identifikasi senyawa untuk mengetahui massa molekul relatif dan rumus molekul dengan menggunakan Liquid Chromatography-Mass spectroscopy (LC-MS). Spektrum LC-MS akan menunjukkan kesesuaian antara struktur yang disarankan dengan rumus molekul dan bobot molekul relatifnya. Identifikasi komponen kimia dalam bahan alam dapat dilakukan dengan berbagai metode seperti skrining fitokimia, kromatografi lapis tipis (KLT), Spektrofotometri UV-Vis, Inframerah (IR), spektroskopi resonansi magnet inti (NMR), dan Liquid Chromatography-Mass spectroscopy (LC-MS).

commit to user

2. Batasan Masalah

Berdasarkan identifikasi masalah di atas, maka masalah dalam penelitian ini dibatasi oleh:

a. Senyawa bahan alam yang diisolasi dari kulit akar Calophyllum inophyllum Linn. adalah senyawa A1 santon.

b. Struktur senyawa A1 santon dibuktikan kebenarannya dengan Liquid Chromatography-Mass spectroscopy (LC-MS) dan dilengkapi datanya dengan

Spektrofotometri UV-Vis, Inframerah (IR), dan 1 H Spektroskopi Resonansi

Magnet Inti ( 1 H NMR).

3. Rumusan Masalah

Apakah senyawa A1 santon terbukti kebenaran strukturnya dengan mengetahui bobot molekul menggunakan metode Liquid Chromatography-Mass spectroscopy (LC-MS)?

C. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, menentukan bobot molekul, dan membuktikan kebenaran struktur senyawa A1 santon yang terdapat dalam kulit akar tumbuhan nyamplung (Calophyllum inophyllum Linn.) dengan Liquid Chromatography-Mass spectroscopy (LC-MS).

D. Manfaat Penelitian

Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini yaitu memberikan informasi mengenai rumus molekul dan bobot molekul relatif senyawa A1 santon yang terdapat dalam kulit akar nyamplung (Calophyllum inophyllum Linn.).

commit to user

BAB II LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Tumbuhan Nyamplung

a. Deskripsi tumbuhan Genus Calophyllum berasal dari bahasa yunani: kalos artinya cantik, dan phullon artinya daun, genus ini terdiri dari sekitar 180-200 spesies berbeda dari familia Clusiaceae (Su, 2008). Karakteristik tumbuhan nyamplung (Calophyllum inophyllum Linn.) dapat dilihat pada Tabel 1. Genus Calophyllum merupakan salah satu tumbuhan yang tersebar terutama di daerah tropis seperti Asia, Afrika, dan Amerika (Laure, 2005). Tumbuhan nyamplung (Gambar 1) dapat tumbuh subur di Indonesia, seperti Sumatera, Jawa, Maluku, Nusa Tenggara, Sulawesi, dan Bali (Heyne, 1987).

Gambar 1. Tumbuhan Nyamplung

Tabel 1. Karakteristik Tumbuhan : Kerjaan

Calophyllum inophyllum Linn.

Nama umum

Nyamplung

(Heyne, 1987)

commit to user

Nyamplung adalah pohon bercabang rendah dengan tinggi sekitar 8 sampai 20 m. Buahnya hijau, bulat dan memiliki biji tunggal yang besar. Saat buah matang berwarna kuning atau merah-coklat dan berkerut. Meskipun berbunga sedikit tetapi dapat berbunga sepanjang tahun, di sebagian besar wilayah terjadi dua periode berbunga yang terjadi di akhir musim semi/awal musim panas dan di akhir musim gugur. Nyamplung tumbuh dari tepi pantai hingga daerah hutan dataran rendah, meskipun kadang-kadang tumbuh di dataran tinggi. Nyamplung dapat tumbuh di berbagai jenis tanah, dari pasir pantai sampai tanah liat, dan dapat pula tumbuh di daerah terdegradasi dan daerah yang kering (Allen, 1989).

b. Manfaat tumbuhan Kayu pohon nyamplung dapat digunakan dalam sebagai bahan konstruksi, pembuatan kapal laut, papan lantai, peralatan rumah tangga, alat-alat instrument dan papan pada bangunan perumahan (Ee, 2009). Getahnya dapat disadap untuk mendapatkan minyak yang dikenal dengan nama minyak tamanu yang diindikasikan berkhasiat untuk menekan pertumbuhan virus HIV. Daunnya digunakan sebagai antiseptik, espektoran, diuretik, dan penyembuh luka (Ali, 1999). Bijinya setelah diekstrak menjadi minyak digunakan dalam sejumlah produk, termasuk minyak untuk penerangan, obat-obatan, dan minyak untuk tubuh dan rambut (Allen,1989).

c. Kandungan kimia tumbuhan Kandungan kimia dalam tanaman nyamplung (Calophyllum inophyllum Linn.) yang pernah dilakukan penelitian dan telah berhasil diisolasi merupakan senyawa aromatik seperti senyawa turunan santon (1), kumarin (2), dan kromanon (3), sedangkan dari golongan non aromatis antara lain triterpenoid (4) dan steroid (5) (Su, et. al ., 2008).

commit to user

Gambar 2. Kerangka Dasar Senyawa

Santon merupakan senyawa dengan kerangka dasarnya terdiri dari dua fenil yang dihubungkan dengan jembatan karbonil dan oksigen (eter). Santon mempunyai kerangka dasar yang terdiri atas 13 atom karbon yang membentuk susunan C6–C1– C6. Berdasarkan hasil penelitian yang pernah dilaporkan, senyawa turunan santon yang telah diisolasi dari tumbuhan Calophyllum inophyllum Linn. cukup banyak. Salah satunya yaitu dari Malaysia telah diisolasi senyawa turunan santon dari ekstrak n -heksana pada bagian heartwood Calophyllum inophyllum L. yaitu 2-(3-hidroksi-3- metilbutil)-1,3,5,6-tetrahidroksisanton (7) (Jantan, 1991).

Gambar 3. Turunan santon pada bagian heartwood C. inophyllum Penelitian lain dari Okinawa, Jepang telah dilakukan isolasi untuk memperoleh

senyawa turunan santon dari ekstrak aseton pada bagian heartwood akar Calophyllum inophyllum L. yaitu calosanton E (8) (Iinuma, 1995).

Gambar 4. Turunan santon pada bagian heartwood akar C. inophyllum

commit to user

Senyawa turunan santon diisolasi dari ekstrak aseton pada kulit batang Calophyllum inophyllum L. yang berasal dari Taiwan yaitu calopinon (9), calosanton I (10), brasilisanton B (11), 6-deoksijacareubin (12) dan piranojacareubin (13) (Shen, 2004).

Gambar 5. Turunan santon pada kulit batang C. inophyllum

Pada bagian ranting Calophyllum inophyllum L. yang berasal dari Hainan, Cina telah diisolasi senyawa turunan santon dari ekstrak etanol yaitu calosanton N (14) dan gerontosanton (15) (Dai, 2008). Selain itu, dari ekstrak etil asetat diperoleh calosanton O (16) dan calosanton P (17) (Dai, 2010).

commit to user

Gambar 6. Turunan santon pada ranting C. inophyllum

Terdapat beberapa penelitian tentang senyawa turunan santon yang diisolasi dari kulit akar Calophyllum inophyllum L. yang berasal dari Okinawa, Jepang yaitu dari ekstrak aseton diperoleh calosanton A (18), calosanton B (19), 1,5- dihidroksisanton (20), dan maklurasanton (21) (Iinuma, 1994), serta calosanton D (22) (Iinuma, 1995). Penelitian lain dari Malaysia dilakukan pada kulit akar Calophyllum inophyllum L. dari ekstrak n-heksana diperoleh 1,3,5-trihidroksi-2-metoksisanton (23), dan Tovopirofilin (24) (Ee, 2009).

commit to user

Gambar 7. Turunan santon pada kulit akar C. inophyllum

Sedangkan dari ekstrak sikloheksan-etil asetat pada kulit akar Calophyllum inophyllum L. yang berasal dari Kamerun diperoleh inosanton (25) (Yimdjo, 2004) dan dari ekstrak metanol pada kulit akar Calophyllum inophyllum L. yang berasal dari Klaten, Indonesia diperoleh A1 santon (26) (Handayani, 2010). Senyawa A1 santon memiliki struktur yang mirip dengan inosanton. Perbedaan antara A1 santon dengan inosanton adalah posisi gugus fungsi hidroksi, pada senyawa A1 santon berada pada posisi C-6 sedangkan inosanton terletak pada C-5.

Gambar 8. Senyawa inosanton dan A1 santon

commit to user

2. Metode Isolasi dan Pemurnian Tumbuhan

a. Ekstraksi Ekstraksi bertujuan untuk menarik komponen kimia yang terdapat dalam simplisia. Ekstraksi didasarkan pada perpindahan massa komponen zat padat ke dalam pelarut dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka, kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut.

Maserasi merupakan contoh metode ektraksi padat-cair bertahap yang dilakukan dengan jalan membiarkan padatan terendam dalam suatu pelarut. Proses perendaman dalam usaha mengekstraksi suatu substansi dari bahan alam ini bisa dilakukan tanpa pemanasan (temperatur kamar), dengan pemanasan atau bahkan pada suhu pendidihan. Salah satu keuntungan metode maserasi adalah cepat, terutama jika maserasi dilakukan pada suhu didih pelarut. Waktu rendaman bahan dalam pelarut bervariasi antara 15-30 menit tetapi terkadang bisa sampai 24 jam. Jumlah pelarut yang diperlukan juga cukup besar, berkisar antara 10-20 kali jumlah sampel.

Ekstraksi biasanya dimulai dengan meggunakan pelarut organik secara berurutan dengan kepolaran yang semakin meningkat. Digunakan pelarut n-heksana, eter, petroleum eter atau kloroform untuk mengambil senyawa yang kepolarannya rendah. Selanjutnya digunakan pelarut yang lebih polar seperti alkohol dan etil asetat untuk mengambil senyawa-senyawa yang lebih polar. Pemilihan pelarut berdasarkan kaidah “like dissolve like“, yang berarti suatu senyawa polar akan larut dalam pelarut polar dan juga sebaliknya, senyawa non polar akan larut dalam pelarut non polar (Kristanti,2008).

b. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Proses pemisahan yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan (Hostettmann, 1995).

Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi

commit to user commit to user

Angka Rf berjangka antara 0,00 sampai 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal, hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h) menghasilkan nilai berjangka 0 sampai

100. Noda yang terjadi setelah dielusi dapat dideteksi dengan cara dipendarkan pada lampu UV untuk substansi yang berfluoresensi. Untuk substansi yang tidak berfluoresensi, plat KLT ditambah indikator fluoresensi kemudian dilihat dengan sinar

tampak atau lampu UV (Stahl, 1995).

Lapisan tipis sering mengandung indikator fluoresensi yang ditambahkan untuk membantu penampakan noda pada lapisan yang telah dikembangkan. Indikator fluoresensi ialah senyawa yang memancarkan sinar tampak jika disinari dengan sinar berpanjang gelombang lain, seperti sinar ultraviolet. Jadi, lapisan yang mengandung indikator fluoresensi akan bersinar jika disinari pada panjang gelombang yang tepat. Jika senyawa pada noda yang akan ditampakkan mengandung ikatan rangkap terkonjugasi atau cincin aromatik jenis apa saja, sinar UV mengeksitasi tidak dapat mencapai indikator fluoresensi, dan tidak ada cahaya yang dipancarkan. Hasilnya ialah noda gelap dengan latar belakang bersinar (Gritter, 1991).

c. Kromatografi Vakum Cair (KVC) Kromatografi vakum cair merupakan salah satu kromatografi kolom khusus yang biasanya menggunakan silika gel sebagai adsorben (biasanya silika gel G 60, 63- 200 µm). Alat yang digunakan adalah corong Buchner berkaca masir atau kolom pendek dengan diameter yang cukup besar. Langkah pemisahan menggunakan kromatografi vakum cair biasanya dilakukan pada tahap awal pemisahan (Pemisahan terhadap ekstrak kasar yang diperoleh langsung dari proses ekstraksi) (Kristanti, 2008).

Kolom yang telah diisi sampel, dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan, kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi. Kromatografi vakum cair menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak (Hostettmann, 1995).

Jarak pusat noda dari titik awal

Jarak elusi total

Harga Rf =

commit to user commit to user

Gel Sephadex (G) merupakan salah satu adsorben yang digunakan sebagai fasa diam dalam kromatografi kolom. Senyawa dipisahkan berdasarkan berat molekulnya jika menggunakan kromatografi ini. Senyawa dengan berat molekul lebih besar akan terelusi terlebih dahulu jika yang digunakan sebagai eluen adalah air, jika yang digunakan sebagai eluen adalah pelarut organik maka gel shepadex berperilaku seperti selulosa tetapi kapasitas pemisahannya lebih besar karena ukuran partikelnya lebih teratur. Gel sephadex (LH-20) dirancang untuk digunakan memakai eluen organik. Biasanya yang digunakan adalah metanol. Sebelum digunakan sebaiknya gel sephadex direndam terlebih dahulu dalam eluen selama 12 jam (Kristanti, 2008).

Salah satu masalah kromatografi kolom ialah pemantauan pelarut ketika keluar dari kolom, untuk mengetahui kapan senyawa keluar. Bukan masalah jika senyawa tersebut berwarna, namun sebagian besar senyawa organik tidak berwarna. Pemantauan dapat dilakukan dengan membagi eluat menjadi beberapa fraksi di dalam beberapa tabung. Fraksi dianalisis KLT untuk memeriksa senyawa dengan menggabungkan noda-noda yang memiliki rf sama (Gritter, 1991).

3. Spektroskopi

Molekul dapat berada pada berbagai tingkat energi. Proses dalam suatu ikatan molekul terkuantisasi, artinya ikatan dapat meregang, bengkok, atau berotasi hanya pada frekuensi tertentu dan elektron hanya dapat bergerak diantara orbital-orbital dengan selisih energi tertentu. Selisih energi/frekuensi inilah yang terukur lewat berbagai jenis spektrum. Spektrum terdiri atas rekaman atau plot dari banyaknya energi radiasi yang diterima oleh detektor sewaktu energi asupannya divariasikan secara berangsur-angsur (Hart, 2003).

commit to user commit to user

Geseran batokhromik adalah geseran dari serapan ke panjang gelombang lebih panjang karena pengaruh pelarut (geseran merah). Geseran batokhromik sering diikuti dengan bertambahnya intensitas dan bertambahnya polaritas dari pelarut. Geseran merah dihasilkan dari suatu penurunan tingkat energi dari tingkat tereksitasi disertai dengan interaksi dwikutub-dwikutub dan ikatan hidrogen. Pita-B (pita benzenoid) adalah khas pita aromatik atau heteroaromatik. Bila suatu gugus khromoforik menempel pada suatu cincin aromatik, pita-B terlihat pada panjang gelombang yang lebih panjang daripad a transisi π π* yang lebih kuat (Silverstein, 2003).

Benzena dan senyawa aromatik memperlihatkan spektra yang lebih kompleks karena adanya beberapa keadaan eksitasi rendah. Sering panjang gelombang 260 nm dilaporkan sebagai λ max untuk benzena. Absorpsi radiasi ultra violet oleh senyawa aromatik yang terdiri dari cincin benzena terpadu bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang dengan bertambah banyaknya cincin benzena karena bertambahnya konjugasi dan memperbesarnya stabilisasi resonansi dari keadaan eksitasi (Fessenden, 1990).

b. Inframerah (IR) Spektroskopi inframerah (IR) merupakan salah satu teknik spektroskopi yang paling umum digunakan dalam analisa organik maupun anorganik. Tujuan utama dari analisis spektroskopi IR adalah untuk menentukan gugus fungsional dalam sampel. Gugus-gugus fungsional menyerap karakteristik frekuensi yang berbeda pada radiasi

commit to user

IR (lihat Tabel 2) . Spektrometer IR dapat digunakan untuk berbagai jenis sampel seperti gas, cairan, dan padatan (Hsu, 1997).

Inframerah biasa terukur pada kisaran antara 700-5000 cm -1 yang sama dengan energi sekitar 2-12 kkal/mol. Jumlah energi ini cukup untuk mempengaruhi getaran (vibrasi) ikatan tetapi sangat kurang untuk memutuskan ikatan (Hart, 2003). Tabel 2. Serapan yang Spesifik pada Spektra IR Berdasarkan Gugus Fungsional

Gugus

Jenis Senyawa

Daerah Serapan (cm -1 ) C–H

Alkana

= C – H Alkena dan senyawa aromatik

≡ C – H Alkuna

O–H Alkohol dan fenol

3500 – 3700 (bebas) 3200 – 3500 (berikatan hidrogen)

O–H Asam karboksilat

C=C Alkena

C=O Aldehida, keton, ester, asam

C ≡C Alkuna

(Hart, 2003) Dua daerah serapan penting dalam pemeriksaan awal sebuah spektrum ialah

daerah 4000 – 1300 cm -1 dan daerah 909 – 650 cm -1 . Bagian serapan tinggi sebuah spektrum disebut sebagai daerah gugus fungsi. Serapan khas bagi gugus-gugus fungsi yang penting seperti OH, NH, dan C=O terletak pada bagian tersebut. Ketiadaan serapan pada daerah gugus-gugus tertentu biasanya dapat digunakan sebagai bukti bahwa molekul itu tidak mempunyai gugus-gugus tersebut. Namun, dalam menafsirkannya harus berhati-hati karena suatu struktur tertentu dapat menyebabkan sebuah pita menjadi luar biasa lebar sehingga tidak terartikan. Pada umumnya, ketiadaan serapan kuat di daerah 909 – 650 cm -1 menunjukkan suatu struktur niraromatik. Senyawa-senyawa aromatik dan heteroaromatik menunjukkan pita serapan kuat C–H di daerah tersebut. Bagian tengah spektrum, yaitu 1300 – 909 cm -1 biasanya disebut sebagai daerah sidik jari. Serapan di daerah ini seringkali rumit dengan pita-pita yang ditimbulkan oleh getaran yang berantaraksi (Silverstein, 2005).

c. Spektroskopi 1 H resonansi magnetik inti ( 1 H NMR)

Spektroskopi NMR didasarkan pada spektroskopi absorpsi, seperti pula pada spektroskopi IR ataupun UV. Sampel dapat menyerap radiasi elektromagnetik pada daerah frekuensi radio. Pola spektra berupa alur antara absorbansi (A) terhadap

commit to user commit to user

(CDCl 3 ) banyak digunakan karena dapat memperkecil kemungkinan terganggunya pergeseran kimia yang diakibatkan pengotor dari CHCl 3 (Silverstein, 2005). Pada dasarnya spektroskopi 1 H NMR dapat memberi jenis informasi struktural mengenai atom-atom hidrogen dalam sebuah molekul organik. Banyaknya sinyal dan pergeseran kimianya dapat digunakan untuk mengidentifikasi jenis inti 1 H yang secara kimia berbeda di dalam molekul. Luas puncak menginformasikan banyaknya inti 1 H dari setiap jenis yang ada. Sedangkan pola pemisahan spin-spin menginformasikan tentang jumlah 1 H tetangga terdekat yang dimiliki oleh inti 1 H tertentu (Hart, 2003). Pergeseran kimia dapat dilihat pada Table 3.

Tabel 3. Pergeseran Kimia 1 H yang Khas Jenis 1 H δ (ppm)

Jenis 1 H δ (ppm)

C ─CH 3 0,85-0,95

─CH=C

9,5-9,7 CH 3 ─C=C

1,6-1,9

─CºC─H

2,4-2,7 CH 3 ─Ar

10-13 CH 3 ─O

4-8 (Hart, 2003)

Selisih letak serapan proton tertentu terhadap proton acuan dinamakan geseran kimia proton. Suatu sistem 3 kelompok proton yang masing-masing saling terpisah oleh beda geseran kimia besar dapat dilambangkan AMX. Jika 2 kelompok terpisah geseran kimia kecil sedangkan kelompok ketiga jauh terpisah dari 2 kelompok lainnya, sistem disebut ABX. Jika geserannya berdekatan, ikatan sebagai ABC (Silverstein, 2005). Spektrum dari A1 santon (26) memperlihatkan sistem ABX dan spektru dari metil 2-furoat (27) memperlihatkan sistem AMX.

commit to user

Gambar 9. Sistem AMX dan ABX

d. Liquid Chromatography – Mass Spectroscopy (LC-MS) Kromatografi adalah metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi antara dua fase, yaitu fase stasioner dan fase gerak. Fase gerak dapat berupa cairan atau gas, sedangkan fase diam dapat berupa padat, gel atau cairan.

Dari perspektif kualitatif, keterbatasan utama dari kromatografi dalam isolasi adalah ketidakmampuan untuk mengidentifikasi secara pasti suatu komponen campuran. Identifikasi ini didasarkan pada perbandingan karakteristik retensi, menyederhanakan waktu retensi, dan penentuan komponen dengan melihat referensi komponen senyawa pada kondisi sama. Keuntungan spektrometri massa terletak pada banyaknya senyawa yang cukup spesifik terhadap spektrum massa untuk memungkinkan identifikasi komponen dengan tingkat kepercayaan tinggi. Spektrum massa yang diperoleh akan mengandung ion dari semua senyawa yang ada. Kombinasi dari pemisahan kromatografi menguntungkan karena banyak senyawa dengan karakteristik retensi identik yang memiliki spektrum massa sangat berbeda (Ardrey, 2003).

LC-MS dapat dipakai untuk sebagian besar senyawa tak atsiri dan senyawa berbobot molekul tinggi. Pemakaian spektrometer massa pada kromatografi kolom memungkinkan dalam pengukuran bobot molekul setiap komponen (dapat komponen murni maupun campuran) (Gritter, 1991).

Beberapa metode ionisasi yang biasa digunakan dalam LC-MS adalah ionisasi elektron (EI), ionisasi kimia (CI), bombardir atom-cepat (FAB), Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI), Ionisasi Elektrospray (ESI) dan Ionisasi Termospray (TSP).

O COCH 3 O

7,24, d, J=7,95

7,70, dd, J=1,8; 7,95

7,26, d, J=1,8

O H OH

commit to user

1) Ionisasi Elektron (EI) Dalam elektron ionisasi (EI), analit dalam fase uap dibombardir elektron berenergi tinggi (biasanya 70 eV) (1 ev = 1,602 177 33 ×10 -19 J). Molekul analit menyerap sebagian dari energi tersebut (biasanya sekitar 10 eV) untuk pembentukan ion. Hal tersebut menghasilkan kation radikal yang disebut ion

molekuler (M + •) dan m/z yang sesuai dengan berat molekul analit. Sisa energi pembombardiran (60 eV) digunakan untuk fragmentasi. Interpretasi spektrum EI melibatkan signifikasi senyawa kimia dari ion yang diamati dalam spektrum massa dan kemudian menggunakan informasi ini untuk mendapatkan struktur.

2) Ionisasi Kimia (CI) Ionisasi kimia (CI) adalah teknik yang telah dikembangkan secara khusus untuk mengurangi fragmentasi yang terkait dengan ionisasi. Dalam hal ini, molekul analit dalam fase uap dimasukkan ke sumber spektrometer massa yang mengandung gas pereaksi. Campuran ini kemudian dibombardir elektron (seperti pada EI) dan ionisasi terjadi. Reaksi ion molekul terjadi antara ion pereaksi gas dan molekul-molekul analit netral dalam tekanan tinggi dari sumber spektrometer massa. Gas-gas pereaksi yang paling umum digunakan adalah metana dan amonia isobutana. Perlu diingat bahwa m/z dari ion yang teramati di ion molekuler tidak memberikan berat molekul secara langsung karena masih terdiri dari campuran analit.

3) Bombardir Atom-Cepat (FAB) Bombardir Atom-Cepat (FAB) adalah salah satu dari sejumlah teknik ionisasi yang memanfaatkan bahan matriks, dimana analit dipisahkan guna mentransfer cukup energi untuk analit dalam pengionisasian. Dalam FAB, bahan matriks berupa cairan, seperti gliserol, dan energi untuk ionisasi digunakan atom energi tinggi (biasanya xenon). Ketika FAB dimanfaatkan untuk LC-MS, sering dikenal sebagai FAB-aliran berkelanjutan, materi matriks ditambahkan ke eluen HPLC (baik pra-kolom atau pasca-kolom) dan campuran ini terus menerus mengalir masuk ke dalam sumber spektrometer massa dimana materi matriks tersebut dibombardir oleh atom. Batas bobot molekul dalam FAB biasanya sekitar 10000 Da.

commit to user

4) Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) MALDI merupakan teknik yang belum digunakan secara luas untuk aplikasi LC-MS, namun MALDI memberikan informasi analisis pelengkap bagi LC-MS. MALDI bekerjasama dengan FAB dalam penggunaan matriks dimana transfer energi untuk molekul analit menggunakan ionisasi polar, suhu labil dan

molekul dengan bobot molekul tinggi. Energi diperoleh dari getaran laser pada panjang gelombang yang dapat diserap oleh material matriks seperti asam nikotinat atau sinapinik. MALDI memiliki rentang massa senyawa yang dapat

terionisasi lebih besar dari FAB, yaitu sekitar 500000 Da (Ardrey, 2003).

5) Ionisasi Termospray (TSP) Pada metode termospray, larutan dimasukkan dan dipanaskan dalam pipa kapiler spektrometer massa. Metode ini dapat mengatasi kecepatan alir yang tinggi dan menyeimbangkan larutan pada permukaan spektrometer massa. Metode ini sebagian besar telah digantikan oleh elektrospray.

6) Ionisasi Elektrospray (ESI) Sumber ion elektrospray (ES) dioperasikan pada atau mendekati tekanan atmosfer, sehingga dapat disebut sebagai ionisasi tekanan atmosfer atau API. Sampel berupa larutan (biasanya, pelarut polar yang mudah menguap) memasuki sumber ion melalui pipa kapiler stanless steel, yang dikelilingi oleh aliran co- aksial nitrogen yang disebut gas nebulizing. Aliran gas nebulizing langsung mengalir ke spektrometer massa. Larutan yang keluar dari pipa kapiler berupa aerosol. Tetesan dalam aerosol disemprot untuk menguapkan pelarut, sehingga konsentrat hanya berisi ion-ion. Ketika tolakan elektrostatik antara ion-ion muatan sampel mencapai titik kritis, tetesan mengalami “ledakan kolom”, dimana terjadi pelepasan ion-ion sampel ke dalam fase uap. Ion-ion fasa uap terfokus pada sejumlah lubang sampel dalam spektrometer massa (Silverstein, 2005).

Time-of-Flight (ToF) merupakan perangkat sederhana dalam sistem pemisahan. Sistem ini bergantung pada kenyataan bahwa jika semua ion yang dihasilkan dalam sumber spektrometer massa dengan teknik apapun diberi energi kinetik yang sama maka kecepatan masing-masing akan berbanding terbalik

dengan akar kuadrat dari massa. Waktu yang dibutuhkan bagi semua ion untuk

commit to user commit to user

Gambar 10. Skema time-of-flight spektrometer massa Ion keluar dari sumber ion ke detektor 1, dan hanya memperoleh spektra

resolusi rendah, sehingga diperlukan cara untuk meningkatan resolusi yang diperlukan agar memperoleh spektrum yang diinginkan. Resolusi analisa ToF tergantung pada kemampuan untuk mengukur perbedaan yang sangat kecil waktu yang dibutuhkan untuk ion m/z mencapai detektor. Peningkatan resolusi dilakukan dengan meningkatkan jarak perjalanan ion dari sumber ion ke detektor, yaitu dengan memperpanjang tabung flight, sehingga membuat instrumen secara fisik akan lebih besar. Oleh karena itu, digunakan satu atau lebih cermin ion, yang dikenal sebagai reflektron. Pencerminan sinar ion dengan reflektron tunggal menuju detektor 2 membuat jarak perjalanan ion menjadi dua kali lipat tanpa memperpanjang tabung flight. Keuntungan dari instrumen ToF selain kesederhanaannya, adalah kemampuan scanning yang cepat dan keterlibatan resolusi kromatografi tinggi (Ardrey, 2003).

Elektrospray digunakan untuk senyawa yang memiliki bobot molekul besar, misalnya protein, ion dengan bermacam bentuk senyawa penyusun. Protein dapat memiliki 40 atau lebih senyawa penyusun sehingga molekul mencapai 100 kDa dapat dideteksi pada kisaran quadrupole konvensional. Penampakan spektrum

Ion source

Ion beam

‘Light’ ions

Flight tube

commit to user commit to user

B. Kerangka Pemikiran

Penelitian tentang isolasi senyawa kimia khususnya dari kulit akar Calophyllum inophyllum masih jarang dilakukan di Indonesia. Penelitian ini dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai metode. Perbedaan sampel, metode pemisahan, dan sistem pelarut yang digunakan akan mempengaruhi jenis senyawa kimia yang dihasilkan. Dari struktur yang disarankan, A1 santon memiliki rumus

molekul C 23 H 22 O 5 . Dalam hal ini, jumlah atom oksigen belum diketahui secara pasti karena hanya dilakukkan identifikasi dengan 1 H NMR dan 13 C NMR. Oleh karena itu, perlu adanya pembuktian struktur senyawa A1 santon dengan mengetahui bobot molekul dari senyawa A1 santon.

Analisis senyawa dari nyamplung (Calophyllum inophyllum Linn.) dapat dilakukan dengan menggunakan teknik kromatografi yaitu kromatografi vakum cair (KVC) dan kromatografi Sephadex yang dipandu dengan teknik kromatografi lapis tipis (KLT). Senyawa yang telah diperoleh dapat diidentifikasi dan dikonfirmasi

kebenarannya dengan metode spektroskopi 1 H NMR, IR, dan UV. Kemudian untuk mengetahui bobot molekul dari senyawa A1 santon digunakan metode spektroskopi LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy) dengan metode ionisasi ESI- ToF. Dalam hal ini, massa yang akan terukur berupa [M-H] - dengan pengukuran resolusi tinggi (HR-MS/High Resolution-Mass Spectroscopy).

C. Hipotesis

Senyawa kimia dari kulit akar tumbuhan Calophyllum inophyllum yang diperoleh adalah senyawa A1 santon dengan rumus molekul C 23 H 22 O 5 dan bobot molekul sebesar 378,14676 Da.

commit to user

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode eksperimen laboratorium. Pemisahan dan pemurnian senyawa A1 santon menggunakan teknik kromatografi yaitu kromatografi vakum cair (KVC) dan kromatografi kolom dengan sephadex LH-20 yang dipandu dengan teknik kromatografi lapis tipis (KLT). Elusidasi struktur senyawa yang diperoleh dilakukan dengan metode spektroskopi UV, inframerah (IR), spektroskopi

1 H NMR dan Liquid Chromatography-Spektroskopi Massa (LC-MS).

B. Tempat dan Waktu Penelitian

Dalam penelitian ini, pemisahan dan pemurnian senyawa dilakukan di Laboratorium Kimia Dasar Fakultas MIPA UNS. Analisis spektoskopi UV dilakukan di Laboratorium Kimia Dasar Fakultas MIPA UNS, analisis spektroskopi Inframerah dilakukan di Laboratorium MIPA Terpadu Fakultas MIPA UNS, analisis NMR di LIPI Serpong, analisis LC-MS di Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam Fakultas MIPA ITB, Bandung. Penelitian dilakukan pada bulan Oktober 2010 – Juli 2011.

C. Alat dan Bahan yang Digunakan

1. Alat

Isolasi dan pemurnian senyawa santon dari kulit akar tumbuhan Calophylum Inophyllum Linn. digunakan KVC dengan diameter kolom 9 cm dan kromatografi Sephadex dengan diameter 1 cm. Fraksi yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator vacum (IKA-WERKE HB4 basic). Analisis KLT digunakan lampu UV dengan λ 254 serta penyemprot penampak noda. Struktur senyawa yang diperoleh ditentukan dengan metode spektroskopi UV (spektrofotometer UV-Vis Shimadzu UV mini 1240), spektroskopi infra merah (spektrofotometer Shimadzu PRESTIGE 21) dengan metode oles. Metode spektroskopi NMR diukur dengan spektrometer JEOL AS 500. Penentuan bobot molekul diukur dengan Liquid Chromatography- Spektroskopi Massa /LC-MS (ESI-ToF, Waters LCT Premier XE, high resolution).

commit to user

2. Bahan

Pelarut yang digunakan untuk penelitian ini adalah pelarut teknis yang didestilasi antara lain n-heksana, EtOAc, aseton dan MeOH. Pelarut CHCl 3 yang digunakan adalah grade pro analisis. Fasa diam pada KVC digunakan silika gel Merck Si-gel 60 G dan untuk kromatografi kolom digunakan sephadex LH-20 Liphophilic Sephadex 0,025-0,1 mm. Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan plat alumunium berlapis silika (Merck Kieselgel 60 GF 254 0,25 mm). Silika gel Merck Kiesel Gel 60 (0,2-0,5mm) digunakan sebagai silika adsorb untuk impregnasi sampel

saat KVC. Untuk pereaksi penampak noda digunakan Ce(SO 4 ) 2 2% dalam H 2 SO 4 1M.

Larutan NaOH 10% digunakan sebagai reagen geser untuk analisis spektroskopi UV.

D. Prosedur Penelitian

Sebanyak 40 gram ekstrak metanol difraksinasi menggunakan teknik kromatografi vakum cair (KVC) dengan diameter kolom 9 cm yang dilakukan 2 kali fraksinasi, KVC I dan KVC II. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel Merck Si- gel 60 G. Variasi eluen yang digunakan adalah n-heksana : EtOAc (10:0); (9,5:0,5) (2x); (9:1) (4x); (8,5:1,5) (4x); (8:2) (2x); (5:5); (0:10). Silika gel ditimbang sebanyak 100 gr, kemudian 20 gram sampel diimpregnasi dengan 20 gram silika adsorb Merck Kieselgel 60 (0,2-0,5 mm) dimana eluen yang diperlukan untuk sekali elusi sebanyak 150 ml. Hasil fraksinasi KVC I dan KVC II diperoleh 14 fraksi kemudian diuapkan dengan rotary evaporator. Setelah itu, ditimbang berat masing-masing fraksi dan dianalisis dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan fasa diam silika gel Merck Kieselgel 60 GF 254 0,25 mm dengan eluen n-heksana : EtOAc (9,5:0,5) .

Penyemprot noda yang digunakan adalah larutan Ce(SO 4 ) 2 kemudian dilihat dengan lampu lampu UV pada λ 254 . Hasil KVC I dan II yang memiliki pola pemisahan sama digabung, sehingga diperoleh 7 fraksi (A–G) dengan berat masing-masing adalah: fraksi A (3,179 g), fraksi B (1,877 g), fraksi C (3,753 g), fraksi D (6,113 g), fraksi E (5,256 g), fraksi F (6,015 g) dan fraksi G (3,287 g). Fraksi B kemudian difraksinasi dan dimurnikan lebih lanjut untuk memperoleh senyawa yang diinginkan.

Sampel fraksi B dilakukan 2 kali fraksinasi dengan kolom kromatografi sephadex LH-20 berdiameter 1 cm. Fase diam yang digunakan adalah Liphophilic

commit to user

Sephadex 0,025-0,1 mm dan eluen yang digunakan adalah metanol. Pada sephadex I, sampel sebanyak 0,223 g diimpregnasi dengan silika gel Merck Kiesel Gel 60 (0,2-0,5 mm) dengan perbandingan 1:1. Hasil fraksinasi dianalisa dengan KLT menggunakan

eluen n-heksana : EtOAc (9:1) dan diperoleh 6 fraksi utama (B 1 -B 6 ) dengan berat masing-masing adalah : fraksi B 1 (0,050 g), fraksi B 2 (0,017 g), fraksi B 3 (0,009 g), fraksi B 4 (0,005 g), fraksi B 5 (0,007 g) dan fraksi B 6 (0,010). Pada sephadex II, sampel sebanyak 0,182 g diimpregnasi dengan perbandingan 1:1. Hasil fraksinasi dianalisa dengan KLT menggunakan eluen n-heksana : EtOAc (9:1) dan diperoleh 4 fraksi

utama (B a -B d ) dengan berat masing-masing adalah : fraksi B a (0,014 g), fraksi B b (0,009 g), fraksi B c (0,007 g), dan fraksi B d (0,010 g). Fraksi B 5 , B 6 , B c dan B d

dianalisa dengan KLT menggunakan 3 variasi eluen berbeda yaitu n-heksana : EtOAc (9:1), n-heksana : CHCl3 (9:1), dan n-heksana : aseton (9:1) menunjukkan satu spot

senyawa. Hasil isolasi dari fraksi B tersebut kemudian diidentifikasi struktur molekulnya dengan spektroskopi UV, IR, 1 H NMR, dan LC-MS.

commit to user

E. Bagan Alir Cara Kerja

n -heksana : EtOAc (*)

20 gr ekstrak pekat (KVC I) 20 gr ekstrak pekat (KVC II)

Ekstrak MeOH pekat

14 fraksi 14 fraksi

Struktur senyawa A1 santon

Analisa KLT (gabung spot sama)

G (3,287 g)

C (3,753 g)

B (1,877 g)

A (3,179 g)

F (6,015 g)

E (5,256 g)

D (6,113 g)

0,223 gr fraksi B (Sephadex I) 0,182 gr fraksi B (Sephadex II)

Analisa KLT (3 variasi eluen)

Metanol Metanol

B a (0,014 g)

B b (0,009 g)

B d (0,010 g)

B 6 (0,010 g)

ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN PENENTUAN BOBOT MOLEKUL SENYAWA A1 SANTON DARI KULIT AKAR NYAMPLUNG (CALOPHYLLUM INOPHYLLUM LINN.)