Identifikasi Ganoderma spp. Menggunakan Teknik DNA Barcoding

1 

 

IDENTIFIKASI Ganoderma spp. MENGGUNAKAN TEKNIK
DNA BARCODING

DHANIAR ASTRI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

2 

 

ABSTRAK
DHANIAR ASTRI. Identifikasi Ganoderma spp. Menggunakan Teknik DNA

Barcoding. Dibimbing oleh SURYANI dan HAYATI MINARSIH.
Kelapa sawit merupakan salah satu komoditas perkebunan yang sangat
penting. Salah satu masalah yang dihadapi pada perkebunan kelapa sawit saat ini
adalah masalah serangan penyakit, yaitu Busuk Pangkal Batang (BPB) akibat
serangan Ganoderma spp. Jika tanaman kelapa sawit sudah terserang BPB, maka
cepat atau lambat tanaman akan mati dan mengalami penurunan produksi secara
nyata. Dalam upaya pengendalian serangan Ganoderma yang efektif, maka
diperlukan suatu teknik pengendalian serangan Ganoderma melalui identifikasi
Ganoderma spp. yang lebih akurat. Tujuan penelitian ini adalah mencari primer
spesifik untuk identifikasi Ganoderma spp. yang menyerang tanaman perkebunan
dan tanaman pelindungnya. Metode dilakukan secara molekuler dengan
menggunakan teknik DNA Barcoding. Berdasarkan hasil penelitian yang telah
dilakukan, diketahui bahwa pasangan primer ITS1_F/ITS4_B memiliki presentase
kemampuan yang tinggi dalam mengidentifikasi isolat Ganoderma spp.
dibandingkan dengan pasangan primer yang lain, yaitu pasangan primer
BenA_F/ BenA_R, Gan_ITS1_F/Gan_ITS1_R,
CO1_PenF1/CO1_PenR1,
CO1_B_F/CO1_B_R, dan Gan_ITS2_F/Gan_ITS2_R. Pasangan primer
ITS1_F/ITS4_B memiliki potensi sebagai DNA barcode untuk identifikasi
spesies-spesies Ganoderma.

Kata kunci: Ganoderma spp., DNA Barcoding, dan Busuk Pangkal Batang (BPB)

3

 

ABSTRACT
DHANIAR ASTRI. Identification of Ganoderma spp. using DNA Barcoding
Technique. Under the direction of SURYANI and HAYATI MINARSIH
Oil palm is one of comodity plantation which is very important. One of the
problems faced by the oil palm plantations are disease, namely Basal Stem Rot
(BSR) which caused by Ganoderma spp. If plants were attacked by BSR, sooner
or later, they would die and the production will decreased significantly.
Consequently, in order to have an effective control of Ganoderma, an accurate
identification is needed. This could be achieved by molecular techniques through
DNA Barcoding method. The aim of this study was to is to find a specific primer
for the identification of Ganoderma spp. that attack estate crops and their shade
trees. Based on this research, it showed that the primer pair ITS1_F/ITS4_B has a
high percentage of the ability to identify isolates of Ganoderma spp. compared

with the other primer pairs, which are primer BenA F/ BenA_R,
Gan_ITS1_F/Gan_ITS1_R, CO1_PenF1/CO1_PenR1, CO1_B_F/ CO1_B_R, and
Gan_ITS2_F/Gan_ITS2_R. The primer pair ITS1_F/ITS4_B had a potential as a
DNA barcode for identification of Ganoderma species.
Keywords : Ganoderma spp., DNA Barcoding, and Basal Stem Rot (BSR)

4

 

IDENTIFIKASI Ganoderma spp. MENGGUNAKAN TEKNIK
DNA BARCODING

DHANIAR ASTRI

Skripsi
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

5

 

Judul Skripsi

: Identifikasi Ganoderma spp. Menggunakan Teknik DNA
Barcoding
: Dhaniar Astri
: G84070036

Nama
NIM

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Suryani, M.Sc
Ketua

Dr. Ir. Hayati Minarsih, M.Sc
Anggota

Diketahui,

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
Ketua Departemen Biokimia

Tanggal lulus

:

6

 

PRAKATA

Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT
atas karunia dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini
dengan baik. Penelitian ini berjudul Identifikasi Ganoderma spp. Menggunakan
Teknik DNA Barcoding. Kegiatan penelitian dilaksanakan dari bulan April hingga
Oktober 2011 dan bertempat di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa
Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), Jalan
Taman Kencana No.1 Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu selama kegiatan penelitian ini berlangsung, yaitu Dr. Suryani, M.Sc
selaku pembimbing utama dan Dr. Ir. Hayati Minarsih, M.Sc selaku pembimbing
lapangan yang telah memberikan saran, kritik, dan bimbingannya. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Mbak Niyyah Fitranty serta segenap staf di
Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia atas peran dan kerjasamanya dalam
membantu pelaksanaan penelitian ini. Ucapan terima kasih juga penulis tujukan
kepada orang tua, kakak, Eka Febrianti, Jatu Rukmi Mulyaningtyas, Ayu Arthuria

Rizqiyanti atas doa, dukungan, dan bantuan bagi penulis.

Bogor, Maret 2012

Dhaniar Astri

7

 

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta, 5 Desember 1988 dari ayah Ateng Zaelani dan
ibu Sri Wahyuni. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara.
Pendidikan penulis dimulai dari SDN Larangan Utara 03 Tangerang,
kemudian dilanjutkan pendidikan ke SMPN 206 Jakarta Barat. Pada tahun 2007,
penulis lulus dari SMAN 90 Jakarta Selatan dan pada tahun yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis
memilih mayor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam beberapa organisasi,

diantaranya menjadi salah satu staf divisi Bioanalisis dalam Himpunan Profesi
Community Research and Education of Biochemistry (CREBs) pada tahun
2008/2009 dan bendahara umum Dewan Perwakilan Mahasiswa (DPM) FMIPA
IPB pada tahun 2009/2010. Penulis juga aktif mengikuti kepanitiaan, diantaranya,
staf divisi Publikasi, Dokumentasi, dan Dekorasi (PDD) Seminar Kesehatan dan
Keselamatan Kerja (K3) Laboratorium Biokimia IPB pada tahun 2008, ketua
divisi Publikasi, Dokumentasi, dan Dekorasi (PDD) Seminar Kanker IPB pada
tahun 2009, sekretaris Sidang Umum Dewan Perwakilan Mahasiswa (DPM)
FMIPA IPB pada tahun 2009, serta bendahara Pemilihan Raya Dewan Perwakilan
Mahasiswa (DPM) IPB pada tahun 2010.
Tahun 2010 penulis melakukan kegiatan praktik lapangan di Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), Jalan Taman Kencana
No.1 Bogor, dengan judul Analisis Keragaman Genetik Ganoderma spp. dengan
Teknik Internal Transcribe Spacer-Random Fragment Length Polymorphism
(ITS-RFLP). Penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia Umum,
Keteknikan Asam Nukleat, dan Bioinformatika pada tahun 2011/2012.

 8

 

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................. viii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ ix
PENDAHULUAN ............................................................................................

1

TINJAUAN PUSTAKA
Ganoderma spp. ......................................................................................
DNA Barcoding ........................................................................................
Isolasi DNA .............................................................................................
Polymerase Chain Reaction (PCR) .........................................................
Teknik Rekombinasi DNA ......................................................................

1
2
3

3
4

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .........................................................................................
Metode Percobaan ....................................................................................

4
5

HASIL DAN PEMBAHASAN
Kultivasi Isolat Murni Ganoderma spp. dari Tubuh Buah .....................
Kualitas dan Kuantitas DNA Kromosom Ganoderma spp. .......................
Desain Primer, Optimasi Primer terhadap Isolat Ganoderma spp. dan
Amplifikasi DNA dengan Metode PCR .................................................
Ekstraksi (Elusi), Purifikasi Fragmen DNA dan Pengklonan Gen .........
PCR Koloni .............................................................................................
Plasmid Rekombinan ..............................................................................
Analisis Sekuens (sequencing) ................................................................

9
9
10
11
12
12
13

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ................................................................................................ 15
Saran........................................................................................................ 15
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 15
LAMPIRAN ....................................................................................................... 18

 
9

 

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi sampel DNA Ganoderma spp. ...

7

2 Data pengukuran nilai absorbansi DNA dengan spektrofotometer UV-VIS
pada panjang gelombang 260 dan 280 nm serta konsentrasi DNA . ..........

10

3 Primer yang berhasil mengidentifikasi isolat Ganoderma spp ...................

14

 

 

10

 
 

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Tubuh buah Ganoderma spp. .......................................................................

2

2 Miselium isolat Ganoderma spp. pada media PDA ......................................

9

3 Elektroforegram kualitas DNA hasil isolasi ...............................................

10

4 Elektroforegram hasil optimasi primer BenA_F/BenA_R..........................

10

5 Elektroforegram hasil optimasi primer ITS1_F/ITS4_B ............................

11

6 Elektroforegram hasil optimasi primer Gan_ITS1_F / Gan_ITS1_R .........

11

7 Elektroforegram hasil amplifikasi dengan primer BenA_F/BenA_R,
ITS1_F/ITS4_B, dan Gan_ITS1_F/Gan_ITS1_R .......................................

11

8 Elektroforegram hasil PCR koloni primer BenA_F/BenA_R ....................... 12
9 Elektroforegram hasil PCR koloni primer ITS1_F/ITS4_B ......................... 12
10 Elektroforegram hasil PCR koloni primer Gan_ITS1_F/Gan_ITS1_R ........ 12
11 Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan primer BenA F/R .......... 13
12 Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan primer ITS1_F/ITS4_B

13

13 Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan primer Gan_ITS1_F/
Gan_ITS1_R .................................................................................................. 13
14 Diagram keberhasilan primer dalam mengidentifikasi isolat Ganoderma
spp. .................................................................................................................. 15
 

  11

 

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Skema isolasi DNA .....................................................................................

19

2 Isolat Ganoderma spp. dan primer yang digunakan untuk sequencing. .....

20

3 Peta marka seleksi vektor pGEM T-Easy ..................................................

21

4 Hasil pengurutan basa nukelotida (sequencing) isolat Ganoderma spp. ....

22

5 Hasil analisis identifikasi sekuen Ganoderma spp. menggunakan program
BLAST .......................................................................................................

26

 
  

1

 

PENDAHULUAN
Kelapa sawit merupakan salah satu
komoditas perkebunan yang sangat penting.
Masalah yang dihadapi di perkebunan
kelapa sawit saat ini adalah masalah
serangan penyakit.. Salah satu penyakit
penting yang menjangkiti pohon kelapa
sawit adalah penyakit Busuk Pangkal Batang
(BPB) akibat serangan Ganoderma spp.
Pohon kelapa sawit yang diserang penyakit
ini menyebabkan kerugian dari dua segi,
yaitu mengurangi jumlah tandan dan berat
buah serta mematikan pohon kelapa sawit
tersebut (Ditjen Perkebunan 2011). Menurut
Taniwiryono (2011), serangan penyakit BPB
pada perkebunan kelapa sawit khususnya di
wilayah Sumatera Utara sudah berada pada
kondisi yang mengkhawatirkan. Berdasarkan
contoh kasus sensus yang dilakukan pada
salah satu perkebunan kelapa sawit di
wilayah Sumatera, serangan penyakit BPB
mencapai 50% dalam satu hektar lahan.
Tanaman kelapa sawit yang terserang
berumur 14 tahun pada generasi ke-3 dan
ke-4. Jika tanaman kelapa sawit sudah
terserang BPB maka cepat atau lambat
tanaman akan menjumpai kematiannya.
Ganoderma spp. merupakan jamur yang
dapat membentuk tubuh buah. Ganoderma
spp. diklasifikasikan ke dalam filum Fungi,
kelas
Basidiomycetes,
subkelas
Homobasidiomycetes, ordo Agaricales,
famili Polyporaceae, genus Ganoderma, dan
spesies Ganoderma boninense (Alexopoulos
et al. 1996). Penyakit BPB yang disebabkan
oleh serangan Ganoderma spp. pada kelapa
sawit mampu mengakibatkan kematian
tanaman lebih dari 80% populasi tanaman
pada satu hamparan (Taniwiryono 2011).
Sementara itu, serangan Ganoderma spp.
baru diketahui ketika tingkat infeksi sudah
kritis dan tanaman sudah sulit diselamatkan
(Mohd Su’ud et al. 2007; Minarsih et al.
2011). Kondisi inilah yang menjadikan
penyakit BPB pada kelapa sawit sebagai
penyakit terpenting yang harus segera
dikendalikan (Taniwiryono 2011). Hal yang
paling merugikan lagi adalah serangan
Ganoderma spp. yang terjadi pada tanaman
sangat sulit dideteksi. Hal ini disebabkan
oleh gejala yang mirip dengan serangan
penyakit perakaran lainnya termasuk juga
mirip dengan gejala kekeringan (Mohd
Su’ud et al. 2007; Minarsih et al. 2011).
Berdasarkan kenyataan-kenyataan yang
terjadi di atas, maka diperlukan suatu teknik
pengendalian serangan Ganoderma yang

efektif
melalui
analisis
identifikasi
Ganoderma spp. secara molekuler. Analisis
identifikasi Ganoderma spp. yang tumbuh
pada tanaman perkebunan, seperti kakao,
kopi, beserta tanaman pelindungnya dari
berbagai wilayah di Indonesia, dilakukan
melalui pendekatan molekuler dengan
menggunakan teknik DNA Barcoding.
Teknik
DNA
Barcoding
dapat
mengidentifikasi dan membedakan suatu
organisme mulai tahap spesies hingga sub
spesies. Keunggulan teknik DNA Barcoding,
yaitu dapat digunakan untuk identifikasi dan
karakterisasi berbagai spesies yang tidak
dapat dibedakan secara morfologi (Tudge
2000). Selain itu, teknik DNA Barcoding
juga dapat digunakan untuk identifikasi
suatu organisme walaupun DNA dari
organisme tersebut tidak dalam bentuk
murni atau utuh, bahkan DNA yang sudah
mengalami degradasi dan proses pengolahan
pun dapat digunakan untuk analisis DNA
Barcoding (Hajibabaei et al. 2006).
Tujuan
penelitian
ini
adalah
mengidentifikasi
Ganoderma
spp.
menggunakan teknik DNA Barcoding.
Sementara itu, hipotesis mengenai penelitian
ini, yaitu dimungkinkan memperoleh
pasangan primer spesifik sebagai DNA
Barcode yang dapat digunakan untuk
mengidentifikasi
spesies
Ganoderma.
Penelitian mengenai identifikasi Ganoderma
spp. menggunakan teknik DNA Barcoding
juga bermanfaat dalam mencari primer yang
spesifik sebagai DNA Barcode untuk
identifikasi isolat Ganoderma spp. sehingga
diharapkan
dapat
memecahkan
permasalahan mengenai identifikasi dan
karakterisasi berbagai spesies Ganoderma
spp. yang menyebabkan BPB di perkebunan
kelapa sawit di Indonesia. Identifikasi
spesies Ganoderma spp. ini merupakan
langkah
awal
dalam pengembangan
teknologi perlindungan tanaman perkebunan
dan tanaman pelindungnya dari serangan
Ganoderma spp. yang terjadi di Indonesia.

TINJAUAN PUSTAKA
Ganoderma spp.
Ganoderma spp. dikenal sebagai Ling
Zhi di Cina dan Reishi di Jepang.
Ganoderma spp. telah digunakan sejak abad
keempat Masehi sebagai salah satu
komponen
obat
dalam
obat-obatan
tradisional di Cina dan Jepang. Walaupun
demikian, penelitian secara sistematik

2

 

mengenai Ganoderma spp. baru berlangsung
sekitar 25 tahun terakhir (Suryanto 2003).
Menurut Alexopoulos et al. (1996)
Ganoderma spp. diklasifikasi ke dalam
filum fungi, kelas Basidiomycetes, subkelas
Homobasidiomycetes, ordo Agaricales,
famili Polyporaceae, genus Ganoderma, dan
spesies Ganoderma spp. Ganoderma spp.
terdiri atas tubuh buah yang tebal, bergabus,
berwarna kuning kemerahan pada awalnya
dan berubah menjadi warna cokelat ketika
telah masak (Chang & Miles 2004 dalam
Sutiarna 2010). Fungi Ganoderma spp.
merupakan anggota Basidiomycetes yang
menyebabkan penyakit pada tanaman keras
dengan kemampuan menguraikan lignin,
selulosa, dan polisakarida (Widyastuti
2007).
Ganoderma spp. membentuk tubuh buah
berupa piringan keras (Gambar 1) yang
menempel pada pangkal batang tanaman,
permukaan atas berwarna cokelat kemerahan
sampai cokelat tua, licin dan tampak
mengkilat seperti dilapisi oleh lilin, bagian
tepinya yang aktif tumbuh berwarna lebih
muda kemudian akan berubah warna ketika
telah tua. Bagian permukaan bawahnya
berwarna putih kekuningan yang tersusun
dari jutaan pori-pori. Pada bagian inilah
terdapat ribuan basidia yang tumbuh dan
menghasilkan jutaan spora secara serentak.
Spora yang diterbangkan oleh angin dan
dibawa terbang oleh serangga diduga
memiliki peranan penting dalam penularan
penyakit dari tanaman satu ke tanaman lain
pada
jarak
yang
melebihi
jarak
perkembangan sistem perakaran, dan
penularan penyakit dari tanaman yang sakit
ke tanaman sehat yang berada di dekatnya.
Hal ini terjadi melalui kontak akar
(Taniwiryono & Panji 1999).
Ciri-ciri lain Ganoderma spp. adalah
memiliki sebuah lapisan himenium yang
terdiri atas struktur yang disebut basidium
(suatu sel berbentuk tabung atau seperti
pemukul bola yang mempunyai empat buah
basidiospora di bagian luarnya). Himenium
yang dimiliki dapat menutupi permukaan,
berpori, tubuh buah berkayu, keras dan ulet,
serta mempunyai lapisan-lapisan membran,
permukaan atas tubuh buah (konus) rata dan
halus, dan spora pipih di bagian bawahnya.
Berbagai macam spesies Ganoderma, yang
paling banyak menyebabkan penyakit adalah
Ganoderma lucidum yang menyebabkan
penyakit busuk hati dan busuk pangkal
batang (Streets 1982), serta Ganoderma

pseudoferreum yang dikenal sebagai jamur
akar merah (Semangun 1988).
Ganoderma spp. merupakan jamur
penyebab penyakit busuk akar yang
menyebabkan kerusakan pada tanaman
perkebunan. Serangan Ganoderma spp. baru
diketahui ketika tingkat infeksi sudah lanjut
dan tanaman sudah sulit untuk diselamatkan
(Mohd Su’ud et al. 2007; Minarsih et al.
2011). Penyakit busuk akar yang disebabkan
oleh serangan Ganoderma spp. akan muncul
pada
pohon
dewasa
karena
perkembangannya sangat lambat sehingga
baru akan terlihat setelah bertahun-tahun
kemudian (Semangun 1988).

Gambar 1 Tubuh buah Ganoderma spp.
DNA Barcoding
Teknik DNA barcoding merupakan
teknik
analisis
identifikasi
yang
menggunakan standarisasi universal pada
suatu fragmen genomik untuk mewadahi
pencarian
dan
identifikasi
spesies
(Hajibabaei et al 2006; Hebert et al 2003;
Kress et al 2005; Savolainen et al 2005).
Hebert et al (2003) telah melakukan
penelitian dengan teknik DNA Barcoding
yang diujikan pada berbagai macam spesies
hewan. Penelitian tersebut menunjukkan
kemampuan fragmen pendek di dalam
mitokondria, yaitu CO1. Fragmen pendek ini
sangat efektif sebagai sekuen barcode secara
universal, terutama untuk hewan.
Kebutuhan
untuk
melakukan
standarisasi universal dalam identifikasi
spesies sangat tinggi dengan munculnya
berbagai masalah dalam metode identifikasi
dan determinasi spesies yang ada saat ini.
Permasalahan tersebut dapat berakibat pada
kesamaan nama pada dua spesies yang
berbeda, yang dapat dimungkinkan karena
kesamaan morfologi. Selain itu, dapat juga
berakibat pada perbedaan nama pada satu
spesies yang memiliki tingkat kehidupan
yang sulit untuk diidentifikasi secara kasat
mata. Oleh karena itu, menurut Hebert et al.
(2003), DNA barcoding memberikan
keuntungan melalui standarisasi universal
(barcode) serta dapat memiliki tingkat
kepercayaan yang sangat tinggi. Metode

3

 

identifikasi seperti ini dapat mempercepat
proses analisis sehingga dapat dijadikan
suatu teknologi yang ekonomis untuk
identifikasi spesies. Selain itu, keunggulan
teknik DNA Barcoding adalah dapat
digunakan
untuk
identifikasi
suatu
organisme walaupun DNA dari organisme
tersebut tidak dalam bentuk murni, bahkan
DNA yang sudah mengalami degradasi dan
proses pengolahan pun dapat digunakan
untuk analisis DNA Barcoding (Hajibabaei
et al. 2006).
Seifert et al. (2007) menunjukkan sebuah
hasil penelitian lain, yaitu terdapat suatu
prospek pada identifikasi fungi dengan
teknik DNA barcoding. Pada fungi, sistem
barcode digunakan pada daerah 400-600
dari subunit ribosom, daerah cistron Internal
Transcribed Spacer (ITS), daerah β-tubulin
A (BenA), dan 1-α (EF-1α), serta gen CO1.
Penelitian Seifert et al. (2007) ini
menggunakan Pennicilum sebagai contoh
untuk melakukan DNA barcoding pada
fungi.
Isolasi DNA
Tahapan umum dalam isolasi DNA
terdiri dari lisis sel atau penghancuran
dinding sel, pemisahan debris sel atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta penghilangan
protein (deproteinase) (Ardiana 2009).
Dinding sel pada tanaman dapat dilisis
secara fisik dan enzimatis, sedangkan
membran sel dilisis dengan penambahan
detergen. Lisis secara fisik dilakukan pada
suhu 4°C agar DNA tidak rusak. Detergen
yang digunakan dapat berupa SDS (sodium
dodecyl
sulfate)
atau
CTAB
(cethyltrimethylammonium
bromide)
(Wilson & Walker 2000). Metode isolasi
DNA yang menggunakan penambahan
CTAB merupakan metode yang umum
digunakan dalam ekstraksi DNA genom
tanaman,
terutama
yang
banyak
mengandung polisakarida dan senyawa
polifenol (Ardiana 2009). Pada proses isolasi
DNA
juga
digunakan
EDTA
(ethylenediaminetetraacetic acid) yang
berfungsi sebagai pengkelat Mg2+, yaitu
senyawa ionik yang dibutuhkan oleh enzim
deoksiribonuklease (DNase) (Wilson &
Walker 2000).
Setelah asam nukleat dipisahkan (DNA
dan RNA) dari sel, maka proses selanjutnya
adalah pemurnian. Proses ini merupakan
proses pemisahan DNA dan RNA dari
pengotor berupa protein dan pecahan sel.

Oleh karena itu, perlu dilakukan ekstraksi
fenol-kloroform.
Penambahan
larutan
ekstraksi ini dilanjutkan dengan proses
sentrifugasi yang akan membagi larutan
menjadi fase organik dan fase air yang
dipisahkan oleh lapisan protein. DNA dan
RNA akan terdapat pada fase air, sementara
fase organik akan berisi lipid dan pecahan
sel. RNA dapat dihilangkan dengan
penambahan enzim ribonuklease (RNase)
atau sentrifugasi gradien CsCl. Langkah
terakhir, yaitu menambahkan etanol absolut
untuk memekatkan DNA yang diperoleh dan
selanjutnya disimpan pada suhu -20°C
hingga siap digunakan (Adam et al. 1986).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Metode Polymerase Chain Reaction
(PCR) digunakan untuk amplifikasi DNA.
Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah
suatu
metode
enzimatis
untuk
melipatgandakan secara eksponensial suatu
sekuen nukleotida tertentu dengan cara in
vitro.
Metode
ini
pertama
kali
dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary
B. Mullis, seorang peneliti di perusahaan
CETUS Corporation. Metode ini sekarang
telah banyak digunakan untuk berbagai
macam manipulasi dan analisis genetik
(Yuwono 2006).
Amplifikasi PCR diawali dengan
denaturasi DNA cetakan sehingga rantai
DNA yang berantai ganda akan terpisah
menjadi rantai tunggal. Denaturasi DNA
menggunakan suhu 95°C selama 1-2 menit.
Setelah itu suhu diturunkan menjadi 55°C
sehingga primer akan menempel (annealing)
pada cetakan yang telah terpisah menjadi
rantai tunggal. Primer bertugas membentuk
jembatan hidrogen dengan cetakan pada
daerah sekuen yang komplementer dengan
sekuen primer. Suhu inkubasi dinaikkan
menjadi 72°C selama 1.5 menit. Pada suhu
ini DNA polimerase akan melakukan
polimerisasi rantai DNA yang baru. Setelah
terjadi polimerisasi, rantai DNA baru akan
membentuk jembatan hidrogen dengan DNA
cetakan dan DNA untai ganda akan
terbentuk. Reaksi-reaksi tersebut akan
berlangsung terus-menerus hingga 25-30
siklus sehingga pada akhir siklus akan
didapatkan molekul-molekul DNA rantai
ganda yang baru hasil polimerisasi dalam
jumlah yang banyak (Reece 2004).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
melibatkan dua oligonukleotida primer dan
biasanya terdiri dari 17 sampai 30
nukleotida. Selain itu, primer yang

4

 

digunakan juga memiliki ujung sekuen DNA
target yang akan dicetak dan umumnya
mempunyai kandungan guanin dan sitosin
sebesar
50-60%.
Primer
universal
mengandung pengertian bahwa primer
tersebut mampu mengamplifikasi sekuen
nukleotida pada DNA cetakan secara umum
sehingga dapat digunakan oleh berbagai
macam DNA cetakan. Sementara itu, pada
primer spesifik, kemampuan primer tersebut
sangat spesifik dalam mengamplifikasi
sekuen nukleotida pada DNA cetakan
sehingga hanya dapat digunakan pada DNA
cetakan tertentu saja dan tidak dapat
digunakan secara umum (Reece 2004).
Metode PCR sangat sensitif sehingga
fragmen DNA yang diamplifikasi dengan
menggunakan
PCR
akan
diperoleh
perbanyakan sebesar 200.000 kali setelah
dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit.
Hal ini menunjukkan bahwa pelipatgandaan
suatu fragmen DNA dapat dilakukan secara
cepat. Kelebihan lain dari metode PCR
adalah
dapat
dilakukan
dengan
menggunakan DNA cetakan dalam jumlah
sangat sedikit. Selain itu, DNA cetakan yang
digunakan juga tidak perlu dimurnikan
terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat
digunakan untuk melipatgandakan suatu
sekuen DNA dalam genom bakteri hanya
dengan mencampurkan kultur bakteri di
dalam tabung PCR (Yuwono 2006).
Teknik Rekombinasi DNA
Teknik rekombinasi DNA secara in vitro
terdiri atas enam tahap. Pertama, isolasi
molekul DNA (gen) yang akan digunakan.
Kedua,
pemotongan
DNA
dengan
menggunakan enzim endonuklease restriksi.
Tahap ketiga adalah penyambungan
molekul-molekul
DNA
dengan
menggunakan enzim DNA ligase ke dalam
suatu molekul DNA vektor. Tahap keempat
adalah transformasi sel inang dengan DNA
rekombinasi hasil ligasi. Tahap terakhir,
yaitu analisis dan konfirmasi keberadaan
DNA rekombinan di dalam sel inang serta
karakterisasi fungsional gen yang diklon
(Brown 2010 diacu dalam Saraswati 2010).
Salah satu bagian terpenting dalam
teknik rekombinasi DNA atau kloning gen
adalah vektor (Chawla 2002). Vektor adalah
molekul DNA yang dapat bereplikasi secara
mandiri dan dapat digunakan sebagai
pembawa molekul DNA lain yang tidak
mampu bereplikasi sendiri di dalam sel.
DNA target perlu disisipkan ke dalam vektor
agar DNA tersebut dapat direplikasi di

dalam sel inang serta dapat diwariskan pada
saat membelah diri. Vektor pengklonan
dirancang dan dikembangkan secara khusus
untuk digunakan pada sel inang tertentu
(Artika 2008).
Setelah proses ligasi DNA asing dengan
DNA vektor dilakukan, tahap selanjutnya
adalah memasukkan DNA rekombinan ke
dalam sel inang yang sesuai (Whitehouse
2009). Proses pemasukan molekul DNA
rekombinan ke dalam sel inang bakteri
dikenal dengan istilah transformasi (jika
vektor yang digunakan adalah plasmid) atau
transfeksi (jika vektor yang digunakan
adalah virus) (Brown 2000). Plasmid akan
mengubah sel inang ke dalam sifat-sifat
tertentu, seperti resisten terhadap antibiotika
tertentu (Artika 2008). Transformasi dapat
dilakukan dengan teknik induksi kompetensi
sel secara kimiawi diikuti kejutan panas
(heat shock) atau teknik elektroporasi
menggunakan
kejutan
arus
listrik
bertegangan tinggi dalam waktu singkat
(Brown 2000). Cara elektroporasi lebih
efisien dibandingkan kejut panas tetapi
memerlukan peralatan khusus untuk
membangkitkan aliran listrik bertegangan
tinggi yang disebut elektroporator (Howe
1995).
Sel inang yang digunakan pada proses
kloning gen biasanya adalah sel E.coli. Sel
E.coli ini telah dibuat menjadi kompeten
sehingga bukan strain alami karena sel
E.coli tergolong tidak efisien dalam
menyerap
DNA.
Setelah
plasmid
dimasukkan ke dalam sel inang, maka
dilakukan seleksi sel transforman dengan
menumbuhkan sel hasil transformasi pada
media tumbuh yang spesifik. Transforman
ditumbuhkan pada media sesuai marka
seleksi. Marka seleksi adalah gen yang
memberi karakteristik baru pada sel
transforman yang tidak dimiliki oleh sel
non-transforman. Sel transforman akan
mampu tumbuh pada media sesuai marka
seleksi, tetapi sel non-transforman akan mati
(Liu 2007).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada
proses kultur isolat Ganoderma spp., yaitu
isolat Ganoderma spp. (Lampiran 2), bubuk
DiftoTM Potato Dextrose Agar (PDA),
tripton, ekstrak ragi, NaCl, dan agar bakto.
Sementara itu, bahan-bahan yang
digunakan pada proses isolasi DNA adalah

5

 

larutan
setiltrimetilamonium
bromida
(CTAB),
serbuk
polivinilpolipirolidon
(PVPP), nitrogen cair, es batu, akuades
steril, larutan β-merkaptoetanol 1%, larutan
kloroform : isoamilalkohol (24:1), larutan
isopropanol dingin, buffer Tris-HCl EDTA
(TE), natrium asetat, etanol absolut, dan
etanol 70%.
Bahan-bahan yang digunakan untuk
amplifikasi DNA, yaitu DNA cetakan, bufer
PCR, molecular water (MW), 6 pasang
primer
(CO1_PenF1 /
CO1_PenR1;
CO1_B_F / CO1_B_R; BenA_F / BenA_R;
ITS 1_F / ITS4_B; Gan_ITS1_F /
Gan_ITS1_R; Gan_ITS2_F / Gan_ITS2_R),
enzim Taq Polimerase, dan dNTPs 10 mM.
Bahan-bahan yang diperlukan untuk
elektroforesis gel agarosa adalah bubuk
agarosa (Fermentas), bufer Tris-Borat
EDTA (TBE) 0.5x, larutan etidium bromida
(EtBr) 5 µg/100ml, loading buffer
(bromfenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan
penanda molekuler (marker) DNA 1 kb plus
ladder (Invitrogen)
Bahan-bahan yang digunakan pada
pengklonan gen adalah DNA target, vektor
(plasmid) pGEM-T Easy (Promega), T4
Ligase, molecular water (MW), sel E.coli
kompeten, antibiotik ampisilin, isopropil-βD-1-tiogalaktopiranosida (IPTG), 5-bromo4-kloro-3-indol-β-D galaktopiranosida (XGal), dan media Luria Bertani (LB) agar.
Bahan-bahan yang digunakan pada elusi
dan pemurnian adalah QIAquick Gel
Extraction Kit (Qiagen). Sementara itu,
untuk isolasi plasmid menggunakan
GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas).
Alat-alat yang digunakan adalah tabung
Eppendorf, pipet mikro (0.1 µL, 10 µL, 100
µL, dan 1000 µL) dan tip, cawan Petri, labu
Erlenmeyer, sudip, bunsen, tusuk gigi steril,
gelas ukur, gelas piala, Laminar Air Flow
(LAF), autoklaf, mikrosentrifus Eppendorf
5417R dengan diameter rotor 10 cm,
seperangkat alat elektroforesis, adaptor 100
volt, transiluminator ultraviolet (UV) T2201
(Sigma), program software geldoc, mesin
PCR (ESCO Swift max), DNA speed vacum
110 savant, transluminator ultraviolet (UV)
T2201 (Sigma), neraca analitik digital, oven,
inkubator, lemari es dan penangas air.

digunakan, yaitu Potato Dextrose Agar
(PDA). Sebanyak 10 gram bubuk PDA
ditimbang, kemudian dilarutkan dengan
akuades sebanyak 250 mL pada labu
Erlenmeyer
dan
dipanaskan
hingga
mendidih. Kemudian larutan media PDA
ditutup rapat dengan kapas dan alumunium
foil. Selanjutnya disterilisasi dalam autoklaf
selama kurang lebih 15 menit pada suhu
121°C dan tekanan 1 atm. Larutan media
yang sudah disterilisasi di dalam autoklaf
kemudian
ditambahkan
antibiotik
streptomisin. Setelah itu dituang ke dalam
cawan Petri yang sudah steril dan didiamkan
hingga padat. Penuangan media ke dalam
cawan Petri dilakukan di dalam laminar.
Sementara itu, media cair yang digunakan
adalah kaldu ekstrak malt (MEB). Sebanyak
4 gram ekstrak malt dan 4 gram pepton
ditimbang, dilarutkan dengan akuades 200
mL, dan dipanaskan di dalam labu
Erlenmeyer. Setelah itu dituang ke dalam
tabung kecil, ditutup rapat dengan
alumunium foil. Selanjutnya disterilisasi
dalam autoklaf selama kurang lebih 15 menit
pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm.
Kemudian
ditambahkan
antibiotik
streptomisin sebelum digunakan.
Selanjutnya, isolat murni Ganoderma
spp. dari tubuh buah dikulturkan dengan
keadaan steril di dalam Laminar Air Flow
(LAF). Tubuh buah Ganoderma spp.
dipatahkan dengan tangan pada bagian
tengah, kemudian diambil jaringan tubuh
buah yang terletak di bagian tengah
sebanyak
satu
cuplikan
dengan
menggunakan pinset steril. Selanjutnya
diinokulasikan pada media PDA yang telah
disiapkan sebelumnya. Biakan akan tumbuh
setelah kurang lebih 1-2 minggu. Setelah 1-2
minggu, biakan murni yang tumbuh
dipindahkan ke dalam agar miring untuk
koleksi dan ke dalam media PDA baru.
Pemindahan biakan ke dalam media PDA
baru bertujuan untuk peremajaan. Setelah
biakan tumbuh banyak, biakan pada media
PDA dipotong-potong kecil dan dipindahkan
ke dalam media cair (MEB). Selanjutnya
diinkubasi selama kurang lebih 1 minggu.
Miselium akan tumbuh lebat dan dipanen
untuk keperluan isolasi DNA.

Metode

Isolasi DNA Genom Ganoderma spp.
(Orozco-Castillo et al. 1994)
Miselium yang tumbuh dalam media
cair MEB dibilas dengan akuades steril dan
dimasukkan ke dalam alumunium foil untuk
dibekukan di dalam nitrogen cair. Setelah

Kultivasi Isolat Murni Ganoderma spp.
dari Tubuh Buah
Media yang dibuat terdiri atas media
padat dan media cair. Media padat yang

6

 

miselium beku, kemudian digerus dengan
mortar dingin dan ditambahkan serbuk
PVPP 0.1 gram. Selama penggerusan,
ditambah nitrogen cair secara terus menerus
untuk menjaga temperatur agar DNA tidak
rusak. Penggerusan dihentikan ketika sampel
telah menjadi serbuk halus dan selanjutnya
dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf.
Setelah itu, sampel ditambahkan campuran 1
mL buffer ekstraksi dan 0.1 mL larutan βmerkaptoetanol 1% yang hangat serta
dicampur merata dengan membolakbalikkan tabung Eppendorf. Kemudian
campuran diletakkan di dalam penangas air
selama 30 menit dengan suhu 65°C. Setelah
30 menit, campuran didinginkan pada suhu
kamar selama 5 menit dan ditambahkan
dengan larutan kloroform : isoamilalkohol
(24:1) sebanyak 1 mL. Selanjutnya dicampur
merata dengan membolak-balikkan tabung
Eppendorf.
Tahap selanjutnya, yaitu sentrifugasi
selama 10 menit dengan kecepatan 1355.2 g.
Sentrifugasi akan menghasilkan dua lapisan
cairan, namun hanya lapisan bagian atas saja
(supernatan) yang diambil dan dipindahkan
ke dalam tabung Eppendorf baru.
Supernatan kemudian ditambahkan dengan
larutan kloroform : isoamilalkohol (24:1)
sebanyak 1 mL dan disentrifugasi selama 10
menit dengan kecepatan 1355.2 g.
Sentrifugasi menghasilkan dua lapisan lagi,
lapisan bagian atas diambil dan dipindahkan
ke dalam tabung Eppendorf baru.
Setelah itu ditambahkan dengan larutan
isopropanol dingin sebanyak 1 volume (1
mL) dan dikocok hingga homogen serta
disimpan pada suhu 4°C selama 30 menit.
Campuran disentrifugasi selama 10 menit
dengan kecepatan 1355.2 g, kemudian pelet
dikeringkan dan dilarutkan dengan 100 µL
buffer TE, 10 µL CH3COONa 3 M pH 5.2,
dan 250 µL etanol absolut. Campuran
dikocok hingga homogen. Kemudian
disimpan di dalam lemari es (suhu -20°C)
selama 30 menit atau semalam. Setelah
beku, kemudian sentrifugasi kembali selama
10 menit dengan kecepatan 1612.8 g dan
suhu 4°C. Pelet DNA diambil dan
ditambahkan dengan etanol 70% sebanyak
100 µL, kemudian ditambahkan dengan 30
µL nuclease-free water
(NFW) serta
disimpan dalam lemari pembeku.
Pengukuran Kuantitas dan Kualitas DNA
(Sambrook & Russell 2001)
Pengukuran
kuantitas
DNA
menggunakan metode spektrofotometri

dengan alat spektrofotometer UV. Sampel
DNA yang sebelumnya telah diisolasi
diencerkan
hingga
100x
dengan
menambahkan 297 µL molecular water
(MW) ke dalam 3 µL sampel DNA.
Selanjutnya, diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm.
Tingkat
kemurnian
sampel
dapat
diperkirakan dengan menghitung nilai rasio
serapan pada panjang gelombang 260 nm
dan 280 nm, sedangkan konsentrasi sampel
diperoleh dari hasil perkalian nilai serapan
pada panjang gelombang 260 nm dengan
faktor koreksi dan faktor pengenceran.
Sementara itu, pengukuran kualitas DNA
menggunakan metode elektroforesis gel
agarosa 1%. Sebanyak 0.6 gram agarosa
dicampur dengan bufer TBE 0.5x sebanyak
60 mL. Setelah dicampurkan, kemudian
dilarutkan sambil dipanaskan di dalam oven
selama 90 detik. Setelah itu, cairan
didiamkan hingga hangat dan diberi larutan
EtBr sebanyak 3 µL. Cairan agarosa diaduk
merata, dituang ke dalam cetakan sumur dan
didiamkan hingga membeku dan padat.
Setelah gel agarosa membeku dan padat, gel
agarosa dipindahkan ke dalam bak
elektroforesis yang telah berisi larutan bufer
TBE 0.5x. Hasil isolasi DNA sebanyak 5 µL
dan loading buffer sebanyak 1 µL
diinjeksikan satu per satu ke dalam sumur
gel agarosa 1%. Pada bagian ujung sumur
gel agarosa dimasukkan juga penanda
molekuler (marker) dengan ukuran 1 kb plus
ladder sebanyak 0.8 µL. Kemudian dialirkan
arus dan diberi tegangan sebesar 75 V.
Migrasi dapat ditunggu selama kurang lebih
45-60 menit. Setelah proses migrasi selesai,
maka diamati dan dianalisis pola pita DNA
isolat Ganoderma spp. pada gel agarosa
dengan
menggunakan
transluminator
ultraviolet (UV) T2201 (Sigma). Hasil
pengamatan pola pita DNA dilihat melalui
perangkat lunak Geldoc.
Desain
Primer,
Optimasi
Primer
terhadap Isolat Ganoderma spp., dan
Amplifikasi DNA dengan Metode PCR
(Wilson &Walker 2000)
Tahap ini bertujuan untuk mendesain
primer yang akan digunakan pada
amplifikasi DNA isolat Ganoderma spp.
melalui analisis secara in silico dengan
program
PRIMER3
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)
atau
ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/cl
ustalw2/) yang dapat diakses secara online
melalui website. Primer yang digunakan

7

 

merupakan hasil desain peneliti di Balai
Penelitian dan Bioteknologi Perkebunan
Indonesia (BPBPI) (Minarsih 2011) dan ada
pula yang dirujuk dari beberapa jurnal
penelitian
serta
website
(http://www.boldsystems.org).
Pilihan
primer yang digunakan ada enam pasang
(forward dan reverse) seperti yang
tercantum pada Tabel 1.
Optimasi primer berfungsi untuk
menguji kecocokan pasangan primer
(forward dan reverse) dengan sampel DNA
Ganoderma spp. melalui teknik Polymerase
Chain Reaction (PCR). DNA isolat
Ganoderma spp. dengan konsentrasi 100 ng
diambil sebanyak 1 µL dan ditampung di
dalam tabung Eppendorf yang berbedabeda. Kemudian masing-masing tabung
Eppendorf yang berisi DNA isolat
Ganoderma spp. ditambahkan campuran
reaksi dengan komposisi bufer 2.5 µL,
dNTPs 0.5 µL, sepasang primer masingmasing 1 µL, enzim Taq polimerase 0.3 µL,
dan ddH2O 18.70 µL. Total volume
campuran dalam satu tabung Eppendorf
adalah 25 µL.
Setelah campuran merata, kemudian
dimasukkan ke dalam mesin PCR. Mulamula dilakukan optimasi suhu penempelan
(annealing) primer dengan menggunakan
metode PCR gradien. Suhu annealing yang
digunakan pada masing-masing pasangan
primer adalah CO1_PenF1/CO1_PenR1
(50.4;
52.4;
54.4;
56.4;
58.4)°C,
CO1_B_F/CO1_B_R (49; 51; 53; 55; 57;
59) °C, BenA_F/BenA_R (53; 55; 57; 59;
61)°C, ITS1_F/ITS4_B (50; 52; 54; 56; 58;
60; 62)°C, Gan_ITS1_F/Gan_ITS1_R (48;
50;
52;
54;
56;
58)°C,
Gan_ITS2_F/Gan_ITS2_R (48; 50; 52; 54;
56; 58)°C. Amplifikasi DNA dilakukan
sebanyak 30 siklus dengan dengan program
predenaturasi pada suhu 94°C selama 5
menit, denaturasi pada suhu 94°C selama 45

detik, penempelan primer (annealing) pada
suhu yang telah disebutkan di atas selama 45
detik, pemanjangan primer (extension) pada
suhu 72°C selama 2 menit, dan pasca
pemanjangan pada suhu 72°C selama 5
menit. Selanjutnya produk PCR diverifikasi
pada elektroforesis gel agarosa 1%.
Ekstraksi (Elusi) dan Purifikasi Fragmen
DNA (Metode QIAquick Gel Extraction
Kit), dan Pengklonan Gen (Sambrook &
Russell 2001)
Tahap ini bertujuan untuk memperoleh
DNA yang terpisah dari komponenkomponen lainnya (pengotor) seperti RNA,
protein, karbohidrat, dan larutan, sehingga
diperoleh suatu DNA murni untuk
kepentingan analisis berikutnya. Gel yang
telah dielektroforesis dan menunjukkan hasil
elektroforegram
positif,
kemudian
dipotong-potong
menjadi
potonganpotongan kecil pada bagian yang terdapat
fragmen DNA. Gel tersebut disimpan dalam
tabung Eppendorf berukuran 2 ml.
Kemudian ditimbang dan diusahakan agar
bobot gel tidak melebihi 400 mg. Elusi
menggunakan metode QIAquick Gel
Extraction Kit (Qiagen) dengan bantuan
mikrosentrifus.
Elusi diawali dengan menambahkan
bufer QG (100 mg~100µL). Kemudian,
diinkubasi pada suhu 50°C selama 10 menit
atau hingga gel mencair. Ketika gel telah
mencair, dipastikan bahwa gel berubah
warna menjadi kuning. Setelah itu,
campuran larutan dimasukkan ke dalam
kolom QIAquick dan disentrifus dengan
kecepatan 1892.8 g selama 1 menit. Setelah
disentrifus, maka DNA akan tersaring dan
menempel pada kolom QIAquick. Sementara
itu, cairan sisa dibuang dan ditambahkan
bufer QG sebanyak 0.5 ml serta disentrifus
kembali dengan kecepatan 1892.8 g selama
1 menit.

8

 

Selanjutnya, kolom QIAquick dibilas
dengan etanol dan disentrifus kembali
dengan kecepatan 1892,8 g selama 1 menit.
Pembilasan dengan etanol berfungsi untuk
mencuci DNA dari senyawa-senyawa lain
seperti lemak, protein, dan lain-lain. Setelah
itu, etanol dibuang dan tabung Eppendorf
yang hanya berisi benang-benang DNA
disentrifus kembali dengan kecepatan dan
waktu yang sama untuk mengeringkan
kolom QIAquick. Kemudian ditambahkan
bufer elusi sebanyak 15 µl untuk mengelusi
cairan yang berada di dalam kolom
QIAquick dan didiamkan selama 1 menit
serta disentrifus lagi. Selanjutnya, cairan
yang terkumpul dapat disimpan di dalam
lemari es dan dapat dianalisis dengan
elektroforesis
gel
agarosa
untuk
membuktikan DNA telah bersih dari
pengotor.
Sementara itu, langkah-langkah untuk
melakukan kloning gen terdiri atas ligasi
insert (DNA target) ke dalam vektor
(plasmid), transformasi DNA plasmid ke
dalam sel kompeten, dan seleksi sel yang
membawa plasmid berisi gen target. Tahap
pertama, yaitu ligasi. Campuran untuk ligasi
insert ke dalam vektor (plasmid) berisi
komposisi insert sebanyak 3.0 µL, vektor
(plasmid) pGEMT-Easy (Promega) sebanyak
0.5 µL, T4 Ligase 1.0 µL, bufer sebanyak
5.0 µL, dan MW 0.5 µL. Pencampuran harus
dilakukan dalam kondisi dingin (di dalam
es). Setelah dicampur, kemudian diinkubasi
selama semalam pada suhu 4°C.
Transformasi DNA plasmid ke dalam sel
E.coli dilakukan dengan memasukkan DNA
plasmid sebanyak 10 µL hasil ligasi ke
dalam 200 µL sel kompeten dan dicampur
merata secara perlahan serta disimpan di
dalam es selama 30 menit. Kemudian diberi
perlakuan heat shock (kejut panas) di dalam
penangas air dengan suhu 42°C selama 50
detik tanpa digoyang sedikit pun. Setelah itu,
didinginkan kembali di dalam es selama 10
menit. Selanjutnya, ditambahkan campuran
800 µL medium LB dan glukosa 20 mM
tanpa antibiotik. Kemudian diinkubasi pada
suhu 37°C sambil digoyang dengan
kecepatan 50 rpm selama 1 jam. Setelah itu,
sebanyak 100 µL suspensi sel transforman
dipindahkan pada media LA yang telah
diberi antibiotik ampisilin 100 ppm, IPTG,
dan X-Gal pada cawan Petri dan diratakan.
Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C
selama semalam. Setelah semalam, maka
akan muncul koloni putih dan biru pada
media LA.

PCR Koloni
Koloni putih yang tumbuh kemudian
dipindahkan ke dalam media LA dengan
menggunakan tusuk gigi steril untuk
membuat duplikat koloni. Selanjutnya
diinkubasi selama semalam pada suhu 37°C.
Selain itu, koloni putih yang tumbuh juga
dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf
yang berisi MW sebanyak 10 µl.
Pemindahan koloni dilakukan secara steril di
dalam laminar. Adapun komponen reaksi
yang perlu dipersiapkan adalah sebagai
berikut: bufer PCR 1.5 µl, dNTPs 0.3 µl,
sepasang primer spesifik masing-masing
0.15 µl, enzim Taq polimerase 0.15 µl, dan
MW 2.75 µl.
Tahap pertama PCR adalah program lisis
96°C selama 5 menit, 50°C selama 1 menit
30 detik, 96°C selama 1 menit 30 detik,
45°C selama 1 menit 30 detik, 96°C selama
1 menit, 40°C selama 1 menit. Program PCR
dihentikan sejenak untuk penambahan
komponen reaksi sebanyak 5 µl ke dalam
masing-masing
tabung
Eppendorf.
Kemudian program PCR dilanjutkan dengan
program PCR biasa, yaitu predenaturasi
pada suhu 94°C selama 5 menit, denaturasi
pada suhu 94°C selama 45 detik,
penempelan primer (annealing) pada suhu
yang telah disebutkan di atas selama 45
detik, pemanjangan primer (extension) pada
suhu 72°C selama 2 menit, dan pasca
pemanjangan pada suhu 72°C selama 5
menit.
Setelah
perbanyakan
koloni
transforman selesai, dilakukan pengujian
dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Isolasi
Plasmid
Rekombinan
(Kit
Fermentas)
Langkah pertama sebelum diisolasi
adalah kultur plasmid. Duplikat koloni putih
yang telah terbentuk pada media LA
selanjutnya dikultur ke dalam media LB cair
yang telah diberi ampisilin sebanyak 100
ppm. Koloni putih tersebut diambil dengan
ujung tusuk gigi steril dan dimasukkan ke
dalam media LB cair. Setelah itu, ditutup
rapat dan diinkubasi sambil digoyang selama
16 jam. Setelah 16 jam, maka koloni akan
tumbuh dan plasmidnya dapat diisolasi.
Plasmid diisolasi dengan GeneJet
Plasmid Miniprep Kit (Fermentas). Sampel
yang positif terinsersi gen target disentrifus
dengan kecepatan 716.8 g selama 2 menit.
Supernatannya dibuang sedangkan peletnya
ditambah
dengan
larutan
resuspensi
sebanyak 250 µL dan dikocok hingga pelet
larut. Setelah itu, ditambah lagi dengan

9

 

larutan lisis sebanyak 250 µL dan tabung
Eppendorf dikocok secara perlahan dengan
membolak-balikkan
tabung
Eppendorf
sebanyak 4-6 kali. Selanjutnya, ditambah
lagi dengan 350 µL larutan netralisasi dan
tabung Eppendorf dikocok secara perlahan
seperti sebelumnya. Kemudian disentrifus
selama 5 menit dengan kecepatan 1892,8 g.
Supernatannya yang terbentuk dituang ke
dalam kolom GeneJET spin dan disentrifus
kembali selama 1 menit dengan kecepatan
1892,8 g. Setelah itu, ditambah larutan
pencuci sebanyak 500 µl dan disentrifus
selama 30-60 detik. Cairan yang tersaring
oleh kolom kemudian dibuang. Hal ini
dilakukan sebanyak dua kali. Selanjutnya,
kolom kosong yang telah dibuang cairannya,
disentrifus kembali untuk menghilangkan
sisa-sisa cairan yang masih ada. Langkah
terakhir, yaitu kolom dipindahkan ke dalam
tabung Eppendorf
baru dan ditambah
dengan 50 µl buffer elusi 10 mM Tris-HCl
pH 8,5. Selanjutnya diinkubasi selama 2
menit pada suhu ruang dan disentrifus
selama 2 menit pada kecepatan 1892,8 g.
Supernatannya yang terbentuk merupakan
hasil isolasi plasmid rekombinan dan
disekuen untuk dianalisis keragaman
genetiknya.
Analisis Sekuens (sequencing)
Fragmen DNA plasmid Ganoderma spp.
yang telah diisolasi, kemudian diurutkan
basa nukleotida (sequencing) di Balai
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
(LIPI)
Cibinong
dan
1st
BASE
menggunakan primer universal (T7). Hasil
sequencing
kemudian
diidentifikasi
spesiesnya dengan menggunakan program
BLAST
pada
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) dan BOLD
System
(http://www.boldsystems.org).
Setelah isolat Ganoderma spp. berhasil
diidentifikasi, tahap selanjutnya adalah
analisis primer yang paling efektif untuk
dijadikan
primer
spesifik
dalam
mengidentifikasi Ganoderma spp. Hal ini
dapat dilihat dari tingkat akurasi setiap
pasang primer dalam mengidentifikasi
spesies Ganoderma.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kultivasi Isolat Murni Ganoderma spp.
dari Tubuh Buah
Miselium isolat Ganoderma spp. tumbuh
menyebar pada media PDA dalam cawan
Petri. Miselium berwarna putih dan

berbentuk seperti benang-benang halus
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.
Miselium ini diperoleh dari penanaman satu
cuplikan jaringan tubuh buah Ganoderma
spp. pada media PDA selama kurang lebih
1-2 minggu.
Selanjutnya, setelah 1-2 minggu,
miselium berwarna putih yang tumbuh
banyak pada media PDA di dalam cawan
Petri dikulturkan kembali ke dalam media
MEB cair. Tujuannya memperbanyak
sampel untuk keperluan isolasi DNA
selanjutnya. Setelah satu minggu, maka
tumbuh miselium berwarna putih yang
menyebar pada media MEB cair di dalam
cawan Petri. Miselium ini kemudian dipanen
untuk keperluan isolasi DNA.

Gambar 2 Miselium isolat Ganoderma spp.
pada media PDA
Kualitas dan Kuantitas DNA Kromosom
Ganoderma spp.
Keberhasilan tahap isolasi ditunjukkan
dengan kualitas DNA, yaitu dengan
visualisasi elektroforesis gel agarosa 1%
pada paparan sinar lampu UV. Gambar 3
menunjukkan pola pita DNA yang terbentuk
tebal dan tidak terfragmentasi.
Sementara itu, kuantitas DNA diukur
dengan menggunakan spektrofotometer UVVIS pada panjang gelombang serapan 260
dan 280. Selanjutnya nilai absorbansi 1,000
dari
hasil
pembacaan
dengan
spektrofotometer setara dengan 50 µg/ml
(Brown 2000; Wilson & Walker 2000). Nilai
ini merupakan faktor konversi sehingga
diperoleh
rumus
untuk
menghitung
konsentrasi DNA, yaitu A260 x faktor
konversi x faktor pengenceran.
Selain itu, tingkat kemurnian DNA juga
dapat dilihat berdasarkan rasio serapan pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm
(A260 : A280). Berdasarkan Wilson & Walker
(2000), suatu DNA memiliki kemurnian
yang tinggi apabila rasio serapan A260 : A280
> 1,8. Adapun kemurnian tinggi yang
dimaksud, yaitu DNA memiliki kadar
protein dan polisakarida yang rendah pada
suatu sampel.

10

 

Pada Tabel 2, sampel DNA isolat
Ganoderma spp. menunjukkan tingkat
kemurnian
yang
beragam.
Tingkat
kemurnian DNA yang tinggi ditunjukkan
oleh sampel PL5, PL6 dan T21. Ketiga
sampel isolat DNA Ganoderma spp. ini
memiliki rasio serapan A260 : A280 > 1.8.
Sementara itu, pada sampel isolat DNA
Ganoderma spp. yang lain (PL7, T9,T20,
Laras, Raja, Bek, Tin, Lipi) memiliki
kemurnian DNA yang rendah. Hal ini
ditunjukkan dengan rasio serapan A260 :
A280 < 1.8. Walaupun DNA hasil isolasi
memiliki tingkat kemurnian yang rendah,
namun DNA tersebut masih dapat dijadikan
sampel untuk proses selanjutnya, yaitu
amplifikasi dengan menggunakan metode
PCR. Hal inilah yang menjadi keunggulan
dari metode PCR, yaitu komponen sampel
DNA dalam jumlah sedikit saja sebagai
DNA cetakan, tetap dapat digunakan untuk
proses amplifikasi (Bintang 2010). Oleh
karena itu, sebelas sampel isolat DNA
Ganoderma spp. yang berhasil diisolasi
dapat
digunakan
untuk
amplifikasi
menggunakan metode PCR.

Desain
Primer,
Optimasi
Primer
terhadap Isolat Ganoderma spp., dan
Amplifikasi DNA dengan Metode PCR
Suhu annealing (penempelan) pada enam
pasang primer masing-masing dioptimasi
terlebih dahulu sebelum digunakan untuk
amplifikasi DNA. Tujuannya untuk mencari
suhu annealing yang optimum untuk proses
amplifikasi DNA pada sampel Ganoderma
spp. Berdasarkan hasil optimasi dengan
berbagai suhu annealing, maka pasangan
primer CO1_PenF1/CO1_PenR1, pasangan
primer CO1_B_F/CO1_B_R, dan pasangan
primer Gan_ITS2_F/Gan_ITS2_R tidak
dapat mengamplifikasi DNA karena tidak
terbentuk pola pita DNA pada gel agarosa
1% (data tidak ditampilkan). Hal ini berarti
ketiga pasang primer tersebut tidak
komplemen
dengan
sampel
DNA
Ganoderma spp. s