Jenis dan Rancangan Penelitian Analisis Hasil

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan post test only control group design.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas Variasi konsentrasi fraksi air yaitu 320; 580; 1000; 1900; dan 3400 µgml. b. Variabel tergantung Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian fraksi air brokoli dengan variasi konsentrasi. c. Variabel pengacau terkendali 1 Subyek uji, meliputi umur larva atemia yaitu 48 jam. 2 Lingkungan tempat percobaan, yang meliputi cahaya untuk mempercepat proses penetasan larva artemia yaitu dengan sinar lampu 5 watt, pH air laut buatan antara 8 - 9, kadar garam 5 permil, dan komposisi air laut buatan.

2. Definisi operasional

a. Metode BST merupakan salah satu uji skrining untuk menentukan ketoksikan suatu ekstrak atau senyawa terhadap larva artemia yang dinyatakan dengan nilai LC B 50 B . PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI b. Brokoli yang digunakan adalah bagian massa bunga brokoli curd, massa bunga terdiri dari bakal bunga yang belum mekar, tersusun atas lebih dari 5.000 kuntum bunga dengan tangkai pendek. c. Larva artemia yang digunakan sebagai hewan uji pada metode BST yaitu larva yang telah berumur 48 jam. d. Larva artemia dikatakan mati jika larva tidak lagi memperlihatkan gerakan. e. Fraksi air merupakan bagian dari sari brokoli dalam pelarut air setelah dipisahkan dari fraksi kloroform.

C. Bahan Penelitian 1. Bahan tanaman

Brokoli yang digunakan dalam penelitian ini merupakan tanaman budidaya dan diperoleh dari Ketep, Muntilan, Jawa Tengah pada bulan Februari 2006.

2. Bahan untuk BST

a. Telur artemia Artemia, Viper b. Ragi sebagai makanan bagi larva artemia. c. Air laut buatan yang berkadar garam 5 permil.

3. Bahan untuk pembuatan air laut buatan ALB

NaCl, MgSO B 4 B , MgCl B 2 B , CaCl B 2 B , KCl, NaHCO B 3 B , dan aquadest yang diperoleh dari laboratorium.

4. Bahan untuk KLT

Silika gel GF B 254 B MERCK, n-butanol, n-propanol, asam asetat glasial, air, dan pereaksi ninhidrin.

D. Alat Penelitian 1. Alat untuk penyarian dan pengeringan

Vacuum rotary evaporator Janke Kunkel RV 05-ST, waterbath Memmert, blender National, labu takar Pyrex, Beakerglass Pyrex, corong pisah Pyrex, gelas ukur Pyrex, corong, batang pengaduk, kain, dan cawan porselen.

2. Alat untuk BST

Neraca analitik Mettler Toledo AB 204, pipet volume 5 ml Pyrex, mikropipet Socorex, bak penetasan artemia lokal, lampu 5 watt Dop, aerator, pipet tetes, dan flakon.

3. Alat untuk ALB

Gelas ukur Pyrex, Beakerglass Pyrex, labu takar 1 liter Pyrex, pengaduk, sendok, dan pH meter.

4. Alat untuk uji KLT

Pipa kapiler, lempeng kaca, gelas ukur, bejana kromatografi, atomizer, kertas saring, Oven Memmert, lampu UV 254 nm dan UV 365 nm.

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman

Untuk memastikan bahwa jenis tanaman yang digunakan untuk penelitian benar-benar brokoli, maka dilakukan determinasi. Determinasi brokoli Brassica oleracea var. italica dilakukan dengan cara membandingkan habitus tanaman yang terdiri dari akar, daun, curd, dan bunga dengan pustaka Mills, 2001. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Pengumpulan bahan dan penyarian

Pemanenan brokoli dilakukan pada saat massa bunga sudah mencapai ukuran maksimal dan telah padat, tetapi kuncup bunganya belum mekar. Umur panen berkisar antara 60 - 90 hari setelah tanam, tergantung pada varietas tanaman. Brokoli yang telah dikumpulkan dicuci menggunakan air mengalir dan dirajang kecil-kecil untuk dibuat jus, kemudian sebanyak 500 gram brokoli dimasukkan ke dalam blender dan ditambah 100 ml aquadest. Setelah dibuat jus, dilanjutkan dengan proses pemerasan dan penyaringan untuk memperoleh fraksi air. Fraksi air ini ditambah dengan kloroform kemudian dipisahkan menggunakan corong pisah, sehingga diperoleh fraksi air dan fraksi kloroform. Namun fraksi kloroform tidak digunakan. Fraksi air yang diperoleh, dipekatkan menggunakan vacum rotary evaporator kemudian diuapkan untuk mendapatkan fraksi kental.

3. Pembuatan air laut buatan

Air laut buatan dengan kadar garam 5 permil dibuat dengan melarutkan berbagai bahan Tabel I. Bahan-bahan seperti natrium klorida, magnesium klorida, kalsium klorida, dan kalium klorida dilarutkan dalam aquadest dengan menggunakan labu takar 1 liter. Khusus untuk magnesium sulfat dilarutkan dalam aquadest panas, sedangkan natrium hidrokarbonat dilarutkan dalam air bebas karbondioksida. Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dan ditambahkan aquadest sampai volume tepat 1 liter, sehingga diperoleh air laut buatan dengan kadar garam 5 permil Mudjiman, 1989. Tabel I. Komposisi Bahan Untuk Pembuatan Air Laut Buatan ALB Mudjiman, 1989 No. Nama Bahan Jumlah gram 1. Natrium klorida NaCl 5 2. Magnesium sulfat MgSO B 4 B 1,3 3. Magnesium klorida MgCl B 2 B 1,0 4. Kalsium klorida CaCl B 2 B 0,3 5. Kalium klorida KCl 0,2 6. Natrium hidrokarbonat NaHCO B 3 B 2,0 7. Aquadest sampai 1 liter

4. Penetasan siste artemia

Siste artemia ditetaskan dengan media air laut buatan berkadar garam 5 permil. Artemia ditetaskan dalam bak penetasan artemia yang terdiri dari dua ruangan tidak sama besar yang disekat menjadi dua bagian, bagian terang dan bagian gelap, dengan lubang pada sekat 1 cm. Bagian gelap merupakan tempat siste artemia ditaburkan dan berukuran lebih kecil dari pada bagian terang. Bagian terang diberi penerangan lampu listrik. Siste menetas setelah kira-kira 24 - 36 jam, kemudian menjadi larva. Larva yang aktif akan bergerak menuju tempat yang terang melalui lubang pada sekat. Larva yang telah berumur 48 jam dan aktif inilah yang akan digunakan untuk uji BST.

5. Penentuan nilai LC

B 50 B dengan metode BST a. Pembuatan larutan stok Penyiapan larutan stok untuk uji BST adalah sebagai berikut : ekstrak kental fraksi air ditimbang sebanyak 100 mg dan dilarutkan dalam 10 ml metanol PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI sebagai larutan A. Sedangkan larutan B dibuat dengan mengambil 1 ml dari larutan A dan dilarutkan dalam 10 ml metanol. Untuk membuat seri kadar, diambil 50 µl dari larutan B, 500 µl dari larutan B, dan 500 µl dari larutan A, sehingga didapatkan kadar 10, 100, dan 1000 µgml. Kontrol fraksi air yang digunakan yaitu metanol Meyer et al., 1982. Seri konsentrasi larutan stok dan kontrol yang telah diperoleh diuapkan diatas waterbath hingga kering, kemudian ditambah dengan air laut buatan yang telah diaerasi sebanyak 3 ml. Larva artemia yang telah berumur 48 jam cirinya sudah berwarna kecoklatan diambil secara random dan dimasukkan ke dalam flakon. Tambahkan air laut buatan hingga volume tepat 5 ml. Sebagai makanan larva artemia, ke dalam tiap-tiap flakon diberi satu tetes suspensi ragi 3 mg ragi dalam 5 ml air laut buatan. Flakon dijaga agar selalu mendapat penerangan. Setelah 24 jam, jumlah larva artemia yang mati dihitung untuk mengetahui besarnya nilai persen kematian. Pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali. b. Pembuatan larutan sampel Dari data persen kematian larutan stok, maka dapat diketahui small dose dan large dose dari fraksi air yang kemudian digunakan untuk memperkirakan lima seri konsentrasi larutan sampel. Konsentrasi larutan sampel yang dapat ditentukan yaitu 320; 580; 1000; 1900; dan 3400 µgml Lampiran 6. Larutan sampel dari fraksi air diberi perlakuan yang sama seperti pada larutan stok dan dilakukan pengulangan sebanyak lima kali. Dari hasil persen kematian yang diperoleh, selanjutnya digunakan untuk menentukan nilai probit dan dianalisis untuk mengetahui harga LC B 50 B . PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

6. Identifikasi alil isotiosianat dengan metode KLT

Ekstrak kental fraksi air ditimbang sebanyak 50 mg dilarutkan dengan metanol p.a. hingga 10 ml, sehingga konsentrasi fraksi air 5 µgµl. Dengan menggunakan pipet kapiler 5 µl, larutan tersebut ditotolkan pada plat KLT sebanyak 6 kali. Sebagai pembanding digunakan ekstrak bawang putih Alii sativi Bulbus dalam pelarut metanol. Cara membuat larutan pembanding yaitu dengan menimbang bawang putih sebanyak 1 gram kemudian direbus dalam 50 ml metanol selama 5 menit dan diamkan selama 1 jam dengan sekali-kali digojog. Bagian yang bening diambil, selanjutnya diuapkan hingga 5 ml. Plat KLT dimasukkan dalam bejana yang berisi fase gerak lalu dikembangkan sampai jarak rambat 10 cm, kemudian diangkat dan dikeringkan. Setelah itu dilakukan deteksi untuk memastikan letak dan warna bercak sampel serta pembandingnya. Deteksi dilakukan dengan menggunakan pereaksi ninhidrin yang disemprotkan pada plat KLT, kemudian dipanaskan pada suhu 110ºC selama 5 menit. Setelah itu diamati bercak yang timbul secara visible secara langsung. Fase diam : silika gel GF B 254 B MERCK Fase gerak : n-butanol : n-propanol : asam asetat glasial : air 30:10:10:10, P v P B v B Pembanding : ekstrak bawang putih dalam pelarut metanol Deteksi : pereaksi ninhidrin Jarak rambat :10 cm PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

F. Analisis Hasil

Persentase kematian larva udang dapat diketahui dengan menggunakan rumus Abbot, hal ini dikarenakan pada kontrol terdapat kematian larva artemia. Kematian terkoreksi = 100 x kontrol pada kematian Persen - 100 kontrol pada kematian Persen - teramati kematian Persen Kumar, Prasad, Singh, 2005 Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh selanjutnya dianalisis menggunakan probit untuk menentukan nilai LC B 50 B . Penentuan nilai LC B 50 B dan perhitungan statistik dilakukan dengan menggunakan program statistik SPSS 10.00. Dalam uji BST suatu ekstrak dikatakan bersifat toksik apabila memiliki nilai LC B 50 B 1000 µgml Meyer et al., 1982. Adanya kandungan alil isotiosianat dalam fraksi air dipastikan melalui uji Kromatografi Lapis Tipis KLT.

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah benar brokoli. Proses determinasi dilakukan dengan cara membandingkan habitus tanaman yang terdiri dari akar, daun, curd, dan bunga dengan kunci determinasi menurut Mills 2001. Berdasarkan hasil determinasi tersebut maka dapat disimpulkan bahwa tanaman brokoli yang digunakan dalam penelitian ini memiliki nama botani Brassica oleracea var. italica.

B. Pengumpulan Bahan

Brokoli dipanen pada saat massa bunga sudah mencapai ukuran maksimal dan telah padat, tetapi kuncup bunganya belum mekar. Brokoli yang masih muda memiliki kandungan kimia dalam konsentrasi tinggi dibandingkan dengan brokoli yang sudah tumbuh besar. Umur tanaman pada saat dipanen yaitu berkisar antara 60 - 90 hari setelah tanam. Pengumpulan bahan dilakukan dalam satu kali pengambilan pada tempat tumbuh yang sama untuk menjaga agar senyawa yang terkandung dalam brokoli tetap sama. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI