Karakterisasi Fragmen DNA Burkholderia Gladioli Yang Terlibat Dalam Aktivitas Antifungi Ganoderma Boninense

KARAKTERISASI FRAGMEN DNA Burkholderia gladioli
YANG TERLIBAT DALAM AKTIVITAS ANTIFUNGI
Ganoderma boninense

RETNO TRI ASTUTI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Karakterisasi Fragmen
DNA Burkholderia gladioli yang Terlibat dalam Aktivitas Antifungi Ganoderma
boninense adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir Tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, November 2015
Retno Tri Astuti
NIM P051130231

RINGKASAN
RETNO TRI ASTUTI. Karakterisasi Fragmen DNA Burkholderia gladioli yang
Terlibat dalam Aktivitas Antifungi Ganoderma boninense. Dibimbing oleh
ANTONIUS SUWANTO dan MARIA SUGIHARTI.
Elaeis guineensis Jacq. atau dikenal dengan kelapa sawit merupakan
salah satu komoditas penting yang digunakan secara luas dalam industri makanan,
kosmetik dan farmasi. Sebagai negara tropis, Indonesia diberkahi iklim dan
kondisi yang tepat bagi pertumbuhan dan produksi kelapa sawit, sekaligus daratan
luas yang memungkinkan perkebunan dalam skala besar. Sejak tahun 2007,
Indonesia merupakan penghasil minyak kelapa sawit terbesar di dunia. Meskipun
demikian, perkebunan kelapa sawit tidak lepas dari ancaman patogen yang
menurunkan tingkat produksi. Cendawan G. boninense merupakan patogen paling
mematikan dan merugikan industri kelapa sawit di Indonesia dan Malaysia.
Berbagai upaya telah dilakukan untuk mengatasi serangan G. boninense
meliputi pengendalian secara kimia, mekanis dan biologis, tetapi belum

menunjukkan hasil yang memuaskan. Meskipun demikian, pengendalian secara
biologis menarik banyak perhatian karena memiliki efek negatif yang relatif kecil
bagi tanah, lingkungan maupun kesehatan manusia. Oleh karena itu, diperlukan
suatu strategi pengendalian yang terstruktur dengan pendekatan-pendekatan baru
seperti biologi molekuler atau pengembangan senyawa antifungi yang aman
dipergunakan dalam jangka panjang.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi gen-gen yang
berperan dalam aktivitas antifungi bakteri antagonis G. boninense sebagai langkah
awal untuk memahami mekanisme ekspresinya. Sebagai langkah pertama,
dilakukan isolasi seratus dua puluh lima bakteri dari sampel uji berupa bag-log
(media tanam) jamur konsumsi, tanah pembibitan kelapa sawit dan janjangan
kosong kelapa sawit. Sebanyak tiga belas isolat menunjukkan penghambatan
dengan nilai lebih dari 50%. Salah satu isolat yaitu S.2.2 diketahui memiliki
aktivitas penghambatan yang tinggi sekaligus stabil terhadap pemanasan dan
perlakuan proteinase K. Analisis runutan gen penyandi 16S rRNA menunjukkan
bahwa S.2.2 memiliki 99% kemiripan dengan Burkholderia gladioli strain ATCC
10248 (accession number CP009322.1). Isolat S.2.2 selanjutnya disebut sebagai
B. gladioli JR01
Untuk memahami mekanisme yang mendasari ekspresi senyawa
antifungi JR01, dilakukan mutagenesis transposisi menggunakan mini-Tn5

menghasilkan 612 mutan transposon. Berdasarkan uji antagonis, ditemukan dua
mutan yang mengalami penurunan aktivitas penghambatan yaitu BglK259 dan
BglK498. Karakterisasi runutan DNA pengapit transposon menunjukkan
kemiripan yang tinggi dengan sebagian gen penyandi LysR-type transcriptional
regulator
(BglK259)
dan
gen
proton-translocating
NADH-quinone
oxidoreductase (BglK498). Kedua gen ini diduga terlibat dalam aktivitas antifungi
B. gladioli sehingga inaktivasinya menyebabkan penurunan aktivitas.
Kata kunci: antifungi, Ganoderma boninense, mutagenesis transposon, analisis
genome walking

SUMMARY
RETNO TRI ASTUTI. Characterization of DNA Fragment on Burkholderia
gladioli Contribute for Anti-fungal Activity toward Ganoderma boninense.
Supervised by ANTONIUS SUWANTO and MARIA SUGIHARTI.
Elaeis guineensis Jacq. or commonly known as oil palm is one of the most

important commodities that are used widely in food, cosmetics and
pharmaceutical industry. Our country is blessed with a great climate and other
condition suitable for growth as well as extensive land allows giant plantation.
Since 2007, Indonesia is the largest producer of palm oil in the world.
Nevertheless, palm oil cultivation faces several threat that reduce production
levels, one of them is pathogenic fungus Ganoderma boninense. G. boninense is
the most serious and deadly pathogen of palm oil in Indonesia and Malaysia by
causing basal stem root disease. The most significant economic loss due to high
rate mortality of plant population.
Many efforts have been conducted to overcome G. boninense’s attack
including by chemical, mechanical and biological approach but no one was really
succesful. However, biological control has received much attention because it
causes smaller negative effect for soil, environment and human health as well as
restoring the soil microbial ecosystem. Thus, we need to generate a well-planned
biological control strategies with new approach such as by molecular
biotechnology, or deployment of safe novel anti-fungal. In this stage, mechanism
of antifungal expression become really important to be understanding.
The aim of this study is to clone and identify genes contribute for antifungal activities of antagonistic bacteria as a first step to understanding the
mechanism of anti-fungal expression. As a first step,we have isolated one hundred
and twenty five isolates from bag-log medium (culture material of edible fungi),

soil and oil palm empty fruit bunches. Thirteen isolates has more than 50%
inhibitory radial growth toward G. boninense. Based on culture filtrate assay,
crude extract of S.2.2 showed high and stable activities after boiling and
proteinase K treatment. Analysis of 16S rRNA sequences showed that S.2.2 was
closely related to B. gladioli strain ATCC 10248 (accession number CP009322.1),
furthermore designed as B. gladioli JR01.
In order to understand mechanism underlying in antifungal expression of
Jr01, we have conducted a mutagenesis transpositional using mini-Tn5KmR
generating 612 transposon-based mutant library. Based on antagonistic assay, we
found two knock-out mutant designed as BglK259 and BglK498. Analysis of
DNA sequence showed that the flanking DNA of mutant BglK259 closely related
to transcriptional regulator LysR family and flanking DNA of mutant BglK498
showed high similarities to proton-translocating NADH-quinone oxidoreductase
gene from B. gladioli ATCC 10248 (accession number CP009322.1).Those two
gene suspected to contribute in antifungal activities on B. gladioli JR01 since
inactivation generating knock-out antifungal mutant.
Keywords: anti-fungal, Ganoderma boninense, transposon mutagenesis,
genome walking

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KARAKTERISASI FRAGMEN DNA Burkholderia gladioli
YANG TERLIBAT DALAM AKTIVITAS ANTIFUNGI
Ganoderma boninense

RETNO TRI ASTUTI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
Pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2014 hingga Juli
2015 ini ialah Karakterisasi Fragmen DNA Burkholderia gladioli yang Terlibat
dalam Aktivitas Antifungi Ganoderma boninense.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Ir Antonius Suwanto, MSi
dan Dr Maria Sugiharti selaku pembimbing, atas segala arahan, saran,
pembelajaran dan solusi selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya
ilmiah ini. Terima kasih kepada Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi selaku penguji
luar komisi atas saran dan pemikiran baru yang diberikan pada saat ujian tesis. Di
samping itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada direktorat jenderal

perguruan tinggi (DIKTI) yang telah memberikan dana perkuliahan selama studi
penulis di IPB melalui program beasiswa BPP-DN calon dosen tahun 2013/2014.
Ucapan terima kasih juga penulis tujukan kepada PT Wilmar Benih Indonesia
Cikarang atas segala fasilitas dan sarana dalam pelaksanaan penelitian.
Terima kasih kepada seluruh staf RnD PT Wilmar Benih Indonesia atas
segala bantuan dan arahan selama pelaksanaan penelitian. Terima kasih kepada
sahabat-sahabat seperjuangan Astri, Sasti, Tira, Nabilah, Natalia, Arif, Albert atas
segala motivasi dan keceriaan selama masa studi. Terima kasih kepada Jekmal
Malau yang telah menjadi partner terbaik sepanjang penelitian ini. Ungkapan
terima kasih tak terhingga juga disampaikan kepada Bapak, Ibuk, Pratama serta
seluruh keluarga, atas segala dukungan, doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, November 2015

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
2
2
2

2

TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit
Cendawan Ganoderma boninense
Transposon Mini-Tn5
Analisis Genome Walking
METODE
Kerangka Penelitian
Waktu dan Tempat Penelitian
Prosedur Penelitian
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemilihan Isolat bakteri Antagonis G. boninense
Mutagenesis Transposon
Identifikasi Sekuen Pengapit Transposon
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN

RIWAYAT HIDUP

3
3
3
4
6
8
8
8
9
14
14
17
20
24
24
24
25
29
30

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7

8
9

10
11
12
13
14

Skema transposon Tn5 dan mini-Tn5
Peta suicide plasmid pUT yang membawa mini-Tn5-KmR
Prosedur genome walkiing menggunakan metode PCR berbasis
adaptor
Runutan nukleotida adaptor dan primer spesifik adaptor
Diagram alur penelitian
Peta fisik vektor pGEMT-Easy
Aktivitas penghambatan pertumbuhan miselium G. boninense
oleh empat isolat bakteri antagonis yang menunjukkan
penghambatan tertinggi pada uji tantang kultur
Hasil BLAST runutan gen penyandi 16S rRNA dari B. gladioli
JR01 dengan data gene bank
Perubahan aktivitas penghambatan mutan BglK259, BglK498,
mutan BglK226 dibandingkan dengan pertumbuhan normal G.
boninense dan penghambatan isolat tipe asal pada media PDA
setelah 10 hari inkubasi
Visualisasi hasil amplifikasi gen kanamisin menggunakan primer
spesifik Kan_1F dan Kan_1R
Visualisasi hasil amplifikasi PCR dengan penambahan adaptor
menggunakan DNA kromosom mutan BglK259 dan BglK498
Peta fragmen hasil amplifikasi genome walking pada mutan
BglK259 dan BglK498
Hasil pensejajaran runutan DNA pengapit transposon miniTn5KmR dari mutan BglK498
Hasil pensejajaran runutan DNA pengapit transposon miniTn5KmR dari mutan BglK498

5
6
7
7
8
12

14
16

18
19
20
21
21
22

DAFTAR TABEL
1
2
3

Daftar primer yang digunakan dalam penelitian
Aktivitas penghambatan oleh kandidat bakteri potensial terhadap
miselium G. boninense
Aktivitas penghambatan ekstrak kasar lima bakteri potensial
dengan aktivitas penghambatan tertinggi pada uji tantang kultur

11
15
16

DAFTAR LAMPIRAN
1

Pembuatan sel kompeten dengan perlakuan CaCl2

29

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Elaeis guineensis Jacq. atau yang umum dikenal sebagai kelapa sawit adalah
salah satu komoditas perkebunan yang digunakan secara luas dalam industri
makanan, farmasi dan kosmetik (Paterson et al. 2009). Sejak tahun 2007,
Indonesia menjadi produsen minyak kelapa sawit terbesar di dunia seiring dengan
luas lahan perkebunan yang terus meningkat (Ditjenbun 2014). Saat ini, budidaya
kelapa sawit menghadapi beberapa kendala yang menurunkan tingkat produksi,
salah satunya adalah serangan cendawan Ganoderma boninense. Cendawan ini
menyebabkan penyakit busuk pangkal batang (basal stem rot/BSR) yang
merupakan penyakit paling serius pada perkebunan kelapa sawit di Malaysia
(Singh 1991; Idris et al. 2001; Wong et al. 2012) dan Indonesia (Darmono 2000;
Susanto et al. 2005). Kerugian karena penyakit ini terutama disebabkan karena
kemampuannya dalam menurunkan populasi tanaman (Ariffin et al. 1996).
Serangan G. boninense di lapangan berjalan lambat sehingga sulit
dideteksi dengan akurat pada fase awal infeksi. Gejala penyakit mulai terlihat
setelah infeksi mencapai tahap lanjut (Sapak et al. 2008) yang seringkali ditandai
dengan tumbuhnya tubuh buah pada pangkal batang (Turner 1981). Akan tetapi,
pada fase ini pengendalian penyakit sudah sangat sulit dilakukan. Tanaman muda
yang menunjukkan gejala ini biasanya akan mati setelah satu hingga dua tahun
sedangkan tanaman dewasa dapat bertahan sekitar tiga tahun (Corley & Tinker
2003).
Berbagai upaya dan penelitian telah dikembangkan dalam usaha
pengendalian G. boninense meliputi pengendalian secara teknis, kimiawi dan
biologis, tetapi belum menunjukkan hasil yang memuaskan (Susanto 2002).
Penggunaan senyawa kimia saat ini masih banyak dikembangkan dalam
mengontrol penyebaran G. boninense di lapangan (Sapak et al. 2008). Akan
tetapi, aplikasi senyawa kimia seperti fungisida seringkali bekerja dengan
menyerang banyak mikroorganisme tanah tanpa pandang bulu termasuk mikroba
yang menguntungkan bagi pertumbuhan tanaman. Selain itu, penggunaan
senyawa kimia secara terus menerus juga mengakibatkan penurunan kualitas
tanah, pencemaran lingkungan (Sarim 2013) hingga kekhawatiran pengendapan
senyawa kimia beracun dalam produk pertanian dan perkebunan.
Strategi pengendalian biologis menggunakan agen hayati atau senyawa yang
dihasilkannya menarik perhatian karena memiliki efek buruk yang rendah
terhadap tanah, lingkungan maupun manusia, bahkan diharapkan dapat
memperbaiki komposisi mikroba di dalam tanah yang memburuk karena aplikasi
berbagai senyawa kimia (Sarim 2013). Beberapa golongan bakteri seperti
Burkholderia, Pseudomonas dan Bacillus diketahui menunjukkan aktivitas
antagonistik kuat terhadap G. boninense pada pengujian in vitro. Akan tetapi
aplikasi langsung sel ataupun produk mikroba seringkali berakhir dalam
kegagalan saat menghadapi kondisi lingkungan yang kompleks dan dinamis.
Alternatif lain melalui pendekatan molekuler atau penemuan antifungi baru yang
aman dibutuhkan dalam pengembangan strategi pengendalian yang lebih baik.
Metabolisme dan mekanisme ekspresi senyawa antifungi penting dipelajari
sebagai pondasi awal dalam penentuan strategi pengendalian yang lebih efisien.
Pada penelitian ini dilakukan pencarian kandidat bakteri antagonis potensial

2

terhadap G. boninense. Kajian molekuler melalui mutagenesis transposon
dilakukan untuk mempelajari fragmen gen yang terlibat dalam aktivitas
penghambatan hifa G. boninense.
Perumusan Masalah
Cendawan patogen G. boninense merupakan salah satu patogen utama
dalam perkebunan kelapa sawit di Indonesia. Berbagai usaha telah dilakukan
untuk menekan serangan G. boninense tetapi belum menunjukkan hasil yang
optimal. Pendekatan menggunakan agen biologis berupa bakteri yang
menghasilkan senyawa antifungi dinilai memiliki efek yang relatif rendah baik
bagi lingkungan maupun manusia, tetapi belum menunjukkan hasil yang
memuaskan dalam aplikasi di lapangan. Penelitian mengenai mekanisme ekspresi
senyawa antifungi penting dilakukan sebagai pondasi dalam menyusun strategi
pengendalian yang lebih baik, efektif dan efisien.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengkarakterisasi gen-gen
yang terlibat dalam mekanisme ekspresi senyawa antifungi dari isolat bakteri
antagonis G. boninense.
Manfaat Penelitian
Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan
informasi mengenai gen yang terlibat dalam aktivitas antifungi dari bakteri
antagonis G. boninense. Pengetahuan tersebut akan menjadi dasar awal dalam
pendekatan molekuler untuk menghasilkan aktivitas antifungi yang lebih kuat,
stabil atau sifat lain yang diinginkan. Hasil dari penelitian ini juga dapat menjadi
langkah awal mempelajari jalur metabolisme yang mendasari mekanisme ekspresi
antifungi dari bakteri antagonis yang sangat penting diketahui untuk menyusun
strategi pengendalian G. boninense yang lebih baik dan terstruktur.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini meliputi isolasi dan pemilihan kandidat
bakteri antagonis G. boninense, kajian mutagenesis menggunakan turunan
transposon mini-Tn5 untuk mengetahui gen-gen yang berperan dalam aktivitas
antifungi, uji aktivitas penghambatan mutan transposon untuk mendapatkan
mutan dengan perubahan sifat yang diinginkan dan karakterisasi fragmen DNA
pengapit transposon dari mutan terpilih.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit
Kelapa sawit (Elaeis guineensis) merupakan tanaman monokotil yang
termasuk dalam famili Arecaceae (klasifikasi sebelumnya Palmae) (Corley dan
Tinker 2003). Kelapa sawit dapat dibedakan menjadi tiga tipe berdasarkan
ketebalan cangkang buahnya yaitu tipe dura, pisifera dan tenera. Tipe dura
memiliki cangkang tebal antara 2.5-5 mm dengan daging buah relatif tipis. Kernel
(daging biji) biasanya besar dengan kandungan minyak rendah. Sedangkan tipe
pisifera memiliki tempurung yang tipis bahkan hampir tidak ada. Sebaliknya,
persentase daging buah cukup tinggi dan daging biji sangat tipis. Tipe pisifera
dikenal dengan bunga betina yang gugur pada fase dini sehingga sangat sulit
diperbanyak tanpa disilangkan dengan jenis lain (Purba et al. 1997).
Untuk mendapatkan sifat unggul dari kedua tipe tersebut, dilakukan
persilangan tipe dura sebagai induk betina dan pisifera sebagai induk jantan
menghasilkan kelapa sawit tipe tenera. Tipe tenera adalah tipe yang banyak
ditaman di perkebunan kelapa sawit saat ini. Tipe ini memiliki ketebalan
cangkang sedang, berkisar antara 0.5-2.5 mm dengan persentase daging buah
tinggi antara 60-96%. Tandan buah yang dihasilkan tenera lebih banyak daripada
dura, tetapi ukuran tandannya relatif lebih kecil (Purba et al. 1997).
Sejarah industri kelapa sawit di Indonesia dimulai tahun 1915 ketika bibit
kelapa sawit dari Kebun Raya Bogor ditanam di Sumatera Utara (Lubis 1992).
Kelapa sawit kemudian berkembang di daerah ini dan dibudidayakan secara
komersial. Pengembangan areal kelapa sawit berkembang pesat tidak hanya di
Sumatera tetapi meluas di Kalimantan, Sulawesi, Irian Jaya hingga Jawa Barat
(Treu 1998). Hingga saat ini, Indonesia sendiri adalah negara penghasil minyak
sawit terbesar di dunia (Ditjenbun 2014).
Cendawan Ganoderma boninense
Di antara patogen yang menyerang tanaman kelapa sawit, G. boninense
adalah yang paling berbahaya dan merugikan secara ekonomi (Semangun 1990).
Cendawan ini dikenal sebagai penyebab penyakit busuk pangkal batang di
Indonesia (Abadi 1987) dan juga di Malaysia (Ho & Nawawi 1985). Penyakit
busuk pangkal batang sulit dideteksi sejak dini karena gejala yang muncul di luar
tidak sejalan dengan proses penyerangan yang terjadi di dalam tanaman.
Umumnya, gejala awal terlihat pada daun yang berwarna hijau pucat seperti
kekurangan air atau unsur hara, daun muda tidak membuka kemudian disertai
dengan nekrosis pada daun dimulai dari daun bawah. Daun-daun yang mengalami
nekrosis akan patah tetapi tetap menggantung di pohon (Turner 1981). Gejala
lainnya adalah terbentuk tubuh buah pada pangkal batang. Pada tahap ini,
serangan telah mencapai tahap lanjut dan sangat sulit diobati. Pada akhirnya
tanaman akan mati dan tumbang (Turner 1981). Tanaman muda yang
menunjukkan gejala ini biasanya akan mati setelah satu hingga dua tahun
sedangkan tanaman dewasa dapat bertahan sekitar tiga tahun (Corley & Tinker
2003).

4

Database Sumatra Bioscience menunjukkan adanya kematian 40-50%
tanaman pada usia 25 tahun dimana tanaman yang masih hidup menunjukkan
gejala serangan G. bonionense. Akan tetapi pada bagian dimana sisa tanaman
terdahulu tertinggal di lapangan pada masa replanting, serangan penyakit menjadi
lebih parah hingga mencapai 25% dalam tujuh tahun saja. Pada lahan bekas
kelapa, serangan mencapai 25% pada usia tanaman 10 tahun dan meningkat
menjadi 40% dua tahun kemudian (Ariffin et al. 1996.). Kematian tanaman mulai
memberikan dampak finansial ketika penyakit menyerang lebih dari 10% tanaman
(Hasan & Turner 1998). Rata-rata penurunan yield tandan buah segar (TBS)
adalah 0.16t/ha untuk setiap tanaman yang mati. Pengurangan tanaman hidup
sebesar 50% menurunkan sekitar 35% yield TBS (Subagio & Foster 2003).
Berbagai upaya telah dikembangkan dalam mengatasi serangan G.
boninense baik secara kimia, teknis maupun biologis. Penggunaan senyawa kimia
seperti fungisida saat ini masih banyak dikembangkan meskipun tidak cukup
memuaskan dalam mengontrol penyebaran G. boninense di lapangan (Sapak et al.
2008; Chung 1990). Penggunaan fungisida sistemik melalui metode injeksi pada
batang dilaporkan dapat memperpanjang usia produksi tanaman sakit, tetapi tidak
mampu memberikan kontrol yang efektif sehingga tanaman akhirnya akan mati
dalam waktu yang tidak terlalu lama (Idris et al. 2004). Tey dan Ahdly (2007)
melaporkan bahwa tidak terdapat perbedaan tingkat penyakit pada tanaman yang
diinjeksi fungisida hexaconazole dibandingkan dengan kontrol tanpa perlakuan
setelah rentang waktu delapan belas bulan.
Pilihan lain yang dilakukan di lapangan saat ini adalah dengan mencegah
penyebaran inokulum G. boninense melalui kultur teknis misalnya dengan sanitasi
lahan. Cara ini dilakukan misalnya dengan pembangunan kanal untuk mengisolasi
tanaman yang sakit. Meskipun dapat membatasi penyebaran inokulum melalui
kontak langsung, metode ini seringkali melelahkan dan kurang efektif baik dalam
pengerjaannya maupun hasil yang diberikan.
Kemungkinan penggunaan kontrol biologis telah banyak diteliti untuk
mengetahui keefektifannya sebagai agen biokontrol. Beberapa genus bakteri
seperti Burkholderia (Bivi et al. 2010), Burkholderia cepacia (Sapak et al, 2008)
dan Bacillus (Susanto et al. 2005; Suryanto et al. 2012) juga cendawan
Trichoderma (Abadi 1987; Purba et al 1994; Illias & Abdullah 1999) terlihat
menjanjikan pada pengujian secara in vitro atau pengujian menggunakan bibit
kelapa sawit. Aktivitas mikoriza arbuskular diketahui juga berperan dalam
menunda laju infeksi G. boninense pada bibit kelapa sawit (Coombs, 2012).
Meskipun demikian, hasil tersebut terjadi pada lingkup penelitian laboratorium
yang sangat terkontrol. Hasil yang berbeda mungkin terjadi pada aplikasi di
lapangan. Selain itu, penggunaan agen biokontrol atau senyawa yang
dihasilkannya relatif lebih mahal dibandingkan senyawa fungisida sintetik.
Hingga saat ini, belum ada aplikasi agen biokontrol komersial yang diterapkan
secara luas di lapangan dengan hasil yang memuaskan (Fee 2011).
Transposon Mini-Tn5
Transposon merupakan bagian dari elemen loncat yaitu suatu segmen
DNA yang memiliki kemampuan meloncat dan menyisip pada sekuens DNA lain
tanpa memerlukan homologi sekuen maupun gen rec yang umum diperlukan pada
rekombinasi homolog. Penyisipan elemen loncat pada suatu gen dapat

5

mengakibatkan terganggunya ekspresi gen tersebut. Pada kondisinya di alam,
elemen loncat juga berperan dalam perpindahan gen yang mengkode suatu sifat
seperti patogenitas atau resistensi antibiotik antar organisme. Peristiwa penyisipan
transposon pada sekuen DNA lain dikenal dengan transposisi yang dikatalisis oleh
suatu enzim yaitu transposase (Tnp) (Berg & Berg 1983).
Salah satu transposon yang sering digunakan adalah transposon Tn5.
Transposon ini merupakan transposon komposit berukuran 5.7kb membawa gen
transposase dan gen resisten antibiotik kanamisin, bleomisin, dan streptomisin
yang diapit dua daerah yang disebut IS (Insertion sequence) yaitu IS50R dan
IS50L. Transposon Tn5 dibatasi oleh runutan 19 bp direct repeat yaitu inside end
(IE) dan outside end (OE) yang merupakan sekuens pengenalan enzim
transposase. Transposon ini merupakan agen mutasi dengan kemampuan
transposisi tinggi dan tempat penyisipan yang relatif acak di dalam genom inang
(Berg 1984). Meskipun demikian, keberadaan enzim transposase yang masih aktif
setelah penyisipan transposon ke dalam genom memungkinkan transposon
berpindah tempat dan menyebabkan hasil sisipan yang tidak stabil (Herrero et al.
1990).
Tn5 (5700 pb)
IS50L
OE

IS50R
IE Resistensi antiobiotik IE

OE

Mini-Tn5 (1835 pb)

OE

Resistensi antiobiotik IE

Gambar 1 Skema transposon Tn5 (A) dan mini-Tn5 (B) (Reznikoff 2003)
Pemindahan gen transposase keluar elemen transposon menghasilkan mini
transposon yang bersifat lebih stabil. Pada pengembangannya, diciptakan mini
transposon TN-5 (Gambar 1) yang hanya terdiri dari suatu gen biomarker yang
dibatasi runutan OE dan IE (de Lorenzo et al. 1990) sedangkan gen yang
menyandikan enzim transposase terletak di luar mini transposon yaitu pada
plasmid vektor (Herrero et al. 1990). Elemen mini-Tn5 biasanya dikonstruksi
dalam suatu vektor plasmid bunuh diri (suicide plasmid), yaitu plasmid yang akan
terdegradasi jika bakteri inang yang digunakan tidak memiliki kemampuan untuk
mereplikasi plasmid ini. Salah satu contoh suicide plasmid adalah plasmid pUT.
Pada replikasi plasmid pUT, diperlukan protein π yang berperan sebagai inisiator
yang akan menempel pada bagian iteron oriR6K sehingga proses replikasi dapat
terjadi (Ya-Bin 1998)
Penggunaaan suicide plasmid dalam proses transposisi sangat penting
dilakukan untuk memastikan plasmid yang membawa gen penyandi transposase
tidak bertahan dalam sel bakteri penerima. Apabila plasmid yang digunakan

6

masih terdapat dalam sel resipien, enzim transposase terus diproduksi sehingga
memungkinkan transposon berpindah tempat dan menyisip berulang kali dalam
kromosom. Hal ini akan sangat mengganggu kestabilan transposon dalam DNA
resipien yang mengakibatkan kegagalan dalam memperoleh mutan yang tepat dan
kesulitan dalam analisis lebih lanjut (Herrero et al. 1990, Ya-Bin 1998).

Gambar 2 Peta suicide plasmid pUT yang membawa mini-Tn5KmR (Artiguenave
et al. 1997). Gen penyandi enzim transposase (tnp*) terletak di luar
runutan mini-Tn5
Transposon yang dikemas dalam plasmid pUT (Gambar 2) dipindahkan
dari bakteri donor ke penerima melalui mekanisme konjugasi, yaitu perpindahan
materi genetik antar bakteri dengan melalui pili. Perpindahan ini memerlukan
faktor F (fertility factor) yang terdiri dari gen tra dan oriT (origin of transfer).
Gen tra sendiri tersusun dari komponen dtr (DNA transfer and replication) dan
mpf (mating pair formation). Secara umum, dtr berperan dalam replikasi dan
perpindahan plasmid ke sel penerima sedangkan mpf berfungsi dalam membentuk
pili sebagai jembatan dalam proses konjugasi (Snyder & Champness 2007). Jika
faktor F berasal dari bakteri donor secara langsung, proses perpindahan disebut
dengan konjugasi biparental mating, sedangkan jika bakteri donor tidak memiliki
faktor F, dibutuhkan bakteri lain pembawa faktor F yang disebut sebagai helper.
Proses perpindahan yang melibatkan helper disebut sebagai konjugasi triparental
mating (Achtman et al. 1978).
Analisis Genome Walking
Genome walking merupakan suatu metode yang sederhana dan efisien
untuk menemukan runutan DNA yang belum diketahui dengan mengacu pada
informasi DNA yang telah diketahui, misalnya dalam mengidentifikasi bagian
hulu dari suatu gen (Siebert et al. 1995). Dalam pelaksanaannya, metode ini tidak
memerlukan konstruksi pustaka DNA. Prosedur genome walking dapat dilakukan
dengan beberapa cara termasuk diantaranya inverse PCR, vectorette PCR dan
PCR berbasis adaptor (Ashoub & Abdalla 2006).

7

Pada penelitian ini, dilakukan strategi PCR berbasis adaptor untuk
mengidentifikasi sekuen DNA pengapit transposon yang diasumsikan sebagai
bagian dari gen yang berperan dalam aktivitas antifungi (Gambar 3). Fragmen
adaptor disambungkan dengan kedua ujung fragmen DNA untuk memungkinkan
amplifikasi daerah hulu dan hilir dari fragmen yang telah diketahui. Fragmen
target diamplifikasi dengan menggunakan primer spesifik adaptor dan primer
spesifik gen untuk mengetahui runutan DNA di antara primer tersebut (Clontech
2007).

Gambar 3 Diagram prosedur genome walking menggunakan metode PCR
berbasis adaptor (Clontech 2007). AP : primer adaptor, GSP : primer
spesifik gen

Gambar 4 Runutan nukleotida adaptor dan primer spesifik adaptor (Clontech
2007)

8

3 METODE PENELITIAN
Kerangka Penelitian
Kerangka penelitian disajikan pada Gambar 5.
Isolasi dan penapisan bakteri

Isolat bakteri terpilih

Identifikasi spesies bakteri
Mutagenenis transposon mini Tn-5

Uji aktivitas antifungi seluruh mutan

Mutan dengan perubahan aktivitas antifungi

Verifikasi mutan dengan PCR

Analisis runutan 16S rDNA mutan

Isolasi DNA kromosom mutan

Amplifikasi PCR berbasi adaptor

Visualisasi dan isolasi hasil amplifikasi

Pengklonan dan perunutan DNA pengapit transposon
Gambar 5 Diagram alur penelitian
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada Agustus 2014 hingga Juli 2015 di Laboratorium
Research and Development PT Wilmar Benih Indonesia (WBE), Cikarang.

9

Prosedur Penelitian
Isolasi dan Penapisan Bakteri Antagonis G. boninense
Isolasi kandidat bakteri antagonis dilakukan dengan menggunakan tiga
jenis sumber isolasi yaitu media tanam buatan jamur (tiram dan shitake), tanah
rumah kaca dan janjangan kosong kelapa sawit. Isolasi dilakukan pada tiga jenis
media agar yaitu media kings B, kings B 10% dan soil extract. Isolasi bakteri
dilakukan dengan metode pengenceran bertingkat. Suspensi pada pengeceran 10-3,
10-4 dan 10-5 diambil masing-masing 100 µl dan disebar pada media agar dengan
masing-masing 2 ulangan.
Skrining kandidat bakteri dilakukan berdasarkan kemampuan antagonisnya
terhadap G. boninense secara in vitro pada media potato dextrose agar (PDA)
yang dibagi menjadi delapan kuadran. Miselia G. boninense berumur tujuh hari
diinokulasi tepat di tengah media PDA dan koloni bakteri diinokulasi pada bagian
tepi kuadran dengan penotolan. Isolat bakteri E. coli dan aquades digunakan
sebagai kontrol negatif sedangkan fitrat isolat CP01 digunakan sebagai kontrol
positif. Isolat bakteri yang memiliki aktivitas penghambatan terhadap G.
boninense diuji lebih lanjut dengan penotolan empat kuadran.
Uji Antagonis dengan Metode Tantang Kultur
Isolat bakteri yang menunjukkan aktivitas penghambatan pada penapisan
awal diuji tantang dengan hifa G. boninense sesuai Jinantana dan Sariah (1998)
dengan modifikasi pembuatan suspensi bakteri. Biakan bakteri antagonis
ditumbuhkan pada media Kings B agar dan diinkubasi selama 2 x 24 jam. Hasil
subkultur biakan bakteri diencerkan dalam larutan NaCl 0.8% hingga diperoleh
suspensi bakteri dengan kerapatan sel 108 cfu mL-1 melalui pengukuran
absorbansinya pada panjang gelombang 600nm (Sapak et al. 2008).
Isolat G. boninense B29 berumur tujuh hari diletakkan di tengah media
PDA, kemudian suspensi bakteri digoreskan dengan jarak 3 cm dari miselium
(gambar 2). Bakteri E. coli, media PDB, dan G. boninense tanpa perlakuan
digunakan sebagai kontrol negatif sedangkan fitrat isolat CP01 dan fungisida
digunakan sebagai kontrol positif. Aktivitas antagonis bakteri diamati setelah
sepuluh hari inkubasi dengan menghitung radius pertumbuhan hifa normal G.
boninense pada kontrol (R1) dan pertumbuhan hifa yang terhambat (R2). Data
yang diperoleh ditransformasi menjadi nilai persentasi penghambatan
pertumbuhan radial (percentage inhibition of radial growth/PIRG) sesuai
Jinantana dan Sariah (1998) sebagai berikut :
x 100%
Uji Penghambatan Filtrat Bakteri terhadap G. boninense
Isolat bakteri yang menunjukkan PIRG di atas 50% ditumbuhkan pada 10
ml media King’s B dan diinkubasi bergoyang pada kecepatan 200 rpm selama
3x24 jam. Kultur bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama lima
menit. Supernantan dikumpulkan dan disterilkan dengan penyaringan mikrofilter
0,4µm.

10

Filtrat yang diperoleh dibagi menjadi tiga perlakuan yaitu tanpa
pemanasan, pemanasan suhu 950C selama 15 menit dan penambahan proteinaseK
200 µg ml-1. Sebanyak 100µl filtrat masing-masing perlakuan dimasukkan ke
dalam sumuran media PDA yang telah dicampurkan dengan suspensi miselium G.
boninense. Filtrat bakteri E. coli, media King’s B, dan G. boninense tanpa filtrat
digunakan sebagai kontrol negatif sedangkan fitrat isolat CP01 dan fungisida
dithane digunakan sebagai kontrol positif. Masing-masing perlakuan dilakukan
dengan 3 ulangan. Biakan diinkubasi pada suhu 28±2oC dan persentase nilai
penghambatan pertumbuhan radial miselium G. boninense diukur setelah 3 hari
inkubasi.
Identifikasi Spesies Bakteri Terpilih
Identifikasi spesies dilakukan melalui analisis gen penyandi 16s rRNA.
Isolat bakteri ditumbuhkan dalam 10 mL media LB pada suhu 30oC selama 16
jam. DNA kromosom bakteri diisolasi sesuai protokol standar Wizard Genomic
DNA Purification Kit (Promega, USA). Konsentrasi dan kemurnian DNA
dianalisis menggunakan NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE,
USA). Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dilakukan dengan PCR menggunakan
primer spesifik 63F dan 1387R sesuai Marchesi et al. 1998 (Tabel 1). Verifikasi
dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1% (w/v).
Produk PCR dimurnikan melalui purifikasi ExoSAP-IT sesuai protokol
standar produk (ExoSAP-IT, USA). Sekuen nukleotida diurutkan melalui PCR
cycle sesuai prosedur standar Big dye cycle sequencing kit. Purifikasi akhir hasil
PCR cycle dilakukan menggunakan Big dye x-terminator purification kit (Applied
Biosystems, USA). Sekuen nukleotida diurutkan menggunakan ABI Prism 3030
Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA). Analisis hasil sekuensing
dilakukan dengan menggunakan software Geneious Pro™5.3.4 dan disejajarkan
dengan dengan data base yang terdapat pada bank gen (www.ncbi.nlm.nih.gov)
melalui program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
Mutagenesis Menggunakan Transposon
Mutagenesis transposon terhadap isolat bakteri antagonis terpilih dengan
menggunakan turunan transposon mini-Tn5KmR (de Lorenzo 1990) yang dikemas
dalam plasmid pUT. Plasmid pUTmini-Tn5KmR diintroduksikan ke dalam sel
bakteri antagonis menggunakan metode biparental mating pada kertas filter steril
sesuai yang dideskripsikan oleh Oleza et al (2009). Bakteri donor E. coli S171( pir) dan bakteri antagonis terpilih (penerima) diinokulasi ke dalam media LB
cair dengan penambahan antibiotik yang sesuai. Setelah disentrifugasi, sel bakteri
donor dan resipien dicampurkan dengan perbandingan 1:1 (R+D). Campuran
diinokulasi sebanyak 30 µl pada kertas filter milipore 0.45 µm steril dan
diletakkan di atas media LA. Kultur bakteri donor (D) dan resipien (R) diinokulasi
secara terpisah pada media LA sebagai kontrol negatif. Kertas filter berisi kultur
bakteri diinkubasi selama 7 jam pada suhu 370C. Kertas filter berisi sel bakteri
kemudian divortex dalam larutan NaCl 0.8% hingga diperoleh suspensi bakteri.
Sebanyak 50 µL dan 100 µL suspensi bakteri R+D diinokulasi ke dalam
media selektif berupa media M9 dengan penambahan kanamisin 50 µg mL-1.

11

Suspensi bakteri yang sama (D+R) diencerkan hingga 10-6. Sebanyak 100 µL dari
masing-masing pengenceran disebar pada media M9 tanpa penambahan antibiotik
untuk menghitung total resipien. Kultur diinkubasi pada suhu yang sesuai selama
2 x 24 jam. Bakteri yang mampu tumbuh pada media M9+kanamisin ditandai
sebagai bakteri penerima yang diduga telah disisipi mini-Tn5 pada genomnya.
Frekuensi transkonjugasi dihitung sebagai jumlah bakteri konjugan yang tumbuh
pada media selektif dibagi dengan jumlah keseluruhan sel resipien.
Penapisan bakteri mutan yang membawa mini-Tn5 dilakukan melalui uji
antagonis G. boninense dengan metode totol empat kuadran. Mutan target yaitu
mutan yang mengalami perubahan kemampuan penghambatan terhadap G.
boninense diperkirakan telah mengalami mutasi pada sekuen gen yang berperan
dalam aktivitas antifungi.Verifikasi mutan target dilakukan dengan analisis gen
penyandi 16srRNA dan dibandingkan dengan isolat tipe awal. Verifikasi juga
dilakukan dengan PCR koloni menggunakan primer spesifik kanamisin.
Deteksi dan Identifikasi Fragmen Gen Pengapit Transposon
Identifikasi DNA pengapit transposon pada mutan target dilakukan
menggunakan metode genome walking melalui PCR dengan penambahan adaptor
spesifik sesuai dengan protokol standar Clontech universal genome walker
(Clontech Laboratories Inc, Takara Bio Company). PCR dilakukan dengan
menggunakan dua pasang primer spesifik gen dan primer spesifik adaptor (Tabel
1). Langkah pertama adalah mendesain dua pasang primer spesifik gen (gene
spesific primer/GSP) berdasarkan pada runutan gen resisten kanamisin (Kmr) dari
transposon Tn903 (Tabel 1). Desain GSP1 dirancang untuk mengamplifikasi
DNA pengapit dari gen Kmr ke arah luar sedangkan GSP 2 dirancang dari runutan
nukleotida di sebelah hulu atau hilir GSP 1 ke arah luar.
Tabel 1 Daftar primer yang digunakan dalam penelitian
No
1
2
3
4
5
6
7
8

Primer
63F
1387R
Asp1
Asp2
GSP_1F
GSP_1R
GSP_2F
GSP_2R

Sekuens (5’ 3’)
CAGGCCTAACACATGCAAGTC
GGGCGGAA/TGTGTACAGGC
GTAATACGACTCACTATAGGGC
ACTATAGGGCACGCGTGGT
GCCCGATGCGCCAGAGTTGT
GGTCTGCGATTCCGACTCCGACTCGTCC
TATTGATGTTGGACGAGTCGGAATC
CGTTTCCCGTTGAATATGGCTCAT

DNA genom mutan diisolasi menggunakan Wizard Genomic DNA
Purification Kit (Promega, USA). Analisis kemurnian dan konsentrasi DNA
genom dilakukan dengan perangkat NanoDrop 2000 (Thermo Scientific,
Wilmington, DE, USA). DNA genom dipotong sempurna menggunakan enzim
restriksi SnaBI, EcoRV dan FspI (Fermentas, Ontario, Canada) secara terpisah.
Seluruh reaksi diinkubasi pada suhu yang sesuai selama 16 jam. Fragmenfragmen DNA kemudian disambung dengan campuran adaptor (Clontech, USA)

12

menggunakan T4 DNA Ligase (NEB, USA) dan digunakan sebagai cetakan
dalam amplifikasi PCR genome walking.
Amplifikasi PCR primer dilakukan dalam campuran 10 l goTaq
(Promega), 1 l primer GSP1 10 pmol, 1 l primer AP1 10 pmol (Clontech,
USA), 1 l DNA cetakan dan 7 l ddH2O. Reaksi PCR dijalankan dengan kondisi
sebagai berikut;95 °C 3 menit, 7 siklus (94 °C 25 detik, 72 °C 3 menit),
dilanjutkan dengan 32 siklus (94 °C 25 menit, 67 °C 3 menit) dan 67°C 7 menit.
Produk PCR primer digunakan sebagai cetakan pada PCR selanjutnya yaitu PCR
sekunder atau PCR tersarang (nested PCR).
PCR tersarang dilakukan menggunakan 10 l goTaq (Promega), 1 l
primer GSP2 10 pmol, 1 l primer AP2 10 pmol (Clontech, USA), 1 l DNA
cetakan and 7 l ddH2O. Reaksi PCR dijalankan dengan kondisi sebagai berikut;
95 °C 3 menit, 5 siklus (94 °C 25 detik, 72 °C 3 menit), dilanjutkan dengan 20
siklus (94 °C 25 menit, 67 °C 3 menit) dan 67°C 7 menit. Visualisasi produk PCR
dilakukan melalui elektroforesis pada gel agarosa 1% (w v-1) dengan pewarnaan
ethidium bromide (EtBr). Pita hasil amplifikasi dimurnikan menggunakan QIA
Quick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, California).
Kloning gen penyandi protein antifungi
Produk amplifikasi genome walking disambungkan dengan plasmid
pGEMT Easy (Gambar 6) menggunakan enzim T4 DNA ligase. Reaksi ligasi
diinkubasi selama 16 jam pada suhu 16ºC. Pembuatan Escherichia coli Top10
kompeten dilakukan dengan perlakuan CaCl2 (Lampiran 1). Plasmid rekombinan
diintroduksikan ke dalam sel kompeten dengan perlakuan kejut panas (heat shock)
pada suhu 42oC selama 90 detik. Bakteri disebar pada media LA yang
mengandung antibiotik ampisilin 100 µg mL-1. Seleksi bakteri transforman
dilakukan dengan seleksi biru putih (blue white selection) seperti dideskripsikan
oleh Sambrook (1989). Sebagai kontrol digunakan sel E. coli kompeten yang
ditumbuhkan pada media LA dengan dan tanpa penambahan antibiotik ampisilin.

Gambar 6 Peta fisik vektor pGEMT-Easy (Promega)

13

Analisis runutan DNA pengapit transposon
Fragmen DNA pengapit transposon digunakan sebagai cetakan dalam PCR
cycle sequencing menggunakan Big Dye® Terminator Cycle sequencing Kit v3.1
(Applied Biosystem, California) dengan primer GSP2 dan ASP2 untuk
mengamplifikasi DNA sisipan. Produk Cycle sequensing dimurnikan mengikuti
protokol standar BigDyeR X-Terminator Purification kit (Applied Biosystems,
Foster City, California) dan dilakukan perunutan menggunakan perangkat ABI
Prism™ 3030 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, California).
Analisis hasil sekuensing dilakukan dengan menggunakan software Geneious
Pro™5.3
dan
disejajarkan
dengan
database
pada
bank
gen
(www.ncbi.nlm.nih.gov) melalui program Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST).

14

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemilihan Isolat Bakteri Antagonis G. boninense
Isolasi kandidat bakteri antagonis G. boninense dilakukan dari sumber
isolasi media tanam jamur tiram, shitake, tanah pembibitan kelapa sawit dan
janjangan kosong kelapa sawit. Analisis keberagaman bakteri dari masing-masing
sumber isolasi yang digunakan didasarkan pada perbedaan warna, tipe koloni dan
ukuran koloni (Bivi et al. 2010). Total seratus dua puluh lima isolat bakteri
berhasil diisolasi dari seluruh sumber isolasi dimana tiga puluh tujuh isolat
menunjukkan aktivitas penghambatan G. boninense dengan tingkat yang berbedabeda.
.

CP

E. coli

S. .

T. .

T. .9

S. .

Gambar 7 Aktifitas penghambatan pertumbuhan miselium G. boninense oleh
empat isolat bakteri antagonis yang menunjukkan penghambatan
tertinggi pada uji tantang kultur

15

Komposisi bakteri pada media sampel bag-log jauh lebih sedikit
dibandingkan sampel tanah, begitu juga jumlah bakteri yang menunjukkan
aktivitas penghambatan. Hal ini mungkin disebabkan karena substrat dan interaksi
antar bakteri yang terbatas. Selain itu, bag-log jamur telah melewati proses
sterilisasi dengan perebusan sehingga komposisi mikroba di dalamnya telah
banyak berkurang.
Tabel 2 Aktivitas penghambatan oleh kandidat bakteri potensial terhadap
miselium G. boninense
No
Perlakuan
Nilai PIRG (%)*
1
Aquades
2
NaCl 0.9%
3
E.coli
4
CPO1
70.50bc
16
ITMA.2
71.38bc
17
ITMA.4
75.81b
18
ITMA.7.2
62.52c
19
ITMA.11
67.21bc
20
HC.3
70.85bc
21
HC.5.1
72.9bc
22
HC.6.1
75.55b
23
HC.10
69.12bc
27
S.2.2
77.45ab
28
S.3.11
81.80ab
29
S.3.8
77.68ab
30
T.2.2
78.75ab
31
T.1.9
74.55b
*

Nilai PIRG setelah inkubasi selama 10 hari
Nilai yang ditandai dengan huruf yang sama tidak memiliki perbedaan yang
signifikan berdasarkan uji Tukey’s (P