Isolasi, Karakterisasi, Dan Pemurnian Enzim Polyphenoloxidase Dari Udang Vaname (Litopenaeus Vannamei).

ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN PEMURNIAN ENZIM
POLYPHENOLOXIDASE DARI UDANG VANAME
(Litopenaeus vannamei)

MEDAL LINTAS PERCEKA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “Isolasi,
Karakterisasi, dan Pemurnian Enzim Polyphenoloxidase dari Udang Vaname
(Litopenaeus vannamei)” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, September 2015

Medal Lintas Perceka
NIM C351120121

RINGKASAN
MEDAL LINTAS PERCEKA. Isolasi, Karakterisasi, dan Pemurnian Enzim
Polyphenoloxidase dari Udang Vaname (Litopenaeus vannamei). Dibimbing oleh
TATI NURHAYATI dan MALA NURILMALA.
Udang merupakan komoditas perikanan penting di Indonesia. Udang
merupakan komoditi yang mudah mengalami kerusakan dan memiliki masa
simpan terbatas karena adanya proses melanosis (pembentukan blackspot).
Blackspot merupakan reaksi enzimatik yang disebabkan oleh enzim
polyphenoloxidase (PPO). Pembentukan blackspot pada udang dapat menurunkan
harga jual, menurunkan penerimaan konsumen, dan menyebabkan kerugian secara
ekonomi. Informasi mengenai PPO dari karapas udang vaname Indonesia belum
pernah ada, oleh karena itu tujuan penelitian ini adalah mengisolasi, menentukan
karakteristik dan memurnikan enzim polifenoloksidase yang berasal dari karapas

udang vaname.
Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap. Tahap pertama yaitu mengekstrak
enzim PPO dari karapas udang vaname. Tahap kedua yaitu menentukan
karakteristik enzim PPO yang meliputi penentuan suhu optimum, pH optimum,
substrat optimum, kinetika enzim, pengaruh inhibitor dan ion logam, serta bobot
molekul enzim. Tahap ketiga yaitu melakukan pemurnian enzim PPO yang
meliputi pengendapan ammonium sulfat, dialisis, dan kromatografi kolom.
Enzim PPO telah berhasil diisolasi dari karapas udang vaname
menggunakan bufer fosfat 0,05 M pH 7,2 (mengandung NaCl 1 M dan Brij-35
0,2%) perbandingan 1:3. Enzim tersebut kemudian diendapkan menggunakan
ammonium sulfat 40% dan didialisis selama 8 jam. Pemurnian lebih lanjut
dilakukan menggunakan kromatografi filtrasi gel dengan matriks Sephadex-G150.
Kelipatan pemurnian enzim menurun setelah proses dialisis.
Ekstrak kasar PPO yang berasal dari karapas udang vaname memiliki
aktivitas optimum pada suhu 35 ºC, pH 6 dan konsentrasi L-DOPA 12,5 mM.
Nilai Km dan Vmaks enzim PPO vaname yaitu sebesar 2,35 mM dan 38,46 U/mL.
Aktivitas PPO dapat dihambat oleh sodium sulfit, EDTA, ion logam Na+, Zn2+,
Fe3+ pada konsentrasi 1 dan 5 mM. Penghambatan tertinggi ditunjukkan oleh
sodium sulfit pada konsentrasi 5 mM. Dua isoform enzim PPO vaname terdeteksi
oleh zimogram dan memiliki bobot molekul sebesar 302,5 kDa dan 337,5 kDa.

Kata kunci : Blackspot, karakterisasi, pemurnian, polyphenoloxidase, vaname.

SUMMARY
MEDAL LINTAS PERCEKA. Isolation, characterization and purification of
polyphenoloxidase from white shrimp (Litopenaeus vannamei). Supervised by
TATI NURHAYATI and MALA NURILMALA.
White shrimp (Litopenaeus vannamei) is an important fishery commodity.
Shrimps are highly perishable product and have limited shelf life due to melanosis
(formation of blackspot). Blackspot is an enzymatic reaction mainly associated
with polyphenoloxidase (PPO). Blackspot on shrimps has an impact to reduce
product market value, consumer acceptability and causes financial lost. However,
there is no information of PPO from carapace of white shrimp in Indonesia. Thus,
the aims of this research were to isolate, characterize, and purify PPO enzyme
from white shrimps carapace.
The study was conducted in three steps. Firstly, extracted of PPO enzyme
from white shrimps carapace. The second, characterized PPO including optimal
temperature, pH and substrat concentration, enzyme kinetics, effect of inhibitor
and metal ions, and molecular weight of the enzyme. The third step, purified PPO
including ammonium sulphate precipitation, dialysis and column
chromatoghraphy.

PPO has been isolated from carapace of white shrimp by buffer phosphate
extraction 1:3 (0.05 M pH 7.2 containing 1 M NaCl and 0.2% Brij-35). PPO was
purified by ammonium sulphate precipitation (40% saturation), dyalised for 8
hours, and purified by Sephadex-G150 gel filtration. Purification fold of PPO was
decreased after dialysis.
The crude PPO activity was optimal at temperature 35 ºC, pH 6 and
L-DOPA concentration 12.5 mM. The Km and Vmax value of the PPO for L-DOPA
were 2.35 mM and 38.46 U/mL, respectively. This activity could be inhibited by
sodium sulphite, EDTA, Na+, Zn2+, and Fe3+ at concentration 1 and 5 mM. The
PPO activity was strongly inhibited by sodium sulphite at concentration 5 mM.
Two isoform were detected by zymogram, which the molecular weights of about
302.5 kDa and 337.5 kDa.
Keywords : Blackspot, characterization, polyphenoloxidase, purification, shrimp

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN PEMURNIAN ENZIM
POLYPHENOLOXIDASE DARI UDANG VANAME
(Litopenaeus vannamei)

MEDAL LINTAS PERCEKA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji luar komisi pada ujian tesis: Dr Ir Bustami Ibrahim, MSc

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
Rahmat dan Karunia-Nya sehingga penulisan tesis ini dapat diselesaikan. Judul tesis
ini adalah ”Isolasi, Karakterisasi, dan Pemurnian Enzim Polyphenoloxidase dari
Udang Vaname (Litopenaeus vannamei)”. Penelitian ini didanai melalui penelitian
Desentralisasi 2014 atas nama Dr Tati Nurhayati, SPi, MSi dengan judul “Isolasi,
Pemurnian, dan Karakterisasi Inhibitor Polyphenoloxidase Alami sebagai
Penghambat Pembentukan Blackspot pada Udang”
Penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Dr Tati Nurhayati, SPi, MSi dan Dr Mala Nurilmala, SPi, MSi selaku dosen
pembimbing yang telah memberikan bimbingan, arahan, dukungan, semangat
kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.
2. Dr Ir Bustami Ibrahim, MSc selaku dosen penguji luar komisi yang telah
memberikan bimbingan dan arahan sehingga penulis mampu menyelesaikan tesis
ini.
3. Dr Kustiariyah Tarman, SPi, MSi selaku perwakilan tim gugus kendali mutu yang
telah memberikan masukan dan arahan kepada penulis.

4. Kedua orang tua beserta kakak dan adik yang telah memberikan dukungan baik
materil maupun spiritual kepada penulis.
5. Teman-teman satu tim penelitian polyphenoloxidase (PPO) yang saya banggakan
(Kak Made dan Laela). Terimakasih atas bantuan yang tulus. Laboran yang telah
membantu penelitian saya (Mas Ipul, Mba Arini, Mba Dini, Ibu Ika)
6. Keluarga besar mahasiswa sekolah pascasarjana Teknologi Hasil Perairan, yang
telah memberikan dorongan semangat baik selama penelitian maupun saat
penyusunan tesis ini.
7. Terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah membantu
penyelesaian tesis ini.
8. DIKTI yang telah membiayai penelitian melalui hibah bersaing Penelitian
Unggulan Perguruan Tinggi Desentralisasi Tahun 2014
Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan dalam penyusunan tesis
ini. Oleh karena itu, jika terdapat kesalahan penulis memohon maaf yang sebesarbesarnya. Penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun sehingga
bermanfaat untuk penyelesaian tesis ini.
Akhirnya, semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2015

Medal Lintas Perceka

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Rumusan Masalah
Tujuan
2 METODE
Waktu dan Tempat
Bahan dan Alat
Prosedur Kerja
Ekstraksi enzim PPO
Penentuan suhu optimum
Penentuan pH optimum
Penentuan substrat optimum dan kinetika enzim
Pengaruh ion logam dan inhibitor terhadap aktivitas enzim
Pemurnian enzim
Analisis

Pengukuran aktivitas enzim PPO
Pengujian konsentrasi protein
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakterisasi Enzim PPO
Penentuan suhu optimum enzim PPO
Penentuan pH optimum enzim PPO
Penentuan substrat optimum dan kinetika enzim PPO
Pengaruh inhibitor dan ion logam terhadap aktivitas PPO
Tahap Pemurnian Enzim PPO Udang Vaname
Pengendapan amonium sulfat dan dialisis
Pemurnian PPO menggunakan kromatografi kolom
Kelipatan pemurnian enzim
Fraksi aktif PPO
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN

Halaman

ix
ix
1
1
2
3
4
4
4
4
5
5
6
6
6
6
7
7
7
9

9
9
10
11
12
13
13
15
16
17
19
19
19
20
22

DAFTAR GAMBAR

1
2
3
4
5
6

Diagram alir penelitian
Suhu optimum PPO udang vaname (Litopanaeus vannamei)
pH optimum PPO udang vaname ((Litopanaeus vannamei)
Konsentrasi substrat optimum PPO udang vaname
Persamaan Lineweaver-Burk untuk menentukan nilai Km dan Vmaks
Pengaruh inhibitor dan ion logam terhadap aktivitas PPO vaname;
1 mM, 5mM
7 Aktivitas spesifik enzim PPO hasil pengendapan ammonium sulfat;
1 mM, 5mM
8 Aktivitas spesifik enzim PPO udang vaname hasil dialisis
9 Fraksi enzim PPO hasil pemurnian kromatografi filtrasi gel;
aktivitas enzim, konsentrasi protein enzim
10 (A) SDS PAGE PPO vaname; (B) zimogram PPO vaname; M: marker
EK: ekstrak kasar, P: pengendapan (NH4)2SO4, D: dialisis, F3: fraksi 3

Halaman
5
9
10
11
11
12
14
15
16
18

DAFTAR LAMPIRAN

1 Cara membuat larutan
2 Pembuatan larutan standar BSA konsentrasi 0,6-2,0 mg/mL
3 Contoh perhitungan konsentrasi protein
4 Penggunaan software Photo-CaptMw
5 Komposisi separating gel dan stacking gel SDS PAGE

Halaman
23
23
24
24
25

1

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Udang merupakan sumberdaya perikanan yang memiliki nilai ekonomis
penting di seluruh dunia. Udang merupakan komoditas andalan ekspor Indonesia
selain tuna, cakalang, tongkol, kepiting serta rumput laut. Udang memiliki posisi
yang strategis dalam menopang perekonomian nasional melalui pendapatan devisa
negara dan sekaligus meningkatkan kesejahteraan pembudidaya dan masyarakat
sekitar lingkungan budidaya udang. Udang menempati posisi pertama baik dari
segi volume maupun nilai ekspor hasil perikanan Indonesia. Nilai ekspor komoditi
udang mencapai 1,6 juta US$ pada tahun 2013 (KKP 2014).
Udang merupakan komoditi yang mudah mengalami kerusakan. Udang
memiliki masa simpan yang terbatas dikarenakan adanya pembentukan melanin
atau lebih dikenal sebagai blackspot. Proses ini terjadi secara alami pada saat
postmortem karena adanya polimerisasi komponen fenol menjadi pigmen
berwarna hitam yaitu melanin.
Melanin atau blackspot pada udang tidak berbahaya bagi konsumen, akan
tetapi dapat mempengaruhi penampakan udang. Penampakan merupakan salah
satu atribut yang dinilai konsumen di dalam memilih bahan pangan. Udang
merupakan komoditas utama ekspor perikanan Indonesia sehingga dengan adanya
blackspot dapat menurunkan penerimaan konsumen serta nilai pasar sehingga
dapat menurunkan devisa negara dan menyebabkan kerugian secara ekonomi.
Pembentukan melanin atau lebih dikenal dengan blackspot disebabkan oleh
adanya enzim polyphenoloxidase. Polyphenoloxidase disebut juga phenoloxidase
atau tirosinase (EC.1.14.18.1) yang mengkatalisis hidroksilasi monohidroksifenol
(aktivitas monofenolase atau kresolase) dan mengoksidasi o-dihidroksifenol
menjadi o-kuinon (aktivitas katekoloksidase dan difenolase). O-kuinon akan
bereaksi secara nonenzimatik dengan keberadaan oksigen sehingga membentuk
melanin (Kim et al. 2000). Intensitas pembentukan melanin pada berbagai
krustasea bervariasi diantara spesies tergantung kepada konsentrasi substrat alami
dan konsentrasi enzim di dalam tubuh udang (Benjakul et al. 2005).
Enzim polyphenoloxidase (PPO) disintesis dari ProPPO yang merupakan
bentuk tidak aktif (zimogen) dari PPO. ProPPO dapat diakifkan menjadi PPO oleh
enzim-enzim protease. Cardenas (1997) menyatakan bahwa ProPO dari Red
swamp crayfish dapat diaktivasi oleh tripsin, zymosan A serta lipopolisakarida
yang terdapat pada membran luar bakteri gram negatif. Fan et al. (2009)
menyatakan bahwa ProPO pada kepiting Charybdis japonica dapat diaktivasi oleh
serin protease, tripsin serta β-1,3 glukan. Sistem ini memainkan peranan penting di
dalam sistem pertahanan diri, pengerasan kutikula dan proses penyembuhan luka
pada krustasea (Sugumaran dan Nellaiappan 2000).
Berbagai penelitian telah berhasil dilakukan untuk mengisolasi,
mengkarakterisasi dan memurnikan enzim PPO pada berbagai krustasea. Enzim
PPO telah berhasil diteliti pada Penaeus japonicus, Artemia sinica, Penaeus
vannamei, karapas dan jeroan Norway lobster (Nephrops norvegicus),
Parapenaeus longirostris, serta Penaeus monodon (Benjakul et al. 2005; Fan
et al. 2011; Garcia-Carreno et al. 2008; Gimenez et al. 2010; Zamorano et al.

2

2009; Nurhayati et al. 2015). Enzim PPO dari berbagai krustasea menunjukkan
adanya perbedaan karakteristik bobot molekul, pH optimum, suhu optimum serta
parameter kinetik. Enzim PPO yang berasal dari spesies yang sama akan tetapi
lokasi yang berbeda menunjukkan perbedaan karakteristik.
Udang vaname merupakan komoditas yang menjadi andalan ekspor
perikanan Indonesia. Studi tentang enzim PPO penyebab blackspot pada udang
vaname yang berasal dari Perairan Indonesia belum pernah dilakukan. Isolasi,
karakterisasi, dan pemurnian enzim PPO dari udang vaname sangat penting
dilakukan untuk menentukan formula atau cara yang tepat di dalam mengontrol
proses pembentukan blackspot udang vaname. Informasi mengenai enzim PPO
diharapkan dapat menjadi acuan kedepannya di dalam mengontrol kerja enzim
PPO.
Beberapa penelitian telah dilakukan dalam mengkaji manfaat dan aplikasi
enzim PPO. Svitel dan Miertus (1998) menyatakan bahwa enzim PPO dapat
digunakan sebagai biosensor dalam mengontrol proses bioremediasi komponen
fenol yang berasal dari limbah pengolahan minyak dan pengolahan kulit. Yu et al.
(2003) menyatakan bahwa biosensor yang digunakan untuk mendeteksi komponen
fenol memiliki beberapa kelebihan diantaranya memiliki sensitivitas yang baik,
biaya murah, cara kerjanya otomatis dan bisa diaplikasikan di lapangan. Van et al.
(2011) menyatakan bahwa enzim PPO dapat digunakan untuk mencegah lipolisis
atau degradasi lemak saat pencernaan makanan di dalam rumen sapi sehingga
dapat meningkatkan kandungan PUFA pada daging dan susu sapi. Lee et al.
(2004) menyatakan bahwa PPO dapat menurunkan laju degradasi lemak ketika
diuji secara in vitro. Zhao et al. (2007) menyatakan bahwa PO dapat menghasilkan
DHI (5.6-dihidroxyindole) yang berfungsi sebagai antibakteri dan antifungi. Zhao
et al. (2011) menyatakan bahwa enzim PO dapat menghasilkan komponen DHI
yang memiliki spektrum luas sebagai anti virus, anti parasit, dan bersifat
sitotoksik.
Rumusan Masalah
Udang merupakan komoditas primadona ekspor hasil perikanan Indonesia
yang mudah mengalami kerusakan diantaranya pembentukan blackspot. Proses
pembentukan blackspot pada udang terjadi secara alami pada saat penanganan dan
penyimpanan postmortem. Blackspot merupakan reaksi biokimia yang terjadi
karena adanya polimerisasi komponen fenol menjadi melanin oleh enzim
polyphenoloxidase. Pembentukan blackspot pada udang tidak berbahaya bagi
konsumen akan tetapi dapat menurunkan penerimaan konsumen sehingga
menimbulkan kerugian secara ekonomi. Blackspot pada udang dapat terbentuk
ketika ada substrat, enzim serta kondisi lingkungan yang mendukung. Isolasi,
karakterisasi dan pemurnian enzim polyohenoloxidase dari udang vaname
Indonesia diperlukan untuk mengenal dan memahami cara kerja enzim tersebut
sehingga didapatkan formula atau cara alami yang tepat di dalam memperlambat
proses pembentukan blackspot sehingga dapat memperpanjang masa simpan
udang.

3

Tujuan
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengisolasi,
mengkarakterisasi dan memurnikan enzim polyphenoloxidase dari udang vaname
Indonesia.

4

2 METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni 2014 hingga Mei 2015 di
Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium
Bioteknologi Hasil Perairan II, Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan,
Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Laboratorium Terpadu Fakultas Perikanan
dan Ilmu Kelautan serta Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan,
Laboratorium Mirobiologi dan Biokimia Hewan Pusat Penelitian Sumberdaya
Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan baku utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah udang
vaname yang diperoleh dari Everfresh Market, Pejompongan, Jakarta Pusat size
55-65. Bahan-bahan lainnya meliputi air deionisasi (Mili Q Water), NaHPO4.2H2O
(Merck, Germany), NaH2PO4.4H2O (Merck, Germany), tris base (Merck,
Germany), CH3COOH (Merck, Germany), NaCH3COO (Merck, Germany), HCl,
NaOH, L-DOPA (Sigma, USA), ammonium sulfat (teknis), kantong dialisis
dengan ukuran cut off 12 kDa (Sigma, USA), asam fosfat (Merck, Germany),
Bovin Serum Albumin (Sigma, USA), Sephadex G-25, SDS (Merck, Germany),
glisin (Merck, Germany), gliserol (Merck, Germany), ammonium persulfat
(Sigma, USA), β-merkaptoetanol (Merck, Germany), coomasie brilliant blue
(Merck, Germany), metanol (Merck, Germany), spectra multicolor broad range
protein (Thermo Scientific, Finland), asam asetat glasial (Merck, Germany), dan
bromphenol blue (Merck, Germany). Alat-alat yang digunakan dalam penelitian
ini meliputi sentrifuse (J2-21 BECKMAN, Germany), spektrofotometer (Spectro
UV-VIS 2500, Germany), pipet mikro (Thermo Scientific Vantaa, Finland), pH
meter (Thermo Electron, Finland), kolom kromatografi, serta alat elektroforesis
(TV-100 YK, SCIE-PLAS, England).
Prosedur Kerja
Penelitian ini dilakukan meliputi tahap ekstraksi, karakterisasi dan
pemurnian enzim PPO dari udang vaname. Karakterisasi enzim PPO yang
dilakukan meliputi penentuan suhu optimum, pH optimum, konsentrasi substrat
optimum, kinetika enzim, pengaruh inhibitor dan ion logam, serta penentuan bobot
molekul enzim. Tahapan pemurnian yang dilakukan meliputi pemekatan
ammonium sulfat, dialisis dan kolom kromatografi. Pemekatan ammonium sulfat
dilakukan dengan variasi tingkat kejenuhan ammonium sulfat yang berbeda.
Tingkat kejenuhan ammonium sulfat yang digunakan yaitu 30% hingga 80%.
Proses dialisis dilakukan menggunakan kantong dialisis ukuran cut off 12 kDa
dengan variasi waktu dialisis 4, 8, dan 12 jam. Pemurnian enzim PPO dari udang
vaname dilakukan menggunakan kolom kromatografi filtrasi gel menggunakan
matriks Sephadex-G150. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.

5

Udang segar
(size 55-65)

Preparasi (pengambilan karapas)

(pengambilan karaps)
Ekstraksi (bufer fosfat 1:3)

Enzim PPO

Karakterisasi:
 aktivitas enzim (Nirmal dan Benjakul 2009)
 kadar protein (Bradford 1976)
 suhu optimum (Cong et al. 2005)
 pH optimum (Cong et al. 2005)
 substrat optimum (Cong et al. 2005)
 kinetika enzim (Cong et al. 2005)
 Pengaruh ion logam (Cong et al. 2005)
 SDS-PAGE (Laemmli 1970)
 zimogram (Nirmal dan Benjakul 2012)

Pengendapan ammonium sulfat
(30%-80%)

Enzim PPO

Dialisis (cut off 12 kDa)

Enzim PPO

Kolom kromatografi
(filtrasi gel
Sephadex-G150)

Enzim PPO

Karakterisasi:
 aktivitas enzim (Nirmal dan Benjakul 2009)
 kadar protein (Bradford 1976)
 SDS-PAGE (Laemmli 1970)

Karakterisasi:
 aktivitas enzim (Nirmal dan Benjakul 2009)
 kadar protein (Bradford 1976)
 SDS-PAGE (Laemmli 1970)


Karakterisasi:
 aktivitas enzim (Nirmal dan Benjakul 2009)
 kadar protein (Bradford 1976)
 SDS-PAGE (Laemmli 1970)


Gambar 1 Diagram alir penelitian

Ekstraksi enzim PPO (Simpson et al. 1987)
Karapas udang dihaluskan menjadi bubuk. Sampel dicampur dengan bufer
fosfat 0,05 M pH 7,2 (mengandung 1 M NaCl dan 0,2% Brij 35) dengan
perbandingan 1:3. Campuran diaduk secara kontinu pada suhu 4 ºC selama
30 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8.000xg pada suhu 4 ºC
selama 30 menit menggunakan sentrifuse dingin.
Karakterisasi enzim
Penentuan suhu optimum (Cong et al. 2005)
Penentuan suhu optimum dilakukan dengan melakukan variasi suhu
inkubasi. Ekstrak kasar PPO sebanyak 200 µL ditambahkan dengan 1,2 mL

6

L-DOPA 12,5 mM yang dilarutkan dalam air deionisasi, 800 µL bufer fosfat
0,05 M pH 6 dan 200 µL air deionisasi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu
25, 30, 35, 40, dan 45 ºC selama 3 menit. Campuran yang telah diinkubasi diukur
pada panjang gelombang 475 nm.
Penentuan pH optimum (Cong et al. 2005)
Penentuan pH optimum dilakukan dengan melakukan variasi pH bufer yang
digunakan. Ekstrak kasar PPO sebanyak 200 µL dicampurkan dengan 1,2 mL
L-DOPA 12,5 mM yang dilarutkan dalam air deionisasi, 800 µL bufer asetat
0,05 M pH 5,5 serta bufer fosfat 0,05 M pH 6; 6,5; 7; 7,5 dan terakhir
ditambahkan 200 µL air deionisasi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu
optimum yang telah diperoleh sebelumnya selama 3 menit dan diukur pada
panjang gelombang 475 nm.
Penentuan substrat optimum dan kinetika enzim (Cong et al. 2005)
Campuran yang terdiri dari enzim, buffer, air deionisasi serta L-DOPA
pada konsentrasi 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15 mM diinkubasi pada suhu optimum
selama 3 menit. Campuran tersebut diukur pada panjang gelombang 475 nm.
Parameter kinetik yang meliputi Km dan Vmaks ditentukan menggunakan plot
Lineweaver-Burk.
Pengaruh ion logam dan inhibitor terhadap aktivitas enzim (Cong et al.2005)
Ekstrak kasar PPO sebanyak 200 µL dicampurkan dengan masing-masing
200 µL sodium sulfit, Na+, Zn2+, Fe3+ serta ethylene diamine tetra acetic acid
(EDTA) yang dilarutkan dalam bufer Tris-HCl 20 mM pH 7,1 untuk memperoleh
konsentrasi 1 dan 5 mM. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 20
menit. Sebanyak 1,2 mL L-DOPA 12,5 M yang dilarutkan dalam air deionisasi
ditambahkan ke dalam campuran. Campuran reaksi diinkubasi selama 3 menit
pada suhu optimum yang telah diperoleh sebelumnya. Sampel kemudian diukur
pada panjang gelombang 475 nm.
Pemurnian Enzim
Pengendapan dengan ammonium sulfat dan dialisis (Benjakul et al. 2005)
Ammonium sulfat ditambahkan ke dalam ekstrak kasar enzim dengan
variasi tingkat kejenuhan 30% hingga 80% kemudian didiamkan pada suhu 4 ºC
selama satu malam. Larutan yang telah diendapkan selama satu malam
disentrifugasi dengan kecepatan 12.500xg suhu 4 ºC selama 30 menit. Pelet yang
diperoleh dilarutkan dengan bufer sodium fosfat 0,05 M pH 7, lalu didialisis.
Ukuran kantong dialisis yang digunakan adalah 12 kDa. Volume bufer yang
berada diluar kantong dialisis adalah 100 kali volume di dalam kantong dialisis.
Waktu dialisis divariasikan yaitu selama 4, 8 dan 12 jam. Hasil pengendapan
ammonium sulfat dan dialisis terbaik ditentukan berdasarkan aktivitas spesifik
enzim tertinggi.
Pemurnian kolom kromatografi (Cong et al. 2005)
Enzim PPO hasil dialisis dimurnikan lebih lanjut menggunakan kolom
kromatografi filtrasi gel. Matriks yang digunakan adalah Sephadex-G150 dan
dielusi menggunakan bufer sodium fosfat 0,05 M pH 7. Setiap fraksi enzim

7

ditampung sebanyak 3 mL. Aktivitas fraksi enzim diukur menggunakan L-DOPA
12,5 mM dan fraksi yang memiliki aktivitas tertinggi dikumpulkan. Proses
pemurnian menggunakan kolom kromatografi filtrasi gel berlangsung pada suhu
4 ºC.
SDS-PAGE (Laemmli 1970) dan Zimogram (Nirmal dan Benjakul 2012)
Metode SDS-PAGE yang dikerjakan dalam penelitian ini menggunakan
3% stacking gel dan 12,5% separating gel. Konsentrasi akrilamid yang digunakan
adalah 30%. Pewarnaan yang dilakukan adalah pewarnaan coomasie brilliant blue.
Ekstrak kasar PPO, hasil pengendapan ammonium sulfat, hasil dialisis, dan PPO
murni hasil kromatografi kolom masing-masing dicampurkan dengan bufer sampel
1:1 (v/v). Sampel sebanyak 5 µL dimasukkan ke dalam gel poliakrilamid.
Elektroforesis dijalankan secara konstan pada arus 15 mA dan voltase 150 volt
menggunakan Mini Protein (SCIE PLAST) selama 3 jam. Deteksi SDS-PAGE
dilakukan dengan melepaskan gel hasil elektroforesis dari cetakan dan diukur jarak
migrasi bromphenol blue. Pewarnaan gel dilakukan menggunakan 0,125%
Coomasie brilliant blue. Proses destaining menggunakan 25% methanol dan 10%
asam asetat. Zona enzim akan membentuk pita berwarna biru.
Pengujian zimogram dilakukan dengan cara merendam gel poliakrilamid
dalam larutan bufer fosfat yang mengandung 12,5 mM L-DOPA selama 25 menit
pada suhu ruang. Zona enzim akan membentuk pita berwarna gelap. Protein
marker yang digunakan adalah marker multicolor dengan rentang bobot molekul
10 kDa hingga 260 kDa. Protein marker ini digunakan untuk mengestimasi bobot
molekul enzim PPO dari udang vaname.
Analisis
Pengukuran aktivitas enzim PPO (Nirmal dan Benjakul 2009)
Pengukuran aktivitas enzim PPO dilakukan menggunakan substrat
L-DOPA. Ekstrak kasar PPO sebanyak 200 µL ditambahkan 1,2 mL L-DOPA
12,5 mM yang dilarutkan dalam air deionisasi, 800 µL bufer fosfat 0,05 M dan
200 µL air deionisasi. Campuran tersebut diinkubasi selama 3 menit pada suhu
35 ºC. Pembentukan dopakrom diamati secara spektrofotometri pada panjang
gelombang 475 nm.
Pengujian konsentrasi protein (Bradford 1976)
Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford dengan
bovine serum albumin (BSA) sebagai standar. Persiapan pereaksi Bradford
dilakukan dengan cara melarutkan 10 mg coomasie briliant blue G-250 dalam
5 mL etanol 95%, lalu ditambahkan dengan 10 mL asam fosfat 85% (b/v).
Akuades ditambahkan hingga 250 mL jika telah larut sempurna dan disaring
dengan kertas saring Whatman 1 sesaat sebelum digunakan.
Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford. Sebanyak
0,1 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 5 mL
pereaksi Bradford, diinkubasi selama 3 menit dan diukur dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 595 nm. Larutan standar dilakukan sama seperti larutan
sampel. Nilai absorbansi yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam kurva

8

standar Bradford untuk menentukan konsentrasi protein yang terkandung dalam
sampel.
Analisis data
Analisis data dilakukan menggunakan analisis deskriptif. Sampel homogen
dianalisis tiga kali pengulangan. Rata-rata dan standar deviasi setiap analisis
ditentukan menggunakan microsoft excel.

9

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakterisasi Enzim PPO
Sumber enzim PPO yang digunakan pada penelitian ini adalah karapas
udang vaname (Litopenaeus vannamei). Zamorano et al. (2009) menyatakan
bahwa aktivitas PPO tertinggi pada udang Penaeus longirostris terdapat pada
karapas, yang diikuti oleh eksoskeleton bagian abdomen, cephalothorax, pleopods
dan telson. Hal ini juga didukung oleh Montero et al. (2001) yang menyatakan
bahwa aktivitas PPO tertinggi pada udang Penaeus japonicus terdapat pada
karapas yang diikuti oleh bagian kaudal dan otot. Ekstrak kasar PPO yang telah
diisolasi dari bagian karapas kemudian dikarakterisasi. Karakterisasi enzim
meliputi penentuan suhu optimum, pH optimum, konsentrasi substrat optimum,
pengaruh inhibitor dan ion logam terhadap aktivitas enzim, kinetika enzim, serta
bobot molekul.

Aktivitas relatif (%)

Penentuan Suhu Optimum Enzim PPO
Aktivitas ekstrak kasar PPO vaname mencapai optimum pada suhu 35 ºC
(Gambar 2). Aktivitas PPO meningkat seiring dengan meningkatnya suhu sampai
mencapai titik optimum. Hal ini diduga karena bertambahnya energi kinetik enzim
dan substrat sehingga memperbesar peluang enzim dan substrat untuk bereaksi.
Aktivitas PPO menurun drastis setelah melewati suhu optimum. Hal ini diduga
karena peningkatan energi termal molekul yang membentuk struktur protein enzim
menyebabkan rusaknya interaksi nonkovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der
walls, ikatan hidrofobik, dan interaksi hidrofobik) yang menjaga struktur tiga
dimensi enzim mengalami denaturasi. Denaturasi menyebabkan struktur lipatan
protein enzim membuka di bagian permukaannya sehingga sisi aktif enzim
berubah dan menyebabkan terjadinya penurunan aktivitas. Peningkatan suhu yang
berlebih juga menyebabkan perubahan konformasi substrat enzim PPO (L-DOPA).
Suhartono (1989) menyatakan bahwa pada suhu tinggi, substrat mengalami
perubahan konformasi sehingga gugus reaktifnya mengalami hambatan dalam
memasuki sisi aktif enzim.
120
100
80
60
40
20
0
20

25

30

35
(Suhu ᵒC)

40

45

50

Gambar 2 Suhu optimum PPO udang vaname (Litopenaeus vannamei).
Hasil penelitian Benjakul et al. (2005) dan Suhandana et al. (2013)
menunjukkan bahwa PO udang Penaeus japonicus dan black tiger (Penaeus
monodon) aktivitas optimumnya dicapai pada suhu 35 ºC. Zamorano et al. (2009)
menyatakan bahwa PPO dari karapas deep water pink shrimp memiliki kestabilan

10

yang tinggi pada suhu (30-35) ºC. Benjakul et al. (2005) menyatakan bahwa PO
dari cephalothorax udang Penaeus japonicus tidak stabil pada suhu tinggi. Enzim
ini stabil hingga suhu 40 ºC dan kehilangan kestabilannya pada suhu 50 ºC.
Pemanasan pada suhu 60 ºC dapat menghilangkan aktivitas PO udang kuruma
hingga 78%. Pemanasan 70 ºC dan 80 ºC selama 30 menit dapat menghilangkan
aktivitas PO udang Penaeus japonicus.
Suhu optimum berbagai krustasea bervariasi tergantung pada spesies dan
lokasi anatominya. Suhu optimum PPO dari karapas udang vaname Indonesia
lebih rendah dibandingkan dengan PPO dari karapas tiger prawn (Penaeus
japonicus) yang memiliki suhu optimum 40 dan 60 ºC (Montero et al. 2001),
PO dari hemosianin whiteleg shrimp yang memiliki suhu optimum 45 ºC
(Garcia-Carreno et al. 2008), PO dari hemosianin kepiting Charybdis japonica
yang memiliki suhu optimum 40 ºC (Fan et al. 2009), dan PO dari brine shrimp
(Artemia sinica) yang memiliki suhu optimum 50 ºC (Fan et al. 2011). Perbedaan
suhu optimum ini diduga disebabkan oleh perbedaan molekul, spesies, suhu
habitat, musim, dan perbedaan kondisi pertahanan tubuh.

Aktivitas relatif (%)

Penentuan pH Optimum Enzim PPO
Aktivitas ekstrak kasar PPO udang vaname mencapai optimum pada pH 6
(Gambar 3). Aktivitas PPO mengalami penurunan setelah mencapai titik optimum.
Nilai pH akan menentukan konformasi enzim berdasarkan keadaan asam amino
pada sisi aktifnya. Pada pH 6 enzim PPO diduga memiliki konformasi yang paling
sesuai dengan substratnya membentuk kompleks enzim-substrat yang tepat
sehingga dapat menghasilkan produk secara maksimal. Benjakul et al. (2005)
menyatakan bahwa pada suasana ekstrim asam maupun ekstrim basa terjadi
penurunan ikatan elektrostatik yang menyebabkan terjadinya kehilangan aktivitas.
Hasil penelitian menunjukkan terdapat dua puncak aktivitas enzim PPO vaname.
Hal ini diduga karena terdapat dua isoform enzim PPO vaname. Hasil penelitian
Montero et al. (2001) menunjukkan terdapat dua puncak pH optimum enzim PPO
yang diisolasi dari karapas P. japonicus yaitu pH 5 dan pH 8.
120
100
80
60
40
20
0
5

5.5

6

6.5
pH

7

7.5

8

Gambar 3 pH optimum PPO udang vaname (Litopenaeus vannamei).
Nilai pH optimum PPO dari karapas udang vaname lebih rendah
dibandingkan dengan PO cephalothorax udang P. japonicus yang memiliki pH
optimum 6,5 (Benjakul et al. 2005), PO hemosianin whiteleg shrimp memiliki pH
optimum 7,6 (Garcia-Carreno et al. 2008); PPO hemosianin kepiting C. japonica
(Fan et al. 2009), PO dari A. sinica (Fan et al. 2011) serta PPO dari karapas
P. monodon (Suhandana et al. 2013) yang memiliki pH optimum 7; serta lebih

11

tinggi dari PPO karapas deepwater pink shrimp (P. longirostris) yang memiliki pH
optimum 4,5. Benjakul et al. (2005) menyatakan bahwa PO cephalothorax udang
P. japonicus stabil pada kisaran pH 3-10. Perbedaan nilai pH optimum diduga
disebabkan oleh perbedaan spesies, perbedaan kondisi pertahanan tubuh yang
meliputi lingkungan tempat hidup dan invasi patogen.

Aktivitas Relatif (%)

Penentuan Substrat Optimum dan Kinetika Enzim PPO
Penentuan kinetika enzim yang meliputi Km dan Vmaks dilakukan
berdasarkan variasi konsentrasi substrat. Variasi konsentrasi substrat yang
dilakukan pada penelitian ini terdiri dari 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 mM.
Semakin tinggi konsentrasi substrat maka kecepatan enzim semakin meningkat
dan pada saat tertentu akan mencapai keadaan konstan. Berdasarkan hasil
penelitian, enzim PPO yang menggunakan L-DOPA sebagai substrat spesifiknya
mencapai aktivitas maksimum pada saat konsentrasi 12,5 mM (Gambar 4).
110
100
90
80
70
60
50
40
2.5

5
7.5
10
12.5
Konsentrasi Substrat (mM)

15

Gambar 4 Konsentrasi substrat optimum PPO udang vaname
Nilai Km dan Vmaks ditentukan dengan persamaan Lineweaver-Burk dengan
membuat grafik 1/[S] sebagai sumbu x dan 1/V sebagai sumbu y (Gambar 5).
Berdasarkan persamaan garis tersebut diperoleh nilai Km sebesar 2,35 mM dan
Vmaks sebesar 38,46 U/mL. Nilai Km menyatakan tetapan disosiasi kompleks
enzim-substrat. Semakin kecil nilai Km menunjukkan kompleks enzim-substrat
semakin baik sehingga enzim memiliki afinitas yang tinggi terhadap substrat.
0.06
0.05
1/V

0.04
0.03
y = 0.061x + 0.026
R² = 0.981

0.02
0.01
0
0

0.1

0.2

1/S

0.3

0.4

0.5

Gambar 5 Persamaan Lineweaver-Burk untuk menentukan nilai Km dan Vmaks
Zamorano et al. (2009) menyatakan bahwa nilai Km PO dari karapas udang
P. longirostris adalah sebesar 1,85 mM untuk substrat L-DOPA. Fan et al. (2009)
menyatakan bahwa nilai Km PO dari hemosianin kepiting C. japonica untuk

12

substrat L-DOPA adalah sebesar 2,90 mM dan tirosin 7,33 mM. Fan et al. (2011)
menyatakan bahwa nilai Km PO brine shrimp (A. sinica) yaitu sebesar 4,2 mM
untuk substrat L-DOPA dan 10,9 mM untuk katekol. Nirmal dan Benjakul (2012)
menyatakan bahwa nilai Km PO dari cephalothorax L. vannamei yang
dibudidayakan di Thailand untuk substrat L-DOPA adalah sebesar 2,43 mM.
Suhandana et al. (2013) menyatakan nilai Km PPO dari karapas udang black tiger
(P. monodon) untuk substrat L-DOPA adalah sebesar 5,42 mM. Gimenez et al.
(2010) menyatakan bahwa enzim PO dari viscera lobster Norway (N. norvegicus)
memiliki afinitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan PO dari karapas lobster
untuk substrat katekol. Nilai Km PO dari viscera lobster Norway adalah sebesar
5,97 dan karapas sebesar 19,40 mM. Perbedaan nilai Km diduga disebabkan oleh
perbedaan metode penangkapan, penanganan serta kondisi penyimpanan.
Pada golongan insekta, enzim PPO diklasifikasikan menjadi 3 golongan
yaitu golongan laccase (E.C 1.10.3, p-difenol: O2 oksidoreduktase), golongan
catechol oxidase (E.C.1.10.3.1, difenol: O2 oksidoreduktase) dan golongan
tirosinase (E.C.1.14.18.1 monofenol, L-DOPA: O2 oksidoreduktase). PPO
golongan tirosinase dapat mengoksidasi monofenol dan difenol, sedangkan
golongan laccase dan catechol oxidase menunjukkan afinitas yang tinggi terhadap
difenol (Cong et al. 2005).
Pengaruh inhibitor dan ion logam terhadap aktivitas PPO udang vaname
PPO merupakan metaloenzim yang mengandung ion Cu pada sisi aktifnya.
Enzim ini dapat dihambat menggunakan agen-agen pengkelat logam. Pada
penelitian ini, beberapa ion logam termasuk sodium sulfit dan EDTA telah
digunakan untuk menentukan efek penghambatan terhadap PPO udang vaname.
Ion-ion logam yang digunakan pada penelitian ini adalah Na+, Zn2+ serta Fe3+.
Ketiga ion logam tersebut masing-masing mewakili logam dari golongan
monovalen, divalen serta trivalen. Konsentrasi sodium sulfit, EDTA dan ion-ion
logam yang digunakan adalah 1 dan 5 mM. Sodium sulfit, EDTA, Na+, Zn2+ dan
Fe3+ dapat menghambat aktivitas enzim PPO udang vaname. Sodium sulfit pada
konsentrasi 5 mM memiliki efek inhibisi paling tinggi pada enzim PPO udang
vaname (Gambar 6).
70

% Inhibisi

60
50
40
30
20
10
0
Sodium sulfit

EDTA

NaCl
Na+

ZnCl2
Zn2+

FeCl3
Fe3+

Gambar 6 Pengaruh inhibitor dan ion logam terhadap aktivitas PPO vaname;
1mM,
5 mM.

13

Sodium sulfit termasuk ke dalam kategori agen pereduksi. Encarnacion
et al. (2012) menyatakan bahwa senyawa sulfit dapat mengontrol melanosis
karena kemampuannya untuk bereaksi dengan intermediet kuinon sehingga
membentuk sulfokuinon serta dapat bereaksi secara ireversibel dengan PPO
menyebabkan inaktivasi enzim. Penggunaan agen-agen pereduksi merupakan cara
yang paling efektif dalam mengontrol browning enzimatik. Penggunaan senyawa
sulfit untuk mengontrol browning enzimatik banyak dilakukan oleh industri, akan
tetapi penggunaan senyawa tersebut dalam bahan pangan dibatasi. Gomez-Guillen
et al. (2005) menyatakan bahwa senyawa sulfit dapat menghasilkan reaksi alergi
pada orang-orang golongan tertentu, khususnya asmatik.
Salah satu inhibitor enzim PPO yang masuk ke dalam kategori GRAS adalah
EDTA. Senyawa tersebut merupakan agen pengkelat yang digunakan pada industri
pangan sebagai pengawet. Prinsip kerja EDTA dalam menghambat aktivitas PPO
adalah dengan cara mengkelat Cu pada sisi aktif enzim sehingga membentuk
kompleks yang stabil dengan Cu. Penggunaan EDTA biasanya dikombinasikan
dengan inhibitor lainnya untuk mengeliminasi terjadinya browning enzimatik.
Kombinasi sodium sulfit dan EDTA 1% biasanya digunakan untuk memperlambat
melanosis dan meningkatkan nilai organoleptik pada udang (Kim et al. 2000).
Garam-garam halida dikenal sebagai inhibitor enzim PPO. NaF merupakan
inhibitor yang sangat potensial untuk menghambat kerja enzim PPO diikuti oleh
NaCl, NaBr, dan NaI. NaCl dan CaCl2 pada konsentrasi 2-4% (b/v) biasa
digunakan pada industri pangan untuk mencegah terjadinya browning enzimatik.
ZnCl2 merupakan inhibitor browning yang efektif ketika dikombinasikan dengan
CaCl2, asam askorbat, dan asam sitrat (Kim et al. 2000). Senyawa FeCl3 dapat
menurunkan aktivitas enzim PPO vaname. Hal ini diduga ion Fe3+ berikatan
dengan sisi aktif enzim sehingga menyebabkan penghambatan terhadap aktivitas
enzim PPO.

Tahap Pemurnian Enzim PPO udang vaname
Pengendapan dengan ammonium sulfat dan dialisis
Enzim seringkali berikatan erat dengan molekul lain yakni lipida dan
karbohidrat. Penggumpalan protein enzim perlu dilakukan untuk memperoleh
enzim yang lebih murni. Penambahan senyawa yang hanya menggumpalkan
protein dan tidak menggumpalkan bahan lain dengan sendirinya akan memisahkan
dan lebih memurnikan enzim yang dihasilkan. Proses penggumpalan enzim dapat
dilakukan dengan menambahkan pelarut organik dan garam. Penggunaan pelarut
organik memperbesar kemungkinan terjadinya denaturasi terutama pada
temperatur yang agak tinggi. Kerugian lain dalam penggunaan pelarut organik
adalah sifatnya yang mudah terbakar dan harganya mahal. Penggunaan garam
sebagai presipitan telah banyak dilakukan. Penggunaan garam ammonium sulfat
sebagai presipitan memiliki keunggulan yaitu kelarutannya tinggi, harganya murah
dan umumnya tidak mempengaruhi struktur protein. Garam pada suasana ionik
tinggi dapat menarik mantel air dari koloid protein. Interaksi hidrofobik diantara
sesama molekul protein pada suasana ionik tinggi akan menurunkan kelarutan
protein. Peristiwa ini disebut dengan salting out (Suhartono 1989).

14

Hasil pengendapan ekstrak kasar enzim PPO menunjukkan dua bagian
yang terpisah yaitu pelet dan supernatan. Aktivitas spesifik enzim PPO udang
vaname mencapai maksimum pada pengendapan ammonium sulfat 40% yang
berasal dari pelet (Gambar 7). Konsentrasi ammonium sulfat 40% merupakan
konsentrasi yang tepat sehingga dapat memisahkan protein enzim dari komponen
lainnya secara maksimal.
Aktivitas spesifik (U/mg)

30
25
20
15
10
5
0
30%

40%

50%

60%

70%

80%

Tingkat kejenuhan ammonium sulfat

Gambar 7 Aktivitas spesifik enzim PPO hasil pengendapan ammonium sulfat;
pelet, supernatan.
Simpson et al. (1987) menyatakan bahwa PO dari karapas udang Penaeus
setiferus telah berhasil difraksinasi menggunakan ammonium sulfat 0-40%.
Benjakul et al. (2005) menyatakan bahwa PO dari cephalothorax udang
P. japonicus juga telah berhasil diekstraksi dan difraksinasi menggunakan
ammonium sulfat 0-40%. Nirmal dan Benjakul (2012) menyatakan bahwa PPO
dari cephalothorax udang putih Pasifik telah berhasil diendapkan menggunakan
ammonium sulfat 40%. Hasil penelitian ini berbeda dengan hasil penelitian
Zamorano et al. (2009) dan Nurhayati et al. (2015) yang menyatakan bahwa
aktivitas terbaik PPO dari deepwater pink shrimp diperoleh melalui pengendapan
ammonium sulfat 40-70% dan aktivitas terbaik PPO udang P. monodon diperoleh
melalui pengendapan ammonium sulfat 70%.
Tahapan pemurnian enzim PPO dilanjutkan dengan proses dialisis. Dialisis
dilakukan dengan tujuan untuk menghilangkan kelebihan garam yang terdapat di
dalam protein enzim setelah pemekatan menggunakan ammonium sulfat. Aktivitas
spesifik tertinggi PPO udang vaname diperoleh dengan lama waktu dialisis selama
8 jam (Gambar 8). Waktu dialisis 8 jam merupakan waktu terbaik untuk
menghilangkan kelebihan garam pada protein enzim setelah pengendapan
menggunakan ammonium sulfat. Waktu dialisis lebih dari 8 jam menyebabkan
terjadinya penurunan aktivitas. Montero et al. (2001) menggunakan waktu dialisis
selama 8 jam untuk pemurnian PO dari udang P. japonicus. Hasil penelitian
Benjakul et al. (2005), Nirmal dan Benjakul (2012), serta Nurhayati et al. (2015)
menyatakan bahwa PPO dari cephalothorax udang P. japonicus dan L. vannamei
yang dibudidayakan di Thailand didialisis selama 12 jam dan PPO dari udang
P. monodon didialisis selama 4 jam.

15

Aktivitas spesifik (U/mg)

16
14
12
10
8
6
4
2
0
4 jam

8 jam

12 jam

Lama waktu dialisis

Gambar 8 Aktivitas spesifik enzim PPO udang vaname hasil dialisis
Pemurnian PPO menggunakan Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom dapat didefinisikan sebagai sistem pengaliran suatu
fluida melalui kolom yang mengandung matriks bahan pengisi dan substansi yang
ingin dipisahkan menjadi beberapa komponen dengan adanya perbedaan daya ikat
terhadap matriks bahan pengisi. Kolom yang digunakan dapat diisi dengan partikel
bahan pengisi yang daya kerjanya digolongkan ke dalam jenis absorpsi, pertukaran
ion, filtrasi gel, dan interaksi biokimia. Pemurnian enzim menggunakan
kromatografi kolom merupakan cara yang paling efektif dibandingkan dengan
semua cara pemisahan yang lainnya (Suhartono 1989).
Jenis kromatografi yang digunakan dalam pemurnian enzim PPO udang
vaname adalah filtrasi gel dengan matriks bahan pengisinya Sephadex-G150.
Wilson dan Walker (2010) menyatakan bahwa kromatografi filtrasi gel merupakan
pemisahan molekul melalui suatu materi berpori. Molekul yang memiliki
perbedaan ukuran akan dilewatkan dalam suatu matriks berpori. Pori-pori pada
permukaan gel ini cukup kecil sehingga mencegah molekul-molekul besar masuk
kedalamnya, tetapi dapat menampung molekul-molekul yang lebih kecil. Molekul
yang memiliki ukuran besar akan terelusi lebih dulu dibandingkan dengan molekul
yang berukuran kecil. Molekul yang memiliki ukuran kecil akan terelusi lebih
lambat dibandingkan dengan molekul yang berukuran besar. Fitrasi gel digunakan
untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul tinggi dari protein atau
molekul lain dengan berat molekul yang rendah.
Enzim PPO yang diektrak dari karapas vaname setelah melalui tahap
dialisis kemudian dimurnikan menggunakan kromatografi filtrasi gel. Fraksi PPO
hasil pemurnian menggunakan kromatografi filtrasi gel disajikan pada Gambar 9.
Hasil pemurnian enzim PPO menunjukkan bahwa terdapat tiga fraksi aktif yaitu
fraksi 2,3 dan 4. Puncak aktivitas enzim PPO tertinggi terdapat pada fraksi 3
dengan aktivitas 29,5 U/mL. Fraksi 3 mempunyai konsentrasi protein 1,59 mg/mL.
Hasil penelitian Nurhayati et al. (2015) menunjukkan bahwa terdapat lima fraksi
aktif enzim PPO P. monodon yang dimurnikan dengan kromatografi filtrasi gel
yaitu fraksi 5 hingga 9 dan puncak aktivitas tertinggi terdapat pada fraksi 6.

Aktivitas Enzim (U/ml)

35

1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

30
25
20
15
10
5
0

Konsentrasi Protein (mg/ml)

16

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223242526
Fraksi Enzim

Gambar 9 Fraksi enzim PPO hasil pemurnian kromatografi filtrasi gel.
aktivitas enzim, konsentrasi protein enzim.
Kelipatan pemurnian enzim
Enzim PPO vaname hasil pemurnian menggunakan kromatografi kolom
filtrasi gel mengalami peningkatan aktivitas spesifik dibandingkan dengan ekstrak
kasar, akan tetapi peningkatan aktivitas spesifik yang dihasilkan belum optimal.
Aktivitas spesifik PPO vaname mengalami penurunan pada saat tahapan dialisis.
Data setiap tahapan pemurnian enzim PPO vaname dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Pemurnian PPO vaname menggunakan kromatografi filtrasi gel
Tahapan

Volume
(mL)

Aktivitas
(U/mL)

Konsentrasi
protein
(mg/mL)

Aktivitas
spesifik
(U/mg)

Total
Protein
(mg)

Total
aktivitas
(U)

Yield
(%)

Kelipatan
pemurnian

Ekstrak kasar

180

19,00

2,20

8,64

396,00

3.420,00

100,00

1,00

Presipitasi

15

52,67

1,92

27,43

28,80

790,05

23,10

3,18

Dialisis

8

23,67

1,61

14,70

12,88

189,36

5,54

1,70

Filtrasi gel

3

29,50

1,59

18,55

4,77

88,50

2,59

2,15

Kelipatan pemurnian enzim PPO vaname mengalami peningkatan setelah
proses presipitasi menggunakan ammonium sulfat. Simpson et al. (1987)
menyatakan bahwa PO dari karapas udang P. setiferus telah berhasil difraksinasi
menggunakan ammonium sulfat 0-40% dengan tingkat kelipatan pemurnian
sebesar 2,4. Nirmal dan Benjakul (2012) menyatakan bahwa PPO dari
cephalothorax udang putih Pasifik telah berhasil diendapkan menggunakan
ammonium sulfat 40% dengan tingkat kelipatan pemurnian sebesar 2,7. Hasil
pengujian menunjukkan bahwa tingkat kelipatan pemurnian PPO udang vaname
menunjukkan nilai paling tinggi dibandingkan dengan spesies lainnya.
Kelipatan pemurnian enzim PPO mengalami penurunan setelah proses
dialisis yaitu dari 3,18 menjadi 1,70. Montero et al. (2001) menyatakan bahwa
dialisis menyebabkan terjadinya penurunan aktivitas enzim karena paling sedikit
waktu yang digunakan untuk proses dialisis adalah 8 jam. Penggunaan kolom
untuk proses desalting lebih baik dibandingkan dengan dialisis karena dapat

17

mengeluarkan kelebihan garam dalam waktu yang relatif lebih cepat yaitu 5-10
menit.
Kelipatan pemurnian enzim PPO udang vaname mengalami peningkatan
menjadi 2,15 setelah dimurnikan lebih lanjut menggunakan kromatografi filtrasi
gel. Simpson et al. (1987) menunjukkan kelipatan pemurnian PO dari udang
P. setiferus yaitu 65,6 setelah dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas.
Hasil penelitian Fan et al. (2011) menunjukkan bahwa PO dari A. sinica
dimurnikan menggunakan kromatografi pertukaran ion Q Sepharose FF dan
filtrasi gel Superdex 200, kelipatan pemurniannya meningkat dari 18,73 menjadi
53,87. Nirmal dan Benjakul (2012) menunjukkan kelipatan pemurnian PPO dari
cephalothorax udang putih Pasifik setelah dimurnikan menggunakan kromatografi
pertukaran ion DEAE-Sephacel yaitu 83,8.
Kelipatan pemurnian PPO vaname paling rendah dibandingkan dengan
spesies lainnya. Hal ini diduga proses pemurnian enzim hanya menggunakan
kromatografi filtrasi gel saja sehingga belum optimal. Selain itu, tahapan
pemurnian dialisis diduga ikut mempengaruhi nilai kelipatan pemurnian PPO
vaname.
Fraksi aktif PPO
SDS-polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) merupakan metode
kualitatif yang umum digunakan untuk pemisahan protein. Metode ini biasanya
digunakan untuk mengestimasi bobot molekul protein disamping untuk memonitor
pemurnian protein. Sampel yang dianalisis menggunakan SDS-PAGE didenaturasi
terlebih dahulu dalam larutan bufer sampel yang mengandung β-merkaptoetanol
dan SDS. Merkaptoetanol berfungsi mereduksi jembatan disulfida yang terdapat
pada struktur tersier protein. SDS merupakan deterjen anionik yang berfungsi
untuk mendenaturasi dan menegatifkan muatan protein (Wilson dan Walker 2010).
Penentuan bobot molekul dilakukan pada ekstrak kasar, enzim hasil
pengendapan ammonium sulfat, hasil dialisis dan fraksi aktif hasil kromatografi
kolom filtrasi gel. Hasil pengujian SDS PAGE (Gambar 10A) menunjukkan
bahwa enzim PPO masih memiliki banyak pita protein, yang berarti masih terdapat
banyak molekul protein yang berasal dari sel maupun protein pengotor lainnya.
Pengendapan enzim dengan ammonium sulfat, dialisis maupun pemurnian
menggunakan kromatografi kolom filtrasi gel tidak dapat menghilangkan protein
pengotor. Hal ini ditandai dengan jumlah pita protein pada setiap tahap pemurnian
tidak mengalami pengurangan. Hal ini menunjukkan bahwa proses pengendapan,
dialisis maupun kromatografi kolom belum menghasilkan enzim PPO murni.
Tingkat kemurnian enzim PPO yang rendah diduga disebabkan oleh fractionation
range matriks Sephadex-G150 yang terlalu besar sehingga pemisahan protein
enzim dan protein pengotor lainnya kurang sempurna. Wilson dan Walker (2010)
menyatakan bahwa matriks yang memiliki fractionation range lebih pendek dapat
meningkatkan ketepatan pemurnian.
Zimogram merupakan metode elektroforesis yang hampir sama dengan
SDS-PAGE. Perbedaan antara SDS-PAGE dan zimogram adalah protein sampel
pada zimogram tidak didenaturasi terlebih dahulu. Bufer sampel pada teknik
zimogram tidak mengandung β-merkaptoetanol dan SDS. Teknik zimogram ini
dapat mendeteksi protein yang masih memiliki aktivitas katalitik. Hasil pengujian

18

zimogram menunjukkan terdapat dua sub unit enzim PPO vaname yang memiliki
bobot molekul sebesar 302,5 kDa dan 337,5 kDa (Gambar 10B).
260 kDa
140 kDa
95 kDa
72 kDa
52 kDa
42 kDa
34 kDa
26 kDa

17 kDa

10 kDa

M

EK

P

D

F3

EK

M

A
B
Gambar 10 (A) SDS-PAGE PPO vaname; (B) Zimogram PPO vaname;
M: marker, EK: ekstrak kasar, P: pengendapan (NH4)2SO4,
D: dialisis, F3: fraksi 3
Bobot molekul enzim PPO berbeda antar spesies. Hasil penelitian Benjakul
et al. (2005) menunjukkan bahwa enzim PPO dari cephalothorax udang
P. japonicus yaitu 160 kDa. Simpson et al. (1987) menunjukkan bobot molekul
enzim PO udang P. setiferus yaitu 30 kDa. Zamorano et al. (2009) menunjukkan
bahwa terdapat 2 sub unit PPO udang P. longirostris yang memiliki bobot molekul
yaitu 200 kDa dan 5