Carnation Mottle Virus Pada Tanaman Anyelir Di Indonesia Etiologi, Ekspresi Gen Protein Selubung, Dan Eliminasinya

Carnation mottle virus PADA TANAMAN ANYELIR DI
INDONESIA: ETIOLOGI, EKSPRESI GEN PROTEIN
SELUBUNG, DAN ELIMINASINYA

ERNIAWATI DININGSIH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Carnation mottle
virus pada Tanaman Anyelir di Indonesia: Etiologi, Ekspresi Gen Protein
Selubung, dan Eliminasinya adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2016
Erniawati Diningsih
NIM A362110051

RINGKASAN
ERNIAWATI DININGSIH. Carnation mottle virus pada Tanaman Anyelir di
Indonesia: Etiologi, Ekspresi Gen Protein Selubung, dan Eliminasinya. Dibimbing
oleh GEDE SUASTIKA, TRI ASMIRA DAMAYANTI, dan SLAMET
SUSANTO.
Anyelir (Dianthus caryophillus L) merupakan salah satu tanaman bunga
potong utama dunia karena bunganya cantik dan memiliki berbagai variasi warna
dan bentuk. Di Indonesia, produksi bunga potong anyelir masih jauh dari potensi
genetiknya, sehingga pendapatan petani dari usaha budidaya tanaman hias juga
lebih rendah dari yang seharusnya. Kondisi ini terjadi karena hampir semua
tanaman anyelir sudah terinfeksi virus, namun petani tidak mengetahui hal ini.
Ada lebih dari 15 virus yang dapat menginfeksi anyelir, akan tetapi Carnation
mottle virus (CarMV) dilaporkan merupakan virus utama pada tanaman anyelir.
Di beberapa sentra produksi anyelir di Jawa Barat ditemukan gejala tanaman
anyelir terinfeksi virus berupa belang-belang hijau tua dan muda (mottle). Gejala

ini mirip dengan yang dilaporkan di luar negeri. Penelitian mengenai penyakit
mottle/belang pada tanaman anyelir di Indonesia belum banyak dilakukan.
Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini secara umum bertujuan untuk
mengidentifikasi dan mendapatkan karakter virus penyebab penyakit belang pada
tanaman anyelir di Jawa Barat serta memperoleh metode eliminasi virus untuk
mendukung pengadaan benih anyelir secara berkelanjutan.
Deteksi secara serologi menggunakan metode ELISA menunjukkan bahwa
semua kultivar tanaman anyelir yang diuji (28 kultivar) terinfeksi oleh CarMV
(100%) dan tidak terinfeksi oleh Carnation latent virus (CLV), Carnation
ringspot virus (CRSV), dan Carnation vein mottle virus (CVMV). CarMV
menginfeksi secara tunggal pada sampel tanaman anyelir yang diuji. Reaksi
positif terhadap antiserum CarMV tidak hanya terjadi pada sampel tanaman yang
bergejala saja tetapi juga pada sampel yang tidak bergejala. Partikel virus dari sap
tanaman sakit berbentuk isometrik dengan diameter berukuran 30 nm teramati
melalui pengecatan negatif 2% uranil asetat menggunakan transmission electron
microscopy (TEM).
RT-PCR dengan primer spesifik protein selubung (coat protein/CP) CarMV
berhasil mengamplifikasi sembilan isolat gen CP CarMV dengan ukuran sekitar ±
1000 pb. Kesembilan CarMV asal Jawa Barat memiliki kesamaan runutan
nukleotida berkisar 94.3% sampai 98.1% dan asam amino yang tinggi berkisar

95.5% sampai 99.4% dengan isolat-isolat dari negara lain yang. CarMV isolatisolat Jawa Barat memiliki kesamaan urutan nukleotida tertinggi dengan isolat
CarMV asal China (AF173879) dan Spanyol (AJ309509.1), dan kesamaan asam
amino tertinggi dengan isolat CarMV asal China dan Mexico (KC834739.1).
Diantara sembilan isolat CarMV asal Jawa Barat, isolat CWB (Ciwangun dengan
gejala berat) sudah didaftarkan di GenBank dengan nomor aksesi KP119181
dengan nama isolat Idn-WJ4.
Alignment runutan nukleotida gen CP sembilan isolat CarMV asal Jawa
Barat dengan sepuluh runutan nukleotida gen CP isolat dari negara lain
menunjukkan bahwa pada isolat-isolat dari Jawa Barat terjadi mutasi tititk pada
beberapa posisi nukleotida. Beberapa mutasi titik menyebabkan perubahan pada

asam amino yang disandi dan motif protein yang dihasilkan. Keragaman genetik
gen CP CarMV berkorelasi dengan variasi gejala pada tanaman anyelir terinfeksi.
Analisis pohon filogenetik menunjukkan bahwa CarMV isolat-isolat Jawa Barat
terpisah dalam tiga kelompok besar bersama-sama dengan isolat-isolat lainnya
yang sudah terdaftar di Genbank.
Deteksi virus yang mudah dan cepat, diperlukan untuk memantau sumber
induk anyelir bebas virus. Metode simple direct tube (SDT) dan simple extraction
method (SEM) berhasil mendapatkan RNA total dari tanaman anyelir baik dari
sampel daun maupun batang. Metode ekstraksi RNA total dengan SDT dan SEM

yang digabungkan dengan One step RT-PCR menghasilkan intensitas DNA yang
sebanding dengan kit komersial. RNA total dari daun sebagai sumber templat one
step RT-PCR terbaik dibandingkan batang. Preparasi RNA total dengan metode
SDT dan SEM adalah metode cepat, mudah, dan murah dalam menyediakan
templat one step RT-PCR. Konsentrasi primer 0.4 µM dan MgCl2 2 mM
merupakan konsentrasi optimum untuk menghasilkan hasil amplifikasi terbaik.
Gen CP parsial CarMV berukuran 1020 pb berhasil dikloning ke dalam TA
vektor pTZ57R/T dan di subkloning ke vektor ekspresi pET28a, serta
diekspresikan dalam bakteri E. coli strain BL21(DE3). Ekspektasi gen CP
CarMV dalam vektor ekspresi menghasilkan protein fusi berukuran ± 40.2 kDa.
Hasil analisis SDS PAGE menunjukkan adanya pita protein fusi pada ukuran
±40.2 kDa sebagai ekspresi dari gen CP CarMV rekombinan walaupun dengan
tingkat ekspresi yang belum optimal. Untuk mendapat protein dalam jumlah
melimpah (over expression) perlu dilakukan optimasi terhadap beberapa faktor
yang dapat mempengaruhi ekspresi gen.
CarMV dapat dibebaskan dari jaringan tanaman anyelir terinfeksi
menggunakan antiviral 2-thiouracil dan amantadin. Kultur meristem terminal dari
planlet pada perlakuan 2 thiourasil menghasilkan planlet bebas virus sebesar 0
sampai 57%, sementara perlakuan amantadin menghasilkan 25.0 sampai 54.55%
planlet bebas virus. Diantara perlakuan yang diuji, perlakuan antiviral amantadin

dengan konsentrasi 5 – 30 ppm lebih optimal menghasilkan planlet anyelir bebas
CarMV dan tidak toksik terhadap tanaman. Perlakuan amantadin 5 sampai 20 ppm
mampu menghambat virus lebih tinggi dibandingkan perlakuan 2-thiouracil pada
konsentrasi yang sama. Amantadin 5 sampai 30 ppm menghasilkan tingkat
penghambatan virus sebesar 42.94 – 59.57%, sedangkan 2-thiouracil sebesar -8.18
- 63,03%. Berdasarkan hasil tersebut amantadin lebih efektif diaplikasikan untuk
mendapatkan tanaman anyelir bebas virus dibandingkan 2-thiouracil.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa penyakit belang pada tanaman
anyelir di Jawa Barat disebabkan infeksi CarMV. Keberadaan CarMV dalam
jaringan tanaman anyelir dapat dideteksi secara cepat menggunakan teknik one
step RT-PCR menggunakan templat yang diekstraksi melalui metode SDT dan
SEM. Gen CP CarMV dapat dikloning ke dalam TA vektor dan disubkloning ke
dalam vektor ekspresi serta diekspresikan dalam bakteri ekspresi untuk
menghasilkan antigen yang bermanfaat dalam pembuatan antiserum. CarMV
dalam jaringan tanaman anyelir dapat dibebaskan melalui penggunaan senyawa
antiviral yang dikombinasikan dengan kultur meristem ujung, dan senyawa
antiviral amantadin lebih efektif dibandingkan 2-thiouracil.
Kata kunci: Antiviral, Carmovirus, deteksi cepat, E.coli, pET28a

SUMMARY

ERNIAWATI DININGSIH. Carnation mottle virus on Carnation Plant In
Indonesia: Etiology, Coat Protein Gene Expression, and Its Elimination.
Supervised by GEDE SUASTIKA, TRI ASMIRA DAMAYANTI, and SLAMET
SUSANTO.
Carnation (Dianthus caryophyllus L) is one of the world's major cut flower
plants since the flowers are beautiful and have a wide variety of colors and shapes.
In Indonesia, carnation cut flower production is stil so far from its genetic
potential, therefore the farmer’s from the cultivation of ornamental plants is lower
than it should be. These situation occurs because almost all the carnation plants
had been infected by virus, however the farmers did not know and aware with this
problem. There are more than 15 known viruses that can infect carnation, among
them Carnation mottle virus (CarMV) was reported as a major virus on carnation
plants. In some carnation production centers in West Java were found the mottle
symptoms which were similar to those reported abroad. Thus, the studies aimed to
identify and to characterize the causal virus of mottle disease on carnation plant in
West Java.
Serological detection by ELISA method showed that all the tested carnation
cultivars (28 cultivars) were infected by CarMV (100%) and did not infected by
Carnation latent virus (CLV), Carnation ringspot virus (CRSV), and Carnation
vein mottle virus (CVMV). CarMV singly infects the tested carnation plant

samples. The positive reaction against CarMV antiserum is detected either on
symptomatic or on a asymptomatic samples. Isometric-shaped virus particles from
infected plant with diameter size 30 nm was observed by negative staining using
2% uranyl acetate on transmission electron microscopy (TEM).
RT-PCR using specific primer of CarMV coat protein (CP) gene
successfully amplified nine isolates with a size aproximately 1000 bp. Nine
CarMV isolates from West Java have high sequences similarities level of either
nucleotide (94.3 to 98.1%) or amino acid (95.5 to 99.4%) with corresponding
isolates from other countries. CarMV West Java isolates had the highest
nucleotide sequences similarity with isolates from China CarMV (AF173879) and
Spain (AJ309509.1), and the highest amino acids similarities with CarMV isolate
from China and Mexico (KC834739.1). Among the nine CarMV West Java
isolates, the CWB isolate (Idn-WJ4) had been deposited in the GenBank data base
with accession numbers KP119181.
The nucleotide sequences alignment of nine CP gene isolates of CaMV from
West Java with ten nucleotide sequences of CP gene isolate from other countries
showed that there were several point mutations. Among those point mutations,
caused either amino acid changes or protein motif. Genetic diversity of CarMV
CP genes correlated with the symptom variations of carnation infected plants.
Phylogenetic tree analysis showed that CarMV West Java isolates are separated

into three major groups together with other isolates that have been registered in
Genbank.
A rapid and easy virus detection is needed for monitoring the carnation
mother plants to keep maintaining them virus-free Total RNA extracted by simple
direct tube (SDT) and simple extraction method (SEM) successfully released the

total RNA either from leaf or stem of carnation plants. Total RNA from leaves
showed the best source of one step RT-PCR template in compared with stem.
Total RNA preparation by SDT and SEM method were considerate as a rapid,
easy, and inexpensive method to provide a one step RT-PCR template. Primer
and MgCl2 concentration of 0.4 μM and 2 mM, was optimum concentration to get
best CarMV amplification, respectively.
The partial CarMV CP gene (1020 bp) was successfully cloned into TA
vector pTZ57R/T and subcloned into expression vector pET28a, and expressed in
E. coli strain BL21 (DE3). The expressed CarMV CP gene will produce fusion
protein with sized of ± 40.2 kDa by SDS-PAGE analysis. However, the
expression of the protein is not optimum yet. To obtain over expression protein,
optimizes some factor that may affect gen expression is necessary to conduct in
order to get the abundance protein of CarMV as antigen.
CarMV could be eliminated from infected carnation plant tissues using 2thiouracil and amantadin antiviral. Meristem tip culture taken from 2-thiouracil

treatment planlets produced virus-free plantlets ranged from 0 to 57% while by
amantadine treatment produced 25.0 to 54.55%. Among tested treatments,
antiviral amantadine with concentration at 5-30 ppm is optimum to produce better
CarMV-free plantlets and toxic to the plants. Amantadine treatment from 5 to 20
ppm was able to inhibit the virus higher than 2-thiouracil treatment at the same
concentration. Amantadine 5 to 30 ppm produced levels of viral inhibition ranging
from 42.94 to 59.57%, while the 2-thiouracil ranging from -8.18 - 63.03%. The
amantadine showed better potential than 2-thiouracil as an antiviral agent to get
CarMV free carnation plants.
The results of this study indicated that the disease mottle on carnation plants
in West Java is caused by CarMV infection. The existence of CarMV in carnation
plant tissue could be detected rapidly using the technique one step RT-PCR using
a template that is extracted through the SDT and SEM methods. CarMV CP gene
could be cloned into TA vector and subkloning into the expression vector and
expressed in a bacterial expression to produce antigens useful in the manufacture
of antiserum. CarMV in carnation plant tissue could be eliminated through the use
of antiviral compounds which combined with the meristem tip culture, and
amantadine.antiviral compound is more effective than 2-thiouracil.
Key word: Antiviral, Carmovirus, E.coli, pET28a, rapid detection

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

Carnation mottle virus PADA TANAMAN ANYELIR DI
INDONESIA: ETIOLOGI, EKSPRESI GEN PROTEIN
SELUBUNG, DAN ELIMINASINYA

ERNIAWATI DININGSIH

Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada

Program Studi Fitopatologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji pada Ujian Tertutup: Prof (R) Dr Budi Marwoto, MSi
(Balai Penelitian Tanaman Hias)
Di Ir Giyanto, MSi
(Institut Pertanian Bogor)
Penguji pada Ujian Terbuka: Prof (R) Dr Ir Yusdar Hilman, MS
(Pusat Penelitian dan pengembangan Hortikultura)
Dr Ir Giyanto, MSi
(Institut Pertanian Bogor)

PRAKATA
Segala puji dan syukur dilimpahkan ke hadirat Allah SWT karena atas
berkat rahmat dan karunia-Nya penulisan disertasi ini dapat diselesaikan.
Penelitian ini berjudul Carnation mottle virus pada Tanaman Anyelir di
Indonesia: Etiologi, Ekspresi Gen Protein Selubung, dan Eliminasinya. Penelitian
ini berjalan dalam kurun waktu sekitar 3.8 tahun (September 2012 – Mei 2016).
Terimakasih yang sedalam-dalam nya penulis sampaikan kepada Badan
Litbang Pertanian, Kementerian Pertanian yang telah memberikan kesempatan
dan beasiswa kepada penulis untuk melanjutkan studi S3 di Institut Petanian
Bogor.
Penghargaan dan ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Dr Ir Gede
Suastika, MSc, Dr Ir Tri Asmira Damayanti, MAgr, dan Prof Dr Ir Slamet
Susanto, MAgr selaku komisi pembimbing atas segala bimbingan, kritik, dan
saran yang diberikan kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan
disertasi ini. Ucapan terimakasih penulis sampaikan juga kepada Prof (R) Dr Ir
Budi Marwoto, MSi, Dr Ir Giyanto, MSi dan Prof (R) Dr Ir Yusdar Hilman selaku
penguji luar komisi yang telah memberikan sumbangsih saran dan perbaikan demi
penyempurnaan disertasi ini.
Penghormatan yang setinggi-tingginya penulis haturkan kepada Ayahanda
Edi Junaedi dan Ibunda Wasilah, serta saudara- saudara yang telah memberikan
dukungan material dan spiritual, serta kasih sayang yang sangat mendalam pada
penulis. Terimakasih yang tak terhingga penulis sampaikan kepada Suami tercinta
Saryono dan anak-anakku Annisa Berliana Yodi, M. Lutfi Bagaskara Yodi, dan
M. Faiq Pradipta Yodi atas segala dukungan, kesabaran dan pengertianya selama
penulis melaksanakan studi.
Rasa terimakasih juga penulis sampaikan kepada Prof Dr Ir Sri Hendrastuti
Hidayat selaku Penanggungjawab Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi
Tanaman, IPB yang telah memfasilitasi sarana penelitian. Terimakasih juga
kepada Dr Ir Ifa Manzila, Dr Ir Tripuji, Ir Wakiah Nuryani, Ir Evi Silvia, Laili
Qodriyah, dan EE Saepudin yang telah membantu kelancaran penelitian. Rasa
terimakasih juga penulis sampaikan kepada Kepala Balai Penelitian Tanaman
Hias, Ketua Kelti Hama dan Penyakit Tumbuhan Balai Penelitian Tanaman Hias
serta jajarannya yang telah mendukung terlaksananya penelitian. Terimakasih juga
kepada teman-teman di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi
Tanaman, IPB atas dukungan dan kerjasamanya yang luar biasa, serta kepada
semua teman-teman yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Tidak lupa
juga kepada Bapak Ir Yoyo Sulyo, MSi (alm) yang telah memberikan dukungan
yang sangat besar terhadap penulis demi kemajuan karier penulis. Semoga Allah
mengampuni segala dosa-dosanya. Terimakasih kepada semua pihak yang telah
membantu kelancaran penelitian.
Akhirnya penulis persembahkan karya ilmiah ini kepada Bangsa Indonesia,
semoga bermanfaat bagi perkembangan pertanian Indonesia.
Bogor, Agustus 2016
Erniawati Diningsih

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis
Manfaat Penelitian
Kebaruan dan Keunggulan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
2

TINJAUAN PUSTAKA

3

IDENTIFIKASI, KARAKTERISASI, DAN KERAGAMAN
GENETIK Carnation mottle virus YANG MENGINFEKSI
TANAMAN ANYELIR DI JAWA BARAT
Pendahuluan
Metode
Hasil
Pembahasan
Simpulan

4

5

6

EVALUASI METODE PREPARASI RNA TOTAL PADA
TANAMAN ANYELIR (Dianthus caryophyllus L.) UNTUK
DETEKSI CEPAT Carnation mottle virus
Pendahuluan
Metode
Hasil
Pembahasan
Simpulan
EKSPRESI GEN PROTEIN SELUBUNG CarMV DALAM
BAKTERI Escherichia coli
Pendahuluan
Metode
Hasil
Pembahasan
Simpulan
ELIMINASI Carnation mottle virus MENGGUNAKAN
SENYAWA ANTIVIRAL PADA KULTUR JARINGAN
ANYELIR (Danthus caryophyllus L.)
Pendahuluan
Metode
Hasil
Pembahasan
Simpulan

xii
xiii
xvi
1
3
4
4
4
5
5
8

20
21
25
42
45

49
50
52
57
59

62
63
69
76
78

81
82
85
91
92

DAFTAR ISI (lanjutan)
7 PEMBAHASAN UMUM
8 SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP

93
98
100
107
119

DAFTAR TABEL
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
4.1
4.2
4.3

5.1
6.1
6.2
6.3

Sembilan isolat CarMV asal Jawa Barat
Komposisi reaktan untuk reaksi reverse transcription (RT)
Komposisi reaktan untuk reaksi polymerase chain reaction
(PCR)
Pengelompokkan gejala infeksi virus pada tanaman anyelir di
lapangan
Kategori gejala dan hasil ELISA pada beberapa varietas/kultivar
tanaman anyelir yang digunakan dalam penelitian
Kejadian penyakit empat jenis virus anyelir di lima lokasi
pengambilan sampel di Jawa Barat
Uji kisaran inang CarMV dari salah satu isolat Jawa Barat
(Cipanas)
Homologi beberapa isolat CarMV asal Jawa Barat dan negara
yang berbeda berdasarkan sekuen nukleotida gen CP
Homologi beberapa isolat CarMV asal Jawa Barat dan negara
yang berbeda berdasarkan sekuen asam amino gen CP
Mutasi titik pada sekuen asam amino sembilan isolat gen CP
CarMV dari Jawa Barat terhadap isolat asal Spanyol dan Cina
Komposisi reaktan untuk reaksi one step RT-PCR
Rerata nilai kemurnian dan konsentrasi RNA hasil pengukuran
dengan nano drop
Perbandingan tiga metode ekstraksi RNA total berdasarkan
komposisi bufer, waktu pelaksanaan, tingkat kerumitan, dan
perkiraan biaya bahan tiap sampel
Perancangan primer gen CP CarMV
Pengaruh perlakuan antiviral terhadap daya tahan hidup dan
pertumbuhan planlet, serta persentase planlet bebas virus
Persentase planlet bebas virus pada beberapa konsentrasi
antiviral
Tingkat penghambatan virus (THR) (%) pada perlakuan
beberapa antiviral

23
24
25
27
30
30
31
36
37
39
52
53
56

63
85
89
91

DAFTAR GAMBAR
1.1

2.1

2.2
3.1

3.2

3.3

3.4
3.5

Alur penelitian Carnation mottle virus pada Tanaman Anyelir di
Indonesia: Etiologi, Ekspresi Gen Protein Selubung dan
Eliminasinya
Organisasi genom Carnation mottle virus (sumber: Brunt &
Martelli 2008). ORF: Open reading frame, RdRp: RNA
dependence RNA polymerase, MP: Movement protein
Peta vektor ekspresi pET28a (Novagen)
Pengawetan dan penyimpanan inokulum CarMV. a. Potongan
daun anyelir terinfeksi dalam CaCl2, b. penyimpanan pada suhu 4
o
C.
Peta lokasi (a) dan kondisi pertanaman anyelir (b) di tempat
pengambilan sampel di Jawa Barat. a. Cihideung (Bandung
Barat), b. Pangalengan (Bandung), c. Cipanas (Cianjur), d.
Ciwangun (Bandung Barat), e dan f. Ciputri. (Cianjur)
Gejala infeksi virus pada tanaman anyelir introduksi asal Ciputri
dengan kategori gejala berat (a-f), sedang (g), dan ringan (h). ((a)
kultivar Castelaro, (b,d & e). Candy, (c) Aicardi, (f) Prado Nova,
(g & h) nama kultivar tidak diketahui).
Gejala infeksi virus pada tanaman anyelir asal Cipanas dengan
kategori gejala berat (a & b), sedang (c) dan ringan (d).
Gejala infeksi ganda virus dan cendawan pada pertanaman
anyelir. Daun mengalami klorosis/belang yang disertai dengan

7

12

17
22

26

28

29
29

pengeringan tanaman (tanda panah).

3.6

3.7

3.8

3.9

Tipe gejala CarMV asal Jawa Barat pada beberapa tanaman uji.
a. Ageratum conyzoides, b. Licopersicon esculentum, c. Cucumis
sativus, d. C. quinoa, e. Nicotiana clevelandii, f. Begonia sp, g. C
amarantocolor, dan h. Phalaenopsis sp.
Partikel CarMV isolat Jawa Barat yang terwarnai oleh 2% uranil
asetat pada pengamatan dengan transmission electrone
mikroskope (TEM). Bar = 100 nm
Amplifikasi DNA gen CP CarMV sembilan isolat asal Jawa
Barat (CHB, CHS, CHR, CWB, CWS, CWR, CPtB, CPtS, dan
CPtR). Visualisasi pada gel agarosa 1.0% dalam 1/2x TBE. (M)
penanda DNA 1 kb.
Motif protein CP sembilan isolat CarMV asal Jawa Barat
berdasarkan analisis protein menggunakan Expasy Myhits.
Spain (Spanyol), Belanda, dan Cina digunakan sebagai
pembanding. 1. Protein kinase C (PKC) phosphorilation ( ) 2.

33

34

34

38

Casein kinase II (CK2) phosphorilation ( ), 3. Myristylation ( ), 4.
Icosahedral virus CP ( ) 5. FARP ( ), 6. Carmo coat (
), 7.
Tyrosin kinase phosphorylation ( ), dan 8. ASN glycosylation ( ).

3.10

Pohon filogenetik nukleotida gen CP CarMV isolat-isolat Jawa
Barat terhadap 9 isolat CarMV pada Genbank. Cowpea mottle
virus (CPMoV) digunakan sebagai pembanding di luar grup.
Isolat yang diberi tanda titik ialah isolat-isolat Jawa Barat.

41

DAFTAR GAMBAR (lanjutan)
3.11

4.1

4.2

5.1
5.2

5.3

5.4

5.5

5.6

5.7

Pohon filogenetik asam amino gen CP CarMV isolat-isolat Jawa
Barat terhadap 9 isolat CarMV pada Genbank. Cowpea mottle
virus (CPMoV) digunakan sebagai pembanding di luar grup.
Isolat yang diberi tanda titik ialah isolat-isolat Jawa Barat.
Amplifikasi DNA gen CP CarMV melalui one step RT-PCR pada
konsentrasi akhir primer 0.4 µM (a) dan 0.8 µM (b) dan MgCl 2 2.0
mM menggunakan templat asal daun dan batang yang diekstraksi
dengan metode SDT, SEM, dan kit. M. Penanda DNA 1 kb (Thermo
Scientific), K-. Kontrol negatif, K+. Kontrol positif.
Amplifikasi DNA gen CP CarMV melalui one step RT-PCR pada
konsentrasi akhir primer 0.4 µM, 0.6 µM, 0.8 µM, dan 1.0 µM, serta
konsentrasi MgCl2 2.0 mM (a) dan 1.5 mM (b) menggunakan templat
asal batang yang diekstraksi dengan metode SDT, SEM, dan kit.

Konstruksi gen CP CarMV dalam vektor eskpresi pET28a
Amplifikasi gen CP CarMV dari sampel daun anyelir terinfeksi
CarMV. (M) Penanda DNA 1 kb (Thermo Scientific), (1-5).
cDNA CP isolat Ciputri.
Amplifikasi cDNA gen CP CarMV (lajur 1-5) dari koloni bakteri
transforman dan visualisasi plasmid yang diisolasi dari bakteri
transforman JM107 (lajur 6-10). (M) Penanda DNA I kb
(Thermo Scientific)
Pola pita DNA gen CP CarMV dan vektor pTZ57R/T yang
terpisah melalui proses restriksi menggunakan enzim
endonuklease BamHI dan XhoI. (M) Marker DNA 1 kb (Thermo
Scientific), (Line 1&2) hasil restriksi pada vektor rekombinan
pTZ57R/T-CP 1020 bp dari dua klon yang berbeda.
Urutan dan posisi nukleotida gen CP CarMV 1020 pb hasil
perunutan DNA (cetak merah). Cetak biru menunjukkan posisi
enzim restriksi yang digunakan dalam perancangan primer
Restriksi vektor ekspresi pET28a dengan enzim restriksi BamHI
dan XhoI. (M) Penanda DNA 1 kb, (1) vektor ekspresi pET28a
sebelum dipotong, (2) pET28a setelah dipotong.
Visualisasi hasil restriksi vektor rekombinan pTZ57R/T dengan
enzim restriksi BamHI dan XhoI (a) dan hasil purifikasi gel gen CP

42

54

55

67
69

70

71

72

72

73

CarMV yang telah terpotong (E1 & E2) (b)

5.8
5.9

5.10

Koloni bakteri transforman BL21 (DE3) pada medium LB agar
yang mengandung 25 µg/ml kanamisin
Amplifikasi gen CP CarMV 1020 pb dari bakteri BL21(DE3)
yang ditransformasi dengan vektor rekombinan pET28a-CP
CarMV. (M). Penanda DNA 1 kb, (1-5) lima koloni bakteri
transforman
Ekspektasi Gen CP CarMV 1020 pb (cetak warna hijau) dalam
vektor ekspresi pET28a (cetak tulisan warna hitam). * Star
codon, ** Stop codon, huruf dengan blok abu-abu: 6x His tag.

73
74

75

DAFTAR GAMBAR (lanjutana)
Ekspresi CP CarMV rekombinan dalam bakteri E. coli strain
BL21(DE3) pada suhu 25 oC dengan konsentrasi IPTG 0 mM
(tanpa induksi/un), 0.25 mM (tidak ditampilkan), 0.5 mM (1),
0.75 mM (2), dan 1.0 mM (3) dengan waktu panen 4, 8, dan 12
jam setelah induksi. (M) Penanda protein low range (Bio Rad).
Persiapan eksplan untuk kultur jaringan. (a) Tanaman sumber
eksplan, (b) tunas-tunas pucuk sebagai eksplan, dan (c) 3 - 4 ruas
batang eksplan.

76

6.2

Sterilisasi eksplan. a. Pembersihan eksplan dengan air yang mengalir
(1 jam), b. Perendaman dalam antibiotik (1 mg/ml) (30 menit), c.
Perendaman dalam deterjen (1 mg/ml) (30 menit), d. Perendaman
dalam NaOCl 20% (5 menit), 10% (10 menit), alkohol 96% (10 detik),
e. Pembilasan dengan aquades, dan f. Pengeringan eksplan.

83

6.3

Pertumbuhan planlet anyelir pada umur 2 bulan setelah perlakuan
pada medium MS yang mengandung antiviral 2-thiouracil pada
konsentrasi 5 – 30 ppm. a. 0 ppm, b. Ribavirin 5 ppm
(pembanding), c. 5 ppm, d. 10 ppm, e. 15 ppm, f. 20 ppm, g. 25
ppm, h. 30 ppm
Pertumbuhan planlet anyelir pada umur 2 bulan setelah perlakuan
pada MSZ-amantadin pada konsentrasi 5 - 30 ppm. a. 0 ppm, b. 5
ppm ribavirin (pembanding), c. 5 ppm, d. 10 ppm, e. 15 ppm, f.
20 ppm g. 25 ppm, dan h. 30 ppm

86

6.5

Kultur meristem ujung (± 0.5 mm) planlet anyelir. a. Meristem ujung
(dalam lingkaran) yang masih menyatu dengan bagian planlet lainnya,
b. ± 0.5 mm meristem ujung yang sudah dipotong, c. Meristem ujung
yang tumbuh (5 hari setelah tanam), dan d. Meristem ujung pada 5
minggu setelah tanam.

88

6.6

Rata-rata titer virus pada perlakuan 2-thiouracil (a) dan
amantadin (b) dibandingkan rata-rata titer virus pada kontrol
(tanpa perlakuan)

90

5.11

6.1

6.4

82

87

DAFTAR LAMPIRAN
1

2

3

Alignment nukleotida gen CP sembilan CarMV isolat Jawa Barat
dengan isolat CarMV asal Belanda dan Spanyol. * Sekuen yang
concerv (terpelihara).
Alignment asam amino CP sembilan CarMV isolat Jawa Barat
dengan beberapa isolat CarMV yang terdapat di GenBank. Huruf
yang diberi warna merah atau berada dalam kotak menunjukkan
adanya mutasi pada daerah tersebut.
Grafik hasil pengukuran kuantitas RNA dengan Nanodrop pada
tiga metode ekstraksi RNA total. A. Kit komersial, B. SDT, dan
C. SEM.

108

113

115

DAFTAR LAMPIRAN (lanjutan)
4

5

6

Ekspresi gen CP CarMV rekombinan dalam bakteri E. coli strain
BL21(DE3) pada suhu 30 oC dengan konsentrasi IPTG 0.25 mM
(1), 0.5 mM (2), 0.75 mM (3), 1.0 mM (4), dan 0 mM (uninduce)
(5). (M) marker protein low range (Bio Rad), (B) E coli tanpa
transformasi, (P) pET28a-BL21, (K2 & K3) klon 2 dan 3.(a)
fraksi protein dalam pelet bakteri (insoluble fraction), (b) fraksi
protein terlarut dalam supernatant (soluble fraction).
Ekspresi gen CP CarMV rekombinan dalam bakteri E. coli strain
BL21(DE3) pada suhu 25 oC (atas) dan 37 oC (bawah) dengan
konsentrasi IPTG 0.25 mM (1), 0.5 mM (2), 0.75 mM (3), 1.0
mM (4), dan 0 mM (tidak diinduksi) (un). (M) Penanda protein
low range (Bio Rad), (P) pET28a-BL21(DE3), (B) E coli tanpa
transformasi.
Ekspresi gen CP CarMV rekombinan dalam bakteri E. coli strain
BL21(DE3) pada suhu 25 oC dan 37 oC dengan waktu panen 12
jam setelah induksi dan konsentrasi IPTG 0.25 mM (1), 0.5 mM
(2), 0.75 mM (3), 1.0 mM (4), dan 0 mM (tidak diinduksi) (un).
(M) Penanda protein low range (Bio Rad), (P) pET28a-BL21.

116

117

118

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Anyelir (Dianthus caryophillus L) merupakan salah satu tanaman bunga
potong yang populer di dunia karena bunganya cantik dan memiliki berbagai
variasi warna dan bentuk. Tanaman ini berasal dari kawasan Mediterania dan
sudah tersebar luas di seluruh dunia. Menurut Sing et al. (2005), anyelir termasuk
ke dalam kategori bunga potong utama dunia bersama dengan lima bunga potong
lainnya. Informasi lain menyebutkan bahwa anyelir merupakan tanaman hias
bunga potong terbesar ketiga di dunia setelah mawar dan krisan (Badan Litbang
Pertanian 2011 (http: //pustaka.litbang.deptan.go.id/inovasi/kl11341039). Pusat
produksi anyelir di dunia meliputi Amerika Serikat (New England, Colorado,
California), Argentina, Chili, Colombia, Costa Rica, Republik Dominika,
Ecuador, Meksiko, Peru, Italia, Spanyol, Belanda, Prancis, Israel, India, Iran, dan
Turki (Whealy 1992; Lisa 1995; Singh et al. 2005; Cevik et al. 2010; Safari 2010)
Potensi ekonomi komoditas anyelir di dunia sangat tinggi. Pada tahun 1987
misalnya, sebagai produsen anyelir terbesar di Amerika Latin, Colombia
mengekspor 1.27 milyar batang anyelir ke pasar dunia bernilai 71 juta USD. Pada
tahun yang sama, Jerman sebagai importir anyelir terbesar di Eropa mengimpor 1
milyar anyelir yang bernilai 272 juta USD dari Belanda (Whealy 1992).
Di Indonesia, produksi bunga potong anyelir belum optimal karena
produktivitas dan mutu bunga masih jauh dari potensi genetiknya. Hal ini
menyebabkan pendapatan petani dari usaha budidaya anyelir juga lebih rendah
dari yang seharusnya. Produksi tanaman anyelir di Indonesia pada tahun 2014
menduduki posisi kedelapan di antara dua belas tanaman hias lainnya mencapai
2.962.777 tangkai dari luas panen sebesar 118.018 m2 dan bernilai sekitar 5.9
milyar (BPS 2014). Hal ini antara lain karena insidensi virus yang tidak disadari
oleh petani. Serangan virus pada anyelir menyebabkan gejala belang (mottle)
pada daun (Brunt & Martelli 2008), pertumbuhan tanaman terhambat, bunga
berukuran kecil, pecah warna bunga, dan daun menyempit (Cevik et al. 2010).
Tanaman terinfeksi virus sangat rentan terinfeksi oleh patogen lainnya (Sing et al.
2005).
Anyelir sangat rentan oleh infeksi beberapa virus. Virus-virus yang dapat
menginfeksi anyelir di antaranya adalah Carnation mottle virus (CarMV),
Carnation vein mottle virus (CVMV), Carnation etched ring virus (CERV),
Carnation necrotic fleck virus (CNFV), Carnation latent virus (CLV), dan
Carnation ringspot virus (CRSV) (Lisa 1995). Menurut Sanchez-Navaro et al.
(2007), Carnation italian ringspot virus (CIRV) juga ditemukan menginfeksi
tanaman anyelir. Semua virus-virus tersebut adalah virus dari genom RNA
kecuali CERV yang merupakan virus dari genom DNA.
Anyelir yang terdapat di Indonesia diintroduksi dari Belanda dan Spanyol
(Badan Litbang Pertanian 2011) yang merupakan produsen anyelir terbesar di
Eropa (Whealy 1992). Sekitar 30-35% biaya produksi digunakan untuk pembelian
bibit. Namun, bibit yang masuk ke Indonesia tidak diketahui status kesehatannya
dari infeksi virus. Perbanyakan dan penggunaan tanaman anyelir introduksi

2
sebagai tanaman induk untuk memproduksi stek berikutnya diduga menjadi
penyebab rendahnya kuantitas dan kualitas bunga potong anyelir di Indonesia
karena adanya akumulasi patogen seperti virus dalam jaringan tanaman.
Di Indonesia, CarMV (Tombusviridae; Carmovirus) ditemukan menginfeksi
tanaman anyelir (Sulyo et al. 2003). Di antara semua anggota Carmovirus,
CarMV dan Cowpea mottle virus merupakan patogen penting secara ekonomi
(Raikhy et al. 2006). Menurut Peraturan Menteri Pertanian no. 93 tahun 2011,
CarMV merupakan organisme pengganggu tanaman karantina (OPTK) A1 yang
penyebarannya ke Indonesia harus dicegah karena keberadaannya di Indonesia
belum dilaporkan (www.karantina.deptan. go.id [4 Juni 2013]). Namun, setelah
ada laporan dari hasil penelitian ini, CarMV berubah status menjadi OPTK A2
yang penyebarannya dicegah ke wilayah lain di Indonesia (Kementan 2015).
Penyebaran CarMV perlu diawasi lebih ketat di Indonesia agar tidak
menginfeksi tanaman-tanaman hias penting lainnya, mengingat CarMV
dilaporkan juga menginfeksi anggrek Phalaenopsis di Taiwan dengan gejala
klorosis berbentuk cincin pada daun (Zheng et al. 2011). Hal ini mengindikasikan
bahwa metode deteksi dini yang cepat pada tanaman anyelir sangat penting,
terutama pada tanaman induk yang akan digunakan sebagai sumber perbanyakan
vegetatif. Di samping itu perlu dilakukan analisis kekerabatan dengan virus
sejenis.
Untuk keperluan deteksi massal, diperlukan adanya antiserum. Antiserum
untuk beberapa virus anyelir sudah diproduksi oleh perusahaan luar negeri.
Namun, untuk mendapatkan antiserum tersebut membutuhkan biaya yang besar
dan kadangkala membutuhkan waktu yang lama karena harus diimpor dari luar
negeri. Untuk mengurangi ketergantungan pada produk luar negeri, di Indonesia
sudah dilakukan produksi antiserum secara konvensional melalui purifikasi
partikel virus dari tanaman sakit yang kemudian diinjeksikan ke kelinci. Namun
melalui metode konvensional ini, antiserum yang dihasilkan tidak spesifik
terhadap partikel virus saja tetapi juga terhadap protein tanaman yang terbawa
pada saat purifikasi dan terinjeksikan ke dalam kelinci.
Untuk mengatasi masalah tersebut, produksi antiserum poliklonal dapat
dilakukan melalui teknik kloning dan ekspresi gen selubung protein (coat protein/
(CP) dalam bakteri Escherichia coli. Produksi antiserum melalui kloning dan
ekspresi gen selubung protein virus pada sistem ekspresi telah banyak dilakukan
pada beberapa virus tanaman (Abdelkader et al. 2004; Cerovska et al. 2010,
Soumya et al. 2014). Dengan metode tersebut, antiserum yang dihasilkan lebih
spesifik terhadap virus yang ditargetkan. Dengan demikian, pada penelitian ini
dilakukan kloning dan ekspresi gen CP CarMV pada sistem ekspresi E. coli.
Semua jenis anyelir dilaporkan rentan terhadap infeksi virus (Lisa 1995),
terutama oleh CarMV yang penyebarannya sangat mudah melalui alat-alat
pertanian dan sap tanaman sakit (Brunt & Martelli 2008). Sing et al. (2005)
melaporkan bahwa 93 kultivar anyelir yang dikumpulkan dari beberapa tempat di
India, 90% positif CarMV berdasarkan hasil penapisan menggunakan uji serologi.
CarMV dalam tanaman anyelir menyebar dengan cepat dan menyebabkan
terjadinya epidemi. Penyebaran yang cepat dan terjadinya epidemi di suatu
wilayah disebabkan oleh perbanyakan anyelir yang umumnya dilakukan secara
vegetatif. Jika tanaman induk sudah terinfeksi, maka produksi stek pucuk secara
otomatis membawa virus dan menjadi sumber inokulum di lokasi baru.

3
Penyediaan bibit bebas virus melalui seleksi hampir tidak dapat dilakukan
karena sampai saat ini sulit menemukan individu tanaman yang tidak membawa
virus tanaman, terutama dari infeksi CarMV. Pada penelitian ini dilakukan upaya
membebaskan tanaman anyelir dari CarMV melalui metode eliminasi virus.
Metode eliminasi yang dilakukan ialah dengan terapi kimia (chemotherapy)
menggunakan antiviral 2-thiouracil dan amantadin yang dikombinasikan dengan
kultur ujung meristem (meristem tip culture). Kultur ujung meristem (3 mm)
yang dikombinasikan dengan chemotherapy menggunakan ribavirin (5 mg/l)
selama 5 minggu dapat menghasilkan tanaman anyelir bebas virus (Wang et al.
1990). Penggunaan antiviral ribavirin pada medium kultur jaringan menyebabkan
penggunaan biaya produksi yang cukup besar karena harga ribavirin yang cukup
mahal. Oleh karena itu dalam penelitian ini digunakan senyawa kimia yang
harganya lebih murah, yaitu 2-thiouracil dan amantadin yang keefektifannya
dibandingkan dengan ribavirin.

Perumusan Masalah
Penelitian virus pada tanaman anyelir di Indonesia belum banyak dilakukan
sehingga data dan informasi ilmiah mengenai sifat dan karakter virus yang
menginfeksi tanaman anyelir di Indonesia masih terbatas. Untuk mengatasi
masalah virus pada tanaman anyelir, pengetahuan mengenai bioekologi seperti
sifat dan karakter virus perlu diketahui terlebih dahulu. Di samping itu, belum
banyak juga dilaporkan cara pengendalian virus yang efektif pada tanaman anyelir
di Indonesia. Di dalam industri perbanyakan anyelir, produksi bibit bebas virus
membutuhkan metode deteksi dini yang cepat dan murah. Antiserum adalah
materi yang sangat dibutuhkan dalam upaya penapisan tanaman anyelir bebas
virus melalui metode ELISA sebagai metode alternatif dari RT-PCR. Pertanyaan
pertanyaan yang harus dijawab dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Virus-virus apa sajakah yang menginfeksi pada tanaman anyelir di Indonesia,
khususnya di Jawa Barat sebagai salah satu sentra produksi tanaman anyelir
yang terbesar di Indonesia
2. Apakah CarMV mendominasi infeksi pada pertanaman anyelir di Jawa Barat
seperti yang pernah dilaporkan sebelumnya bahwa CarMV mendominasi di
beberapa negara produksi anyelir di dunia.
3. Bagaimanakah karakter biologi dan molekuler CarMV pada tanaman anyelir
di Jawa Barat.
4. Adakah metode deteksi CarMV yang cepat dan sederhana
5. Apakah gen CP CarMV yang melimpah dapat dihasilkan dari ekspresi
pET28a pada E. coli yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber antigen bagi
pembuatan antiserum.
6. Apakah CarMV dapat dibebaskan dari jaringan tanaman anyelir
menggunakan metode kemoterapi dan kultur ujung meristem.

4
Tujuan Penelitian
Secara umum penelitian ini bertujuan mengidentifikasi dan mendapatkan
karakter virus penyebab penyakit belang pada tanaman anyelir serta memperoleh
metode eliminasi virus untuk mendukung pengadaan benih anyelir bebas virus
secara berkelanjutan.
Secara khusus penelitian ini telah dilaksanakan dengan beberapa tujuan,
yaitu:
1. Mendapatkan data insidensi CarMV di beberapa sentra produksi tanaman
anyelir di Jawa Barat dan insidensi virus-virus lain yang kemungkinan
menginfeksi anyelir.
2. Mendapatkan karakter biologi (kisaran inang dan tipe gejala), morfologi, dan
molekuler CarMV berdasarkan variasi gejala.
3. Mengkaji keragaman genetik CarMV isolat Jawa Barat berdasarkan variasi
gejala.
4. Mengevaluasi tiga metode ekstraksi RNA total untuk deteksi cepat Carnation
mottle virus pada tanaman anyelir.
5. Mendapatkan antigen CarMV melalui ekspresi gen CP CarMV pada bakteri E.
coli.
6. Mendapatkan teknologi eliminasi CarMV yang efektif pada tanaman dan
planlet anyelir bebas virus

Hipotesis
1. CarMV mendominasi infeksi virus pada tanaman anyelir dibandingkan
beberapa virus lainnya.
2. Karakteristik biologi, morfologi (fisik), maupun molekuler CarMV isolat
Jawa Barat (Indonesia) identik dengan isolat-isolat dari negara lain.
3. Salah satu metode ekstraksi RNA total yang dievaluasi akan menjadi metode
yang mampu menyediakan RNA total dalam deteksi one step RT-PCR
dengan hasil yang sebanding dengan RNA total yang diekstraksi dengan kit.
4. Salah satu senyawa antiviral yang digunakan dalam penelitian ini efektif
mengeliminasi virus.
5. CP CarMV dapat diekspresikan pada E. coli sebagai sumber antigen

Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi mengenai distribusi berbagai jenis virus pada tanaman
anyelir dan karakteristik CarMV isolat Jawa Barat, sehingga dapat membantu
dalam penentuan strategi pengendalian.
2. Informasi penemuan CarMV pada hampir semua kultivar anyelir di Jawa
Barat dapat dijadikan sebagai dasar bagi pemulya tanaman untuk
menghasilkan tanaman tahan virus
3. Teknik preparasi RNA total yang sederhana dan cepat dapat digunakan untuk
indeksing CarMV secara rutin pada tanaman anyelir dan mungkin juga pada

5
virus tumbuhan lainnya, terutama bagi karantina tumbuhan dan institusi
sertifikasi benih.
4. Antigen yang didapatkan akan digunakan untuk produksi antiserum
poliklonal CarMV
5. Teknik eliminasi yang diperoleh dalam penelitian ini dapat diaplikasikan
secara rutin untuk menghasilkan tanaman anyelir bebas virus.
6. Planlet anyelir bebas virus yang diperoleh dalam penelitian ini dapat
dijadikan sumber eksplan untuk menghasilkan induk-induk tanaman anyelir
bebas virus.

Kebaruan dan Keunggulan Penelitian

1.

2.

3.
4.

Penelitian ini memiliki beberapa nilai kebaruan yaitu:
Diperolehnya pengetahuan mengenai virus yang mendominasi infeksi pada
tanaman anyelir di Jawa Barat, yaitu Carnation mottle virus (CarMV).
CarMV masih dianggap sebagai organisme pengganggu tanaman karantina
(OPTK) A1 sebelum penelitian ini dilakukan. Saat ini, menurut Permentan
No 51 Tahun 2015, CarMV berubah statusnya menjadi OPTK A2 yang
keberadaannya di Indonesia sudah diketahui dan dicegah penyebarannya ke
daerah lain.
Diperolehnya karakter biologi (kisaran inang dan tipe gejala), morfologi dan
molekuler CarMV isolat Jawa Barat serta keragaman genetiknya yang dapat
dijadikan sebagai pengetahuan dasar untuk mempelajari mekanisme
pengendalian penyakit belang pada tanaman anyelir.
Penelitian ini terkait kajian biologi dan molekuler, serta upaya pengendalian
CarMV, merupakan yang pertama dilakukan di Indonesia
Teknik deteksi cepat, teknik eliminasi, dan antigen CarMV yang diperoleh
dalam penelitian ini merupakan teknologi yang bermanfaat berkaitan dengan
penyediaan bibit bebas virus dan monitoring penyakit.

Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian dilakukan mulai dari September 2012 sampai Mei 2016 dengan
ruang lingkup penelitian meliputi (Gambar 1.1):
1. Mendeteksi secara serologi beberapa virus pada tanaman anyelir dari Jawa
Barat menggunakan antiserum terhadap CarMV, CRSV, CLV dan CVMV
untuk mendapatkan spesies virus yang menginfeksi anyelir.
2. Mengkaji karakter CarMV (sebagai virus utama pada anyelir) melalui deteksi
secara biologi (uji kisaran inang dan keragaman biologi), morfologi
(mikroskop elektron), dan molekuler (perunutan DNA CarMV).
3. Mengkaji keragaman genetik sekuen gen CP carMV melalui analisis asam
amino dan motif protein.
4. Mengevaluasi tiga metode preparasi RNA total untuk templat one step RTPCR CarMV dari tanaman anyelir .
5. Menguji ekspresi gen CP CarMV pada bakteri ekspresi E. coli strain BL21
untuk mendapatkan antigen CarMV.

6
6. Mengkaji teknik eliminasi CarMV pada tanaman anyelir melalui aplikasi
antiviral 2-thiouracil dan amantadin dikombinasikan dengan teknik kultur
meristem ujung (0.5-1.0 mm).

7
Mulai
Survei dan koleksi
sampel
\\\\\\\\\

Identifikasi, karakerisasi, dan
keragaman genetic CarMV

Evaluasi metode preparasi
RNA total untuk deteksi
cepat CarMV

Ekspresi gen coat protein
CarMV dalam bakteri
Escherichia coli

Eliminasi CarMV menggunakan
sentawa antiviral pada kultur
jaringan anyelir

Kegiatan penelitian:
 Deteksi serologi
 RT-PCR
 Perunutan asam
nukleat
 Uji keragaman biologi
 Pengamatan

Kegiatan penelitian:
 Preparasi sampel
 Preparasi asam nukleat
 Kuantifikasi RNA
 One step RT-PCR
 Visualisasi

Kegiatan penelitian:
 Desain primer
 RT-PCR
 TA cloning
 Subkloning
 Ekspresi gen CP
 SDS PAGE

Kegiatan penelitian:
 Preparasi sampel dan media
tanam
 Uji serologi pra perlakuan
 Inisiasi dan propagasi eksplan
 Perlakuan antivral
 Kultur meristem ujung
 Uji serologi dan analisis data

 Metode preparasi RNA
total dan deteksi cepat
 Informasi kuantitas RNA
 Publikasi nasional**

 Antigen CP CarMV
 Publikasi ilmiah

 Identitas CarMV
 Keragaman genetik
CarMV
 Morfologi partikel virus
 Tipe gejala
 Publikasi inter. 1* & 2**

 Antigen CP CarMV
 Planlet bebas virus
 Publikasi ilmiah1*

7

Gambar 1.1 Alur penelitian Carnation mottle virus pada Tanaman Anyelir di Indonesia: Etiologi, Ekspresi Gen Protein Selubung,
dan Eliminasinya. * Sudah terbit, ** In review,
Topik penelitian,
Kegiatan penelitian, Luaran

8

2 TINJAUAN PUSTAKA
Sifat dan Perbanyakan Tanaman Anyelir (Dianthus caryophyllus L.)
Anyelir, dalam bahasa Inggris dikenal sebagai carnation, mempunyai nama
ilmiah Dianthus caryophillus L. Nama carnation berasal dari nenek moyangnya
orang Yunani yaitu sebagai bunga yang digunakan untuk acara penobatan gelar
atau upacara kenaikan tahta di kerajaan-kerajaan (coronation flower). Dalam
taksonomi tumbuhan, Dianthus termasuk family Caryophyllaceae Juss. Famili
Caryophyllaceae memiliki 88 genus dan 1750 spesies ( 2011).
Tanaman anyelir dibudidayakan lebih dari 200 tahun yang lalu. Tanaman
ini berasal dari kawasan Mediterania dan sudah tersebar luas di seluruh dunia.
Varietas-varietas modern pertama kali dikembangkan di Perancis pada tahun 1840
(Badan Litbang Pertanian 2011). Bunga anyelir memiliki warna yang terang dan
berwarna warni sehingga sering digunakan sebagai hiasan.
Anyelir termasuk tanaman perennial, yaitu tanaman yang dapat dipanen
ulang (Mattjik 2010) dan dapat hidup lebih dari 2 tahun. Tanaman dapat diganti
dengan yang baru setelah produksinya menurun. Warna bunga anyelir sangat
beragam, kadangkala menampilkan warna yang berbintik-bintik, sehingga
menjadikan komoditas ini banyak dicari. Untuk menghasilkan bunga yang bagus,
budidaya tanaman anyelir harus dilakukan di daerah yang cocok, yaitu dataran
tinggi dan udara serta cahaya yang mendukung.
Karakteristik dan Kegunaan Tanaman Anyelir
Tanaman anyelir dapat dibudidayakan sebagai anyelir tipe standar maupun
tipe spray. Pada tipe standar, dalam satu tangkai hanya terdiri satu kuntum bunga,
sedangkan pada tipe spray, dalam satu tangkai terdapat lebih dari satu kuntum
bunga. Untuk membentuk bunga tipe standar dilakukan disbudding sesegera
mungkin dengan membuang kuncup-kuncup bunga lateral. Sedangkan, untuk
membentuk bunga tipe spray dilakukan pembuangan terhadap kuncup bunga
terminal. Tanaman anyelir juga memiliki beberapa karakter yang membedakannya
dari spesies bunga potong lainnya. Beberapa karakter tersebut adalah sebagai
berikut: Tinggi tanaman dapat mencapai 30 sampai 100 cm. Batang bulat, beruasruas, licin, permukaan berlilin, dan berwarna hijau kebiruan, percabangannya
banyak, dimana pada ujung-ujungnya akan tumbuh kuncup bunga. Daun sempit,
mempunyai kutikula yang tebal, tunggal, tersebar, duduk berkarang, tanpa tangkai
daun, pangkal memeluk batang, bentuk lanset, ujung runcing, tepi rata, panjang 510 cm, lebar 5-10 mm, pertulangan sejajar, permukaan licin, tebal, dan berwarna
hijau agak ke abu-abuan. Bunga majemuk, bentuk malai, terletak di ujung batang
atau di ketiak daun, bunga sempurna, berkelamin ganda, dasar kelopak berlekatan
membentuk tabung, ujung bergerigi, panjang 2-3 cm, benang sari dan putik tidak
tampak, mahkota berlepasan, bentuk asimetris, panjang 3-5 cm. Buah berbentuk
elips, kecil, dan berwarna coklat. Biji berbentuk elips, kecil, lunak, dan putih.
Akar serabut, dan berwarna putih kehitaman. Anyelir merupakan tumbuhan yang
umum dibudidayakan sebagai tanaman hias di kebun-kebun atau pekarangan.
Anyelir tumbuh baik di daerah pegunungan pada ketinggian 1000 m sampai 1800
m di atas permukaan laut pada kisaran suhu 20 sampai 30 oC. Anyelir menyukai

9
tanah yang gembur dan subur. Kondisi yang cocok untuk menanam tanaman
anyelir adalah yang bertekstur liat berpasir, subur, gembur, berdrainase baik dan
memiliki pH antara 5.5 sampai 6.7. Anyelir dapat hidup 18 sampai 20 bulan dan
merupakan salah satu bunga yang tertua dan yang paling terkenal. Bunga anyelir
memiliki 500 variasi yang berbeda. Bunga anyelir dapat dipanen sepanjang tahun.
Tanaman anyelir berguna selain sebagai hiasan juga berguna bagi kesehatan.
Sebagai hiasan, tanaman anyelir dapat digunakan sebagai tanaman pot, bunga
potong, maupun bedding plant. Bunga anyelir dijadikan sebagai hiasan karena
memiliki variasi warna yang menarik. Di bidang kesehatan, anyelir dimanfaatkan
dalam pengobatan tradisional Tiongkok, seperti obat diare, wasir, penenang,
infeksi saluran kencing, kencing batu, sembelit, anti-radang dan pembengkakan
pada kulit. Bagian-bagian tanaman anyelir yang digunakan ialah daun dan bunga
dalam keadaan segar atau setelah dikeringkan. Disamping itu, dilaporkan juga
bahwa tanaman anyelir memiliki kandungan senyawa kimia yang sangat
bermanfaat yang disebut dengan saponin. Selain itu, juga mengandung flavonoid
dan minyak atsiri (Whealy 1992).
Perbanyakan Tanaman Anyelir
Perbanyakan tanaman anyelir dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu
dengan stek pucuk tunas samping, kultur jaringan, atau dengan biji. Stek pucuk
biasanya diambil dari tanaman yang awalnya diintroduksi (tanaman impor).
Tanaman induk sebagai sumber stek biasanya tidak digunakan untuk produksi
bunga. Untuk mendapatkan pertumbuhan tanaman, kualitas pembungaan dan
bunga yang terbaik, tanaman harus dinaungi dengan penaungan sebesar 20%
(Hiatshwayo & Wahome 2010). Perbanyakan anyelir dengan teknik kultur
jaringan sudah banyak dilakukan. Menurut Kharrazi et al. (2011), regenerasi
tunas dipengaruhi oleh kultivar, jenis media dan konsentrasi zat pengatur tumbuh.
Medium MS yang dilengkapi dengan 1-2 mg/L BAP dan 0,2 mg/L NAA
merupakan medium multiplikasi tanaman yang optimal. Tanaman anyelir dapat
dibudidayakan dengan masa produksi sekitar 2 tahun. Namun, agar bunga dapat
memberikan hasil secara optimal, sebaiknya setelah umur 1.5 tahun pertanaman
dibongkar dan diganti dengan tanaman yang baru.
Dalam upaya mengurangi ketergantungan negara akan benih impor anyelir,
Balai Penelitian Tanaman hias (Balithi) sudah melakukan perakitan varietas
unggul sejak tahun 1999. Sampai dengan tahun 2011, Balithi berhasil melepas
delapan varietas baru, yaitu Top Beauty, Snazzy, Unique, Puspita Arum, Alifia,
Sitari, Laura, dan Brenda. Kedelapan varietas ini merupakan hasil persilangan
dari varietas-varietas anyelir komersial.
Sifat-Sifat Carnation mottle virus (CarMV)
Arti Ekonomi Infeksi CarMV pada Tanaman Anyelir
Carnation mottle virus dalam taksonominya tergolong Famili
Tombusviridae, dan Genus Carmovirus (Rochon et al. 2012). Di antara semua
anggota Carmovirus, CarMV dan Cowpea mottle virus merupakan patogen yang
penting secara ekonomi (Raikhy et al. 2006). Menurut