ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT

ANALISIS KIMIA
PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2013
Pendahuluan
Mikroorganisme yag ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifatsifat yang khas, begitu juga dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasikan ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
( Volt W A. Dan Margaret F W 1989).
Pewarna gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling
penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasikan bakteri. Dalam proses ini, olesan
bakteri yang sudah erfiksasi dikenai larutan-larutan berikut :zat pewarna kristal violet, larutan
iodium, larutan alkohol, dan zat pewarna tandinganberupa zat warna safranin. Metode ini diberi
nama berdasarkan penemunya, ilmuan Denmark Hans Christian Gram (1853- 1938) yang
mengembangkan
teknik
ini
pada
tahun

1884,
untuk
membedakan
antara pneumokokusdan klebsiella pneumonieae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini
dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positig dan bakteri gram negatif. Bakteri gram
positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna
ungu tua dibawah mikroskop. Adapun gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet
setelah dicuci denan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat
pewarna air safranin akan tampak berwarna merah. Perbedan warna ini disebabkan oleh
perbedaan dalam struktur kimiawi dindingselnya ( pelezar M J 1989).
Spora dibentuk oleh jenis bakteri tertentu terutama genus bacillus dan costridium. Pada
umumnya spora terdapat pada endospora dengan letak dan ukuran yang berbeda. Spora pada
bakteri dibentuk pada kondisi secara kimiawi dan kondisi kimiawi yang kurang menguntungkan
misalnya nutrisi, sinar panas dan kering. Macam-macam metode yang digunakan untuk melihat
spora, yaitu Schaefferfulton, Bartolomew- Mitter, Klein dan Donner. Pewarnaan spora dapat
digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Letak spora ada tiga macam, yaitu sentral ( letak
spora berada ditengah- tengah sel), terminal ( letak spora ada diujung sel) dan sub terminal
( letak spora diantara ujung-ujung dan ditngah-tengah terminal) ( Dwidjoseputro, 2005).
Tujuan
Praktikum bertujuan untuk mengetahui cara pewarnaan gram dan spora serta mengetahui

jenis gram dan ada tidaknya spora pada Escherchia Coli dan Bacillus.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini ialah mikroskop, kaca objek, pipet tetes,
kawat ose, pembakar spirtus, gelas piala, kasa asbes, botol semprot dan hot plate.

Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini ialah biakan bakteri Escherchia
Colidan Bacillus, alkohol, kristal ungu, larutan iodin, safranin, malacite green, kertas serap dan
aquades.
Prosedur kerja
Pewarnaan Gram dilakukan dengan biakan bakteri diambil dengan kawat ose dan
dioleskan di kaca objek, dan dibiarkan kering. Kemudian setelah kering difiksasi di atas
pembakar spirtus hingga bakteri melekat pada kaca objek yang ditandai dengan bakteri yang
berwarna keruh. Setelah itu bakteri ditetesi larutan kristal ungu selama kurang lebih satu menit,
dan dicuci dengan aquades kemudian dikeringkan. Setelah kering bakteri kemudian ditetesi iodin
kurang lebih 1 menit, dicuci dengan aquades kemudian dikeringkan. Setelah kering bakteri
ditetesi alkohol selama kurang lebih 30 detik, dan dicuci kembali dengan aquades kemudian
dikeringkan. Setelah dicuci dan dikeringkan, ditetesi safranin selama 30 detik, kemudian dicuci
dan dikeringkan menggunakan kertas serap, setelah itu diamati dengan perbesaran 1000X.
Pewarnaan spora dilakukan dengan biakan bakteri diambil dengan kawat ose dan
dioleskan di kaca objek. Dan dibiarkan sampai kering, setelah kering kemudian difiksasi di atas

pembakar spirtus hingga bakteri melekat pada kaca objek yang ditandai dengan bakteri yang
berwarna keruh. Bakteri kemudian ditetesi malacite green dan diuapkan di atas penangas air 2
sampai 3 menit, setelah dingin dicuci dengan aquades. Kemudian bakteri ditetesi safranin selama
kurang lebih 30 detik, setelah itu dibilas, dan dikeringkan dengan kertas serap, kemudian diamati
dengan perbesaran 1000X.
Data dan Hasil Pembahasan
Berdasarkan hasil pengamatan didapat data seperti yang terlihan pada tabel berikut ini :
Tabel 1 Pewarnaan gram pada bakteri
Bakteri
Gram (+/-)
Warna
Escherchia Coli
Merah muda
Bacillus
+
Ungu

Gambar 1 pewarnaan gram pada bakteri bacillis sp

Gambar 2 pewarnaan gram pada bakteri Escherchia Coli

Tabel 2 Pewarnaan spora bada bakteri Bacillus
Bakteri
Gram (+/-)
Warna
Bacillus
+
Merah muda
Gambar 3 hasil pewarnaan spora pada bakteri bacillus sp
Pembahasan
Umumnya bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena
tidak membiaskan cahaya hal tersebut menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme. Zat warna dapat mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras

mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Mengamati bakteri dalam kehidupan sangat
sulit sehingga dikembangkan teknik pewarnaan sel bakteri agar sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati (Karmana 2007). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi,
pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat pewarna penutup.
Pada praktikum kali ini dilakukan dua teknik pewarnaan yaitu pewarnaan pada bakteri
dan pewarnaan pada spora. Diawali dengan mengoleskan isolat bakteri (Bacillus SP) dengan

tujuan agar isolat bakteri dapat merata dikaca preparat. Lalu dilakukan fiksasi untuk melekatkan
mikroorganisme di kaca preparat. Pemberian Kristal ungu bertujuan untuk memberi warna pada
bakteri. Sedangkan pemberian Iodium bertujuan untuk memperkuat warna pada bakteri. Alkohol
96% berfungsi sebagai pemucat atau peluntur warna pada bakteri. Dan tahap terakhir yaitu
pemberian safranin yang berfungsi untuk memberi warna kembali pada bakteri yang telah
kehilangan warna pada proses pemucatan dengan menggunakan alkohol.Pada bakteri di preparat
menunjukkan warna ungu. Hal ini membuktikan bahwa bakteri di preparat merupakan bakteri
gram positif dikarenakan pada bakteri ini mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah
berikatan dengan kristal ungu. Jika berwarna merah muda menunjukan bakteri gram negatif
dikarenakan pada bakteri tersebut mengandung banyak lipid sehingga mudah berikatan dengan
safranin.
Hasil uji bakteri E-Colli dan bakteri agar miring atau Bacillus spdapat mempertahankan
warna primernya walaupun mengalami dekolorisasi(pencucian) ketika ditambahkan alkohol
sehingga bakteri E-Colli dan bakteri Bacillus sp merupakan kelompok bakteri gram
positif.Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel sehingga
menyebabkan perbedaan reaksi dengan perbedaan permeabilitas zat warna dan penambahan
larutan pencuci (Dwidjosapuro 2005).
Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat.
Kemudian preparat diberikan malakit hujau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang
digunakan untuk melumuri fiksasi panas. Preparat diuapkan diatas air mendidih dengan tujuan

untuk memperbesar pori-pori bakteri agar pada saat pewarnaan dapat menembus dinding
endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air dialirkan dari
atas, yang bertujuanuntuk menghilangkan malacite green dari seluruh bagian sel endospora.
Pewarnaan safranin bertujuan untuk counterstein yang digunakan untuk melumuri bagian warna
dari sel yang lain dari pada endospora. Hasil uji bakteri Bacillus spmenghasilkan bakteri gram
positif. Prinsip pewarnaan spora didasarkan pada penggunaan zat warna malachite
green dan safranin dimana pada hasil pewarnaan akan menghasilkan warna hijau pada spora dan
warna merah pada sel vegatitifnya (Lay 1994).
Simpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa bakteri gram positif terdapat
pada bakteri Bacillus sp karena gram positif dapat mempertahankan warna awalnaya.sedangkan
gram negatifnya terdapat pada bakteri E-Colli, karena gram negatif kehilangan kompleks ungu
kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol.
Daftar pustaka
Dwidjoseputro.2005.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta:PT Gramedia
Karmana.2007.Biologi.Jakarta:PT Grafindo Media Pratama

Lay.1994.Mikrobiologi
Microbiology.

Umum.Herna,Penerjemah.Jakarta:

Erlangga.

Terjemahan

dari:General

Pelezar chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta
Margareth F W. 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Jakarta : Erlangga

Laporan pewarnaan gram
A. Tujuan
Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
B. Dasar Teori
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut
sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena

sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui
bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana
ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
a.

pewarnaan asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru
dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies

bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884
untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gramnegatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan
Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci
dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram
negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah
dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses
pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua
jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid)
kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna

merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal.
Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi
oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria,
2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat
Bakteri garam (+)
Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel
Kandungan lipid rendah (1Kandungan lipid tinggi
4%)
Ketahanan terhadap
Lebih sensitif
Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh
Lebih dihambat
Kurang dihambat

pewarna basa (VK)

Kebutuhan nutrisi
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
(Manurung, 2010).

Kebanyakan spesies relatif
kompleks
Lebih tahan

Relatif sederhana
Kurang tahan

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler.
Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk
mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung
pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna
tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam
alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat
intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur
pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu
dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau
lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkoholasam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh
terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru
(Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan,
kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau
kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat
warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol
3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci
dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1%
dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci
dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

4. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu
dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan
Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang
memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel

a.

b.

c.

d.

vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan
kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan
endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak
jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak
sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana,
endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat
melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru
gelap.
Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara
memanaskan preparat.
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga
terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).

A. Alat dan Bahan
NO

Alat

Jumlah

1

Jarum ose

1

2

1

3

Pembakar
spirtus
Kaca preparat

4

Pipet tetes

1

5
6
7

Mikroskop
Gelas kimia
Kaca objek

1
3
1

1

Bahan
Biakan murni B.
cereus dan E.colipada
medium NA yang
berumur 24 jam
Aquades steril
Larutan hucker’s
crystal violet
Larutan mordan
lugol iodine
Larutan alkohol 96%
Larutan safranin

8

Tabung reaksi

1

B.
Kaca Objek
Cara Kerja

Dibersihkan dengan menggunakan alkohol
Dikeringkan dengan cara dianging-anginkan pada api
Kaca objek yang telah steril
Ditetesi aquades
Jarum ose

Dibakar sampai merah
Dicelupkan pada alkohol
Jarum ose yang steril
Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada api
Sampel e.coli dan Bacillus

Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan sampai terambil).
Disimpan di atas kaca objek
Aduk pelan-pelan sampai tercampur dengan aquades yang telah ada pada kaca objek
Kaca objek yang telah berisi sampel
Dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas api kecil.

Ditetesi violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi alkohol 96% ( diamkan selama 45 detik)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)

Dicuci dengan air yang mengalir
Dikeringkan pada udara terbuka
Hasil
Diamati dibawah mikrosko

A. Hasil Pengamatan dan Pembahasan
Tabel pengamatan
Gambar 1. Fiksasi
Sumber : dokumentasi Pribadi

Gambar 2. Pada saat ditetesi violet
Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar 3. Penambahan lugol
Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar 4. Saat ditetesi alkohol 96%
Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar 5. Pada saat ditetesi safranin
Sumber : dokumentasi pribadi

Bakteri yang telah di ambil kemudian di
simpan pada kaca objek yang dicampur
dengan setetes aquades. Setelah itu
difiksasi di atas api sampai kering.
Pemanasan tidak boleh terlalu panas
karena bisa merusak sel bakteri.
Setelah difiksasi, sampel ditetesi violet.
Sampai bakteri terendam. Lalu biarkan
selama 1 menit. Setelah itu, cuci di air
yang mengalir. Hasilnya terdapat warna
ungu pada kaca objek.
Kemudian bakteri ditetesi lugol sampai
terendam lalu biarkan 1 menit dan cuci di
air yang mengalir. Setelah dicuci, kaca
objek tetap berwarna ungu akibat dari
tetesan violet.
Setelah ditetesi lugol dan dicuci, bakteri
ditetesi alkohol 96% dan dibiarkan
selama 45 detik. Setelah itu, cuci di air
yang mengalir. Setelah dicuci, warna
ungu pada kaca objek menghilang akibat
penambahan dari alkohol.
Setelah warna ungu pada bakteri hilang,
kemudian bakteri ditetesi safranin sampai
terendam dan biarkan selama 1 menit.
Kemudian cuci di air yang mengalir.
Hasilnya, bakteri yang dihasilkan
berwarna merah muda.
Gambar 6. Hasil pewarnaan
Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar 7. Hasil pengamatan pada mikroskop (pembesaran 40x10)
Sumber : dokumentasi pribadi
Gambar B. cereus pada pembesaran 16x10
Sumber : Purna,2012.laporan praktikum mikrobiologi
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah
awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di
dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri
berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri
gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram
negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung,
2010).
Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal
violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme
target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang
bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna
ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung
protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya
tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna
ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang
berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan
warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme
gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan

didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih
kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan
selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95%
merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan
kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung
pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak
akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna
akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua
kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi
tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel.
Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1
menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan
pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain,
safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat
atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna
merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi
dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran
menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu
yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan
komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat
warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung
cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca
objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat
warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu
dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak
tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir,
gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka
termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka
termasuk golongan bakteri gram negatif.

B. Kesimpulan
Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna merah merupakan
gram negatif dan bacillus yang berwarna ungu merupakan gram positif.

Daftar Pustaka
Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.
http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11 November 2010
Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram
Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gramnegatif. 11 November 2010.
Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.
Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia,
dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai
Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara
Kesehatan Vol. 9 No. 1.
Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.
http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. 11 November
2010.
Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi
UNS

DASAR TEORI LAPORAN PEWARNAAN
PEWARNAAN
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Sel bakteri dan mikroorganisme lainnya diamati dengan bantuan mikroskop.
Terutama sel bakteri selain selnya sangat kecil, juga transparan dan tidak berwarna.
Setelah metode pewarnaan diketahui d
an dikembangkan. Pengamatan bakteri menjadi lebih muda. Bahkan hasil
pewarnaan itu dapat digunakan untuk pewarnaan lebih lanjut dan mendalam.
Diantaranya digunakan dalam penentuan jenis atau identifikasi. Banyak metode
pewarnaan yang dapat dilakukan dan setiap metode mempunyai tujuan-tujuan
tertentu. (Mila Ermila, 2005, Penuntun Praktikum Mikrobiologi)
B. Tujuan Praktikum
Mempelajari tehnik pewarnaan dan mengamati
reaksinya terhadap zat kimia (pewarna)

bentuk-bentuk

bakteri

dan

II. TINJAUAN PUSTAKA
Pewarnaan gram menghasilkan 2 (dua) kelompok besar bakteri, yaitu gram positif
yang berwarna ungu dan gram negatif yang berwarna merah. Adanya hram positif
dan gram negatif disebabkan oleh perbedaan bandingan dinding sel bakteri.
Kandungan senyawa peptidoglikan pada dinding sel gram positif lebih tebal
dibandingkan pada dinding gram negatif. Beberapa cara pengecetan, yaitu :
- Pengecetan negatif
- Pengecetan sederhana
- Pengecetan gram
- Pengecetan ziehl nielsen
- Pengecetan kapsul
- Pengecetan spora
- Pengecatan flagella
(Ani Murniati, 2000. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi)
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk
mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka
dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan
rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin.
(Mila Ermila, 2005, Penuntun Praktikum Mikrobiologi)

TEKNIK PEWARNAAN MIKROORGANISME
A.
PENDAHULUAN
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel
dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel
bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi

ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada
pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam
dan
pewarna
basa
Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam
kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif,
sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel,
maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna
asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain.
Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan
diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari
pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain.
Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna,
teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk
mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain
adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih
dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram
positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.
Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora
dan
nukleus.
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan
bekerja serta mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut:
mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk
membuat
apusan
dari
bakteri
yang
diwarnai.
mempersiapkan apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat
seperti
lapisan
yang
tipis.
Apusan
ini
dapat
berasal
dari
biakan
cair
atau
padat.
Biakan Cair. Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan
pada kaca obyek. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan
mengering diudaraata diatas api kecil dengan jarak 25 cm. Biakan Padat. Bakteri
yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari
biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu
denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air
dan apusan. Biarkan mengering diudara.• Fiksasi dengan pemanasan. Apusan
bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada
waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek
dapat
dilakukan
diantaranyadengan
cara
memanaskan
diatas
api.
B.
DASAR
TEORI
-pewarnaan
gram
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas
dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri
gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri.
Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan
mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing
agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel,
bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci

sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna
akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci
maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna
dasar.
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena
bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya
secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan
olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri
terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar
mudah
dilihat
dan
dipelajari
(Volk
dan
Whleer,
1998).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus
pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar
dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan
indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar
belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zatzat
warna
(Hadioetomo,
1990).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan
dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus
diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci
tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan
ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan
perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel
bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat
mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada
zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor
dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang
berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih
banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada
permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue,
Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain
Eosin,
Congo
Red
dll
(Irawan,
2008).
Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur
pewarnaan
untuk
(Suriawiria,
1985)
:
Mengamati
dengan
baik
morfologi
mikroorganisme
secara
kasar.
Mengidentifikasi
bagian-bagian
struktural
sel
mikroorganisme.
- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.
Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan
mikroskopik
adalah
(Pelczar,
1986)
:
Penempatan
olesan
atau
lapisan
spesimen
pada
kaca
objek.
Fiksasi
olesan
pada
kaca
objek.

- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan
pewarna
atau
reagen
(pewarnaan
diferensial.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara
langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan
murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria,
1985)
:
- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
Memperjelas
ukuran
dan
bentuk
jasad
- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan
kimia
yang
ada
akan
dapat
diketahui.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang
akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan
tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri
bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga
kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif
(Suriawiria,
1985).
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat
ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan
suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka
akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan
untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa
merusak
struktur
selnya
(Campbell
dan
Reece,
2005)).
Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi
mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel
melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan
dengan
latar
belakang
hitam
(Campbell
dan
Reece,
2005).
Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut
merupakan
berbagai
bentuk
sel
bakteri
(Anonim,
2008):

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan
penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak
pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki
dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif
mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan,
2008).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut
(Irawan,
2008):
a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang
mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih
yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak

n

seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan
etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara
sempurna
sehingga
sel
gram
negatif
seperti
gram
positif.
b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak
lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel
menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan
menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan
sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang
memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
Pewarnaan Endospora. Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan
Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya.
Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya
bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas,
kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora
adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya
tampak
jelas
(Irawan,
2008).
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan
tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan
pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (keduaduanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan
endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan,
2008):

PEWARNAAN MAJEMUK (PEWARNAAN GRAM)
Hari / Tanggal
: Jumat, 14 desember 2012
Tempat
: Laboratorium Biologi
: Mampu melakukan pewarnaan bakteri dengan menggunakan beberapa macam zat warna
dengan metode gram
A. Dasar Teori
Pada tahun 1884, seorang bakteriologiwan Denmark secara kebetulan menemukan prosedur
pewarnaan gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan
paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. (Hadieotomo,1988).
Adapun tujuan dari pewarnaan adalah :
1.

Memudahkan melihat mikroba dengan mikroskop

2.

Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba

3.

Melihat struktur dalam bakteri , seperti dinding sel dan vakuola

Menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna.
(Waluyo, 2008)
Ada 5 macam pewarnaan, yaitu :
Pewarnaan sederhana, memungkinkan untuk melihat bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat
membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dalam morfologi yang sama,
Pewarnaan tahan asam, untuk pewarnaan bakteri yang mengandung sejumlah besar besar zat
lipoid (berlemak) didalam dinding selnya yang menyebabkan tidak permeabel terhadap zat
warna yang umum,
Pewarnaan spora, untuk pewarnaan bakteri yang membentuk endospora yang tahan terhadap
kondisi ekstrim sehingga dibutuhkan perlakuan yang keras,
Pewarnaan kapsul, dan
Pewarnaa negative, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya
hitam gelap. (Volk ,1992)
Komposisi dinding sel bakteri gram positive berbeda dengan bakteri gram negative. Dinding
sel yang lebih yang tebal pada bakteri gram positive menyusul oleh perlakuan alkohol karena
terjadi dehidrasi. Sedangkan sel-sel gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi
pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Contoh dari gram
positive adalah S.aureus dan gram negative adalah E.coli. (Hadioetomo, 1988).
Perbedaan struktur dinding sel bakteri gram positive dan gram negative sehingga
menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pemucat.
Sebagian besar dinding sel bakteri gram positive terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding
sel bakteri gram negative mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel
bakteri gram negative (Lay,1994).
Pewarnaan gram/diferensial memerlukan sekurang-kurangnya tiga macam reagen bahan
kimia yang dipakai pada film bakteri yang sudah difiksasi. Zat kimia pertama disebut zat warna
utama. Fungsi zat ini adalah untuk memberikan warna pada semua sel bakteri. Agar diperoleh
warna yang kontras, zat kimia kedua yang dipakai adalah zat penghilang warna (decolourizing
agent). Berdasarkan komposisi kimia komponen sel bakteri, maka zat kimia yang kedua tersebut
dapat atau tidak dapat menghilangkan zat warna yang pertama dari semua bagian sel atau hanya
dapat menghilangkan zat warna yang pertama dari bagian sel tertentu dalam struktur bakteri. Zat
kimia yang terakhir, yaitu lawan warna (counterstain) memiliki sifat warna yang kontras dengan
zat warna yang pertama. (Subandi, 2010)
Peluntur cat yang digunakan untuk mendapat kontras yang baik pada bayangan mikroskop
antara lain:
Bahan peluntur untuk lemak: air, aceton, alcohol
Bahan peluntur untuk cat basa: HCl, H2SO4, HNO3, dsb.
Bahan peluntur untuk cat asam: KOH encer, sabun
Garam - garam logam berat: AgNo3, CuSo4, dsb.
Garam- garam logam ringan: Na2SO4, MgSo4, dsb. (Tim bakteriologi umum, 2005)
Sifat gram ditentukan oleh sifat- sifat fisik dan kimia dinding dan membran selnya. Selama
proses pewarnaan, penambahan alcohol terhadap bakteri gram negative menyebabkan
terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya rembes/permeabilitas dinding sel gram
negative. Jadi kompleks Kristal violet-Iodium (lugol) yang telah memasuki dinding sel selama
langkah awal dalam pewarnaan dapat diekstraksi. Karena itu gram negative kehilangan warna
tersebut. Karena kandungan lipidnya lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi
4.

1.
2.
3.
4.
5.

1.
2.
3.
4.
5.

1.
2.

3.
4.
5.
1.
2.
3.
4.

terdehidrasi selama perlakuan dengan alcohol. Ukuran pori-pori mengecil, permeabilitas
berkurang dan kompleks Kristal violet–iodium tidak dapat terekstraksi. Pada saat pemberian cat
penutup (safranin), bakteri gram negative terwarnai sehingga berwarna merah, bakteri gram
positif tidak terwarnai sehingga berwarna ungu. (Tim bakteriologi umum, 2005)
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu :
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung
asam tekoat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. (Hadiotomo, 1990)
Sedangkan ciri-ciri bakteri gram positif yaitu :
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai
lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam
tekoat.
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. (Hadiotomo, 1990)

Pembahasan
Bakteri yang termasuk gram positif antara lain:
1. Staphylococus aureus
Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang
berkoloni dan berbentuk seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada
dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus aureus yang berwarna kuning
danStaphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang
dimiliki Staphylococcus aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif
dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada
konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S.
Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paruparu, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan
endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins
menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran
darah (Kenneath, 2008).
Peran S. aureus , diantaranya penyebab bisul, jerawat, pneumonia, meningitis, dan arthritits.
Sebagian besar penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini memproduksi nanah, oleh karena itu
bakteri ini disebut piogenik. S. aureus juga menghasilkan katalase, yaitu enzim yang
mengkonversi H2O2 menjadi H2O dan O2, dan koagulase, enzim yang menyebabkan fibrin
berkoagulasi dan menggumpal. Koagulase diasosiasikan dengan patogenitas karena
penggumpalan fibrin yang disebabkan oleh enzim ini terakumulasi di sekitar bakteri sehingga
agen pelindung inang kesulitan mencapai bakteri dan fagositosis terhambat.
2. Bacillus subtilis

Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang, dan secara alami
sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu
berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup
walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres
situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan
panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set
kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein.
Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah
besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).
3. Sarcina lutea
Sarcina lutea, merupakan bakteri nonmotile, gram positif, aerob (fakultatif anaerobik),
Micrococcus penghasil pigmen, dapat ditemukan di udara, tanah, dan air di seluruh bumi.
Bakteri ini sensitive terhadap penisilin. Koloni berwarna kuning.
Sedangkan bakteri yang termasuk gram negative adalah:
1. Escherichia coli
Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu
jenisspesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor
Escherich ini dapat ditemukan dalam usus besarmanusia. Kebanyakan Escherichia coli tidak
berbahaya, tetapi beberapa, seperti Escherichia coli tipe O157:H7, dapat mengakibatkan
keracunan makanan yang serius pada manusia yaitu diare berdarah karena eksotoksin yang
dihasilkan bernama verotoksin. Toksin ini bekerja dengan cara menghilangkan satu
basa adenin dari unit 28SrRNA, sehingga menghentikan sintesis protein. Sumber bakteri ini
contohnya adalah daging yang belum masak, seperti daging hamburger yang belum matang.
Escherichia coli yang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia dengan
memproduksi vitamin K2, atau dengan mencegah baketi lain di dalam usus. Escherichia
coli banyak digunakan dalam teknologirekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vektor untuk
menyisipkangen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. Escherichia colidipilih
karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya.
2. Proteus vulgaris
Proteus Vulgaris berbentuk batang, bakteri gram negatif yang menghuni saluran usus manusia
dan hewan. Bakteri ini dapat ditemukandi tanah, air dan tinja. Bakteri ini dikelompokkan
dengan Enterobacteriaceae dan merupakan patogen oportunistik manusia.Bakteri ini diketahui
menyebabkan infeksi saluran kemih dan infeksi luka.
Peran: Proteus mirabilis menyebabkan 90% dari infeksi Proteus.Proteus vulgaris dan Proteus
penneri mudah diisolasi dari individu dalam jangka panjang fasilitas perawatan dan rumah sakit
dan dari pasien dengan penyakit yang mendasari atau sistem kekebalan tubuh
dikompromikan. Pasien dengan infeksi berulang, orang-orang dengan kelainan struktural dari
saluran kemih, mereka yang memiliki instrumentasi uretra, dan mereka yang diperoleh infeksi di
rumah sakit mengalami peningkatan frekuensi infeksi yang disebabkan oleh Proteus dan
organisme lain (misalnya, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas , enterococci, staphylococci)
DAFTAR PUSTAKA

Hadioetomo. 1988. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia:Jakarta.
Lay dan Hartono.1992. Mikrobiologi. Jakarta : Rajawali Pers.
Subandi. 2010. Mikrobiologi. Bandung : PT Remaja Rosda Karya
Tim Bakteriologi Umum. 2005. Diktat Penuntun Praktikum Mikroskop Dan Bakteriologi Umum.
Tasik: Akademui Analis Kesehatan Bakti Husada.
Volk, Wheter. 1992. Mikrobiologi Dasar. University Of Southern Maine.

I.PENDAHULUAN
A.Latar Belakang
Bakteri yang memiliki ciri-ciri berantai karbon (C) yang panjangnya 8 – 95 dan memiliki dinding sel
yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60%
dari berat dinding sel disebut bakteri tahan asam (BTA). Bakteri ini ada 41 spesies yang telah diakui
oleh ICSB (International Committee on Systematic Bacteriology) yang sebagaian besar sudah saprofit
dan sebagaian kecil lainnya patogen untuk manusia diantaranya Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium leparae dan lain-lainnya yang dapat menyebabkan infeksi kronik. Golongan saprofit
dikenal

juga

dengan

nama

atipik

(Syahrurachman,

1994).

Bakteri ini membutuhkan bahan tambahan makanan seperti darah egg yolk, serum dan sel yang tebal
yang terdiri