Analisis Molekuler Regio Core Promoter Dan Precore/Core Isolat Virus Hepatitis B 09idskab-3

ANALISIS MOLEKULER REGIO CORE PROMOTER DAN

ISOLAT VIRUS HEPATITIS B 09IDSKAB-3 SKRIPSI Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran

IBNU YUDISTIRO G.0009103 FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET Surakarta 2012

ABSTRAK

Ibnu Yudistiro, G0009103, 2012. Analisis Molekuler Regio Core Promoter dan

Precore/Core Isolat Virus Hepatitis B 09IDSKAB-3. Skripsi. Fakultas

Kedokteran, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Latar belakang: Infeksi Virus Hepatitis B (VHB) menjadi salah satu masalah

utama kesehatan di dunia karena memiliki angka kematian yang tinggi. Virus hepatitis B sangat mudah mengalami mutasi karena bereplikasi melalui transkripsi balik. Mutasi VHB sering ditemukan pada regio core promoter dan precore/core. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui data molekuler dan variasi genetik pada regio tersebut dengan isolat VHB 09IDSKAB-3.

Metode: Penelitian yang bersifat eksploratif ini dilaksanakan di Laboratorium

Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. Ekstraksi DNA dilakukan pada sampel dengan HBsAg positif yang diambil dari Komunitas

Man Sex with Man . Proses amplifikasi dengan PCR menggunakan primer KL-28

dan KL-6 kemudian dilakukan penentuan sekuens nukleotida pada regio tersebut.

Analisis molekuler dilakukan dengan aplikasi MEGA 4.0.

Hasil: Berdasarkan hasil analisis BLAST, isolat VHB 09IDSKAB-3 memiliki

skor BLAST tertinggi dengan isolat AP011085 yang berasal dari DKI Jakarta.

Ditemukan variasi genetik A1726C pada regio core promoter, T1860C, C1877T, dan G1957C pada regio precore/core.

Simpulan: Isolat VHB 09IDSKAB-3 termasuk dalam kategori HBV genotipe B

subgenotipe B3 berdasarkan regio core promoter dan precore/core. Variasi genetik yang terdapat pada isolat sampel mungkin mempengaruhi proses replikasi dan produksi HBeAg/HBcAg, sehingga membutuhkan penelitian lebih lanjut.

Kata kunci: regio core promoter dan precore/core, isolat VHB 09IDSKAB-3,

analisis molekuler

ABSTRACT

Ibnu Yudistiro, G0009103, 2012, Molecular Analysis of Core Promoter and

Precore/Core Regions of 09IDSKAB-3 Hepatitis B Virus Isolate. Mini Thesis, Faculty of Medicine, Sebelas Maret University, Surakarta.

Background: Hepatitis B virus (HBV) infection is a major health problem

leading to significant morbidity and mortality worldwide. HBV replicates its DNA genome through reverse transcription from RNA intermediate. It is vulnerable to a high number of mutations during such reverse transcription which are frequently found in core promoter and precore/core regions. This study was aimed to identify genetic variation of core promoter and precore/core regions of

09IDSKAB-3 HBV isolate.

Methods: This was an explorative experiment. DNA extraction was performed on

09IDSKAB-3 blood sample that was taken from Man Sex with Man Community.

Core promoter and precore/core regions were determined by PCR using KL-28 and KL-6 primers and direct sequencing of the corresponding region. Molecular analysis was performed using MEGA 4.0.

Result: Based on BLAST result, 09IDSKAB-3 HBV isolate had the highest

similarity to isolate AP011085 from DKI Jakarta. Genetic variations A1726C in core promoter, and T1860C, C1877T, G1957C in precore/core regions were found in 09IDSKAB-3 isolate.

Conclusion: 09IDSKAB-3 HBV isolate was classified into genotype B and

subgenotype B3 based on core promoter and precore/core region. The genetic variations found in this isolate may have influence to the replication efficiency and HBeAg/HBcAg production, therefore need further study.

Keywords : core promoter and precore/core regions, 09IDSKAB-3 HBV isolate,

molecular analysis

PRAKATA

Puji syukur penulis haturkan ke hadirat Allah SWT karena atas karuniaNya penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul

”Analisis

Molekuler Regio Core Promoter dan Precore/Core Isolat Virus Hepatitis B

09IDSKAB-3 ”. Penelitian dan penulisan skripsi ini dapat terlaksana dengan baik

berkat bantuan, bimbingan, dan petunjuk dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Prof. Dr. Zainal Arifin A, dr., Sp.PD (KR), FINASIM, selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

2. Muthmainah, dr., M. Kes, selaku Ketua Tim Skripsi FK UNS.

3. Afiono Agung Prasetyo, dr., Ph.D selaku Pembimbing Utama atas bimbingan dalam penyusunan skripsi ini.

4. Yulia Sari, S.Si., M.Si selaku Pembimbing Pendamping atas bimbingan dalam penyusunan skripsi ini.

5. Hudiyono, Drs., M.Si selaku Penguji Utama yang telah memberikan bimbingan, kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi ini.

6. Leli Saptawati, dr., Sp.MK selaku Penguji Pendamping yang telah memberikan bimbingan, kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi ini.

7. Seluruh Dosen dan Staf Laboratorium Biomedik dan Mikrobiologi FK UNS.

8. Bagian Skripsi FK UNS yang turut memberi kelancaran pembuatan skripsi ini.

9. Ayahanda Suparmo, Ibunda Suharti serta adik-adikku yang sangat kucintai dan kusayangi Azizah Muthi’ah dan Izzatunnisa Istiqomah. Keluargaku yang selalu mendoakanku agar menjadi dokter yang baik.

10. Teman-teman Avicenna dan Wienda yang telah memberikan banyak bantuan demi kelancaran skripsi ini.

11. Teman-teman seperjuangan dalam skripsi, Angga Dwi Prasetyo, Raden Arteswara, Martinus Nuherwan, yang bahu membahu hingga selesainya skripsi ini.

12. Teman-teman dan pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu yang turut mendukung skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan dan jauh dari kata sempurna. Penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun demi kebaikan skripsi ini. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi dunia kedokteran umumnya dan pembaca khususnya.

Surakarta, Juni 2012 Ibnu Yudistiro

DAFTAR ISI

PRAKATA .................................................................................................... vi DAFTAR ISI .............................................................................................. vii DAFTAR GAMBAR ................................................................................. ix DAFTAR TABEL ...................................................................................... x DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xi

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang .................................................................... 1 B. Perumusan Masalah ............................................................ 3 C. Tujuan Penelitian ................................................................ 3 D. Manfaat Penelitian .............................................................. 3 BAB II LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka ................................................................. 4 1. Virus Hepatitis B .............................................................

4 2. Gen Core . ........................................................................

5 3. Regio Core Promoter ......................................................

7 B. Kerangka Pemikiran ............................................................ 8

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian .................................................................... 9 B. Lokasi Penelitian ................................................................. 9 C. Objek Penelitian .................................................................. 9 D. Rancangan Penelitian .......................................................... 9 E. Instrumen Penelitian ............................................................ 10 1. Alat .................................................................................

10 2. Bahan ..............................................................................

10 F. Cara Kerja ........................................................................... 11 1. Ekstraksi DNA HBV ........................................................

11 2. Amplifikasi dan Sekuensi PCR ........................................

BAB IV HASIL PENELITIAN A. Analisis Molekuler Regio Core Promoter dan Precore/Core 15 B. Variasi Genetik Regio Core promoter dan Precore/Core ...... 18 BAB V PEMBAHASAN A. Regio Core Promoter Isolat 091DSKAB-3 ........................... 19 B. Regio Precore/Core Isolat 091DSKAB-3 ............................. 20 BAB VI PENUTUP A. SIMPULAN ........................................................................ 26 B. SARAN .... ........................................................................... 26 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................

27 LAMPIRAN

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Virus Hepatitis B (VHB) merupakan salah satu virus penyebab hepatitis

pada manusia. Diperkirakan dua milyar penduduk dunia telah terinfeksi VHB dan 350 juta jiwa di antaranya menjadi kronis, dan 600 ribu orang diantaranya meninggal setiap tahun akibat VHB terkait sirosis hepatis dan atau karsinoma hepatoseluler (WHO, 2009; Yu et al., 2010). Hepatitis B merupakan penyakit endemik, terutama di negara berkembang dengan populasi penduduk yang tinggi. Indonesia termasuk negara dengan kategori

intermediate to high endemic region dengan prevalensi HBsAg mencapai

5,1% dari populasi umum (Hasan, 2005). Sebanyak 13 juta penduduk Indonesia merupakan penderita hepatitis B (Sekretariat Jenderal Kementerian Kesehatan RI, 2011).

VHB merupakan virus DNA yang bereplikasi melalui transkripsi balik dari RNA intermediate. Selama proses transkripsi balik tersebut, proses mutasi genetik sangat rawan terjadi dengan angka mutasi mencapai satu nukleotida/10.000 basa/tahun infeksi (Alexopoulou, 2009; Hunt et al., 2000).

Mutasi genetik VHB sering terjadi pada regio core promoter dan precore /core (gen C).

Beberapa mutasi yang terjadi pada core promoter dan precore/core (gen

C) terkait dengan perubahan manifestasi klinis hepatitis B (Lin dan Kao,

2011). Pasien yang terinfeksi oleh mutan tersebut cenderung mengalami nekroinflamasi dan fibrosis hati yang lebih parah daripada pasien yang terinfeksi VHB wild type (Al-Mahtab et al., 2007). Di samping itu, mutasi genetik pada regio core promoter dan precore/core juga berpengaruh terhadap proses perjalanan penyakit dan terapi hepatitis (Wang et al., 2005) Oleh karena itu, analisis molekuler mengenai regio core promoter dan

/core diperlukan untuk memperoleh data mengenai variasi genetik

precore serta pengaruhnya pada penyakit hepatitis B.

Studi yang terkait dengan analisis regio core promoter dan precore/core telah banyak dilakukan oleh peneliti di seluruh dunia. Publikasi mengenai analisis molekuler regio core promoter dan precore/core dalam Pubmed pubmed/) mencapai 880 publikasi di seluruh dunia hingga Juni 2012, namun hanya terdapat lima publikasi yang dilakukan di Indonesia (Heriyanto et al., 2012; Juniastuti et al., 2010; Utama et al., 2009a, 2009b, 2011).

Pada penelitian ini kami melakukan analisis molekuler regio core

promoter dan precore/core isolat 09IDSKAB-3 yang berasal dari Provinsi

Jawa Tengah. Data molekuler yang didapatkan melalui penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk penelitian lanjutan mengenai virulensi, strategi replikasi, patogenesis, diagnosis, terapi, dan vaksinasi VHB terutama di Indonesia.

B. Rumusan Masalah

Bagaimanakah analisis molekuler regio dan precore/core

core promoter

virus hepatitis B isolat 09IDSKAB-3? C.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui data molekuler regio core promoter dan precore/core virus hepatitis B isolat 09IDSKAB-3.

D. Manfaat Penelitian 1. Aspek teoritis

Manfaat penelitian ini adalah untuk mengetahui data molekuler regio core promoter dan precore/core virus hepatitis B isolat 09IDSKAB-3.

2. Aspek aplikatif

Analisis molekuler yang didapatkan melalui penelitian ini dapat digunakan untuk penelitian lanjutan mengenai strategi replikasi, patogenesis, diagnosis, terapi, dan vaksinasi VHB terutama di Indonesia.

BAB II LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka 1. Virus Hepatitis B Virus hepatitis B merupakan kelompok virus DNA dan termasuk

dalam famili Hepadnaviridae. Virus hepatitis B diklasifikasikan menjadi 8 genotipe (A-H) berdasarkan perbedaan 8% atau lebih dalam urutan nukleotida genom intergrup atau perbedaan 4% atau lebih dalam urutan nukleotida gen S. Genotipe A, B, C, D, E, dan F dibagi menjadi subgenotipe masing-masing berdasarkan perbedaan 4% atau lebih dalam urutan nukleotida intragenotipe (Kurbanov et al., 2010).

Virion VHB atau disebut juga partikel dane, memiliki struktur seperti bola dengan diameter 42 nm. Virion terdiri dari partikel genom (DNA) untai ganda dan kapsid yang tersusun atas protein core nukleokapsid dengan diameter 27 nm yang disebut dengan antigen core

VHB (HBcAg) (Seeger et al., 2007). HBcAg dikelilingi oleh mantel luar lipoprotein yang disebut antigen surface (HBsAg) (Patient et al., 2009).

Genom VHB merupakan virus DNA kecil berukuran 3,2 kb yang terbentuk dari transkripsi balik RNA intermediate (Seeger et al., 2007).

DNA VHB memiliki untai positif dan untai negatif. Untai positif DNA terletak di sebelah dalam, dengan panjang 2/3 dari panjang genom.

Sedangkan untai negatif merupakan untai penuh yang terletak di sebelah luar (Seeger et al., 2007). Untai negatif menyandi empat Open Reading (ORF) yang letaknya saling tumpang tindih: ORF S untuk gen S

Frame

(surface), ORF C untuk gen C (core), ORF X untuk gen X, dan ORF P untuk gen P (polymerase) (Liang, 2009) (Gambar 2.1). Keempat ORF pada genom VHB dikontrol oleh empat promoter (promoter pre-S1, pre- S2, core dan x) dan dua enhancer (Enh1 dan Enh2). Enhancer berfungsi dalam pengaturan transkripsi RNA dan sinyal poliadenilasi yang dibutuhkan untuk replikasi DNA (Seeger et al., 2007).

Gambar 2.1 Susunan genom VHB (genotipe A) 2.

Gen Core

Gen core terdiri dari dua regio: regio precore (nukleotida 1814- 1900) dan regio core (nukleotida posisi 1901-2449) (Gambar 2.2). ORF C merupakan penyandi HBcAg dan HBeAg, sehingga memiliki dua kodon inisiasi untuk pembentukan dua protein yang memiliki fungsi berbeda tersebut. Produk translasi dari kodon inisiasi yang pertama menghasilkan protein precore/core yang merupakan prekursor dari HBeAg, sedangkan translasi kodon inisiasi yang kedua menghasilkan HBcAg (Alexopoulou, 2009).

HBcAg atau protein core merupakan protein utama nukleokapsid (Patient et al., 2009). Terbentuknya nukleokapsid diawali oleh ikatan polimerase virus pada stem loop struktur yang terdapat pada 5’end RNA

pregenomic (Alexopoulou, 2009). Protein core tersusun dari 183-185 asam

amino dengan berat molekul 21 kD (Seeger et al., 2007). Produk kedua dari gen core adalah HBeAg yang merupakan hasil translasi dari mRNA

precore di lumen retikulum endoplasma. HBeAg memiliki berat molekul

yaitu 15 kD (Seeger et al., 2007). HBeAg merupakan antigen yang ditampilkan di permukaan hepatosit dan merupakan antigen sasaran dari imunitas humoral tubuh, dalam hal ini anti-HBe. Sehingga, keberadaan HBeAg penting untuk diagnosis dan eliminasi virus di dalam tubuh (Soewignjo, 2008).

core Gambar 2.2 Gen core (dengan nomor posisi nukleotida).

3. Regio Core Promoter

Core promoter memiliki peran yang sangat penting dalam proses

replikasi VHB, yaitu sebagai penginisiasi transkripsi untuk pembentukan

precore mRNA dan pregenomic RNA (pgRNA). Aktivitas core promoter

diatur oleh elemen enhancer II (EnII) yang terletak pada nukleotida 1685- 1773 (Alexopoulou, 2009). Core promoter tersusun atas Core Upstream (CURS) dan Basic Core Promoter (BCP). CURS

Regulatory Sequences

terbagi menjadi dua regio, yaitu regio A (nukleotida 1636-1703) dan B (nukleotida 1704-1743), yang berfungsi menstimulasi aktivitas BCP (Yuh et al., 1992). Regio BCP (nukleotida 1744-1851) terletak tumpang tindih dengan 3’end gen X dan 5’end regio precore. Regio BCP memiliki elemen yang berfungsi mengatur reverse transcriptase pgRNA dan

cis-acting

precore mRNA (Alexopoulou, 2009). pgRNA berfungsi sebagai cetakan

untai negatif DNA VHB dan hasil translasinya akan membentuk protein

core (HBcAg) dan protein polimerase. Hasil translasi precore mRNA akan

membentuk HBeAg.

B. Kerangka Pemikiran

Kandidat diagnostik Isolat VHB

Sekuensing Kloning gen penyandi regio core promoter dan precore/core

Analisis molekuler regio core promoter dan

precore

/core Vaksin Kandidat diagnostik

Ekspresi mutasi pada regio core promoter Fokus Penelitian

Ekspresi mutasi pada regio precore/core Vaksin

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini bersifat eksploratif. B. Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. C. Objek Penelitian Objek penelitian adalah aliquot sampel HBsAg positif 09IDSKAB-3. D. Rancangan Penelitian Sampel darah dari Komunitas Man Sex with Man. Tes serologi HBsAg

Isolasi DNA PCR

Sekuensing Analisis regio core promoter

E. Instrumen Penelitian 1.

Alat penelitian:

a. Centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Jerman); b. Thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Jerman); c. Micropipet (P1000, P200, P10) (Gilson, Wisconsin, USA); d. Vortex (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA); e. Microwave (Panasonic, Osaka, Jepang); f.

Deepfreezer (New Brunswick Scientific, New Jersey, USA ); g. Tube rack;

h. Apparatus elektroforesis (chamber, comb, dan power

supply ) (BioRad, California, USA); i. Gel documentation (BioRad, California, USA); j. Autoclave (Hirayama, Saitama, Jepang); k.

Refrigerator (Sharp, Osaka, Jepang); l. Class II safety cabinet

(ESCO, Oregon, USA); m. Digital scale (Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland); n. Magnetic stirrer (Cimarex, Colorado, USA); o. Glove; p. Masker; q. Tissue 2.

Bahan penelitian:

a. 96-100% etanol; b. Sampel untuk isolasi DNA; c. Phosphate

Buffered Saline (PBS) ; d. Lysozyme dan lysozyme digestion buffer

(25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.5 mM EDTA, 1% Triton X-100); e. 3 M natrium asetat (pH 5-5.5) dan 2.8 ml isopropanol; f. Tabung microcentrifuge steril; g. Water bath atau heat blocks; h.

PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit (Invitrogen, California, USA); h.

Proteinase K (20 mg/ml); i. RNase A (20 mg/ml); j. GoTaq® Green

Master Mix , 2X (Promega, Wisconsin, USA); k. Nuclease-free l. Ethidium Bromide (EtBr). water; F.

Cara kerja 1. Ekstraksi DNA VHB

Prosedur penggunaan

PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit: a.

Lysate dipersiapkan.

Binding DNA.

1) PureLink™ spin column dipindahkan ke dalam collection tube.

2) Lysate (~640 μl) dengan lysis/binding buffer dan etanol dimasukkan ke dalam

PureLink™ spin column.

3) Column dipusingkan dengan 10.000 g selama satu menit pada suhu ruangan.

4) Collection tube dibuang dan spin column ditempatkan ke dalam collection tube baru.

Pembilasan DNA 1)

Column dibilas dengan 500 μl wash buffer 1 yang disiapkan dengan etanol.

2) Column dipusingkan pada 10.000 g selama satu menit pada suhu ruangan. Kemudian collection tube dibuang dan ditempatkan pada

collection tube baru.

3) Column dicuci dengan menggunakan 500 μl wash buffer 2 yang disiapkan dengan etanol.

4) Column dipusingkan pada kecepatan maksimum selama tiga menit pada suhu ruangan, kemudian collection tube dibuang.

Eluting DNA 1)

Spin column ditempatkan di dalam 1,5 ml microcentrifuge tube steril.

2) DNA dielusikan menggunakan 25-200 μl PureLink™ Genomic

elution buffer .

3) Column diinkubasi pada temperatur ruangan selama satu menit.

4) Column dipusingkan pada kecepatan maksimum selama satu menit pada suhu ruangan.

2. Amplifikasi dan Sekuensi PCR

Hasil ekstraksi digunakan sebagai cetakan/template untuk amplifikasi regio core promoter dan precore/core. Proses amplifikasi dan PCR menggunakan GoTaq® Green Master Mix.

GoTaq® Green Master Mix dicairkan dengan temperatur ruangan.

Reaksi campuran disiapkan di es.

Tabel 3.1 Komponen yang digunakan dalam PCR.

Nuclease-Free Water

Big Dye Deoxy Terminator v1.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems,

Sekuens nukleotida dari hasil amplifikasi ditentukan menggunakan

Ekstensi 72ºC Dua menit Regio core promoter dan precore/core diamplifikasi dengan PCR

menggunakan primer KL-28 dan KL-6 (Okamoto et al., 1990). Hasil

dibaca pada gel agarose 2% yang dicat dengan ethidium bromide (Lusida

et al., 2008).

Tahapan Siklus Suhu Durasi Denaturasi 94ºC Satu menit Annealing 55ºC Satu menit

menit, selanjutnya dilakukan 40 kali siklus PCR yang terdiri dari : Tabel 3.2 Tahapan, suhu, dan durasi dalam siklus PCR.

Kemudian dilakukan proses preheated pada suhu 94ºC selama 5

20 μl

5 μl

Komponen Jumlah

, 10μM (KL28) 1 μl DNA template

Downstream primer

1 μl

, 10μM (KL6)

Upstream primer

12.5 μl

GoTaq® Green Master Mix , 2X

3. Sekuensing dan Analisis Data

Foster City, CA) dan ABI Prism 310 genetic analyzer (Perkin Elmer). Data sekuens yang diperoleh didaftarkan di National Center for Biotechnology

Information GenBank database dengan accession number JQ965948. Data

tersebut dibandingkan dengan data molekuler

VHB di GenBank/DDBJ/EMBL dan dianalisis menggunakan aplikasi MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007). Multiple alignments dilakukan dengan menggunakan metode CLUSTAL W (Lampiran 3-5). Phylogenetic tree dibuat menggunakan metode Neighbor-Joining, Kimura Two-Parameter dan Bootstrap 1000 Replication.

BAB IV HASIL PENELITIAN A. Analisis Molekuler Regio Core Promoter dan Precore/Core Untuk mendapatkan informasi dan data molekuler, isolat 09IDSKAB-3

13 C6 AB493841

10 C3 X75656

19 H AY090454

9 C2 AF533983

18 G AF160501

8 C1 AB074756

17 F X69798

7 B6 DQ463789

16 E X75657

6 B5 AB219427

15 D2 X72702

5 B4 AY031267

14 D1 AY161157

4 B3 AB033555

dibandingkan dengan isolat lain di seluruh dunia yang sudah terdaftar di dalam GenBank/DDBJ/EMBL. Isolat 09IDSKAB-3 dibandingkan dengan

reference isolates (genotipe A-H) dan isolat hasil analisis BLAST.

12 C5 AB241110

2 B1 AB010291

11 C4 AB04870

1 A S50225

Accession Number

Genotipe/ Subgenotipe

No.

Accession Number

Genotipe/ Subgenotipe

No.

Tabel 4.1 Daftar reference isolates.

isolates dari genotipe A-H yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada tabel 4.1.

Isolat 091DSKAB-3 memiliki skor BLAST tertinggi dengan isolat AP011085 yang berasal dari DKI Jakarta (Lampiran 2). Sedangkan reference

3 B2 AF 282917

Berdasarkan sekuens nukleotida regio core promoter dan precore/core, isolat 09IDSKAB-3 dapat dikategorikan dalam VHB genotipe B dan subgenotipe B3. Hal tersebut dapat dilihat dalam phylogenetic tree pada gambar 4.1.

Keterangan: : Isolat sampel.

: Isolat hasil analisis BLAST.

Gambar 4.1 Phylogenetic tree, berdasarkan sekuens nukleotida regio core

promoter dan precore/core isolat 09IDSKAB-3 dibandingkan dengan reference isolates genotipe A-H.

Analisis isolat 09IDSKAB-3 juga dilakukan pada tingkat asam amino dan nukleotida. Hal ini diperlukan untuk mengetahui variasi genetik yang terdapat pada regio core promoter dan precore/core dari isolat tersebut. Hasil dari multiple alignment pada regio core promoter, precore dan core dapat dilihat pada gambar 4.2-4.4.

Gambar 4.2 Hasil multiple alignment regio core promoter VHB isolat

09IDSKAB-3 dibandingkan dengan reference sequences (aa 80-146).

Gambar 4.3 Hasil multiple alignment regio precore pada VHB isolat

09IDSKAB-3 dibandingkan dengan reference sequences yang memiliki genotipe sama (aa 1-29).

Gambar 4.4 Hasil multiple alignment regio core pada VHB isolat

09IDSKAB-3 dibandingkan dengan reference sequences (aa 30-53).

B. Variasi Genetik Regio Core Promoter dan Precore/Core

Berdasarkan hasil multiple alignment isolat 09IDSKAB-3 dengan

reference isolate (isolat AB033555), pada regio core promoter ditemukan

adanya subtitusi basa nukleotida 1726 dari adenine menjadi cytosine (A1726C). Variasi genetik ini menyebabkan perubahan kodon 118 sehingga asam amino aspargine berubah menjadi threonine (N118T).

Pada regio precore ditemukan adanya subtitusi basa nukleotida 1860 dari thymine menjadi cytosine (T1860C). Variasi ini menyebabkan perubahan kodon 16 dari asam amino isoleusine menjadi threonine (I16T). Selain itu ditemukan pula subtitusi basa cytosine menjadi thymine pada nukleotida 1877 (C1877T) pada regio precore. Namun, subtitusi ini tidak menyebabkan perubahan asam amino pada isolat sampel (silent mutation).

Pada regio core ditemukan adanya subtitusi basa nukleotida 1957 dari

guanine menjadi cytosine (G1957C). Variasi genetik ini menyebabkan

perubahan kodon 48 sehingga asam amino leusine berubah menjadi phenylalanine (L48F).

BAB V PEMBAHASAN Berdasarkan phylogenetic tree, sekuens nukleotida regio core promoter

dan precore/core isolat 09IDSKAB-3 dapat dikategorikan dalam VHB genotipe B dan subgenotipe B3.

Berdasarkan hasil analisis BLAST, isolat 09IDSKAB-3 memiliki kemiripan sekuens nukleotida tertinggi dengan isolat AP011085. Isolat AP011085 merupakan isolat yang berasal dari DKI Jakarta yang juga dikategorikan dalam VHB genotipe B dan subgenotipe B3. Menurut Mulyanto et al. (2009) VHB genotipe B subgenotipe B3 merupakan genotipe yang berasal dari Indonesia. Hingga saat ini belum ada laporan yang menyatakan adanya penemuan VHB genotipe B subgenotipe B3 di negara lain selain di Indonesia. Lusida et al. (2008) dalam penelitiannya mengenai distribusi genotipe dan subgenotipe VHB di Indonesia, mengemukakan bahwa ternyata VHB genotipe B merupakan kelompok genotipe yang terdistribusi dominan di wilayah barat Indonesia (Jawa dan Sumatera), sedangkan yang terdistribusi dominan di wilayah timur Indonesia (Papua) adalah kelompok genotipe C dan D. Hal tersebut sesuai dengan hasil penelitian ini, bahwa isolat 09IDSKAB-3 yang berasal dari Jawa Tengah termasuk dalam kategori VHB genotipe B subgenotipe B3.

A. Regio Core Promoter Isolat 09IDSKAB-3

memiliki peran yang sangat penting dalam proses

Core promoter

replikasi VHB, yaitu sebagai penginisiasi transkripsi untuk pembentukan

precore mRNA dan pregenomic RNA (pgRNA). Aktivitas core promoter

diatur oleh elemen enhancer II (EnII) yang terletak pada nukleotida 1685- 1773 (Alexopoulou, 2009). Core promoter tersusun atas Core Upstream (CURS) dan Basic Core Promoter (BCP). CURS

Regulatory Sequences

terbagi menjadi dua regio, yaitu regio A (nukleotida 1636-1703) dan B (nukleotida 1704-1743), yang berfungsi menstimulasi aktivitas BCP. Regio BCP (nukleotida 1744-

1851) terletak tumpang tindih dengan 3’ end gen X dan 5’ end regio precore (Yuh et al., 1992). Regio BCP memiliki elemen cis-

acting yang berfungsi mengatur reverse transcriptase pgRNA dan precore

mRNA (Alexopoulou, 2009). pgRNA berfungsi sebagai cetakan untai negatif DNA VHB dan hasil translasinya akan membentuk protein core (HBcAg) dan protein polimerase, sedangkan hasil translasi precore mRNA akan membentuk HBeAg. Oleh sebab itu, mutasi yang terjadi pada regio core

promoter dapat menyebabkan dampak klinis terhadap sel penjamu karena

terjadi perubahan transkripsi precore mRNA dan pgRNA VHB (Tatsukawa et al., 2011).

Mutasi yang sering terjadi pada regio core promoter adalah mutasi ganda A1762T/G1764A pada BCP. Mutasi A1762T menyebabkan perubahan kodon 130 sehingga asam amino lysine berubah menjadi methionine (K130M), sedangkan mutasi G1764A menyebabkan perubahan kodon 131 sehingga asam amino valine berubah menjadi isoleusine (V131I) (Juniastuti et al., 2010). Pengaruh biologis mutasi ganda VHB masih belum diketahui, tetapi mutasi tersebut sering ditemukan pada berbagai macam keadaan infeksi

VHB. Hingga saat ini pengaruh yang sudah jelas diketahui adalah penurunan produksi HBeAg dan peningkatan replikasi virus (Buckwold et al., 1996; Li et al., 1999). Penurunan produksi HBeAg disebabkan penurunan produksi mRNA, yang di sisi lain ternyata menyebabkan peningkatan produksi

precore

pgRNA, proses enkapsidasi, dan protein core yang akan mengakibatkan peningkatan replikasi virus. Beberapa penelitian melaporkan mutasi ganda ini dapat menyebabkan terjadinya status HBeAg negatif (Horikita et al., 1994; Hou et al., 1999; Okamoto et al., 1994). Ditinjau dari manifestasi klinis, mutasi ini ditemukan secara signifikan pada pasien hepatitis B kronis, hepatitis fulminan, dan karsinoma hepatoseluler (Baumert et al., 1996; Buckwold et al., 1996).

Hasil analisis pada isolat 09IDSKAB-3 tidak ditemukan adanya mutasi ganda BCP, sehingga faktor risiko isolat 09IDSKAB-3 terhadap hepatitis B kronis, hepatitis fulminan, dan karsinoma hepatoseluler maupun terkait dengan status HBeAg negatif tidak ada.

Mutasi yang ditemukan pada isolat 09IDSKAB-3 adalah mutasi A1726C yang menyebabkan perubahan asam amino aspargine menjadi

threonine (N118T). Nukleotida 1726 terletak pada CURS, sehingga mutasi

ini mungkin akan menyebabkan terganggunya aktivitas BCP yang berdampak pada gangguan proses replikasi virus. Menurut penelitian Yin et al. (2011) mutasi A1726C spesifik ditemukan pada keadaan klinis sirosis hepatis, sehingga isolat 09IDSKAB-3 kemungkinan memiliki faktor risiko terhadap sirosis hepatis dan mengalami perubahan pada proses replikasinya.

B. Regio Precore/Core (Gen Core) Isolat 09IDSKAB-3

Regio precore/core memiliki dua start codon yang menginisiasi pembentukan dua protein yang berbeda. Inisiasi AUG (start codon) yang pertama akan membentuk protein protein precore/core yang merupakan prekursor HBeAg, sedangkan yang kedua akan membentuk protein core (HBcAg) (Alexopoulou, 2009).

HBeAg merupakan protein VHB yang beredar di dalam darah dan diproduksi ketika virus dalam fase replikasi, sedangkan HBcAg merupakan protein penyusun nukleokapsid virus (Liang, 2009). Dalam pembentukan virion VHB, protein core akan menyelubungi pgRNA dan polimerase yang dikenal sebagai proses enkapsidasi. Proses enkapsidasi diinisiasi penempelan polimerase pada sinyal enkapsidasi (ε), yaitu sebuah struktur berbentuk stem

loop

yang terletak pada ujung 5’ pgRNA. Selain berfungsi dalam pengepakan pgRNA, sinyal enkapsidasi berperan dalam menginisisasi proses transkripsi (Alexopoulou, 2009).

Mutasi regio precore/core yang paling sering ditemukan dan dilaporkan adalah mutasi G1896A. Mutasi ini menyebabkan perubahan asam amino

tryptophan menjadi stop codon sehingga terjadi kegagalan pembentukan

HBeAg (Okamoto et al., 1990). HBeAg tidak memiliki peran penting dalam proses replikasi virus, tetapi diyakini bahwa HBeAg merupakan target imunitas humoral dan seluler, sehingga kegagalan pembentukan HBeAg menyebabkan terbentuknya escape mutant yang berkontribusi terhadap persistensi virus (Carman et al., 1993; Soewignjo, 2008). Mutagenesis dari

wild type menjadi mutan G1896A membutuhkan waktu beberapa tahun dan

prosesnya terjadi selama fase replikasi virus (Okamoto et al., 1990). Mutasi ini dikaitkan dengan banyak kondisi klinis hepatitis, dari tingkatan ringan hingga berat (Friedt et al.,1999; Juniastuti et al., 2010; Kao et al., 2000).

Kramvis dan Kew (2005) menyatakan bahwa faktor yang berkontribusi terhadap frekuensi terjadinya mutasi ini adalah genotipe virus. Mutasi G1896A dilaporkan hanya ditemukan pada pasien VHB dengan genotipe B,

D, E serta sebagian kecil genotipe C dan F. Genotipe tersebut memiliki basa

thymine pada nukleotida 1858 yang merupakan pasangan nukleotida 1896

pada stem loop pgRNA. Ikatan basa thymine-guanine yang tidak stabil, memudahkan terjadinya mutasi yang membentuk ikatan basa thymine-

adenine yang lebih stabil yang dibutuhkan untuk membentuk sinyal

enkapsidasi yang lebih kuat. Hal tersebut dapat dilihat pada gambar 5.1 (Alexopoulou, 2009).

Gambar 5.1 Stem loop structure, perubahan ikatan T-G menjadi T-A

dibutuhkan untuk membentuk sinyal enkapsidasi yang lebih kuat (Alexopoulou, 2009).

Mutasi lain regio precore yang menyebabkan hilangnya produksi HBeAg adalah T1815C dan A1846T (Okamoto et al., 1990). Mutasi T1815C menyebabkan hilangnya start codon karena asam amino methionine berubah menjadi threonine. Mutasi A1846T tidak menyebabkan perubahan asam amino (silent mutation). Namun demikian, Chen et al. (2006) dalam penelitiannya menyatakan bahwa mutasi ini signifikan ditemukan pada pasien dengan status HBeAg negatif.

Mutasi G1896A, T1815C, dan A1846T tidak ditemukan dalam penelitian ini. Variasi nukleotida yang ditemukan pada regio precore adalah

silent mutation C1877T. Subtitusi T1860C mungkin akan mengganggu proses

pembentukan HBeAg karena nukleotida 1860 terletak pada regio precore yang hasil translasi akhirnya membetuk HBeAg. Sedangkan pada regio core ditemukan adanya subtitusi basa nukleotida 1957 dari guanine menjadi

cytosine (G1957C). Subtitusi ini mungkin akan mempengaruhi komposisi

nukleokapsid virus karena nukleotida 1957 terletak pada regio core yang translasi akhirnya membentuk HBcAg.

Hingga saat ini belum ada penelitian yang melaporkan manifestasi dari mutasi yang ditemukan pada regio precore/core isolat 09IDSKAB-3. Namun ditinjau dari tidak ditemukannya mutasi G1896A, T1815C, dan A1846T kemungkinan isolat 09IDSKAB-3 tidak terkait dengan status HBeAg negatif.

BAB VI PENUTUP A. Simpulan Berdasarkan regio core promoter dan precore/core, isolat

09IDSKAB-3 termasuk ke dalam kategori VHB genotipe B dan subgenotipe B3. Sedangkan berdasarkan analisis BLAST, isolat

09IDSKAB-3 memiliki skor BLAST tertinggi dengan isolat AP11085 yang berasal dari DKI Jakarta dengan genotipe B subgenotipe B3.

Mutasi yang terjadi pada isolat 09IDSKAB-3 mungkin mempengaruhi proses replikasi serta produksi HBcAg dan HBeAg virus.

B. Saran

Diperlukan penelitian lebih lanjut pada seluruh genom VHB untuk mengetahui implikasi dari variasi nukeotida maupun asam amino isolat

09IDSKAB-3, terutama yang terkait dengan virulensi, replikasi, patogenesis, diagnosis, terapi, dan vaksinasi.

Analisis Molekuler Regio Core Promoter Dan Precore/Core Isolat Virus Hepatitis B 09idskab-3