IDENTIFIKASI MIKROORGANISME BEBBY SYLVIA. docx

BIOTEKNOLOGI

IDENTIFIKASI MIKROORGANISME

Disusun Guna Memenuhi Tugas pada Materi Perkuliahan
Bioteknologi

Dosen: Dr. F. M. Titin Supriyanti, M.Si

OLEH:

BEBBY SYLVIANA SYAMSURI
NIM. 1502700

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA
SEKOLAH PASCASARJANA
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
BANDUNG
2016

IDENTIFIKASI ESCHERICHIA COLI

1. Identifikasi Fisik
a. Klasifikasi
Klasifikasi Escherichia coli menurut Songer dan Post (2005) adalah sebagai berikut:
Kingdom : Bacteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Ordo : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies : Escherichia coli
b. Morfologi
Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang pendek, tidak
tahan asam dan memiliki panjang sekitar 2 μm, diameter 0,7 μm, lebar 0,4-0,7μm dan
bersifat anaerob fakultatif. Escherichia coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan
halus dengan tepi yang nyata.
2. Teknik observasi bakteri Escherichia coli
Berdasarkan morfologinya, bakteri Escherichia coli dapat diidentifikasi dengan
menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran lensa objektif 1000-2000 kali yang
dapat melihat mikroorganisme dengan ukuran 1 μm-100 μm.
Diidentifikasi

menggunakan
mikroskop cahaya

Sampel mikroorganisme yang
mengandung E.coli dalam cawan petri

Didapatkan
penampang
mikroorganisme

Escherichia coli
3. Teknik Pewarnaan

a.

Teknik pewarnaan negatif E.coli
Pengamatan morfologi dan penentuan jenis bakteri dengan pewarnaan
negative berdasarkan penambahan tetesan nigrosin pada ujung gelas objek bersama
inokulum yang digeserkan dengan gelas objek lain secara perlahan-lahan hingga
membentuk lapisan tipis dan diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 10.

Pengamatan morfologi bakteri dengan menggunakan teknik pewarnaan negatif
dimana yang akan terwarnai yaitu latar belakangnya yang berwarna hitam sedangkan
bakteri tidak berwarna menggunakan zat warna nigrosin.
Pewarnaan pada bakteri Escherichia coli menunjukkan bakteri berbentuk
batang lurus dan bersifat transparan. Hal ini karena bakteri Escherichia coli
mempunyai dinding sel yang bermuatan negatif yang sulit menyerap cat atau pewarna
yang juga bermuatan negatif sehingga bagian yang terwarnai adalah bagian latar
belakang (berwarna gelap) sehingga bentuk bakteri lebih mudah terlihat.

b. Teknik pewarnaan sederhana E.coli
Pewarnaan sederhana memungkinkan dibedakannya bakteri dengan berbagai
morfologi dan strukturnya. Pewarna yang biasa dipakai dalam pewarnaan umum
adalah biru metilen. Biasanya hanya untuk membedakan sel bakteri dengan latar
belakangnya saja tanpa bermaksud melakukan kajian diferensiasi.
Pewarnaan sederhana dilakukan dengan alasan yakni karena bakteri transparan
dan tidak berwarna. Dengan dilakukan pewarnaan, bakteri E. coli akan tampak
walaupun tidak jelas strukturnya hanya saja mampu dibedakan dan terlihat saling
terpisah antar satu individu bakteri dengan individu lainnya.
Proses pewarnaan dimulai dengan mengambil suspensi bakteri yang
diletakkan di atas sebuah kaca objek kemudian difiksasi di atas api dan ditambahkan

zat warna metilen blue, lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop. Pada
pewarnaan ini yang terwarnai adalah bakterinya, hal ini disebabkan karena zat warna
yang digunakan itu bersifat basa (positif) sedangkan bakteri umumnya bersifat
negatif. Oleh karena itu zat warna dan bakteri saling berikatan sehingga zat warna
tersebut dapat melekat pada dinding sel bakteri sehingga memberikan warna biru pada
bakteri tersebut.
Hasil pengamatan mikroskop cahaya pada pembesaran 40x sebagai berikut:
Bentuk E. coli dilihat di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 40x
adalah batang (basil) yang membentuk koloni yang tersusun seperti rantai
yang memanjang. E. coli bereaksi dengan zat warna biru metilen, karena E.
coli bersifat asam (acidofil) sedangkan biru metilen merupakan zat warna
basa.

c.

Teknik pewarnaan diferensial
 Pewarnaan gram
Teknik pewarnaan gram bakteri dengan melakukan pengecatan gram pada
bakteri menggunakan tetesan sebagai berikut:
Gram A (Kristal violet)

Gram B (Iodium)
Gram C (Etanol), dan
Gram D (Safranin),
Gram tersebut diteteskan secara berturut-turut dan diamati di bawah mikroskop,
dimana bakteri yang bersifat Gram-positif akan berwarna ungu karena mengikat zat
warna kristal violet, dan bakteri Gram-negatif akan berwarna merah karena mengikat
zat warna safranin.
Teknik pewarnaan dilakukan untuk mengetahui morfologi mikroorganisme
dengan lebih baik, mengidentifikasi struktur sel mikroorganisme, dan membedakan
mikroorganisme yang diteliti dengan mikroorganisme lain yang serupa. Tahapan dan
hasil analisis pewarnaan Gram ditunjukkan dalam gambar berikut:

Hasil pewarnaan : bakteri dengan warna merah dan berbentuk basil merupakan
bakteri E.coli dan merupakan bakteri gram negatif
 Acids fast strain

Pengamatan warna bakteri dengan melakukan pengecatan tahan asam
menggunakan zat warna karbol fuchsin, lalu dicuci dengan alcohol asam sampai
berwarna kemerahan dan penambahan metilen biru kemudian diamati dibawah
mikroskop.

Untuk pewarnaan tahan asam dilakukan dengan mengambil suspensi bakteri
kemudian diletakkan diatas kaca objek lalu difiksasi dan ditambahkan zat warna
karbol fuchsin dan dicuci dengan air mengalir dan ditambahkan alkohol asam, dan zat
warna selanjutnya yaitu metilen blue. Prinsip pengikatan zat warna pada pewarnaan
ini sama dengan pada pewarnaan Gram. Hasil akhir yang diperoleh yaitu, apabila
bakterinya tahan asam maka akan berwarna merah dari karbol fuchsin, dan apabila
bakterinya tidak tahan asam maka akan berwarna biru dari metilen blue. Bakteri
E.coli, termasuk bakteri yang tahan asam.
 Deteksi Asal Mikroba
Pada deteksi asal mikroba ini, jika bakteri berbentuk kokus berasal dari manusia
sedangkan jika bakteri berbentuk basil berasal dari lingkungan. Bentuk bakteri ini
setelah diidentifikasi dengan berbentuk basil. Jadi, dapat disimpulkan bakteri berasal
dari lingkungan.
 Structural Strain
Pewarnaan structural strain dengan pewarnaan spora dengan metode
Schaeffer-Fulton, endospore pertama kali diwarnai dengan malachite green dengan
proses pemanasan. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospore dan
warna merah muda pada sel vegetatifnya. Escherichia coli akan berwarna merah
muda setelah pengecatan dari safranin. E.coli berarti tidak memiliki endospore, hanya
memiliki sel vegetative. Sel vegetative tidak tahan terhadap pewarnaan. Saat diwarnai

dengan malachite, sel vegetative tidak dapat mengikat malachite sehingga saat
dilunturkan, warna malachite akan hilang. Kemudian saat diberi safranin, sel
vegetative dapat mengikat warna kembali sehingga warna sel menjadi merah muda.
4. Teknik Pengkulturan
 Aseptik
Media untuk membiakan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran
terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme.
Pemindahabiakan mikroba yang dibiakan harus sangat hati-hati dan mematuhi
prosedur laboratorium agar tidak terjadi kontaminasi (Dwijoseputro 1998).
Tekniknya sebagai berikut:
 Sterilisasi: mematikan mikroba: endotoksin tidak punah
 Desinfeksi: tidak mematikan bentuk vegetatif mikroba (spora, virus, dll
resisten)
 Sanitasi: desinfeksi dengan pencucian
 Antiseptis: menghancurkan mikroba pada permukaan jaringan hidup
 Inokulasi
Metode Gores

Teknik pengkulturan menggunakan teknik gores untuk mengisolasi satu koloni
yang terpisah dari koloni lainnya. Inokulum digoreskan dengan pola zig-zag seperti

gambar:

Koloni E.coli yang sudah
berkembang pada media EMBA

EMBA adalah media selektif dan media diferensial. Media ini mengandung Eosin
dan metilen biru, yang menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif, maka
media ini dipilih untuk bakteri Gram negatif. EMBA juga mengandung karbohidrat
laktosa, dengan adanya karbohidrat laktosa bakteri Gram negatif terdiferensiasi
berdasarkan pada kemampuan mereka untuk memfermentasi laktosa. Warna media
sebelum pemupukan bakteri berwarna merah keunguan. Perubahan warna hijau
metalik pada media EMBA karena Escherichia coli dapat memfermentasi laktosa
yang mengakibatkan peningkatan kadar asam dalam media. Kadar asam yang
tinggi dapat mengendapkan methylen blue dalam media EMBA (Cheeptham, 2012
dan Lindquist, 2004).
Selanjutnya dilakukan isolasi sel tunggal dengan menggunakan kuarmikro.
Kemudian satu sel tunggal di pisahkan ke medium steril. Didapatkan sel tunggal
bakteri.

Media selektif E.coli:

a. Media mac conkay agar (mca)
Escherichia coli merupakan salah satu bakteri gram negative (merah) sehingga
pertumbuhannya cocok dengan media mac conkay agar (mca). Pertumbuhan

bakteri yang baik ditandai dengan koloni bulat, sedang-besar, keeping-cembung,
merah keruh dan smooth.
b. media endo agar
Endo agar merupakan media yang baik untuk pertumbuhan bakteri escherichia
coli. Pertumbuhan yang baik ditandai dengan koloni besar-besar, elevasi cembung,
smooth dan berwarna merah tua metalik.
c. media emba (eosin methylen blue agar)
Pada media ini pertumbuhan bakteri dapat dilihat dengan koloni tampak sedang,
keeping, smooth, berwarna hijau metalik dan terkadang ditengahnya koloni
terdapat warna ungu.
5. Uji Biokimia
a. Tsia
seluruh bagian pada media tsia mengalami perubahan menjadi kuning, baik pada
lereng ataupun dasar. Ini menunjukkan bahwa bakteri mampu menfermentasikan ketiga
gula-gula dalam media tsia (glukosa, laktosa, dan sukrosa) sehingga menghasilkan asam
yang membuat media berwarna kuning. Adanya ruangan kosong atau udara pada media

menandakan bahwa bakteri mampu menghasilkan gas.
b. Gula-gula
hasil positif didapatkan pada seluruh gula-gula yang digunaka baik glukosa,
maltose, laktosa, sukrosa dan manitol. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan
warna indicator yang terdapat dalam media ini yaitu dari biru menjadi kuning. Perubahan
warna tersebut disebabkan karena bakteri yang tumbuh di dalamnya mampu
memfermentasikan gula-gula tersebut berupa produk asam.
c. Sim
s (sulfur) : bakteri tidak menghasilkan sulfur. Hal ini ditandai dengan tidak
terbentuknya endapan hitam pada media, karena bakteri ini tidak mampu mendesulfurasi
cysteine yang terkandung dalam media sim.
i (indol) : reaksi indol hanya bisa dilihat ketika pertumbuhan bakteri pada media
ini ditambahkan dengan reagen covac’s. Indol dikatakan positif jika terdapat cincin merah
pada permukaannya. Warna merah dihasilkan dari resindol yang merupakan hasil reaksi
dari asam amino tryptopan menjadi indol dengan penambahan covac's. Bakteri yang
mampu menghasilkan indol menandakan bakteri tersebut menggunakan asam amino
tryptopan sebagai sumber carbon. Pada hasil pengamatan diperoleh indol positif sehingga
dapat disimpulkan bakteri yang tumbuh mampu menggunakan asam amino tryptopan
sebagai sumber carbonnya.
m (motility) : pergerakan bakteri dapat terlihat pada media ini berupa berkas

putih di sekitar tusukan. Adanya pergerakan ini bisa dilihat karena media sim merupakan
media yang semi solid. Pada hasil pengamatan diperoleh motility positif. Hal ini
menandakan bakteri mempunyai alat gerak dalam proses pertumbuhannya.
d. Mr :
setelah ditambahkan dengan indicator metil red, media berubah menjadi merah
(positif). Berarti terjadi fermentasi asam campuran (asam laktat, asam asetat, dan asam
formiat) oleh bakteri.

vp : setelah penambahan koh 10 % dan α-nafto 1 %, warna media tetap tidak
berubah (negative). Ini disebabkan bakteri tidak memfermentasikan butanadiol oleh
bakteri.
e. Urease
hasil yang didapat adalah negatif karena warna media tidak berubah menjadi
warna merah muda.
f. Simmon’s citrate
didapatkan hasil negatif (-), sebab tidak terjadi perubahan warna pada media. Ini
disebabkan bakteri e.coli merupakan salah satu spesies yang tidak menggunakan sitrat
sebagai sumber karbon untuk metabolisme dengan tidak menghasilkan suasana basa.
Di bawah ini salah satu contoh hasil uji biokimia E.coli

Gambar Hasil uji indol, MR, VP, motilitas, citrat, urea, TSIA dan Hasil uji gulagula (glukosa, laktosa, sukrosa, galaktosa, fruktosa, maltosa dan
manitol) pada E. coli