2. Triana Wulansari (1548201106) - KLT kelompok 3

Kelompok 3 : 1. Putri Amelia (1548201088)

2. Triana Wulansari (1548201106)

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Jurnal : Mengetahui dan memahami teknik pemisahan senyawa dalam suatu

ekstrak daun sirih (Piper betle folia) dengan menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.

KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki system pelarut dan system penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi.

 Manfaat KLT 1. Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.

2. Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.

3. Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.

4. Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif campuran senyawa obat.

 Prinsip Percobaan KLT Suatu metode pemisahan komponen kimia yang berdasarkan prinsip partisi dan adsorpsi secara selektif, komponen kimia bergerak naik mengikuti cairan pengembang karena daya serap adsorben terhadap komponen-komponen kimia tidak sama maka komponen dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda dan hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan. Pemisahan senyawa pada ekstrak daun sirih dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan silika gel GF 254 sebagai fase diam dan fase gerak campuran hexan-eti asetat 10 : 1 (non polar) dan 2 : 3 (polar).

 Pelaksanaan KLT

1. Fase Diam

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi.

Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan dalam kromatografi lapis tipis adalah sebagai berikut :

1. Silika gel Ada beberapa jenis silika gel, yaitu :

a. Silika gel G Silika gel G adalah silika gel yang mengandung 13 % kalsium sulfat sebagai perekat. Jenis silika gel ini biasanya mengandung ion logam, terutama ion besi.

Kandungan ion besi dapat dihilangkan dengan mengembangkan plat TLC silika gel G dengan sstem pelarut metanol : asam HCl pekat 9 : 1.

b. Silika gel H Perbedaan silika gel G dan silika gel H ialah, bahwa silika gel H tidak mengandung perekat kalsium sulfat. Silika gel H dipakai untuk pemisahan yang bersifat spesifik, terutama lipida netral.

c. Silika gel PF Jenis silika gel ini diketemukan belakangan, yang dibuat sedemikian rupa sehingga senyawa-senyawa organik terikat pada plat ini dapat mengadakan fluoresensi. Oleh karena itu visualisasinya dapat dikerjakan dengan menempatkan plat yang telah dikembangkan di dalam ruangan gelap atau dengan sinar ultra violet yang bergelombang pendek.

2. Alumina Penggunaan alumina dalam TLC, yang semula diperkenalkan oleh peneliti dari Cekoslowakia, tidak sesering silika gel. Sebenarnya alumina netral mempunyai kemampuan untuk memisahkan bermacam-macam senyawa, seperti terpena, alkaloid, steroid, dan senyawa-senyawa alisklik, alifatik, serta aromatik. Sebagai zat perekat alumina tidak mengandung zat perekat, memepunyai sifat alkalis dan dapat digunakan baik tanpa maupun dengan aktivasi (Keese,R. dkk, 1982)

3. Kieselguhr Kieselguhr merupakan adsorben yang lebih lemah dari silika gel dan alumina, oleh karena itu lebih cocok untuk memisahkan senyawa- senyawa polar

(Adnan, M., 1997)

2. Fase Gerak Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT - teknik yang sensitif.

Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau ammonia masing-masing akan meningkatkan solute-solut yang bersifat basa dan asam.

 Proses KLT Aplikasi (Penotolan) Sampel Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 μl. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl, maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.

Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak sedikit mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan). Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh. Gambar berikut ini menunjukkan posisi dari totolan sampel, posisi lempeng dalam bejana serta ketinggian eluen dalam bejana :

Gambar 1 : Lempeng dalam beaker(chamber) dengan garis pembatas

penotolan sampel dan batas eluen.

Gambar 2 : Lempeng dengan penunjukan kenaikan bercak dan batas atas pengelusian.

Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas. Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :

Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan - bereaksi secara kimia dengan solute yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas warna bercak. Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet yang dipasang panjang - gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluorosensi terang pada dasar yang berfluorosensi seragam. Lempeng yag diperdagangkan dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa fliorosen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar fluorosensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen fluorosensi setelah dilakukan pengembangan. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu - dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklat-coklatan. Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup. -

Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu instrument yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyera[p sinar akan dicatat sebagai puncak (peak) dalam pencatatan (recorder).

Perhitungan Nilai Rf (4) Gambar 3 : Perbandingan jarak bercak dan jarak tempuh eluen

Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh eluen, dengan persamaan :

Jarak yang ditempuh senyawa terlarut

Alat Alat yang digunakan dalam percobaan kromatograf lapis tipis adalah lempeng, pinset, pipa kapiler, vial.
Bahan Bahan yang digunakan dalam percobaan kromatograf lapis tipis adalah aluminium foil, ekstrak awal, ekstrak latur heksan, ekstrak larut butanol jenuh air, etil asetat, heksan, metanol.
Cara Kerja

10. Kemudian dikeringkan dan dimasukkan dalam chamber.

Rf noda ekstrak awal Jarak yang ditempuh senyawa terlarut

Perhitungan Eluen non polar

12. Ukur jarak noda dan jarak pelarut. Kemudian dihitung nilai R

4 10 %.

11. Dikeluarkan kemudian dilihat nodanya pada UV 254 dan 366 nm. Diberi tanda pada lempeng nodanya. Lalu disemprot dengan H

9. Setelah jenuh Sampel ditotolkan ke lempeng menggunakan pipa kapiler

R f = Jarak yang ditempuh pelarut

8. Disiapkan 2 chamber yang masing-masing dijenuhkan dengan kertas saring dengan pelarut etil dan heksan 10 : 1 dan 2 : 3

7. Larutkan masing-masing ekstrak heksan, tidak larut hexan, dan ekstrak awal dengan metanol.

6. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan

5. Identifkasi Kromatograf Lapis Tipis

4. Lempeng siap digunakan.

3. Lempeng dikeluarkan dan digunting dengan ukuran tertentu

2. Lempeng KLT diaktifkan dalam oven

1. Penyiapan Lempeng KLT

Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa pustaka menyatakan nilai Rf yang baik yang menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar antara 0,2-0,8.

2 SO

2,54 cm =

5,8 cm = 0.438

Rf noda larut heksan Jarak yang ditempuh senyawa terlarut

R =

Jarak yang ditempuh pelarut 2,74 cm

= 5,8 cm

= 0,473 Rf noda larut butanol jenuh air

Jarak yang ditempuh senyawa terlarut R =

Jarak yang ditempuh pelarut 1,52 cm

= 5,8 cm

= 0,263

Eluen polar

Rf noda ekstrak awal Jarak yang ditempuh senyawa terlarut

R f = Jarak yang ditempuh pelarut 5,4 cm

= 5,7 cm

= 0.948 Rf noda larut heksan Jarak yang ditempuh senyawa terlarut

R f = Jarak yang ditempuh pelarut 5,5 cm

= 5,7 cm

= 0,965 Rf noda larut butanol jenuh air

Jarak yang ditempuh senyawa terlarut R f =

Jarak yang ditempuh pelarut 4,61 cm

= 5,7 cm

= 0,81  Cara membaca KLT

cara membaca KLT dapat ditentukan dari nilai Rf dan HRf yang

telah dihitung melalui proses KLT. Plat KLT yang sudah ditotoli sampel

dideteksi di UV 254nm dan UV 366nm kemudian akan terlihat bercak

lalu disemprotkan dengan pereaksi dari masing-masing senyawa yang

didentifkasi. Dari bercak yang ditunjukan sampel yang telah dideteksi

dengan UV akan didapatkan nilai Rf.

DAFTAR PUSTAKA

1. Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi

Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar

2. Anonim. http:// repository.usu.ac.id/ bitstream/ 123456789/ 21191/ 4/

Chapter% 20II.pdf. Diakses pada tanggal 31 Maret 2014

3. Gritter, Roy J. dkk. (1991). “Pengantar Kromatografi”. Edisi II. Penerbit ITB, Bandung.

4. http://www.scribd.com/doc/54821830/11/ Spektrofotometer Anonim.

UV-Vis. Diakses pada tanggal 31 Maret 2014

2. Triana Wulansari (1548201106) - KLT kelompok 3