Hubungan kadar alkaline phosphatase pada saliva dengan tahap maturasi vertebrata servikalis pada perempuan usia tumbuh kembang Chapter III VI

BAB 3
METODE PENELITIAN

3.1 Jenis dan Desain Penelitian
Jenis penelitian ini adalah penelitian analitik observasional dengan desain
penelitian cross-sectional karena pengukuran variabel pada subjek hanya dilakukan
pada satu waktu.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
3.2.1 Tempat penelitian
Pengumpulan sampel penelitian dilakukan di Klinik Spesialis Ortodonti
RSGMP FKG USU, sedangkan pemeriksaan sampel penelitian dilakukan di
Laboratorium Terpadu FK USU.
3.2.2 Waktu penelitian
Waktu yang dibutuhkan untuk melaksanakan penelitian ini adalah selama satu
bulan (Oktober - November 2016).
3.3 Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian
3.3.1 Populasi penelitian
Populasi penelitian adalah permpuan usia 8-15 tahun yang datang ke klinik
ortodonti RSGMP FKG USU dan murid SLTP Namira Medan.

Universitas Sumatera Utara

3.3.2 Sampel penelitian
Sampel pada penelitian ini adalah saliva dan Rontgen sefalometri lateral yang
diperoleh dari perempuan usia 8-15 tahun yang sesuai dengan kriteria inklusi dan
eksklusi.
Teknik pengambilan sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah
consecutive sampling. Subjek yang dipilih pada penelitian ini ditentukan oleh kriteria
sebagai berikut :
a. Kriteria Inklusi:


Perempuan.



Usia antara 8-15 tahun.



Keadaan umum baik.



Tidak menderita penyakit sistemik.



Kebersihan rongga mulut baik dan memiliki jaringan periodontal yang sehat.



Tidak pernah mengalami trauma pada daerah kepala dan leher.



Subjek bersedia mengikuti penelitian

b. Kriteria Ekslusi:


Ada kelainan metabolisme tulang.



Saat penelitian subjek sedang mengkonsumsi suplemen kalsium dan vitamin
D.



Saat penelitian subjek sedang menjalani terapi antibiotik dan anti inflamasi.

Universitas Sumatera Utara

3.3.3 Besar sampel
Perkiraan besar sampel yang dibutuhkan pada penelitian ini ditentukan dengan
rumus:

2σ2 (Z(1-α/2) + Z(1-β))2
n1 = n2 ≥

(µ 1 - µ 2)2

dimana:
Z(1-α/2) = deviat baku alpha, untuk α = 0,05 maka nilai baku normalnya 1,96.
Z(1-β)) = deviat baku betha, untuk β = 0,10 maka nilai baku normalnya 1,282.
Sd = σ = Standar ALP laki-laki dan perempuan = 485,425 (Kepustakaan)9
µ 1 - µ 2 = Beda rerata yang bermakna ditetapkan sebesar 110.
Dari perhitungan besar sampel, maka jumlah sampel minimal pada setiap
kelompok adalah sebanyak 18, total jumlah sampel pada penelitian ini adalah
sebanyak 57 orang subjek.
3.4 Variabel Penelitian
3.4.1 Variabel bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah tahap maturasi vertebra servikalis
yang dilihat pada Rontgen foto sefalometri lateral.
3.4.2 Variabel tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar alkaline phosphatase pada
saliva pasien yang akan diukur dengan uji spektrofotometri.

Universitas Sumatera Utara

3.4.3 Variabel terkendali
Variabel yang dapat dikendalikan pada penelitian ini adalah:
 Jenis kelamin: perempuan.
 Usia subjek: 8-15 tahun.
 Kesehatan jaringan periodontal.
 Waktu pengambilan saliva: pukul 10.00-12.00 WIB.
 Metode pengambilan saliva; passive drool.
 Keterampilan operator dalam memeriksa kadar alkaline phosphatase.
 Ras: proto melayu dan deutro melayu.
3.4.4 Variabel tak terkendali
Variabel yang tidak dapat dikendalikan pada penelitian ini adalah:
 Diet.
 Suku.

Universitas Sumatera Utara

3.5 Definisi Operasional
Definisi operasional, cara ukur, alat ukur dan skala ukur masing-masing
variabel penelitian dijelaskan dalam Tabel 3.1.
Tabel 3.1. Definisi operasional, alat ukur dan skala ukur dari variabel bebas,

tergantung dan terkendali
Variabel

Definisi operasional

Maturasi
vertebra
servikalis
Kadar ALP

Kematangan tulang vertebra servikalis
yang dinilai berdasarkan analisa
Hassel dan Farman
Aktivitas ALP pada cairan saliva
subjek penelitian dengan satuan
Internasional Unit per Liter (IU/L).

Sampel
saliva

Cairan sekresi eksokrin berasal dari
kelenjar saliva subjek penelitian yang
diperoleh dengan metode passive
drool
Jenis kelamin pasien yang menjadi
subjek penelitian
Perhitungan usia yang dimulai dari
saat kelahiran sampai saat akan
menjadi subjek penelitian

Jenis
kelamin
Usia

Skala
ukur
Foto Rontgen Ordinal
sefalometri
lateral
Uji

Rasio
spektrofotometri
Alat ukur

Tabung
eppendorf

Rasio

Ciri-ciri seks Nominal
sekunder
Tanggal lahir Rasio

3.6 Bahan dan Alat Penelitian
3.6.1 Bahan


Saliva perempuan usia 8-16 tahun



Assay kit untuk ALP yang terdiri dari: Assay Buffer: 50 mL, pH 10.5,
Calibrator: 10 mL Tartazine , Mg Acetate: 1.5 mL 0.2 M dan pNPP Liquid:
600 µL 1M, (Gambar 3.1).



Aquadest

Universitas Sumatera Utara



Sefalogram lateral



Kertas acetat tracing (tebal 0.003 inci, 8 x10 inchi)



Ice gel

Gambar 3.1. Assay kit untuk ALP.

Gambar 3.2. Centrifuge.

3.6.2 Alat


Centrifuge (Gambar 3.2)



Freezer -80°



Spektrofotometer (Gambar 3.3)



Microplate shaker (Gambar 3.4)



Pot/wadah sampel



Tabung eppendrof 2 ml



Tabung eppendrof 15 ml (Gambar 3.5a)



Multichannel pipette (Gambar 3.5b)



Clear bottom 96-well plate (Gambar 3.5c)

Universitas Sumatera Utara



Micro pipette (Gambar 3.5d)



Cooler box (Gambar 3.6)



Kaca mulut



Tracing box (Gambar 3.7)



Pensil 4 H



Penghapus

Gambar 3.3. Spektrofotometer.

Gambar 3.4. Microplate shaker.

c

d
a

b

Gambar 3.5. a. Tabung eppendorf 15 ml,
b. multichannel pipette, c. 96 clear
bottom well-plate, d. micro pipette.

Universitas Sumatera Utara

Gambar 3.6. Tracing box.

Gambar 3.7. Cooler box.

3.7 Prosedur Penelitian
3.7.1 Penilaian maturasi skeletal vertebra servikalis
Maturasi skeletal vertebra servikalis dinilai dengan menggunakan radiografi
sefalometri lateral, dengan teknik pengambilan radiografi dibuat dalam posisi berdiri
(seperti pada Gambar 2.8). Setelah dilakukan tracing pada Rontgen sefalometri
lateral, maturasi skeletal vertebra servikalis dilihat pada vertebra servikalis C2,C3,
dan C4 dengan menggunakan metode Hassel dan Farman. Cara penilaiannya adalah
sebagai berikut :
a. CVMI 1 (tahap awal).
Tahap 1 adalah tahap inisiasi. Pada tahap ini, batas inferior dari C2, C3, dan C4
masih datar. Batas superior meruncing dari posterior ke anterior.

Universitas Sumatera Utara

b. CVMI 2 (tahap percepatan).
Tahap 2 adalah tahap akselerasi. Pada tahap ini mulai terlihat kecekungan pada
batas inferior C2 dan C3, sementara batas inferior C4 masih datar. Bentuk C3 dan
C4 hampir menyerupai persegi panjang.
c. CVMI 3 (tahap peralihan).
Tahap 3 adalah tahap transisi. Pada tahap ini kecekungan pada batas inferior dari
C2 dan C3 telah terlihat jelas. Batas inferior C4 mulai mengalami kecekungan, dan
badan C3 dan C4 telah berbentuk persegi panjang.
d. CVMI 4 (tahap perlambatan).
Kecekungan telah jelas terlihat pada batas inferior C2, C3 dan C4. Bentuk badan
C3 dan C4 mulai berbentuk bentuk persegi.
e. CVMI 5 (tahap maturasi).
Batas inferior C2, C3, dan C4 lebih jelas terlihat cekung. Bentuk badan C3 dan C4
menjadi lebih persegi.
f. CVMI 6 (tahap komplit).
Kecekungan yang dalam terlihat pada batas inferior C2, C3, dan C4. Dimensi
vertikal badan C3 dan C4 lebih besar dibanding dimensi horizontalnya.

Universitas Sumatera Utara

Gambar 3.8. Enam tahap Cervical Vertebrae Maturation Index (CVMI).29

3.7.2 Pengumpulan saliva
Pengumpulan saliva dilakukan dengan metode passive drool. Saat
pengambilan saliva subjek diinstruksikan untuk duduk tenang di dental unit. Pasien
diinstruksikan untuk menghindari asupan makanan dan minuman (kecuali air) satu
jam sebelum dilakukan pengumpulan saliva. Kepala harus sedikit condong ke depan
dan mulut harus tetap terbuka dan biarkan saliva mengalir pada wadah yang telah
disediakan sampai 1 ml.
3.7.3 Persiapan sampel saliva
Sampel saliva dikumpulkan dalam wadah sampel dan diberi label. Wadah
sampel dimasukkan dan disusun kedalam cooler box yang telah diberi ice gel.
Sebelum dilakukan analisa kuantitaf ALP, sampel disimpan pada lemari pendingin
bersuhu -80° di Laboratorium Terpadu FK USU sampai waktu pemeriksaan.

Universitas Sumatera Utara

3.7.4 Analisa kuantitatif Alkaline Phosphatase dengan uji spektrofotometri
Pemeriksaan kadar ALP menggunakan metode colorimetric yang berdasarkan
reaksi kinetik antara sampel saliva dengan reagen. Pengujian ini dilakukan oleh
laboran yang terlatih di Laboratorium Terpadu FK USU.
1. Persiapan Reagen:


Reagen dikeluarkan dari lemari pendingin kemudian dicairkan pada suhu
ruangan.



Siapkan semua reagen yang diperlukan sesuai standar kerja.



Persiapkan working solution untuk setiap well sampel dengan cara
mencampur 200 µL Assay Buffer, 5 µL Mg Acetate (final mM) dan 2 µL
cairan substrat pNPP (10 mM) pada tabung eppendorf 15 ml.

2. Persiapan Sampel:


Sampel dikeluarkan dari lemari pendingin kemudian dicairkan pada suhu
ruangan.



Sampel saliva yang telah mencair dipindahkan sebanyak 50 ml dari pot saliva
ke ke dalam tabung eppendorf 2 ml, lalu disentrifugasi pada 10.000 RPM
selama 2 menit untuk memisahkan antara supernatant dengan plate hingga
yang tersisa adalah sampel dalam bentuk supernatant yang memiliki
kandungan ALP.

Universitas Sumatera Utara

3. Uji reaksi kinetik ALP menggunakan 96-well plate:


Ambil 200 µL aquadest (H2O) dan 200 µL calibrator lalu masukkan kedalam
well yang berbeda.



Ambil 5 sampai 50 µL sampel saliva lalu masukkan ke dalam well yang lain.



Pipet 150 sampai 195 µL working solution lalu masukkan ke dalam well
sampel, hingga volume akhir pada well sampel harus mencapai 200 µL.
Gunakan multichannel pipette untuk penambahan cepat.



Goncangkan plate dengan ringan untuk mencampur isinya dengan
menggunakan microplate shaker.



Baca Optical Density (OD) pada panjang gelombang 405 nm pada
spektrofotometer, ulangi kembali setelah 4 menit (t = 4 menit).



Hitung aktivitas ALP dari setiap sampel (IU/L = µ mol/ (L min)) dengan
rumus sebagai berikut:

Universitas Sumatera Utara

Gambar 3.9. Pembacaan aktivitas ALP pada spektrofotometer.

3.8 Analisis Data
Semua data disajikan dalam bentuk rata-rata ± simpangan baku (rata-rata ±
SD). Dilakukan uji homogenitas data dengan menggunakan Levene test. Untuk
melihat hubungan antara kadar alkaline phosphatase dangan tahap maturasi vertebra
servikalis dilakukan uji Oneway ANOVA, untuk melihat perbedaan kadar alkaline
phosphatase pada setiap tahap maturasi vertebra servikalis dilakukan uji LSD.

Universitas Sumatera Utara

3.9 Diagram Alur Penelitian
Sampel penelitian yang memenuhi kriteria inklusi
Tracing Rontgen sefalometri lateral untuk menilai maturasi skeletal
vertebra servikalis

Pre-pubertal
(CVMI 1&2)

Pubertal
(CVMI 3&4)

Post-pubertal
(CVMI 5&6)

Pengumpulan saliva dengan metode passive drool yang dilakukan
antara pukul 10.00-12.00 WIB

Preparasi sampel saliva dan dibekukan pada lemari pendingin suhu -80°

Analisa kadar alkaline phosphatase dengan uji spektrofotometri

Hasil

Analisis data

Kesimpulan

Universitas Sumatera Utara

BAB 4
HASIL PENELITIAN

Penelitian ini telah dilakukan pada 57 orang subjek perempuan usia 8-15
tahun yang berada dalam masa tumbuh kembang, subjek penelitian dibagi menjadi
tiga kelompok yaitu kelompok pre-pubertal growth spurt (CVMI 1 dan CVMI 2),
kelompok pubertal growth spurt (CVMI 3 dan CVMI 4), dan kelompok post-pubertal
growth spurt (CVMI 5 dan CVMI 6). Untuk melihat tahap

maturasi vertebra

servikalis dilakukan analisa maturasi vertebra servikalis menurut metode Hassel dan
Farman. Distribusi tahap maturasi vertebra servikalis pada setiap kelompok dapat
dilihat pada Tabel 4.1. Distribusi usia subjek berdasarkan tahap maturasi skeletal
dapat dilihat pada Tabel 4.2.

Tabel 4.1. Distribusi tahap maturasi vertebra servikalis pada setiap kelompok.
Tahap
Pre-pubertal
maturasi
CVMI 1
7
CVMI 2
12
CVMI 3
CVMI 4
CVMI 5
CVMI 6
Total
19

Pubertal
8
11
19

Post-pubertal Total
14
5
19

7
12
8
11
14
5
57

Tabel 4.1 menunjukkan bahwa pada tahap pre-pubertal subjek yang berada
pada tahap CVMI 1 berjumlah 7 subjek dan pada tahap CVMI 2 berjumlah 12 subjek.
Pada tahap pubertal subjek yang berada pada tahap CVMI 3 berjumlah 8 subjek dan

Universitas Sumatera Utara

pada tahap CVMI 4 berjumlah 11 subjek. Sedangkan pada tahap post-pubertal subjek
yang berada pada tahap CVMI 5 berjumlah 14 subjek dan pada tahap CVMI 6
berjumlah 5 subjek.

Tabel 4.2. Distribusi usia subjek berdasarkan tahap maturasi skeletal.
Usia
8
9
10
11
12
13
14
Total

Pre-pubertal
4
6
5
1
3
19

Pubertal
3
5
7
4
19

Post-pubertal
2
9
8
19

Total
4
6
8
6
12
13
8
57

Tabel 4.2 menunjukkan bahwa rentang usia subjek yang berada pada tahap
pre-pubertal berada pada kisaran usia 8-12 tahun, terbanyak pada usia 9 tahun. Pada
tahap pubertal rentang usia subjek berkisar antara usia 10-13 tahun dengan usia
terbanyak pada 12 tahun, sedangkan pada tahap post-pubertal usia subjek berkisar
antara 12-14 tahun dengan usia subjek terbanyak pada usia 13 tahun.
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah cairan saliva. Kadar ALP
pada saliva diukur dengan menggunakan uji spektrofotometri. Pembacaan Optical
Density (OD) yang dihasilkan dari perubahan warna dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 405 nm.
Seluruh data diuji homogenitas dengan menggunakan uji Levene dan
hasilnya didapat bahwa data berasal dari varian yang sama. Karena data homogen,
maka umtuk mengetahui hubungan antara kadar ALP dengan tahap maturasi vertebra

Universitas Sumatera Utara

servikalis dilakukan uji Oneway ANOVA dengan derajat kemaknaan α = 0,05. Hasil
penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara kadar
ALP pada saliva dengan kelompok tahap maturasi vertebra servikalis dengan nilai
p=0,0001 (Tabel 4.3) . Berdasarkan uji Oneway ANOVA didapat rerata kadar ALP
tertinggi berada pada tahap pubertal yaitu 233,39 ± 106,29 (IU/L), lalu pada tahap
pre-pubertal 192,87 ± 69,02 (IU/L) sedangkan rerata kadar ALP paling rendah pada
tahap post-pubertal yaitu 79,20 ± 31,41(IU/L) (Gambar 4.1).

Tabel 4.3. Hubungan antara kadar ALP dengan tahap maturasi vertebra servikalis
berdasarkan uji Oneway ANOVA
Tahap Maturasi
n
X ± SD (IU/L)
19
192,87 ± 69,02*
Pre-pubertal
19
233,39 ± 106,29*
Pubertal
19
79,20 ± 31,41*
Post-pubertal
Uji Oneway ANOVA signifikan, p