LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI JUR
LAPORAN RESMI PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
PENGECATAN BAKTERI
DISUSUN OLEH :
Nama
: Angga Teja Kusuma
NIM
: 0470.0006
Kelompok
: B4
2005
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS KATOLIK SOEGIJAPRANATA
SEMARANG
1. PENDAHULUAN
1.1
Tinjauan Pustaka
Untuk mengamati sel – sel suatu mikroorganisme digunakan suatu cara yang disebut
pewarnaan. Hal ini mutlak diperlukan karena sel mikroorganisme yang tidak diwarnai
umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop
cahaya biasa sehingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias
yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair (Hadioetomo,
1993).
Pengamatan terhadap bakteri, lebih sering dilakukan dengan olesan terwarnai, daripada
bakteri dalam keadaan hidup. Artinya, mikroorganisme yang akan diamati telah diberi
zat pewarna kimia supaya lebih mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan
bakteri terwarnai dapat mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan ada atau tidaknya
struktur internal seperti spora dan butiran (Volk dan Wheller, 1993).
Bakteri merupakan mikroorganisme yang menempati golongan prokariotik, karena tidak
memiliki dinding inti yang jelas atau belum memiliki dinding inti yang sejati, sehingga
semua bagian intinya tersebar di dalam sitoplasma secara bebas. Tetap memiliki faktor
pembawa sifat yang tersimpan di dalam DNA yang berada di dalam kromosom namun
tersebar luas dan bebas di dalam sitoplasma. Bukan berarti tidak memiliki inti namun
hanya saja tidak memiliki dinding inti yang jelas sehingga tampak tidak berinti sel.
Beberapa sifat morfologi bakteri perlu diperhatikan karena pertumbuhannya di dalam
makanan dan juga karena bakteri memiliki ketahanan cukup tingggi selama pengolahan
dengan panas maupun dengan suhu dingin (Schlegel & Schmidt,1994).
Pengecatan sederhana dapat digunakan untuk melihat morfologi dan komposisi sel
bakteri karena asam nukleat bakteri dan beberapa jenis komponen dinding sel tertentu
bermuatan negatif yang akan saling tarik-menarik dan berikatan kuat dengan metilen
blue, sehingga terbentuklah warna sel biru (Cappuccino & Sherman, 1983).
Menurut Lay (1994), ada 3 jenis pengecatan yang dapat digunakan pada pengecatan
bakteri ini. Yaitu pengecatan sederhana, pengecatan gram, dan pengecatan endospora.
Pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling sederhana, dimana pada
pengecatan ini hanya dilakukan dengan penambahan satu zat pewarna atau hanya
melalui satu tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri. Pengecatan gram adalah
pewarnaan atau pengecatan dengan melalui beberapa tahap pengecatan dengan beberapa
reagen yang berbeda. Pengecatan endospora adalah pengecatan yang bertujuan untuk
mengamati endospora, dimana tidak semua jenis bakteri mampu membentuk endospora.
Pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan, yang meliputi :
a. Pewarnaan sederhana
b. Pewarnaan diferensial
pewarnaan gram
pewarnaan asam cepat (acid-fast)
c. pewarnaan struktural
pewarnaan inti sel (Feulgen), yaitu pewarnaan inti sel bakteri
pewarnaan endospora, yaitu pewarnaan spora bakteri
pewarnaan dinding sel, yaitu pewarnaan dinding sel dari bakteri
pewarnaan kapsul, yaitu pewarnaan kapsul yang dibentuk oleh bakteri
pewarnaan flagella, yaitu pewarnaan flagel / alat gerak bakteri
d. pewarnaan untuk menguji komponen dalam sel seperti Glikogen, Lipida.
(Fardiaz, 1992).
Bentuk dan ukuran mikrobia merupakan karakteristik yang penting untuk identifikasi.
Adapun 3 bentuk dasar sel bakteri : batang (baccil), bulat (coccus), dan lengkung
(koma, vibrion, dan spiral). Bentuk bakteri yang paling dikenal ada 2 macam, yaitu
batang dan bulat (Timotius, 1982).
Hubungan bakteri dengan zat perwarna basa yang menonjol disebabkan oleh adanya
asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi jika bakteri diwarnai,
muatan negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi dengan ion positif zat pewarna
basa. Oleh karena itu, pada percobaan digunakan metilen loeffer yang memiliki sifat
basa dan alkalin sebagai pewarna sederhana. Pewarna alkalin lain yang umumnya
digunakan dapat berupa pewarna basa seperti metylen blue, basic fuschin, dan violet
kristal (Volk dan Wheller, 1993).
Hal yang penting yang mempengaruhi keberhasilan pada pengecatan bakteri adalah
penyiapan preparat yang baik yakni tidak terlalu tebal atau tidak terlalu tipis, biakan
dapat tetap melekat pada gelas preparat selama pencucian berulang-ulang, sel-selnya
tidak berubah bentuk setelah fiksasi dan pengecatan. Selain penyiapan preparat,
pengolesan bakteri pada gelas benda tidak boleh terlalu tebal ataupun terlalu tipis.
Sebab jika olesannya terlalu tebal, maka sel-sel bakteri akan bertumpang tindih,
sehingga ketika bagian selnya tidak bisa teramati dengan jelas bila dilihat di bawah
mikroskop, dan juga akan menylitkan dalam pewarnaan. Apabila terlalu tipis, hal yang
dikhawatirkan adalah akan banyak sel yang hilang saat pencucian sehingga bisa saja
semua bakteri akan hilang akibat pencucian selain itu mengingat kecilnya sel bakteri,
sehingga akan menyulitkan dalam pengamatan (Hadioetomo, 1993).
Pada setiap proses pengecatan yang dilakukan, baik pengecatan sederhana, pengecatan
gram, ataupun pengecatan endospora, selalu dilakukan proses fiksasi. Proses fiksasi ini
dilakukan dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api spirius beberapa kali
selama 1-2 detik. Proses ini bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda
dan mematikan bakteri, karena sebenarnya bakteri yang hidup tidak dapat diamati,
karena pada bakteri hidup, selnya tidak mengandung pigmen atau transparan, karena
indeks bias sitoplasmanya hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat
cair (Lay, 1994).
Pengecatan deferensial merupakan pengecatan yang memiliki keunggulan dalam
mengelompokkan bakteri, karena dengan pengecatan ini bakteri bisa digolongkan
menjadi bakteri gram positif dan gram negatif. Dimana hal yang membedakannya
adalah lapisan membran selnya, untuk bakteri gram negatif hanya memiliki 5-20%
peptidoglikan sedangkan bakteri gram positif memiliki 90% peptidoglikan di dalam
membran selnya, dan dengan adanya peptidoglikan yang tebal meyebabkan bakteri
tersebut tidak mudah terdehidrasi saat pelarutan ataupun pemanasan sehingga cat yang
sudah masuk tidak dapat keluar lagi. Disamping itu ada pula faktor lain yang dapat
mempengaruhi sifat gram negatif dan gram positif, yaitu penyiapan preparat yang
terlalu tebal menyebabkan pelarutan kurang baik, konsentrasi dan kesegaran bahan
untuk pewarna, waktu pelarutan yang terlalu lama menyebabkan warna pada sel bakteri
gram positif ikut terlarut, pencucian dan pengeringan yang mempengaruhi keberadaan
iodin, serta umur bakteri yang mempengaruhi keutuhan bakteri (Trihendrokesowo,
1989).
Pengecatan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
benyak digunakan dalam laboratorium. Selain itu pengecatan gram merupakan tahap
penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri. Pengecatan gram ini dapat digunakan
untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram negatif atau gram positif (Lay, 1994).
Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat warna primer (violet kristal),
larutan mordan (iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat warna penutup (safranin).
Larutan mordan berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh
bakteri, sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat, memperjelas zat
warna, mempersulit pelarutan zat warna, dan menyebabkan terbentuknya persenyawaan
kompleks kristal violet-yodium. Sedangkan etanol, berfungsi untuk melunturkan zat
warna primer dengan daya kerja lambat, sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya
pemucatan yang berlebihan. Fungsi penambahan zat warna penutup adalah sebagai
pembeda (kontras) terhadap zat warna primer, dan juga untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan zat warna primernya (Lay, 1994).
Perbedaan antara bakteri bergram negatif dan bakteri bergram positif disebabkan oleh
perbedaan struktur dinding sel bakteri gram-positif dan gram-negatif, sehingga
menyebabkan perbedaan larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri grampositif terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri gram-negatif
mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri grampositif. Lipida ini akan larut dalam alkohol dan aseton yang digunakan sebagai larutan
pemucat, sehingga pori-pori dinding sel membesar dan meningkatkan daya larut
kompleks kristal-violet-yodium pada dinding sel bakteri gram-negatif. Selain itu yang
menyebabkan adanya perbedaan antara bakteri bergram negatif dengan bakteri bergram
positif adalah pada bakteri gram-positif akan terbentuk persenyawaan kompleks kristalviolet-yodium ribonukleat yang tidak larut dalam larutan pemucat. Persenyawaan
kompleks ini tidak terbentuk pada bakteri gram-negatif sehingga diduga adanya
perbedaan kandungan asam ribonukleat antara bakteri gram-positif dan gram-negatif.
Faktor-faktor lain yang juga dapat menentukan jenis gram bakteri, yaitu pelaksanaan
fiksasi panas terhadap olesan, kerapatan sel pada olesan, konsentrasi dan umur reagenreagen yang digunakan, sifat dan konsentrasi dan jumlah pemucat yang dipakai, serta
sejarah biakan (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan gram ini memilahkan bakteri menjadi kelompok bakteri gram positif dan
gram negatif. Bakteri gram positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna
kristal violet-yodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat sedangkan
bakteri gram negatif berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu pemberian
larutan pemucat dan kemudian mengambil zat warna yang kedua yaitu Safranin yang
menyebabkan sel menjadi berwarna merah. Fungsi zat warna kedua hanyalah sebagai
pembeda (kontras) terhadap zat warna kristal violet (Capuccino & Sherman, 1983).
Jenis bakteri yang termasuk gram positif adalah famili Micrococcaceae seperti
Microsoccocus, Staphylococcus
dan famili Streptococcaceae seperti Streptococcus,
Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus. Streptococcus merupakan bakteri berbentuk
bulat yang hidup secara berpasangan, atau membentuk rantai pendek dan panjang
tergantung dari spesies dan kondisi pertumbuhannya (Fardiaz, 1992).
Beberapa jenis bakteri yang merupakan jenis bakteri gram (-) adalah Eschericia coli,
Enterobacter aerogenes, dan kelompok Pseudomonas. Sedangkan yang termasuk
bakteri gram (+) adalah kelompok Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan
Streptococcus. (Hadioetomo, 1993).
Menurut Hadioetomo (1993), ada empat reagen yang digunakan dalam pengecatan gram
Cat utama, yaitu larutan violet kristal
Mordan, yaitu senyawa yang digunakan untuk mengindentifikasikan cat utama
(kompleks antara cat utama dengan senyawa yang dicat lebih baik) misalnya
larutan iodine
Bahan peluntur (decolorizing agent) yaitu solvent organik (alkohol atau aseton)
yang dapat digunakan untuk melunturkan cat utama
Cat penutup seperti safranin, digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utamanya setelah dilunturkan. Karena cat penutup harus
berbeda dengan cat utama.
Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri.
Endospora berbentuk sangat padat dan bersifat sangat refraktif bila dilihat di bawah
mikroskop, karena kandungan airnya sangat rendah. Endospora sangat sukar diwarnai
dengan pewarna biasa, karenanya harus digunakan pewarna spesifik, dan yang biasa
digunakan adalah pewarna hijau malasit (malachite green) (Fardiaz, 1992).
Endospora hanya terdapat dalam bakteri berbentuk batang (basilus) dan dapat dilihat
dengan pewarnaan endospora. Pada umumnya, bakteri pembentuk endospora memang
berbentuk batang, dan setelah membentuk endospora sporangium, bakteri akan mati lalu
mengalami lisis (pemecahan membran sel). Spora bekas lisis memiliki ukuran cukup
besar, sehingga dapat terlihat jelas pada mikroskop. Spora bekas inilah yang
menunjukkan adanya endospora (Lay, 1994).
Dalam percobaan pengecatan endospora, setelah penetesan pewarna malachite green,
dilakukan pemanasan. Pemanasan ini bertujuan untuk mengembangkan lapisan luar
spora yang bersifat tahan terhadap perubahan faktor luar, yang dalam hal ini adalah
penambahan bahan kimia berupa larutan pewarna malachite green, sehingga zat warna
malachite green dapat masuk ke dalam spora. Setelah didinginkan, warna hijau tersebut
terperangkap dalam spora, sehingga struktur endospora dapat diamati (Lay, 1994).
Pengecatan bakteri akan berhasil, jika sebelum melakukan pengecatan diperlukan
penyiapan preparat yang baik, yaitu tidak terlalu tebal atau terlalu tipis, tetap melekat
pada gelas preparat selama pencucian berulang-ulang, sel-selnya tidak berubah bentuk
atau morfologi setelah fiksasi dan pengecatan (Hadioetomo, 1993).
1.2
Tujuan Praktikum
Tujuan praktikum ini adalah mengetahui cara pengecatan pada bakteri dan yeast yang
benar. Mengamati bentuk dari bakteri dan yeast. Mengetahui cara pengelompokan
bakteri dalam gram positif atau gram negatif.
2. MATERI DAN METODA
2.1
2.1.1
Materi
Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah larutan violet kristal, lugol, alkohol
95%, larutan safranin, larutan malachite green, metilen blue.
2.1.2
Alat
Peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas objek, ose, mikroskop,
bunsen, Bacillius subtilis, Streptococcus thermophilus, Echerichia coli, Sacharomyses
cerevisiae.
2.2
2.2.1
Metoda
Pengecatan sederhana
Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi aquades 1 tetes kemudian
ditambahkan biakan (B. Subtilis, S. Thermophilus) sedikit dengan menggunakan jarum
ose. Dibiarkan dulu sampai kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi perwarna violet
kristal. Setelah itu dipanaskan 3 menit tetapi jangan sampai kering, jika mulai kering
ditambahkan violet kristal 1 tetes lagi. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
alkohol, Setelah itu dikeringkan. Setelah kering ditetesi dengan metylen blue, lalu
didiamkan selama 10 detik kemudian dicuci dengan air mengalir. Kemudian
dikeringkan, setelah itu diamati dalam mikroskop dan hasilnya digambar.
2.2.2
Pengecatan gram
Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat dibersihkan dengan alkohol kemudian
dikeringkan kemudian ditetesi dengan aquades sebanyak 1 tetes. Tambahkan
mikroorganisme (Escherichia coli dan Streptococcus thermophilus) yang
diambil
dengan jarum ose dan diletakkan pada kaca preparat dan kemudian dibiarkan sampai
kering. Setelah kering, kemudian difiksasi dan diberi pewarna violet kristal. Dan
dibiarkan di meja selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan air mengalir, dan sisa air
yang tertinggal dibuang dan ditetesi dengan lugol. Tunggu lagi selama 1 menit,
kemudian dicuci kembali dengan air dan kemudian dihilangkan warnanya dengan
alkohol. Setelah itu diberi pewarna safranin dan didiamkan selama 10 detik. Setelah
kering, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Hasilnya
diamati di bawah
mikroskop dan digambar.
2.2.3
Pengecatan endospora (B. Subtilis)
Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi aquades 1 tetes kemudian
ditambahkan biakan (B. Sublitis) sedikit dengan menggunakan jarum ose. Dibiarkan
dulu sampai kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi perwarna hijau malasit dan
dibiarkan selama 20 menit tanpa pemanasan atau selama 5 menit diatas pemanas air.
Setiap kali perwarna menjadi kering tetesi kembali pewarnanya. Kemudian dicuci
dengan air mengalir selama 20-30 detik, setelah itu diberi safranin selama 30 detik.
Setelah itu dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Hasilnya diamati di bawah
mikroskop dan digambar.
2.2.4
Pengecatan endospora yeast (Saccaromyces cereviseae)
Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi aquades 1 tetes kemudian
ditambahkan biakan (Saccharomyces cerevisiae) sedikit dengan menggunakan jarum
ose Dibiarkan dulu sampai kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi perwarna violet
kristal. Setelah itu dipanaskan 3 menit tetapi jangan sampai kering, jika mulai kering
ditambahkan violet kristal 1 tetes lagi. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
alcohol, Setelah itu dikeringkan. Setelah kering diberi warna yang kedua yaitu safranin,
didiamkan selama 10 detik dan dicuci dengan air mengalir. Kemudian dikeringkan,
hasilnya diamati di bawah mikroskop dan digambar.
3. HASIL PENGAMATAN
Jenis pengecatan
Pengecatan
Jenis mikroorganisme
Bacillus subtilis
sederhana
Gambar
Keterangan
Perbesaran : 40 x 10
Warna : biru
Bentuk : bacillus,
berkoloni
Pengecatan
Streptococcus thermophilus
sederhana
1. MO
Perbesaran : 40 x 10
Warna : biru
Bentuk
:
coccus,
menyebar
Pengecatan gram
Echerichia coli
1. MO
Perbesaran : 40 x 10
Warna : merah
Bentuk
:
fibrio,
menyebar
Pengecatan gram
Streptococcus thermophilus
1. MO 2. pewarna
Perbesaran : 40 x 10
Warna : merah
Bentuk
:
coccus,
menyebar
Endospora
Bacillus subtilis
1. MO
Perbesaran : 40 x 10
Warna : hijau
Bentuk : bacillus,
berkoloni
Endospora
Sacharomyses cerevisiae.
1. MO
Perbesaran : 40 x 10
Warna
:
merah
:
coccus,
muda
Bentuk
berkoloni
1. MO
4. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini masing-masing kelompok mencoba untuk mengamati morfologi
dari bakteri dan spora yeast. Karena ukurannya sangat kecil dan tidak dapat dilihat
dengan mata telanjang serta pada mikroskop kurang jelas kenampakannya maka
diperlukan suatu pewarnaan atau pengecatan untuk memperjelas morfologi dari masingmasing mikroba. Ini sesuai dengan pernyataan Hadioetomo (1993), bahwa kebanyakan
sel mikrobia tidak berwarna atau mempunyai pigmen yang sangat sedikit dan tidak
dapat mengadsorbsi ataupun membiaskan cahaya sehingga tidak dapat dilihat dengan
mudah pada mikroskop karena indeks bias sitoplasma sel yang hampir sama dengan
indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya
dapat dipertajam dengan mewarnai sel-sel tersebut dengan sel warna. Oleh karena itu,
penggunaan zat warna terhadap bakteri yang dilakukan pada percobaan bertujuan
supaya zat warna dapat mengadsorbsi atau membiaskan cahaya sehingga dapat
meningkatkan kontras dengan sekelilingnya dan struktur sel bakteri dapat diamati.
Pada setiap proses pengecatan yang dilakukan, baik pengecatan sederhana, pengecatan
gram, ataupun pengecatan endospora, selalu dilakukan proses fiksasi. Proses fiksasi ini
dilakukan dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api spirius beberapa kali
selama 1-2 detik. Proses ini bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda
dan mematikan bakteri, karena sebenarnya bakteri yang hidup tidak dapat diamati,
karena pada bakteri hidup, selnya tidak mengandung pigmen atau transparan, karena
indeks bias sitoplasmanya hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat
cair (Lay, 1994). Ini sesuai dengan yang kami lakukan dalam praktikum.
Ada dua macam cara pewarnaan yang dilakukan selama percobaan, yakni pewarnaan
sederhana dan pewarnaan gram. Menurut Fardiaz (1992), pewarnaan bakteri dapat
dibedakan atas beberapa golongan, yang meliputi :
a. Pewarnaan sederhana
b. Pewarnaan diferensial
pewarnaan gram
pewarnaan asam cepat (acid-fast)
c. pewarnaan struktural
pewarnaan inti sel (Feulgen), yaitu pewarnaan inti sel bakteri
pewarnaan endospora, yaitu pewarnaan spora bakteri
pewarnaan dinding sel, yaitu pewarnaan dinding sel dari bakteri
pewarnaan kapsul, yaitu pewarnaan kapsul yang dibentuk oleh bakteri
pewarnaan flagella, yaitu pewarnaan flagel / alat gerak bakteri
d. pewarnaan untuk menguji komponen dalam sel seperti Glikogen, Lipida.
Percobaan yang pertama adalah pewarnaan sederhana dari bakteri Bacillus subtilis dan
Streptococcus thermophilus. Proses pengamatan bakteri tidak akan sempurna jika
kenampakan yang diperoleh kurang jelas, pewarnaan berguna untuk memperjelasnya.
Pengecatan sederhana yang dilakukan dengan pemberian warna terlebih dahulu pada
bakteri sebelum dilihat mikroskop, bertujuan untuk mengetahui ciri-ciri tertentu bakteri.
Hal ini dikarenakan bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa
karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun
biakan secara keseluruhan mungkin berwarna (Volk & Wheeler, 1993). Dikatakan oleh
Lay (1994), bahwa pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling sederhana,
dimana pada pengecatan ini hanya dilakukan dengan penambahan satu zat pewarna atau
hanya melalui satu tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri. Ini sesuai dengan yang
kami lakukan, karena hanya melewati satu tahap pewarnaan dalam pewarnaan
sederhana. Pewarna yang dipakai adalah Methylen blue loefler (metilen biru). Pada
percobaan pengecatan dilakukan dengan zat warna yang bersifat basa yaitu biru metilen
(Lay, 1994). Hubungan bakteri dengan zat perwarna basa yang menonjol disebabkan
oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi jika bakteri
diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi dengan ion positif zat
pewarna basa. Oleh karena itu, pada percobaan digunakan metilen loeffer yang
memiliki sifat basa dan alkalin sebagai pewarna sederhana. Pewarna alkalin lain yang
umumnya digunakan dapat berupa pewarna basa seperti metylen blue, basic fuschin,
dan violet kristal (Volk dan Wheller, 1993). Setelah diamati pada mikroskop dengan
perbesaran 40 x 10 terlihat bahwa B. subtilis bentuknya basil (batang), berkoloni, dan
berwarna biru. Warna biru tersebut muncul setelah adanya penambahan metilen biru.
Bacillus subtilis adalah jenis bakteri yang menghasilkan spora berbentuk silinder yang
tidak membengkak, sporanya langsing dan tidak melebihi diameter 0,9 m (Fardiaz,
1992). Bacillus subtilis merupakan bakteri berwujud silinder terentang (Schlegel &
Schmidt,1994). Sedangkan pada Streptococcus thermophilus dengan perbesaran
mikroskop 40 x 10 terlihat bahwa bentuknya bulat (coccus), menyebar, dan warnanya
biru. Streptococcus merupakan bakteri berbentuk bulat yang hidup secara berpasangan,
atau membentuk rantai pendek dan panjang tergantung dari spesies dan kondisi
pertumbuhannya (Fardiaz, 1992). Sama seperti B.subtilis warna biru yang muncul juga
dikarenakan adanya penambahan metilen biru. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan pewarna sederhana, karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka basa), dan zatzat warna yang digunakan dalam pengecatan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromoforiknya bermuatan positif) (Hadioetomo, 1993). Jadi karena sifat
metilen biru yang basa maka akan mudah menempel pada bakteri dan sulit hilang.
Dengan dilakukannya pewarnaan sederhana ini terlihat bahwa masing-masing bakteri
memiliki
bentuk
yang
berbeda-beda.
Pengecatan
sederhana
yang
dilakukan
memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (kokus,
basilus, vibrio, sprilum, dan sebagainya) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan
yang diwarnai (Hadioetomo, 1993).
Percobaan yang kedua adalah pewarnaan bakteri dengan cara pewarnaan gram. Ada dua
bakteri yang dipakai yakni Echerichia coli dan Streptococcus thermophilus. Digunakan
beberapa macam pewarna dalam praktikum ini, yakni violet kristal, larutan iodium gram
(lugol), dan safranin. Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat warna primer
(violet kristal), larutan mordan (iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat warna penutup
(safranin). Larutan mordan berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna
oleh bakteri, sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat,
memperjelas zat warna, mempersulit pelarutan zat warna, dan menyebabkan
terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet-yodium. Sedangkan etanol,
berfungsi untuk melunturkan zat warna primer dengan daya kerja lambat, sehingga
memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. Fungsi penambahan
zat warna penutup adalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat warna primer, dan
juga untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan zat warna primernya (Lay,
1994).
Pengecatan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
benyak digunakan dalam laboratorium. Selain itu pengecatan gram merupakan tahap
penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri. Pengecatan gram ini dapat digunakan
untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram negatif atau gram positif (Lay, 1994).
Pebedaan bakteri gram positif dan gram negatif :
Pada saat pengecatan dengan cat utama, bakteri gram positif maupun gram negatif
akan mengikat violet kristal dan menunjukkan warna ungu atau biru tua.
Pada saat penambahan mordan, pada bakteri gram positif maupun gram negatif
sama-sama akan terbentuk kompleks violet kristal dengan lugol atau iodin dan
tetap berwarna biru.
Pada saat pelarutan, bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi membran sel
namun tidak sampai pecah dan pori-porinya mengecil sehingga kompleks violet
kristal dan lugol atau iodin tetap tertinggal di dalam sel dan bakteri tetap berwarna
biru atau ungu. Sedangkan pada bakteri gram negatif, akan terdehidrasi sampai
lemaknya terekstraksi dan pori-pori pada membrannya akan melebar sehingga
semua kompleks violet kristal dan lugol atau iodin akan keluar dan sel bakteri
menjadi tidak berwarna.
Pada saat penambahan cat penutup, bakteri gram positif tidak berpengaruh apa-apa
dan warnanya tetap biru atau ungu. Sedangkan bakteri gram negatif akan mengikat
cat penutup tersebut dan menjadi berwarna merah.
(Trihendrokesowo, 1989).
Sewaktu pengamatan terlihat bahwa E.coli bentuknya fibrio, menyebar, dan warnanya
merah. Ini berarti E.coli merupakan bakteri gram negatif. Pada pengamatan
Streptococcus thermophilus terlihat bentuknya batang (coccus), menyebar, dan
warnanya merah. Menurut Hadioetomo (1993), Beberapa jenis bakteri yang merupakan
jenis bakteri gram (-) adalah Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, dan kelompok
Pseudomonas. Sedangkan yang termasuk bakteri gram (+) adalah kelompok
Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Streptococcus. Terlihat bahwa
ketidakcocokan terjadi pada Streptococcus thermophilus kami. Seharusnya warnanya
adalah tetap ungu tua atau biru kalau menurut teori. Kemungkinan kesalahan terjadi
karena penyemprotan alkohol yang berlebihan. Etanol 95% berfungsi sebagai larutan
pemucat yang akan melarutkan zat warna utama, namun larutan ini bekerja lambat
sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. Iodin
merupakan larutan mordan, yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan cat
utama dan berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri
sehingga pengikatan ini menjadi lebih kuat (Hadioetomo, 1993).
Percobaan yang ketiga adalah pewarnaan endospora. Ada dua mikroba yang dipakai
yakni B.subtilis dan Sacharomyses cerevisiae. Pada B.subtilis pewarna yang digunakan
adalah pewarna hijau malasit dan safranin sedang pada Sacharomyses cerevisiae
pewarnanya violet kristal dan safranin. Endospora sukar untuk diwarnai oleh pewarna
biasa. Endospora merupakan struktur di dalam sel pada tempat – tempat yang khas yang
dibentuk oleh bakteri jenis – jenis tertentu, misalnya bakteri genus Bacillus dan
Clostridium (Hadioetomo, 1993). Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna
biasa, karenanya harus digunakan pewarna spesifik, dan yang biasa digunakan adalah
pewarna hijau malasit (malachite green) (Fardiaz, 1998). Sewaktu pengamatan
B.subtilis terlihat bahwa bentuknya batang (basil), berkoloni, dan warnanya hijau.
Bacillus subtilis merupakan bakteri berwujud silinder terentang (Schlegel &
Schmidt,1994). Karena bentuknya batang maka B.subtilis dapat membentuk endospora.
Bakteri pembentuk endospora umumnya adalah bakteri berbentuk batang, dan setelah
membentuk endospora, sporangium mati dan akhirnya lisis dan spora bekas ukurannya
cukup besar dan dapat dilihat di mikroskop (Hadioetomo, 1993). Endospora hanya
terdapat dalam bakteri berbentuk batang (basilus) dan dapat dilihat dengan pewarnaan
endospora (Lay, 1994). Setelah diwarnai warna B.subtilis berubah menjadi hijau ini
semakin menunjukkan bahwa B.subtilis memiliki endospora. Pada pengamatan
Sacharomyses cerevisiae terlihat bahwa bentuknya bulat (coccus), berkoloni, dan
warnanya merah muda. Ini menunjukkan bahwa tidak hanya bakteri bentuk batang saja
yang bisa membentuk endospora, tapi yeast juga bisa membentuknya.
5. KESIMPULAN
Pewarnaan bakteri dapat digolongkan menjadi pewarnaan sederhana, pewarnaan
diferensial, pewarnaan struktural, dan pewarnaan untuk menguji keberadaan
komponen tertentu di dalam sel.
Pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling sederhana, dimana pada
pengecatan ini hanya dilakukan dengan penambahan satu zat pewarna atau
hanya melalui satu tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri.
Pengecatan sederhana yang dilakukan memungkinkan dibedakannya bakteri
dengan bermacam-macam tipe morfologi (kokus, basilus, vibrio, sprilum, dan
sebagainya)
Pengecatan gram adalah pewarnaan atau pengecatan dengan melalui beberapa
tahap pengecatan dengan beberapa reagen yang berbeda.
Pengecatan endospora adalah pengecatan yang bertujuan untuk mengamati
endospora, dimana tidak semua jenis bakteri mampu membentuk endospora.
Adapun 3 bentuk dasar sel bakteri : batang (baccil), bulat (coccus), dan
lengkung (koma, vibrion, dan spiral).
Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat warna primer (violet
kristal), larutan mordan (iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat warna penutup
(safranin).
Dalam menyiapkan preparat tidak boleh terlalu tebal.
Pewarnaan gram memisahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram
negatif.
Beberapa jenis bakteri yang merupakan jenis bakteri gram (-) adalah Eschericia
coli, Enterobacter aerogenes, dan kelompok Pseudomonas.
Beberapa jenis bakteri yang termasuk bakteri gram (+) adalah kelompok
Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Streptococcus.
Pada saat penambahan cat penutup, bakteri gram positif tidak berpengaruh apaapa dan warnanya tetap biru atau ungu.
Bakteri gram negatif akan mengikat cat penutup tersebut dan menjadi berwarna
merah.
Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri.
Endospora hanya terdapat dalam bakteri berbentuk batang (basilus) dan dapat
dilihat dengan pewarnaan endospora.
Pengecatan bakteri akan berhasil, jika sebelum melakukan pengecatan
diperlukan penyiapan preparat yang baik, yaitu tidak terlalu tebal atau terlalu
tipis, tetap melekat pada gelas preparat selama pencucian berulang-ulang, selselnya tidak berubah bentuk atau morfologi setelah fiksasi dan pengecatan.
6. DAFTAR PUSTAKA
Cappuccino, I.G. & N. Sherman. (1983). Microbiology a Laboratory Manual. AddisonWesley Publishing Company. Massachuset.
Fardiaz, S. ( 1992 ). Mikrobiologi Pangan 1. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Gaman, P. M. & K. B. Sherrington. (1994). Ilmu Pangan. Gadjah Mada University
Press. Yogyakarta.
Hadioetomo, R. S. ( 1993 ). Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Hadioetomo, R.S. (1993). Mikobiologi Dasar dalam Praktek, Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Lay, B. W. ( 1994 ). Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada.
Jakarta.
Schlegel, H.G. & K. Schmidt. (1994). Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University
Press. Yogyakarta.
Timotius, K. H. ( 1982 ). Mikrobiologi Dasar. Universitas Kristen Satya Wacana.
Salatiga.
Trihendrokesowo. (1989). Petunjuk Laboratorium Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar
Universitas Pangan dan Gizi. Yogyakarta.
Volk, W.A. & M.F. Wheeler. (1993). Mikrobiologi Dasar. Erlangga. Jakarta.
7. LAMPIRAN
MIKROBIOLOGI
PENGECATAN BAKTERI
DISUSUN OLEH :
Nama
: Angga Teja Kusuma
NIM
: 0470.0006
Kelompok
: B4
2005
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS KATOLIK SOEGIJAPRANATA
SEMARANG
1. PENDAHULUAN
1.1
Tinjauan Pustaka
Untuk mengamati sel – sel suatu mikroorganisme digunakan suatu cara yang disebut
pewarnaan. Hal ini mutlak diperlukan karena sel mikroorganisme yang tidak diwarnai
umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop
cahaya biasa sehingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias
yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair (Hadioetomo,
1993).
Pengamatan terhadap bakteri, lebih sering dilakukan dengan olesan terwarnai, daripada
bakteri dalam keadaan hidup. Artinya, mikroorganisme yang akan diamati telah diberi
zat pewarna kimia supaya lebih mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan
bakteri terwarnai dapat mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan ada atau tidaknya
struktur internal seperti spora dan butiran (Volk dan Wheller, 1993).
Bakteri merupakan mikroorganisme yang menempati golongan prokariotik, karena tidak
memiliki dinding inti yang jelas atau belum memiliki dinding inti yang sejati, sehingga
semua bagian intinya tersebar di dalam sitoplasma secara bebas. Tetap memiliki faktor
pembawa sifat yang tersimpan di dalam DNA yang berada di dalam kromosom namun
tersebar luas dan bebas di dalam sitoplasma. Bukan berarti tidak memiliki inti namun
hanya saja tidak memiliki dinding inti yang jelas sehingga tampak tidak berinti sel.
Beberapa sifat morfologi bakteri perlu diperhatikan karena pertumbuhannya di dalam
makanan dan juga karena bakteri memiliki ketahanan cukup tingggi selama pengolahan
dengan panas maupun dengan suhu dingin (Schlegel & Schmidt,1994).
Pengecatan sederhana dapat digunakan untuk melihat morfologi dan komposisi sel
bakteri karena asam nukleat bakteri dan beberapa jenis komponen dinding sel tertentu
bermuatan negatif yang akan saling tarik-menarik dan berikatan kuat dengan metilen
blue, sehingga terbentuklah warna sel biru (Cappuccino & Sherman, 1983).
Menurut Lay (1994), ada 3 jenis pengecatan yang dapat digunakan pada pengecatan
bakteri ini. Yaitu pengecatan sederhana, pengecatan gram, dan pengecatan endospora.
Pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling sederhana, dimana pada
pengecatan ini hanya dilakukan dengan penambahan satu zat pewarna atau hanya
melalui satu tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri. Pengecatan gram adalah
pewarnaan atau pengecatan dengan melalui beberapa tahap pengecatan dengan beberapa
reagen yang berbeda. Pengecatan endospora adalah pengecatan yang bertujuan untuk
mengamati endospora, dimana tidak semua jenis bakteri mampu membentuk endospora.
Pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan, yang meliputi :
a. Pewarnaan sederhana
b. Pewarnaan diferensial
pewarnaan gram
pewarnaan asam cepat (acid-fast)
c. pewarnaan struktural
pewarnaan inti sel (Feulgen), yaitu pewarnaan inti sel bakteri
pewarnaan endospora, yaitu pewarnaan spora bakteri
pewarnaan dinding sel, yaitu pewarnaan dinding sel dari bakteri
pewarnaan kapsul, yaitu pewarnaan kapsul yang dibentuk oleh bakteri
pewarnaan flagella, yaitu pewarnaan flagel / alat gerak bakteri
d. pewarnaan untuk menguji komponen dalam sel seperti Glikogen, Lipida.
(Fardiaz, 1992).
Bentuk dan ukuran mikrobia merupakan karakteristik yang penting untuk identifikasi.
Adapun 3 bentuk dasar sel bakteri : batang (baccil), bulat (coccus), dan lengkung
(koma, vibrion, dan spiral). Bentuk bakteri yang paling dikenal ada 2 macam, yaitu
batang dan bulat (Timotius, 1982).
Hubungan bakteri dengan zat perwarna basa yang menonjol disebabkan oleh adanya
asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi jika bakteri diwarnai,
muatan negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi dengan ion positif zat pewarna
basa. Oleh karena itu, pada percobaan digunakan metilen loeffer yang memiliki sifat
basa dan alkalin sebagai pewarna sederhana. Pewarna alkalin lain yang umumnya
digunakan dapat berupa pewarna basa seperti metylen blue, basic fuschin, dan violet
kristal (Volk dan Wheller, 1993).
Hal yang penting yang mempengaruhi keberhasilan pada pengecatan bakteri adalah
penyiapan preparat yang baik yakni tidak terlalu tebal atau tidak terlalu tipis, biakan
dapat tetap melekat pada gelas preparat selama pencucian berulang-ulang, sel-selnya
tidak berubah bentuk setelah fiksasi dan pengecatan. Selain penyiapan preparat,
pengolesan bakteri pada gelas benda tidak boleh terlalu tebal ataupun terlalu tipis.
Sebab jika olesannya terlalu tebal, maka sel-sel bakteri akan bertumpang tindih,
sehingga ketika bagian selnya tidak bisa teramati dengan jelas bila dilihat di bawah
mikroskop, dan juga akan menylitkan dalam pewarnaan. Apabila terlalu tipis, hal yang
dikhawatirkan adalah akan banyak sel yang hilang saat pencucian sehingga bisa saja
semua bakteri akan hilang akibat pencucian selain itu mengingat kecilnya sel bakteri,
sehingga akan menyulitkan dalam pengamatan (Hadioetomo, 1993).
Pada setiap proses pengecatan yang dilakukan, baik pengecatan sederhana, pengecatan
gram, ataupun pengecatan endospora, selalu dilakukan proses fiksasi. Proses fiksasi ini
dilakukan dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api spirius beberapa kali
selama 1-2 detik. Proses ini bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda
dan mematikan bakteri, karena sebenarnya bakteri yang hidup tidak dapat diamati,
karena pada bakteri hidup, selnya tidak mengandung pigmen atau transparan, karena
indeks bias sitoplasmanya hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat
cair (Lay, 1994).
Pengecatan deferensial merupakan pengecatan yang memiliki keunggulan dalam
mengelompokkan bakteri, karena dengan pengecatan ini bakteri bisa digolongkan
menjadi bakteri gram positif dan gram negatif. Dimana hal yang membedakannya
adalah lapisan membran selnya, untuk bakteri gram negatif hanya memiliki 5-20%
peptidoglikan sedangkan bakteri gram positif memiliki 90% peptidoglikan di dalam
membran selnya, dan dengan adanya peptidoglikan yang tebal meyebabkan bakteri
tersebut tidak mudah terdehidrasi saat pelarutan ataupun pemanasan sehingga cat yang
sudah masuk tidak dapat keluar lagi. Disamping itu ada pula faktor lain yang dapat
mempengaruhi sifat gram negatif dan gram positif, yaitu penyiapan preparat yang
terlalu tebal menyebabkan pelarutan kurang baik, konsentrasi dan kesegaran bahan
untuk pewarna, waktu pelarutan yang terlalu lama menyebabkan warna pada sel bakteri
gram positif ikut terlarut, pencucian dan pengeringan yang mempengaruhi keberadaan
iodin, serta umur bakteri yang mempengaruhi keutuhan bakteri (Trihendrokesowo,
1989).
Pengecatan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
benyak digunakan dalam laboratorium. Selain itu pengecatan gram merupakan tahap
penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri. Pengecatan gram ini dapat digunakan
untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram negatif atau gram positif (Lay, 1994).
Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat warna primer (violet kristal),
larutan mordan (iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat warna penutup (safranin).
Larutan mordan berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh
bakteri, sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat, memperjelas zat
warna, mempersulit pelarutan zat warna, dan menyebabkan terbentuknya persenyawaan
kompleks kristal violet-yodium. Sedangkan etanol, berfungsi untuk melunturkan zat
warna primer dengan daya kerja lambat, sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya
pemucatan yang berlebihan. Fungsi penambahan zat warna penutup adalah sebagai
pembeda (kontras) terhadap zat warna primer, dan juga untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan zat warna primernya (Lay, 1994).
Perbedaan antara bakteri bergram negatif dan bakteri bergram positif disebabkan oleh
perbedaan struktur dinding sel bakteri gram-positif dan gram-negatif, sehingga
menyebabkan perbedaan larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri grampositif terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri gram-negatif
mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri grampositif. Lipida ini akan larut dalam alkohol dan aseton yang digunakan sebagai larutan
pemucat, sehingga pori-pori dinding sel membesar dan meningkatkan daya larut
kompleks kristal-violet-yodium pada dinding sel bakteri gram-negatif. Selain itu yang
menyebabkan adanya perbedaan antara bakteri bergram negatif dengan bakteri bergram
positif adalah pada bakteri gram-positif akan terbentuk persenyawaan kompleks kristalviolet-yodium ribonukleat yang tidak larut dalam larutan pemucat. Persenyawaan
kompleks ini tidak terbentuk pada bakteri gram-negatif sehingga diduga adanya
perbedaan kandungan asam ribonukleat antara bakteri gram-positif dan gram-negatif.
Faktor-faktor lain yang juga dapat menentukan jenis gram bakteri, yaitu pelaksanaan
fiksasi panas terhadap olesan, kerapatan sel pada olesan, konsentrasi dan umur reagenreagen yang digunakan, sifat dan konsentrasi dan jumlah pemucat yang dipakai, serta
sejarah biakan (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan gram ini memilahkan bakteri menjadi kelompok bakteri gram positif dan
gram negatif. Bakteri gram positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna
kristal violet-yodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat sedangkan
bakteri gram negatif berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu pemberian
larutan pemucat dan kemudian mengambil zat warna yang kedua yaitu Safranin yang
menyebabkan sel menjadi berwarna merah. Fungsi zat warna kedua hanyalah sebagai
pembeda (kontras) terhadap zat warna kristal violet (Capuccino & Sherman, 1983).
Jenis bakteri yang termasuk gram positif adalah famili Micrococcaceae seperti
Microsoccocus, Staphylococcus
dan famili Streptococcaceae seperti Streptococcus,
Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus. Streptococcus merupakan bakteri berbentuk
bulat yang hidup secara berpasangan, atau membentuk rantai pendek dan panjang
tergantung dari spesies dan kondisi pertumbuhannya (Fardiaz, 1992).
Beberapa jenis bakteri yang merupakan jenis bakteri gram (-) adalah Eschericia coli,
Enterobacter aerogenes, dan kelompok Pseudomonas. Sedangkan yang termasuk
bakteri gram (+) adalah kelompok Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan
Streptococcus. (Hadioetomo, 1993).
Menurut Hadioetomo (1993), ada empat reagen yang digunakan dalam pengecatan gram
Cat utama, yaitu larutan violet kristal
Mordan, yaitu senyawa yang digunakan untuk mengindentifikasikan cat utama
(kompleks antara cat utama dengan senyawa yang dicat lebih baik) misalnya
larutan iodine
Bahan peluntur (decolorizing agent) yaitu solvent organik (alkohol atau aseton)
yang dapat digunakan untuk melunturkan cat utama
Cat penutup seperti safranin, digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utamanya setelah dilunturkan. Karena cat penutup harus
berbeda dengan cat utama.
Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri.
Endospora berbentuk sangat padat dan bersifat sangat refraktif bila dilihat di bawah
mikroskop, karena kandungan airnya sangat rendah. Endospora sangat sukar diwarnai
dengan pewarna biasa, karenanya harus digunakan pewarna spesifik, dan yang biasa
digunakan adalah pewarna hijau malasit (malachite green) (Fardiaz, 1992).
Endospora hanya terdapat dalam bakteri berbentuk batang (basilus) dan dapat dilihat
dengan pewarnaan endospora. Pada umumnya, bakteri pembentuk endospora memang
berbentuk batang, dan setelah membentuk endospora sporangium, bakteri akan mati lalu
mengalami lisis (pemecahan membran sel). Spora bekas lisis memiliki ukuran cukup
besar, sehingga dapat terlihat jelas pada mikroskop. Spora bekas inilah yang
menunjukkan adanya endospora (Lay, 1994).
Dalam percobaan pengecatan endospora, setelah penetesan pewarna malachite green,
dilakukan pemanasan. Pemanasan ini bertujuan untuk mengembangkan lapisan luar
spora yang bersifat tahan terhadap perubahan faktor luar, yang dalam hal ini adalah
penambahan bahan kimia berupa larutan pewarna malachite green, sehingga zat warna
malachite green dapat masuk ke dalam spora. Setelah didinginkan, warna hijau tersebut
terperangkap dalam spora, sehingga struktur endospora dapat diamati (Lay, 1994).
Pengecatan bakteri akan berhasil, jika sebelum melakukan pengecatan diperlukan
penyiapan preparat yang baik, yaitu tidak terlalu tebal atau terlalu tipis, tetap melekat
pada gelas preparat selama pencucian berulang-ulang, sel-selnya tidak berubah bentuk
atau morfologi setelah fiksasi dan pengecatan (Hadioetomo, 1993).
1.2
Tujuan Praktikum
Tujuan praktikum ini adalah mengetahui cara pengecatan pada bakteri dan yeast yang
benar. Mengamati bentuk dari bakteri dan yeast. Mengetahui cara pengelompokan
bakteri dalam gram positif atau gram negatif.
2. MATERI DAN METODA
2.1
2.1.1
Materi
Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah larutan violet kristal, lugol, alkohol
95%, larutan safranin, larutan malachite green, metilen blue.
2.1.2
Alat
Peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas objek, ose, mikroskop,
bunsen, Bacillius subtilis, Streptococcus thermophilus, Echerichia coli, Sacharomyses
cerevisiae.
2.2
2.2.1
Metoda
Pengecatan sederhana
Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi aquades 1 tetes kemudian
ditambahkan biakan (B. Subtilis, S. Thermophilus) sedikit dengan menggunakan jarum
ose. Dibiarkan dulu sampai kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi perwarna violet
kristal. Setelah itu dipanaskan 3 menit tetapi jangan sampai kering, jika mulai kering
ditambahkan violet kristal 1 tetes lagi. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
alkohol, Setelah itu dikeringkan. Setelah kering ditetesi dengan metylen blue, lalu
didiamkan selama 10 detik kemudian dicuci dengan air mengalir. Kemudian
dikeringkan, setelah itu diamati dalam mikroskop dan hasilnya digambar.
2.2.2
Pengecatan gram
Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat dibersihkan dengan alkohol kemudian
dikeringkan kemudian ditetesi dengan aquades sebanyak 1 tetes. Tambahkan
mikroorganisme (Escherichia coli dan Streptococcus thermophilus) yang
diambil
dengan jarum ose dan diletakkan pada kaca preparat dan kemudian dibiarkan sampai
kering. Setelah kering, kemudian difiksasi dan diberi pewarna violet kristal. Dan
dibiarkan di meja selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan air mengalir, dan sisa air
yang tertinggal dibuang dan ditetesi dengan lugol. Tunggu lagi selama 1 menit,
kemudian dicuci kembali dengan air dan kemudian dihilangkan warnanya dengan
alkohol. Setelah itu diberi pewarna safranin dan didiamkan selama 10 detik. Setelah
kering, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Hasilnya
diamati di bawah
mikroskop dan digambar.
2.2.3
Pengecatan endospora (B. Subtilis)
Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi aquades 1 tetes kemudian
ditambahkan biakan (B. Sublitis) sedikit dengan menggunakan jarum ose. Dibiarkan
dulu sampai kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi perwarna hijau malasit dan
dibiarkan selama 20 menit tanpa pemanasan atau selama 5 menit diatas pemanas air.
Setiap kali perwarna menjadi kering tetesi kembali pewarnanya. Kemudian dicuci
dengan air mengalir selama 20-30 detik, setelah itu diberi safranin selama 30 detik.
Setelah itu dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Hasilnya diamati di bawah
mikroskop dan digambar.
2.2.4
Pengecatan endospora yeast (Saccaromyces cereviseae)
Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi aquades 1 tetes kemudian
ditambahkan biakan (Saccharomyces cerevisiae) sedikit dengan menggunakan jarum
ose Dibiarkan dulu sampai kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi perwarna violet
kristal. Setelah itu dipanaskan 3 menit tetapi jangan sampai kering, jika mulai kering
ditambahkan violet kristal 1 tetes lagi. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
alcohol, Setelah itu dikeringkan. Setelah kering diberi warna yang kedua yaitu safranin,
didiamkan selama 10 detik dan dicuci dengan air mengalir. Kemudian dikeringkan,
hasilnya diamati di bawah mikroskop dan digambar.
3. HASIL PENGAMATAN
Jenis pengecatan
Pengecatan
Jenis mikroorganisme
Bacillus subtilis
sederhana
Gambar
Keterangan
Perbesaran : 40 x 10
Warna : biru
Bentuk : bacillus,
berkoloni
Pengecatan
Streptococcus thermophilus
sederhana
1. MO
Perbesaran : 40 x 10
Warna : biru
Bentuk
:
coccus,
menyebar
Pengecatan gram
Echerichia coli
1. MO
Perbesaran : 40 x 10
Warna : merah
Bentuk
:
fibrio,
menyebar
Pengecatan gram
Streptococcus thermophilus
1. MO 2. pewarna
Perbesaran : 40 x 10
Warna : merah
Bentuk
:
coccus,
menyebar
Endospora
Bacillus subtilis
1. MO
Perbesaran : 40 x 10
Warna : hijau
Bentuk : bacillus,
berkoloni
Endospora
Sacharomyses cerevisiae.
1. MO
Perbesaran : 40 x 10
Warna
:
merah
:
coccus,
muda
Bentuk
berkoloni
1. MO
4. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini masing-masing kelompok mencoba untuk mengamati morfologi
dari bakteri dan spora yeast. Karena ukurannya sangat kecil dan tidak dapat dilihat
dengan mata telanjang serta pada mikroskop kurang jelas kenampakannya maka
diperlukan suatu pewarnaan atau pengecatan untuk memperjelas morfologi dari masingmasing mikroba. Ini sesuai dengan pernyataan Hadioetomo (1993), bahwa kebanyakan
sel mikrobia tidak berwarna atau mempunyai pigmen yang sangat sedikit dan tidak
dapat mengadsorbsi ataupun membiaskan cahaya sehingga tidak dapat dilihat dengan
mudah pada mikroskop karena indeks bias sitoplasma sel yang hampir sama dengan
indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya
dapat dipertajam dengan mewarnai sel-sel tersebut dengan sel warna. Oleh karena itu,
penggunaan zat warna terhadap bakteri yang dilakukan pada percobaan bertujuan
supaya zat warna dapat mengadsorbsi atau membiaskan cahaya sehingga dapat
meningkatkan kontras dengan sekelilingnya dan struktur sel bakteri dapat diamati.
Pada setiap proses pengecatan yang dilakukan, baik pengecatan sederhana, pengecatan
gram, ataupun pengecatan endospora, selalu dilakukan proses fiksasi. Proses fiksasi ini
dilakukan dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api spirius beberapa kali
selama 1-2 detik. Proses ini bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda
dan mematikan bakteri, karena sebenarnya bakteri yang hidup tidak dapat diamati,
karena pada bakteri hidup, selnya tidak mengandung pigmen atau transparan, karena
indeks bias sitoplasmanya hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat
cair (Lay, 1994). Ini sesuai dengan yang kami lakukan dalam praktikum.
Ada dua macam cara pewarnaan yang dilakukan selama percobaan, yakni pewarnaan
sederhana dan pewarnaan gram. Menurut Fardiaz (1992), pewarnaan bakteri dapat
dibedakan atas beberapa golongan, yang meliputi :
a. Pewarnaan sederhana
b. Pewarnaan diferensial
pewarnaan gram
pewarnaan asam cepat (acid-fast)
c. pewarnaan struktural
pewarnaan inti sel (Feulgen), yaitu pewarnaan inti sel bakteri
pewarnaan endospora, yaitu pewarnaan spora bakteri
pewarnaan dinding sel, yaitu pewarnaan dinding sel dari bakteri
pewarnaan kapsul, yaitu pewarnaan kapsul yang dibentuk oleh bakteri
pewarnaan flagella, yaitu pewarnaan flagel / alat gerak bakteri
d. pewarnaan untuk menguji komponen dalam sel seperti Glikogen, Lipida.
Percobaan yang pertama adalah pewarnaan sederhana dari bakteri Bacillus subtilis dan
Streptococcus thermophilus. Proses pengamatan bakteri tidak akan sempurna jika
kenampakan yang diperoleh kurang jelas, pewarnaan berguna untuk memperjelasnya.
Pengecatan sederhana yang dilakukan dengan pemberian warna terlebih dahulu pada
bakteri sebelum dilihat mikroskop, bertujuan untuk mengetahui ciri-ciri tertentu bakteri.
Hal ini dikarenakan bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa
karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun
biakan secara keseluruhan mungkin berwarna (Volk & Wheeler, 1993). Dikatakan oleh
Lay (1994), bahwa pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling sederhana,
dimana pada pengecatan ini hanya dilakukan dengan penambahan satu zat pewarna atau
hanya melalui satu tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri. Ini sesuai dengan yang
kami lakukan, karena hanya melewati satu tahap pewarnaan dalam pewarnaan
sederhana. Pewarna yang dipakai adalah Methylen blue loefler (metilen biru). Pada
percobaan pengecatan dilakukan dengan zat warna yang bersifat basa yaitu biru metilen
(Lay, 1994). Hubungan bakteri dengan zat perwarna basa yang menonjol disebabkan
oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi jika bakteri
diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi dengan ion positif zat
pewarna basa. Oleh karena itu, pada percobaan digunakan metilen loeffer yang
memiliki sifat basa dan alkalin sebagai pewarna sederhana. Pewarna alkalin lain yang
umumnya digunakan dapat berupa pewarna basa seperti metylen blue, basic fuschin,
dan violet kristal (Volk dan Wheller, 1993). Setelah diamati pada mikroskop dengan
perbesaran 40 x 10 terlihat bahwa B. subtilis bentuknya basil (batang), berkoloni, dan
berwarna biru. Warna biru tersebut muncul setelah adanya penambahan metilen biru.
Bacillus subtilis adalah jenis bakteri yang menghasilkan spora berbentuk silinder yang
tidak membengkak, sporanya langsing dan tidak melebihi diameter 0,9 m (Fardiaz,
1992). Bacillus subtilis merupakan bakteri berwujud silinder terentang (Schlegel &
Schmidt,1994). Sedangkan pada Streptococcus thermophilus dengan perbesaran
mikroskop 40 x 10 terlihat bahwa bentuknya bulat (coccus), menyebar, dan warnanya
biru. Streptococcus merupakan bakteri berbentuk bulat yang hidup secara berpasangan,
atau membentuk rantai pendek dan panjang tergantung dari spesies dan kondisi
pertumbuhannya (Fardiaz, 1992). Sama seperti B.subtilis warna biru yang muncul juga
dikarenakan adanya penambahan metilen biru. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan pewarna sederhana, karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka basa), dan zatzat warna yang digunakan dalam pengecatan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromoforiknya bermuatan positif) (Hadioetomo, 1993). Jadi karena sifat
metilen biru yang basa maka akan mudah menempel pada bakteri dan sulit hilang.
Dengan dilakukannya pewarnaan sederhana ini terlihat bahwa masing-masing bakteri
memiliki
bentuk
yang
berbeda-beda.
Pengecatan
sederhana
yang
dilakukan
memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (kokus,
basilus, vibrio, sprilum, dan sebagainya) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan
yang diwarnai (Hadioetomo, 1993).
Percobaan yang kedua adalah pewarnaan bakteri dengan cara pewarnaan gram. Ada dua
bakteri yang dipakai yakni Echerichia coli dan Streptococcus thermophilus. Digunakan
beberapa macam pewarna dalam praktikum ini, yakni violet kristal, larutan iodium gram
(lugol), dan safranin. Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat warna primer
(violet kristal), larutan mordan (iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat warna penutup
(safranin). Larutan mordan berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna
oleh bakteri, sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat,
memperjelas zat warna, mempersulit pelarutan zat warna, dan menyebabkan
terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet-yodium. Sedangkan etanol,
berfungsi untuk melunturkan zat warna primer dengan daya kerja lambat, sehingga
memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. Fungsi penambahan
zat warna penutup adalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat warna primer, dan
juga untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan zat warna primernya (Lay,
1994).
Pengecatan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
benyak digunakan dalam laboratorium. Selain itu pengecatan gram merupakan tahap
penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri. Pengecatan gram ini dapat digunakan
untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram negatif atau gram positif (Lay, 1994).
Pebedaan bakteri gram positif dan gram negatif :
Pada saat pengecatan dengan cat utama, bakteri gram positif maupun gram negatif
akan mengikat violet kristal dan menunjukkan warna ungu atau biru tua.
Pada saat penambahan mordan, pada bakteri gram positif maupun gram negatif
sama-sama akan terbentuk kompleks violet kristal dengan lugol atau iodin dan
tetap berwarna biru.
Pada saat pelarutan, bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi membran sel
namun tidak sampai pecah dan pori-porinya mengecil sehingga kompleks violet
kristal dan lugol atau iodin tetap tertinggal di dalam sel dan bakteri tetap berwarna
biru atau ungu. Sedangkan pada bakteri gram negatif, akan terdehidrasi sampai
lemaknya terekstraksi dan pori-pori pada membrannya akan melebar sehingga
semua kompleks violet kristal dan lugol atau iodin akan keluar dan sel bakteri
menjadi tidak berwarna.
Pada saat penambahan cat penutup, bakteri gram positif tidak berpengaruh apa-apa
dan warnanya tetap biru atau ungu. Sedangkan bakteri gram negatif akan mengikat
cat penutup tersebut dan menjadi berwarna merah.
(Trihendrokesowo, 1989).
Sewaktu pengamatan terlihat bahwa E.coli bentuknya fibrio, menyebar, dan warnanya
merah. Ini berarti E.coli merupakan bakteri gram negatif. Pada pengamatan
Streptococcus thermophilus terlihat bentuknya batang (coccus), menyebar, dan
warnanya merah. Menurut Hadioetomo (1993), Beberapa jenis bakteri yang merupakan
jenis bakteri gram (-) adalah Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, dan kelompok
Pseudomonas. Sedangkan yang termasuk bakteri gram (+) adalah kelompok
Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Streptococcus. Terlihat bahwa
ketidakcocokan terjadi pada Streptococcus thermophilus kami. Seharusnya warnanya
adalah tetap ungu tua atau biru kalau menurut teori. Kemungkinan kesalahan terjadi
karena penyemprotan alkohol yang berlebihan. Etanol 95% berfungsi sebagai larutan
pemucat yang akan melarutkan zat warna utama, namun larutan ini bekerja lambat
sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. Iodin
merupakan larutan mordan, yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan cat
utama dan berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri
sehingga pengikatan ini menjadi lebih kuat (Hadioetomo, 1993).
Percobaan yang ketiga adalah pewarnaan endospora. Ada dua mikroba yang dipakai
yakni B.subtilis dan Sacharomyses cerevisiae. Pada B.subtilis pewarna yang digunakan
adalah pewarna hijau malasit dan safranin sedang pada Sacharomyses cerevisiae
pewarnanya violet kristal dan safranin. Endospora sukar untuk diwarnai oleh pewarna
biasa. Endospora merupakan struktur di dalam sel pada tempat – tempat yang khas yang
dibentuk oleh bakteri jenis – jenis tertentu, misalnya bakteri genus Bacillus dan
Clostridium (Hadioetomo, 1993). Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna
biasa, karenanya harus digunakan pewarna spesifik, dan yang biasa digunakan adalah
pewarna hijau malasit (malachite green) (Fardiaz, 1998). Sewaktu pengamatan
B.subtilis terlihat bahwa bentuknya batang (basil), berkoloni, dan warnanya hijau.
Bacillus subtilis merupakan bakteri berwujud silinder terentang (Schlegel &
Schmidt,1994). Karena bentuknya batang maka B.subtilis dapat membentuk endospora.
Bakteri pembentuk endospora umumnya adalah bakteri berbentuk batang, dan setelah
membentuk endospora, sporangium mati dan akhirnya lisis dan spora bekas ukurannya
cukup besar dan dapat dilihat di mikroskop (Hadioetomo, 1993). Endospora hanya
terdapat dalam bakteri berbentuk batang (basilus) dan dapat dilihat dengan pewarnaan
endospora (Lay, 1994). Setelah diwarnai warna B.subtilis berubah menjadi hijau ini
semakin menunjukkan bahwa B.subtilis memiliki endospora. Pada pengamatan
Sacharomyses cerevisiae terlihat bahwa bentuknya bulat (coccus), berkoloni, dan
warnanya merah muda. Ini menunjukkan bahwa tidak hanya bakteri bentuk batang saja
yang bisa membentuk endospora, tapi yeast juga bisa membentuknya.
5. KESIMPULAN
Pewarnaan bakteri dapat digolongkan menjadi pewarnaan sederhana, pewarnaan
diferensial, pewarnaan struktural, dan pewarnaan untuk menguji keberadaan
komponen tertentu di dalam sel.
Pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling sederhana, dimana pada
pengecatan ini hanya dilakukan dengan penambahan satu zat pewarna atau
hanya melalui satu tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri.
Pengecatan sederhana yang dilakukan memungkinkan dibedakannya bakteri
dengan bermacam-macam tipe morfologi (kokus, basilus, vibrio, sprilum, dan
sebagainya)
Pengecatan gram adalah pewarnaan atau pengecatan dengan melalui beberapa
tahap pengecatan dengan beberapa reagen yang berbeda.
Pengecatan endospora adalah pengecatan yang bertujuan untuk mengamati
endospora, dimana tidak semua jenis bakteri mampu membentuk endospora.
Adapun 3 bentuk dasar sel bakteri : batang (baccil), bulat (coccus), dan
lengkung (koma, vibrion, dan spiral).
Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat warna primer (violet
kristal), larutan mordan (iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat warna penutup
(safranin).
Dalam menyiapkan preparat tidak boleh terlalu tebal.
Pewarnaan gram memisahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram
negatif.
Beberapa jenis bakteri yang merupakan jenis bakteri gram (-) adalah Eschericia
coli, Enterobacter aerogenes, dan kelompok Pseudomonas.
Beberapa jenis bakteri yang termasuk bakteri gram (+) adalah kelompok
Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Streptococcus.
Pada saat penambahan cat penutup, bakteri gram positif tidak berpengaruh apaapa dan warnanya tetap biru atau ungu.
Bakteri gram negatif akan mengikat cat penutup tersebut dan menjadi berwarna
merah.
Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri.
Endospora hanya terdapat dalam bakteri berbentuk batang (basilus) dan dapat
dilihat dengan pewarnaan endospora.
Pengecatan bakteri akan berhasil, jika sebelum melakukan pengecatan
diperlukan penyiapan preparat yang baik, yaitu tidak terlalu tebal atau terlalu
tipis, tetap melekat pada gelas preparat selama pencucian berulang-ulang, selselnya tidak berubah bentuk atau morfologi setelah fiksasi dan pengecatan.
6. DAFTAR PUSTAKA
Cappuccino, I.G. & N. Sherman. (1983). Microbiology a Laboratory Manual. AddisonWesley Publishing Company. Massachuset.
Fardiaz, S. ( 1992 ). Mikrobiologi Pangan 1. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Gaman, P. M. & K. B. Sherrington. (1994). Ilmu Pangan. Gadjah Mada University
Press. Yogyakarta.
Hadioetomo, R. S. ( 1993 ). Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Hadioetomo, R.S. (1993). Mikobiologi Dasar dalam Praktek, Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Lay, B. W. ( 1994 ). Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada.
Jakarta.
Schlegel, H.G. & K. Schmidt. (1994). Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University
Press. Yogyakarta.
Timotius, K. H. ( 1982 ). Mikrobiologi Dasar. Universitas Kristen Satya Wacana.
Salatiga.
Trihendrokesowo. (1989). Petunjuk Laboratorium Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar
Universitas Pangan dan Gizi. Yogyakarta.
Volk, W.A. & M.F. Wheeler. (1993). Mikrobiologi Dasar. Erlangga. Jakarta.
7. LAMPIRAN