Hubungan Ekspresi Reseptor Progesteron Dengan Diferensiasi Sel dan Stadium Karsinoma Endometrium Chapter III V
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1.
Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif rancangan cross-sectional
dengan analisa inferensial dimana dilakukan pemeriksaan imunohistokimia
terhadap parafin blok jaringan karsinoma endometrium kemudian akan dianalisa
secara analitik untuk melihat hubungan ekspresi reseptor progesteron dengan
diferensiasi sel dan stadium karsinoma endometrium.
3.2.
Tempat dan Waktu Penelitian
Tempat penelitian dilakukan di Departemen Obstetri dan Ginekologi
RSUP
H.
Adam
Malik
Medan.
Pemeriksaan
imunohistokimia
reseptor
progesteron dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi USU.
Waktu penelitian dimulai dari Mei 2016 sampai Januari 2017.
3.3.
Subyek Penelitian
Subyek penelitian adalah sediaan blok parafin jaringan pasien karsinoma
endometrium paska pembedahan (laparotomy surgical staging) di Departemen
Obstetri dan Ginekologi RSUP. H. Adam Malik Medan.
55
Universitas Sumatera Utara
3.4.
Sampel Penelitian73
= Zα 2 P Q
n
d2
dimana :
n
= besar sampel minimum
Zα = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya bergantung pada nilai α
yang ditentukan. Nilai α = 0,05 Zα = 1,96
P
= proporsi
ekspresi
reseptor
progesteron
positif
pada
karsinoma
endometrium =0,874
Q
= 1-P
d
= kesalahan (absolut) yang dapat ditolerir = 0,1
Q
= 1-P = 0,2
n
= 61,4 dibulatkan menjadi 65 orang.
3.5.
Kriteria Inklusi dan Eksklusi
3.5.1. Kriteria Inklusi
Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah:
1. Blok parafin jaringan adenokarsinoma endometrium tipe I, yang
dibuktikan dengan hasil pemeriksaan histopatologi.
2. Data rekam medis lengkap
3.5.2. Kriteria Eksklusi
Kriteria eksklusi pada penelitian ini adalah sediaan blok parafin
tidak dapat dilabel (blok parafin tidak ditemukan) dan tidak dapat
dilakukan pemeriksaan imunohistokimia untuk pemeriksaan ekspresi
reseptor progesteron.
56
Universitas Sumatera Utara
3.6.
1.
Cara kerja dan teknik pengumpulan data
Setelah mendapat persetujuan dari komisi etik untuk melakukan
penelitian, penelitian dimulai dengan mengumpulkan data dari rekam
medik mengenai identitas lengkap, karakteristik pasien dan diagnosa
pasien (sesuai kriteria inklusi dan eksklusi).
2.
Setelah data diambil, dilakukan pencarian blok parafin hasil pemeriksaan
histopatologi dari departemen Patologi Anatomi RSUP HAM, pasien
dengan karsinoma endomterium yang telah dilakukan pembedahan
(laparotomy surgical staging). Blok parafin yang diambil adalah jaringan
endometrium.
3.
Dilakukan peminjaman sediaan blokparafin.
4.
Dilakukan pemeriksaan immunohistokimia di Laboratorium Patologi
Anatomi
FK
USU.
Pada
blok
parafin
dilakukan
pemeriksaan
imunohistokimia reseptor progesteron. Pemeriksaan imunohistokimia
adalah pemeriksaan jaringan yang telah dilabel dengan antibodi spesifik
untuk melihat ekspresi protein antigen spesifik dengan mikroskop.
5.
Pembacaan hasil pemeriksaan imunohistokimia dilakukan oleh dua dokter
spesialis Patologi Anatomi.
6.
3.7.
Hasil interpretasi sediaan tersebut dilakukan analisis statistik.
Prosedur Pemeriksaan Imunohistokimia
3.7.1. Alat dan Bahan Penelitian
Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah: mikrotom, waterbath,
hot plate, freezer, incubator, staining jar, rak object glass, pipet mikro, kertas
saring, tabung sentrifuge 15ml, coated object glass, kaca penutup, entelan dan
mikroskop cahaya,microwave , mikroskop.
57
Universitas Sumatera Utara
Bahan-bahan yang diperlukan untuk penelitian ini adalah xylene, alkohol
absolut 70%, alkohol absolut 80%, akuades, target retrieval solution (TRS), wash
buffer (WB), Dako FLEXtm peroxidase,Dako FLEXtm Diamino Benzidine (DAB),
phosphate buffer saline (PBS), hematoxylin, mounting medium, Antibodi primer:
Monoclonal Mouse Anti-Human Progesteron Receptor, clone PgR 636.
3.7.2. Cara kerja
Tahapan pewarnaan reseptor progesteron tercantum pada tabel dibawah
ini :
Tabel 3.1.Tahapan Pewarnaan Reseptor Progesteron
Deparafinisasi slide (Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3
5 menit
Rehidrasi (Alkohol absolut,alcohol 96%, 80%, 70%)
4 menit
Bilas dengan air mengalir (keran)
5 menit
Masukkan slide ke dalam PT Link Dako Epitope Retrieval : set
1 jam
up Preheat 65ºC, Running time 98 ºC selama 15 menit
Pap pen Segera masukan dalam Trias Buffered Saline (TBS)
5 menit
pH 7,4
Blocking dengan peroxidase block
5-10 menit
Cuci dalam Tri Buffered Saline (TBS) pH 7,4
5 menit
Blocking dengan Normal horse Serum (NHS) 3%
15 menit
Cuci dalam Tri Buffered Saline (TBS) pH 7,4
5 menit
Inkubasi dengan Antibodi primer : Monoclonal Mouse Anti-
1 jam
Human Progesteron Receptor, clone PgR 636
Cuci dalam Tri Buffered Saline (TBS) pH 7,4
5 menit
Dako Real envision Rabbit
20 menit
Cuci dalam Tri Buffered Saline (TBS) pH 7,4
5 menit
DAB + Substrat Chromogen solution dengan penegenceran 20
5 menit
µl DAB : 1000 µl substrat (tahan 5 hari di suhu 2-8 ºC setelah
di mix
Cuci dengan air mengalir
10 menit
Hematoxylin
10 menit
Bilas dengan air mengalir (keran)
5 menit
Lithium carbonat (5% dalam aqua)
2 menit
58
Universitas Sumatera Utara
Cuci dengan air mengalir
5 menit
Rehidrasi (Alkohol absolut,alcohol 96%, 80%, 70%)
4 menit
Clearing (Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3
5 menit
Mounting medium dan coverslip
5 menit
Pengamatan di bawah mikroskop
3.8.
Instrumen Penilaian
Penilaian ekspresi imunuhistokimia reseptor progesteron menggunakan
Allred Score yang merupakan penjumlahan Proportion Score (PS) dan Intensity
Score (IS).
Tabel 3.2.Penilaian Allred Score Pada Ekspresi Reseptor Progesteron58
Proportion Score (PS)
Score
Intensity Score (IS)
Tidak ada nukleus yang terwarnai
0
Tidak terwarnai
66% nukleus yang terwarnai
5
Skor Total = Proportion Score (PS) + Intensity Score (IS)58
Tabel 3.3.Interpretasi Penilaian Allred Score 73
Skor Total
Interpretasi
0-2
Negatif
>3
Positif
Penilaian ekspresi immunohistokimia akan dilakukan oleh dua orang
observer (patolog). Untuk menganalisa perbedaan akurasi dua observer akan
dihitung nilai kappa, dimana jika validitas >75% maka tidak ditemukan perbedaan
bermakna antara kedua pengamatan observer.
59
Universitas Sumatera Utara
3.9.
Definisi Operasional
Pada penelitian ini digunakan batasan sebagai berikut:
No
1.
Variabel
Cara dan Alat Ukur
Definisi
Kategori
Skala Ukur
Karsinoma
Kasus keganasan
Pemeriksaan
Karsinomaendo
endometrium
endometrium dengan
histopatologi
metrium
Kategorik
endometrioid
hasil histopatologi
karsinomaendometrium
endometrioid yang
didapat dari
pembedahan
(laparotomy surgical
staging)
2.
1,75
Reseptor
Pemeriksaan
Progesteron
reseptor
terhadap
progesteron
dengan
menggunakan
metode
pemeriksaan
Pewarnaan
Skor Allred
Imunohistokimia
0-2 (negatif)
yang
diamati
oleh
dan
menggunakan
dilakukan interpretasi
Monoclonal Mouse Anti-
dengan skor Allred.
Progesteron
Receptor,
clone
≥ 3 (positif)
dua orang observer
imunohistokimia dengan
Human
Kategorik
kemudian
PgR
47,48
636
3.
Usia
Usia
yang
terhitung
Rekam medik
50
penelitian
dilaksanakan
yang
dinyatakan
dalam
76
tahun
4.
Indeks
tubuh
massa
Indeks
massa
tubuh
Alat pengukur berat
kriteria
badan dalam satuan
77
kilogram serta alat
berdasarkan
WHO tahun 2004
pengukur
tinggi
badan dalam satuan
meter
Underweight :
30 kg/m
5.
Diferensiasi
Deskripsi pada tumor
berdasarkan
Histopatologi
pada
Baik,
2
sedang,
Kategorik
buruk
seberapa abnormal sel
tumor
dan
jaringan
tumor yang terlihat di
bawah mikroskop yang
diklasifikasikan
berdasarkan
2102
6.
FIGO
15
Stadium
Derajat keparahan dan
karsinoma
penyebaran karsinoma
endometrium
endometrium
Laparatomi
Stadium I, II, III
Kategorik
yang
diklasifikasikan
berdasarkan FIGO (The
Federation
of
Gynecology
Obstetrics)
and
15,38
61
Universitas Sumatera Utara
3.10.
Analisa Data
Data akan dianalisa secara deskriptif untuk melihat distribusi frekuensi
berdasarkan karakteristik. Kemudian akan dianalisa secara iferensial dengan
menggunakan uji chi-square untuk melihat hubungan ekspresi reseptor
progesteron dengan diferensiasi sel dan stadium karsinoma endometrium.
Untuk menganalisa perbedaan akurasi dua observer akan dihitung nilai
kappa, dimana jika validitas >75% maka tidak ditemukan perbedaan bermakna
antara kedua pengamatan observer.
3.11. Alur Penelitian
Data Laporan Rekam Medik: Diagnosa, Data umum
Kriteria Inklusi/Eksklusi
Karsinoma endometrium
tipe 1
Sampel Blok Parafin
Pemeriksaan imunohistokimia reseptor progesteron
Analisis Data
62
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1.
KarakteristikSubyekPenelitian
Penelitian
ini
menggunakansediaan
blok
parafin
jaringan
pasien
karsinoma endometrium paska pembedahan di Departemen Obstetri dan
Ginekologi RSUP. H. Adam Malik Medansebanyak 65 buah.
Dilakukan pengamatan oleh dua observer terhadap ekspresi reseptor
progesteron pada karsinoma endometrium. Kedua data pengamatan tersebut
diuji dengan menghitung nilai kappa dan didapatkan nilai kappa 99 %. Hal ini
menunjukkan bahwa data yang diperoleh dari observer 1 dan 2 tidak jauh
berbeda (konsisten) dan untuk melakukan analisa data dapat digunakan data
dari pembacaan dari salah satu observer saja.
63
Universitas Sumatera Utara
Karakteristik subyek penelitian digambarkan pada tabel 4.1
Tabel 4.1 Ditribusi frekuensi berdasarkan karateristik subjek penelitian
Karakteristik
Karsinoma Endometrium
n
%
< 50 tahun
21
32.3
> 50 tahun
44
67.7
Underweight
0
0
Normoweight
14
21.5
Overweight
29
44.6
Obesitas
22
33.8
Baik
29
44.6
Sedang
16
24.6
Buruk
20
30.8
I
21
32.3
II
17
26.2
III
27
41.5
65
100
Umur
IMT
Diferensiasi Sel
Stadium
Total
Berdasarkan tabel 4.1 dapat dilihat bahwa subyek penelitian karsinoma
endometrium terbanyak dengan usia > 50 tahun (67.7%). Dari hasil tersebut,
menunjukkan bahwa karsinoma endometrium umumnya dijumpai pada usia
lanjut. Hal ini sesuai dengan penelitian Tulumang et al yang diperoleh bahwa
kasus karsinoma endometrium terbanyak pada usia > 51 tahun.1
Hasil penelitian yang sama oleh Holman et aldanSalom et al didapatkan
mayoritas wanita yang didiagnosa karsinoma endometrium adalah wanita
dengan rentang usia 55-64 tahun.18,19
Menurut Pike et al insidensi karsinoma endometrium meningkat seiring
dengan usia. Penelitian yang dilakukan di Birmingham of UK (1968-1972)
menunjukkan pada wanita perimenopause terjadi penurunan kadar E2 dan
64
Universitas Sumatera Utara
rendahnya P4. Kondisi ini terjadi secara konstan sehingga hal inilah yang
dikatakan unopposed estrogen pada perimenopause. Selain itu, hal ini berkaitan
dengan
penggunaan
menopausenya.
terapi
Peningkatan
estrogen
resiko
ini
untuk
mengatasi
berhubungan
gejala-gejala
dengan
durasi
penggunaan.8
Berdasarkan indeks massa tubuh, sebagian besar kasus karsinoma
endometrium termasuk dalam kategori overweight sebanyak 29 sampel (44.6%)
dan obesitas sebanyak 22 sampel (33.8%). Seperti yang kita ketahui bahwa
kondisi overweight dan obesitas mempengaruhi produksi peptida (seperti insulin
dan IGF-I, SHBG) dan hormon steroid (seperti estrogen, progesteron, androgen).
Obesitas pada menopause menyebabkan kelebihan produksi estrogen karena
androgen yang diproduksi oleh kelenjar adrenal dan ovarium dikonversi menjadi
estron oleh enzim aromatase di kelenjar adiposa.2 Hasil ini sesuai dengan
penelitian Salom et al, Goodman, dan Chiang yang menyatakan bahwa
peningkatan indeks massa tubuh akan meningkatkan resiko untuk terjadinya
karsinoma endometrium baik pada wanita premenopause atau postmenopause.
Hal ini berhubungan dengan produksi estrogen endogen yang berlebihan karena
aromatisasi androgen menjadi estradiol dan konversi androstenedion menjadi
estron pada jaringan adipose perifer.Selain itu, wanita premenopause yang
gemuk lebih mungkin untuk mengalami anovulasi kronis.17,18,21
Menurut MacNab et al wanita overweight dan obesitas memiliki resiko 2-4
kali menderita karsinoma endometrium. Wanita karsinoma endometrium dengan
obesitas memiliki prognosis yang lebih buruk dibandingkan wanita dengan berat
badan normal.2
Berdasarkan diferensiasi sel, didapati 44.6% karsinoma endometrium
berdiferensiasi baik (derajat I). Menurut Amant et al sebagian besar karsinoma
endometrium endometrioid (tipe I) berdiferensiasi baik-sedang (G1-G2) karena
65
Universitas Sumatera Utara
merupakan progresifitas dari hiperplasia endometrium dan memiliki prognosis
yang lebih baik.9 Hal ini juga sesuai dengan Binder yang menyatakan bahwa
patologi karsinoma endometrium yang paling banyak adalah adenokarsinoma
endometrioid dengan diferensiasi baik.78 Menurut The Cancer Genome Atlas
(TCGA) bahwa karsinoma endometrium tipe I merupakan tumor dengan low copy
number yang umumnya dengan mutasi PTEN dan berhubungan dengan
diferensiasi sel yang baik.59
Berdasarkan stadium, sebagian besar kasus karsinoma endometrium
adalah stadium III (41.5%). Hasil penelitian ini bertentangan dengan hasil
penelitian oleh Holman et al dan Salom et al yang menyatakan bahwa sebagian
besar karsinoma endometrium didiagnosa pada stadium awal (75%).10,17 Hal ini
juga bertentangan dengan data dari SEER tahun 2003-2009, bahwa 68%
karsinoma endometrium didiagnosa pada stadium awal, selebihnya (32%)
terdiagnosa pada stadium akhir setelah terjadi penyebaran lokal atau
penyebaran
lebih
jauh.
Kasus
yang
terdiagnosa
pada
stadium
akhir
kemungkinan karena terlambatnya diagnosa atau jenis histologi lain yang lebih
agresif.78 Dari hasil penelitian ini didapati bahwa kasus terbanyak dijumpai pada
stadium lebih lanjut kemungkinan karena tingkat pengetahuan pasien yang
rendah dalam mengenali gejala dan tidak adanya skrinning baku dalam
mendeteksi karsinoma endometrium. Namun perlu adanya penelitian yang lebih
lanjut untuk menyimpulkan hal ini.
4.2
Ekspresi
Reseptor
Progesteron
pada
Sediaan
Karsinoma
Endometrium
Hasil pemeriksaan ekspresi reseptor progesteron pada 65 buah sediaan
karsinoma endometrium dapat dilihat pada tabel 4.2.
66
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.2. Ekspresi reseptor progesteron pada karsinoma endometrium
Ekspresi
Karsinoma Endometrium
n
%
Positif
30
46.2
Negatif
35
53.8
Total
65
100.0
Dari tabel di atas dapat dilihat bahwa kelompok karsinoma endometrium
yang memiliki ekspresi reseptor progesteron negatif lebih banyak bila
dibandingkan dengan kelompok karsinoma endometrium yang memiliki ekspresi
reseptor progesteron positif (53.8%), namun persentasenya tidak jauh berbeda.
Hal ini sesuai dengan penelitian Xie et al dan Yang S et al yang menyatakan
bahwa ekspresi reseptor progesteron akan menurun selama perjalanan
karsinoma endometrium yang menyebabkan hilangnya inhibisi pertumbuhan
yang diregulasi oleh progesteron. Hilangnya ekspresi reseptor progesteron ini
dapat disebabkan karena dua hal yaitu tidak adanya reseptor progesteron atau
terjadinya down-regulasi reseptor progesteron. Pada karsinoma endometrium
terjadi fosforilasi dan ubiquinasasi reseptor progesterone oleh proteasome.46,59
Hasil penelitian yang sama oleh Kreizman-Shefer et al yang menyatakan
bahwa ekspresi PR menurun sampai menghilang pada karsinoma endometrium.
14
4.3
Hubungan Ekspresi Reseptor Progesteron dengan Diferensiasi Sel
Pada Karsinoma Endometrium
Hubungan ekspresi reseptor progesteron dengan diferensiasi sel pada
karsinoma endometrium yang dinilai secara statistik dengan uji chi-square dapat
dilihat pda tabel 4.3.
67
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.3.Hubungan Ekspresi Reseptor Progesteron dengan Diferensiasi
Sel Pada Karsinoma Endometrium
Diferensiasi Sel
Baik
Ekspresi
Sedang
n
Buruk
n
%
%
n
Positif
22
73.3%
8
26.7%
Negatif
7
20.0%
8
22.9%
Nilai p
Total
%
n
%
0
.0%
30
100.0%
20
57.1%
35
100.0%
0.000
*Uji Fischer Exact
Tabel 4.3 menjelaskan bahwa sebagian besar karsinoma endometrium
dengan ekspresi reseptor progesteron positif memiliki diferensiasi sel baik
(73.3%) dan sebaliknya, sebagian besar karsinoma endometrium dengan
ekspresi reseptor progesteron negatif memiliki memiliki diferensiasi sel buruk
(57.1%). Hubungan antara penilaian ekspresi reseptor progesteron dengan
diferensiasi sel karsinoma endometrium dinilai secara statistik dengan uji fischerexact didapatkan nilai p=0.000 (p
METODOLOGI PENELITIAN
3.1.
Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif rancangan cross-sectional
dengan analisa inferensial dimana dilakukan pemeriksaan imunohistokimia
terhadap parafin blok jaringan karsinoma endometrium kemudian akan dianalisa
secara analitik untuk melihat hubungan ekspresi reseptor progesteron dengan
diferensiasi sel dan stadium karsinoma endometrium.
3.2.
Tempat dan Waktu Penelitian
Tempat penelitian dilakukan di Departemen Obstetri dan Ginekologi
RSUP
H.
Adam
Malik
Medan.
Pemeriksaan
imunohistokimia
reseptor
progesteron dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi USU.
Waktu penelitian dimulai dari Mei 2016 sampai Januari 2017.
3.3.
Subyek Penelitian
Subyek penelitian adalah sediaan blok parafin jaringan pasien karsinoma
endometrium paska pembedahan (laparotomy surgical staging) di Departemen
Obstetri dan Ginekologi RSUP. H. Adam Malik Medan.
55
Universitas Sumatera Utara
3.4.
Sampel Penelitian73
= Zα 2 P Q
n
d2
dimana :
n
= besar sampel minimum
Zα = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya bergantung pada nilai α
yang ditentukan. Nilai α = 0,05 Zα = 1,96
P
= proporsi
ekspresi
reseptor
progesteron
positif
pada
karsinoma
endometrium =0,874
Q
= 1-P
d
= kesalahan (absolut) yang dapat ditolerir = 0,1
Q
= 1-P = 0,2
n
= 61,4 dibulatkan menjadi 65 orang.
3.5.
Kriteria Inklusi dan Eksklusi
3.5.1. Kriteria Inklusi
Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah:
1. Blok parafin jaringan adenokarsinoma endometrium tipe I, yang
dibuktikan dengan hasil pemeriksaan histopatologi.
2. Data rekam medis lengkap
3.5.2. Kriteria Eksklusi
Kriteria eksklusi pada penelitian ini adalah sediaan blok parafin
tidak dapat dilabel (blok parafin tidak ditemukan) dan tidak dapat
dilakukan pemeriksaan imunohistokimia untuk pemeriksaan ekspresi
reseptor progesteron.
56
Universitas Sumatera Utara
3.6.
1.
Cara kerja dan teknik pengumpulan data
Setelah mendapat persetujuan dari komisi etik untuk melakukan
penelitian, penelitian dimulai dengan mengumpulkan data dari rekam
medik mengenai identitas lengkap, karakteristik pasien dan diagnosa
pasien (sesuai kriteria inklusi dan eksklusi).
2.
Setelah data diambil, dilakukan pencarian blok parafin hasil pemeriksaan
histopatologi dari departemen Patologi Anatomi RSUP HAM, pasien
dengan karsinoma endomterium yang telah dilakukan pembedahan
(laparotomy surgical staging). Blok parafin yang diambil adalah jaringan
endometrium.
3.
Dilakukan peminjaman sediaan blokparafin.
4.
Dilakukan pemeriksaan immunohistokimia di Laboratorium Patologi
Anatomi
FK
USU.
Pada
blok
parafin
dilakukan
pemeriksaan
imunohistokimia reseptor progesteron. Pemeriksaan imunohistokimia
adalah pemeriksaan jaringan yang telah dilabel dengan antibodi spesifik
untuk melihat ekspresi protein antigen spesifik dengan mikroskop.
5.
Pembacaan hasil pemeriksaan imunohistokimia dilakukan oleh dua dokter
spesialis Patologi Anatomi.
6.
3.7.
Hasil interpretasi sediaan tersebut dilakukan analisis statistik.
Prosedur Pemeriksaan Imunohistokimia
3.7.1. Alat dan Bahan Penelitian
Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah: mikrotom, waterbath,
hot plate, freezer, incubator, staining jar, rak object glass, pipet mikro, kertas
saring, tabung sentrifuge 15ml, coated object glass, kaca penutup, entelan dan
mikroskop cahaya,microwave , mikroskop.
57
Universitas Sumatera Utara
Bahan-bahan yang diperlukan untuk penelitian ini adalah xylene, alkohol
absolut 70%, alkohol absolut 80%, akuades, target retrieval solution (TRS), wash
buffer (WB), Dako FLEXtm peroxidase,Dako FLEXtm Diamino Benzidine (DAB),
phosphate buffer saline (PBS), hematoxylin, mounting medium, Antibodi primer:
Monoclonal Mouse Anti-Human Progesteron Receptor, clone PgR 636.
3.7.2. Cara kerja
Tahapan pewarnaan reseptor progesteron tercantum pada tabel dibawah
ini :
Tabel 3.1.Tahapan Pewarnaan Reseptor Progesteron
Deparafinisasi slide (Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3
5 menit
Rehidrasi (Alkohol absolut,alcohol 96%, 80%, 70%)
4 menit
Bilas dengan air mengalir (keran)
5 menit
Masukkan slide ke dalam PT Link Dako Epitope Retrieval : set
1 jam
up Preheat 65ºC, Running time 98 ºC selama 15 menit
Pap pen Segera masukan dalam Trias Buffered Saline (TBS)
5 menit
pH 7,4
Blocking dengan peroxidase block
5-10 menit
Cuci dalam Tri Buffered Saline (TBS) pH 7,4
5 menit
Blocking dengan Normal horse Serum (NHS) 3%
15 menit
Cuci dalam Tri Buffered Saline (TBS) pH 7,4
5 menit
Inkubasi dengan Antibodi primer : Monoclonal Mouse Anti-
1 jam
Human Progesteron Receptor, clone PgR 636
Cuci dalam Tri Buffered Saline (TBS) pH 7,4
5 menit
Dako Real envision Rabbit
20 menit
Cuci dalam Tri Buffered Saline (TBS) pH 7,4
5 menit
DAB + Substrat Chromogen solution dengan penegenceran 20
5 menit
µl DAB : 1000 µl substrat (tahan 5 hari di suhu 2-8 ºC setelah
di mix
Cuci dengan air mengalir
10 menit
Hematoxylin
10 menit
Bilas dengan air mengalir (keran)
5 menit
Lithium carbonat (5% dalam aqua)
2 menit
58
Universitas Sumatera Utara
Cuci dengan air mengalir
5 menit
Rehidrasi (Alkohol absolut,alcohol 96%, 80%, 70%)
4 menit
Clearing (Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3
5 menit
Mounting medium dan coverslip
5 menit
Pengamatan di bawah mikroskop
3.8.
Instrumen Penilaian
Penilaian ekspresi imunuhistokimia reseptor progesteron menggunakan
Allred Score yang merupakan penjumlahan Proportion Score (PS) dan Intensity
Score (IS).
Tabel 3.2.Penilaian Allred Score Pada Ekspresi Reseptor Progesteron58
Proportion Score (PS)
Score
Intensity Score (IS)
Tidak ada nukleus yang terwarnai
0
Tidak terwarnai
66% nukleus yang terwarnai
5
Skor Total = Proportion Score (PS) + Intensity Score (IS)58
Tabel 3.3.Interpretasi Penilaian Allred Score 73
Skor Total
Interpretasi
0-2
Negatif
>3
Positif
Penilaian ekspresi immunohistokimia akan dilakukan oleh dua orang
observer (patolog). Untuk menganalisa perbedaan akurasi dua observer akan
dihitung nilai kappa, dimana jika validitas >75% maka tidak ditemukan perbedaan
bermakna antara kedua pengamatan observer.
59
Universitas Sumatera Utara
3.9.
Definisi Operasional
Pada penelitian ini digunakan batasan sebagai berikut:
No
1.
Variabel
Cara dan Alat Ukur
Definisi
Kategori
Skala Ukur
Karsinoma
Kasus keganasan
Pemeriksaan
Karsinomaendo
endometrium
endometrium dengan
histopatologi
metrium
Kategorik
endometrioid
hasil histopatologi
karsinomaendometrium
endometrioid yang
didapat dari
pembedahan
(laparotomy surgical
staging)
2.
1,75
Reseptor
Pemeriksaan
Progesteron
reseptor
terhadap
progesteron
dengan
menggunakan
metode
pemeriksaan
Pewarnaan
Skor Allred
Imunohistokimia
0-2 (negatif)
yang
diamati
oleh
dan
menggunakan
dilakukan interpretasi
Monoclonal Mouse Anti-
dengan skor Allred.
Progesteron
Receptor,
clone
≥ 3 (positif)
dua orang observer
imunohistokimia dengan
Human
Kategorik
kemudian
PgR
47,48
636
3.
Usia
Usia
yang
terhitung
Rekam medik
50
penelitian
dilaksanakan
yang
dinyatakan
dalam
76
tahun
4.
Indeks
tubuh
massa
Indeks
massa
tubuh
Alat pengukur berat
kriteria
badan dalam satuan
77
kilogram serta alat
berdasarkan
WHO tahun 2004
pengukur
tinggi
badan dalam satuan
meter
Underweight :
30 kg/m
5.
Diferensiasi
Deskripsi pada tumor
berdasarkan
Histopatologi
pada
Baik,
2
sedang,
Kategorik
buruk
seberapa abnormal sel
tumor
dan
jaringan
tumor yang terlihat di
bawah mikroskop yang
diklasifikasikan
berdasarkan
2102
6.
FIGO
15
Stadium
Derajat keparahan dan
karsinoma
penyebaran karsinoma
endometrium
endometrium
Laparatomi
Stadium I, II, III
Kategorik
yang
diklasifikasikan
berdasarkan FIGO (The
Federation
of
Gynecology
Obstetrics)
and
15,38
61
Universitas Sumatera Utara
3.10.
Analisa Data
Data akan dianalisa secara deskriptif untuk melihat distribusi frekuensi
berdasarkan karakteristik. Kemudian akan dianalisa secara iferensial dengan
menggunakan uji chi-square untuk melihat hubungan ekspresi reseptor
progesteron dengan diferensiasi sel dan stadium karsinoma endometrium.
Untuk menganalisa perbedaan akurasi dua observer akan dihitung nilai
kappa, dimana jika validitas >75% maka tidak ditemukan perbedaan bermakna
antara kedua pengamatan observer.
3.11. Alur Penelitian
Data Laporan Rekam Medik: Diagnosa, Data umum
Kriteria Inklusi/Eksklusi
Karsinoma endometrium
tipe 1
Sampel Blok Parafin
Pemeriksaan imunohistokimia reseptor progesteron
Analisis Data
62
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1.
KarakteristikSubyekPenelitian
Penelitian
ini
menggunakansediaan
blok
parafin
jaringan
pasien
karsinoma endometrium paska pembedahan di Departemen Obstetri dan
Ginekologi RSUP. H. Adam Malik Medansebanyak 65 buah.
Dilakukan pengamatan oleh dua observer terhadap ekspresi reseptor
progesteron pada karsinoma endometrium. Kedua data pengamatan tersebut
diuji dengan menghitung nilai kappa dan didapatkan nilai kappa 99 %. Hal ini
menunjukkan bahwa data yang diperoleh dari observer 1 dan 2 tidak jauh
berbeda (konsisten) dan untuk melakukan analisa data dapat digunakan data
dari pembacaan dari salah satu observer saja.
63
Universitas Sumatera Utara
Karakteristik subyek penelitian digambarkan pada tabel 4.1
Tabel 4.1 Ditribusi frekuensi berdasarkan karateristik subjek penelitian
Karakteristik
Karsinoma Endometrium
n
%
< 50 tahun
21
32.3
> 50 tahun
44
67.7
Underweight
0
0
Normoweight
14
21.5
Overweight
29
44.6
Obesitas
22
33.8
Baik
29
44.6
Sedang
16
24.6
Buruk
20
30.8
I
21
32.3
II
17
26.2
III
27
41.5
65
100
Umur
IMT
Diferensiasi Sel
Stadium
Total
Berdasarkan tabel 4.1 dapat dilihat bahwa subyek penelitian karsinoma
endometrium terbanyak dengan usia > 50 tahun (67.7%). Dari hasil tersebut,
menunjukkan bahwa karsinoma endometrium umumnya dijumpai pada usia
lanjut. Hal ini sesuai dengan penelitian Tulumang et al yang diperoleh bahwa
kasus karsinoma endometrium terbanyak pada usia > 51 tahun.1
Hasil penelitian yang sama oleh Holman et aldanSalom et al didapatkan
mayoritas wanita yang didiagnosa karsinoma endometrium adalah wanita
dengan rentang usia 55-64 tahun.18,19
Menurut Pike et al insidensi karsinoma endometrium meningkat seiring
dengan usia. Penelitian yang dilakukan di Birmingham of UK (1968-1972)
menunjukkan pada wanita perimenopause terjadi penurunan kadar E2 dan
64
Universitas Sumatera Utara
rendahnya P4. Kondisi ini terjadi secara konstan sehingga hal inilah yang
dikatakan unopposed estrogen pada perimenopause. Selain itu, hal ini berkaitan
dengan
penggunaan
menopausenya.
terapi
Peningkatan
estrogen
resiko
ini
untuk
mengatasi
berhubungan
gejala-gejala
dengan
durasi
penggunaan.8
Berdasarkan indeks massa tubuh, sebagian besar kasus karsinoma
endometrium termasuk dalam kategori overweight sebanyak 29 sampel (44.6%)
dan obesitas sebanyak 22 sampel (33.8%). Seperti yang kita ketahui bahwa
kondisi overweight dan obesitas mempengaruhi produksi peptida (seperti insulin
dan IGF-I, SHBG) dan hormon steroid (seperti estrogen, progesteron, androgen).
Obesitas pada menopause menyebabkan kelebihan produksi estrogen karena
androgen yang diproduksi oleh kelenjar adrenal dan ovarium dikonversi menjadi
estron oleh enzim aromatase di kelenjar adiposa.2 Hasil ini sesuai dengan
penelitian Salom et al, Goodman, dan Chiang yang menyatakan bahwa
peningkatan indeks massa tubuh akan meningkatkan resiko untuk terjadinya
karsinoma endometrium baik pada wanita premenopause atau postmenopause.
Hal ini berhubungan dengan produksi estrogen endogen yang berlebihan karena
aromatisasi androgen menjadi estradiol dan konversi androstenedion menjadi
estron pada jaringan adipose perifer.Selain itu, wanita premenopause yang
gemuk lebih mungkin untuk mengalami anovulasi kronis.17,18,21
Menurut MacNab et al wanita overweight dan obesitas memiliki resiko 2-4
kali menderita karsinoma endometrium. Wanita karsinoma endometrium dengan
obesitas memiliki prognosis yang lebih buruk dibandingkan wanita dengan berat
badan normal.2
Berdasarkan diferensiasi sel, didapati 44.6% karsinoma endometrium
berdiferensiasi baik (derajat I). Menurut Amant et al sebagian besar karsinoma
endometrium endometrioid (tipe I) berdiferensiasi baik-sedang (G1-G2) karena
65
Universitas Sumatera Utara
merupakan progresifitas dari hiperplasia endometrium dan memiliki prognosis
yang lebih baik.9 Hal ini juga sesuai dengan Binder yang menyatakan bahwa
patologi karsinoma endometrium yang paling banyak adalah adenokarsinoma
endometrioid dengan diferensiasi baik.78 Menurut The Cancer Genome Atlas
(TCGA) bahwa karsinoma endometrium tipe I merupakan tumor dengan low copy
number yang umumnya dengan mutasi PTEN dan berhubungan dengan
diferensiasi sel yang baik.59
Berdasarkan stadium, sebagian besar kasus karsinoma endometrium
adalah stadium III (41.5%). Hasil penelitian ini bertentangan dengan hasil
penelitian oleh Holman et al dan Salom et al yang menyatakan bahwa sebagian
besar karsinoma endometrium didiagnosa pada stadium awal (75%).10,17 Hal ini
juga bertentangan dengan data dari SEER tahun 2003-2009, bahwa 68%
karsinoma endometrium didiagnosa pada stadium awal, selebihnya (32%)
terdiagnosa pada stadium akhir setelah terjadi penyebaran lokal atau
penyebaran
lebih
jauh.
Kasus
yang
terdiagnosa
pada
stadium
akhir
kemungkinan karena terlambatnya diagnosa atau jenis histologi lain yang lebih
agresif.78 Dari hasil penelitian ini didapati bahwa kasus terbanyak dijumpai pada
stadium lebih lanjut kemungkinan karena tingkat pengetahuan pasien yang
rendah dalam mengenali gejala dan tidak adanya skrinning baku dalam
mendeteksi karsinoma endometrium. Namun perlu adanya penelitian yang lebih
lanjut untuk menyimpulkan hal ini.
4.2
Ekspresi
Reseptor
Progesteron
pada
Sediaan
Karsinoma
Endometrium
Hasil pemeriksaan ekspresi reseptor progesteron pada 65 buah sediaan
karsinoma endometrium dapat dilihat pada tabel 4.2.
66
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.2. Ekspresi reseptor progesteron pada karsinoma endometrium
Ekspresi
Karsinoma Endometrium
n
%
Positif
30
46.2
Negatif
35
53.8
Total
65
100.0
Dari tabel di atas dapat dilihat bahwa kelompok karsinoma endometrium
yang memiliki ekspresi reseptor progesteron negatif lebih banyak bila
dibandingkan dengan kelompok karsinoma endometrium yang memiliki ekspresi
reseptor progesteron positif (53.8%), namun persentasenya tidak jauh berbeda.
Hal ini sesuai dengan penelitian Xie et al dan Yang S et al yang menyatakan
bahwa ekspresi reseptor progesteron akan menurun selama perjalanan
karsinoma endometrium yang menyebabkan hilangnya inhibisi pertumbuhan
yang diregulasi oleh progesteron. Hilangnya ekspresi reseptor progesteron ini
dapat disebabkan karena dua hal yaitu tidak adanya reseptor progesteron atau
terjadinya down-regulasi reseptor progesteron. Pada karsinoma endometrium
terjadi fosforilasi dan ubiquinasasi reseptor progesterone oleh proteasome.46,59
Hasil penelitian yang sama oleh Kreizman-Shefer et al yang menyatakan
bahwa ekspresi PR menurun sampai menghilang pada karsinoma endometrium.
14
4.3
Hubungan Ekspresi Reseptor Progesteron dengan Diferensiasi Sel
Pada Karsinoma Endometrium
Hubungan ekspresi reseptor progesteron dengan diferensiasi sel pada
karsinoma endometrium yang dinilai secara statistik dengan uji chi-square dapat
dilihat pda tabel 4.3.
67
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.3.Hubungan Ekspresi Reseptor Progesteron dengan Diferensiasi
Sel Pada Karsinoma Endometrium
Diferensiasi Sel
Baik
Ekspresi
Sedang
n
Buruk
n
%
%
n
Positif
22
73.3%
8
26.7%
Negatif
7
20.0%
8
22.9%
Nilai p
Total
%
n
%
0
.0%
30
100.0%
20
57.1%
35
100.0%
0.000
*Uji Fischer Exact
Tabel 4.3 menjelaskan bahwa sebagian besar karsinoma endometrium
dengan ekspresi reseptor progesteron positif memiliki diferensiasi sel baik
(73.3%) dan sebaliknya, sebagian besar karsinoma endometrium dengan
ekspresi reseptor progesteron negatif memiliki memiliki diferensiasi sel buruk
(57.1%). Hubungan antara penilaian ekspresi reseptor progesteron dengan
diferensiasi sel karsinoma endometrium dinilai secara statistik dengan uji fischerexact didapatkan nilai p=0.000 (p