PENGEMBANGAN SARI KACANG KEDELAI SEBAGAI BAHAN PENGENCER SEMEN ANJING KINTAMANI.

THESIS

PENGEMBANGAN SARI KACANG KEDELAI SEBAGAI

BAHAN PENGENCER SEMEN ANJING KINTAMANI

I MADE YOGA WINDU PRADANA NIM 1492361006

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

ii

PENGEMBANGAN SARI KACANG KEDELAI SEBAGAI

BAHAN PENGENCER SEMEN ANJING KINTAMANI

Tesis untuk memperoleh Gelar Magister

Pada Program Magister, Program Studi Kedokteran Hewan Program Pascasarjana Universitas Udayana

I MADE YOGA WINDU PRADANA NIM 1492361006

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

Lembaran Pengesahan

TESIS INI TELAH DISETUJUI TANGGAL 18 April 2016

Pembimbing I, Pembimbing II,

Prof. Dr. drh I Ketut Puja, M.Kes Dr. drh Wayan Bebas,M.Kes NIP. 19621231 198903 1 315 NIP. 19621231 198903 1 021

Mengetahui

Ketua Program Magister Direktur

Kedokteran Hewan Program Pascasarjana

Program Pascasarjana Universitas Udayana

Universitas Udayana

Prof. Dr. drh I Ketut Puja, M.Kes Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S (K) NIP. 19621231 198903 1 315 NIP. 19590215 198510 2 001

iv

Tesis ini Telah Diuji Pada Tanggal 18 April 2016

Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, 1506/UN.14.4/HK/2016,

Tanggal 12 April 2016

Ketua : Prof.Dr.drh. I Ketut Puja, M.Kes Anggota :

1. _{Dr. drh. Wayan Bebas,M.Kes} 2. _{Dr.drh.Tjok Gde Oka Pemayun,MS} 3. _{Dr. drh. I Ketut Suatha, M.Si} 4. _{Dr. drh. Hapsari Mahatmi, MP}

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT

Saya yang bertandatangan di bawah ini :

Nama : I Made Yoga Windu Pradana

NIM : 1492361006

Program Studi : Kedokteran Hewan

Judul Tesis : Pengembangan Sari Kacang Kedelai Sebagai Bahan Pengencer Semen Anjing Kintamani

Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah Tesis ini bebas plagiat.

Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundang-undangan yang berlaku.

Denpasar, 1 April 2016 Yang membuat pernyataan,

vi

RIWAYAT HIDUP

Penulis lahir di Bontang pada tanggal 27 Desember 1990,merupakan anak ke dua dari pasangan I Nyoman Kembar Bagiarta, S.Ag dan Ni Ketut Rusni (Alm). Penulis menempuh pendidikan Taman Kanak-kanak di TK Yayasan Pupuk Kaltim Bontang (2000-2005) melanjutkan ke SD Yayasan Pupuk Kaltim Bontang, SMP Yayasan Pupuk Kaltim Bontang, dan SMA Yayasan Pupuk Kaltim Bontang. Penulis pernah menjabat sebagai ketua muda-mudi hindu Kota Bontang pada tahun 2008-2009. Pada tahun 2009, penulis diterima sebagai mahasiswa Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana. Penulis juga aktif di Badan Eksekutif Mahasiswa (BEM) dan Badan Perwakilan Mahasiswa (BPM) Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, serta memperoleh gelar profesi Dokter Hewan pada tahun 2015.

Penulis berkesempatan untuk melanjutkan pendidikan ke jenjang Magister pada Program Magister Kedokteran Hewan, Program Pascasarjana Universitas Udayana tahun 2014. Dalam rangka menyelesaikan tugas akhir, penulis melakukan penelitian tentang Pengembangan Sari Kacang Kedelai Sebagai Bahan Pengencer Semen Anjing Kintamani.

UCAPAN TERIMA KASIH

Pada kesempatan ini pertama-tama perkenankan penulis memanjatkan puji syukur kehadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa / Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat berkah dan karunia-Nya, tesis ini dapat terselesaikan.

Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada keluarga yang telah memotivasi penulis sehingga tesis ini dapat diselesaikan. Ucapan terima kasih juga kepada Prof. Dr. drh. I Ketut Puja M.Kes. selaku pembimbing I yang dengan penuh perhatian telah memberikan dorongan, semangat , bimbingan, dan saran selama penulis mengikuti Program Magister, khususnya dalam penyelesaian tesis ini. Terima kasih sebesar-besarnya pula penulis sampaikan kepada Dr. drh. Wayan Bebas, M.Kes. selaku pembimbing II yang telah memberikan bimbingan dan saran kepada penulis. Ucapan terima kasih ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, sp.PD-KEMD, Direktut Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. dr. A.A Raka Sudewi, Sp.S (K) serta Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran Hewan Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. drh. I Ketut Puja M.Kes. atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan Program Magister di Universitas Udayana.

Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya penulis ucapkan kepada para penguji tesis yaitu Dr. drh. Tjok Gde Pemayun, M.S., Dr. drh. I Ketut Suatha, M.Si., dan Dr. drh Hapsari Mahatmi, M.P yang telah memberikan saran, masukan, dan koreksi sehingga tesis ini dapat terselesaikan. Ucapan terma kasih juga diberikan kepada dosen yang telah membimbing penulis di dalam mengikuti pendidikan Program Magister pada program Studi Ilmu Kedokteran Hewan Universitas Udayana. Selain itu penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya juga kepada teman-teman yaitu Manik, Galih Diparayoga, Edi Susanta, Windhu Mahardia, Nana Destriana, serta semua pihak yang telah mendukung dalam penyelesaian penulisan tesis ini. Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa / Tuhan Yang Mahas Esa selalu melimpahkan anugrah-Nya kepada bapak/ibu semua serta kepada penulis

Denpasar, 1 April 2016 Penulis

viii ABSTRAK

PENGEMBANGAN SARI KACANG KEDELAI SEBAGAI BAHAN PENGENCER SEMEN ANJING KINTAMANI

Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi viabilitas dan integritas DNA pada semen anjing dengan bahan pengencer sitrat-glukosa- kuning telur dan tris-sitrat-glukosa-sari kacang kedelai. Semen dikoleksi dilakukan dengan cara manual dari anjing kintamani yang sehat. Semen secara subjektif dan pemeriksaan mikroskopik guna menentukan viabilitas untuk dibuat pengencer. Semen yang hanya memiliki rata-rata motilitas 60% atau lebih yang digunakan dalam penelitian ini. Sampel semen dicampurkan ke dalam tris-sitrat-glukosa-sari kacang kedelai dan sitrat-glukosa-kuning telur dengan dua perbedaan tingkat pengenceran yaitu 1:2, 1:3. Dua pengencer di evaluasi motilitas, persentase hidup dan integritas DNA dalam waktu 0 jam, 3 jam dan 6 jam dengan penyimpanan suhu dingin 5oC. Data dianalisis dengan menggunakan Data was analyzed by multivariate analysis of variance (MANOVA). Hasil yang diperoleh menunjukkan terdapat perbedaan sangat nyata (p<0,01) terhadap motilitas, persentase hidup dan integritas DNA spermatozoa anjing kintamani antara pengencer sitrat-glukosa-kuning telur dan tris-sitrat-glukosa-sari kacang kedelai . Hasil juga menunjukkan persentase hidup dan integritas DNA sperma dengan rasio pengencer 1:2 berpengaruh nyata (p<0,01) dan waktu penyimpanan juga berpengaruh nyata (p<0,01) dari rasio pengencer sperma 1:3. Viabiltas dan integritas berpengaruh nyata (p<0,01) dengan waktu penyimpanan suhu 5oC. Penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pengencer tris sitrat glukosa sari kacang kedelai mampu mempertahankan motilitas, viabilitas dan integritas DNA spermatozoa anjing kintamani pada suhu 5oC. Penelitian kedepannya dapat diinduksikan untuk mengevaluasi kemampuan fertilisasi spermatozoa dengan pengencer ini..

ABSTRACT

SOYA BEAN DEVELOMPMENT AS INGREDIENT OF KINTAMANI DOG SEMEN DILUTTER

The objective of this study was to evaluate the viability and integrity of canine semen extended in Egg yolk Glucose-Citrate and Tris-citrate-Glucose- soyabean. Semen was collected by Manual manipulation from an apparently healthy Kintamani dog stud. The semen was subjected to gross and microscopic examination to determine its viability for made extenders. Only semen with motility rate of 60% or higher was used in this study. Semen samples were extended in Tris-citrate-Glucose-soyabean and Egg yolk Glucose-Citrate at two different levels of sperm to extenders solutions of 1:2, 1:3. Two extenders were evaluated motility, percentage life and DNA integrity at 0 hour, 3 hours, and 6 hours on cold storage 5oC. Data was analyzed by multivariate analysis of variance (MANOVA). The results from the study showed a high significant difference (p<0.01) in sperm Motility, percentage of live and DNA integrity between Egg yolk Glucose-Citrate and Tris-citrate-Glucose- soyabean. The result also showed that sperm percentage of live and DNA integrity of semen in the ratio diluent 1:2 differed significanly (p<0.01) from of semen in the ratio diluent 1:3. The sperm viability and integrity were significanly (p<0,01) following the time of storage at 5°C. This study indicated that Tris-citrate-Glucose- soyabean extenders was sufficien to protect on the maintainance of motility, viability and DNA integrity of kintamani dog spermatozoa during storage at 5 oC. Further research should be conducted to evaluate the fertility capacity of spermatozoa with these extenders.

x

RINGKASAN

Anjing kintamani merupakan anjing ras Indonesia yang berasal dari Desa Sukawana Kecamatan Kintamani Kabupaten Bangli Bali. Para pecinta anjing mulai mengembangbiakan anjing ras ini. Namun cara pengembangbiakannya masih dilakukan dengan cara konvensional yaitu dengan cara mendatangkan pejantan. Cara seperti itu dapat membawa dampak dan berbagai permasalahan yang timbul karena transportasi hewan hidup dalam jarak yang jauh berisiko menimbulkan stres dan juga kurang praktis. Cara lain yang dapat digunakan yaitu dengan cara inseminasi buatan (IB). Salah satu hal terpenting dalam inseminasi buatan adalah bahan pengencer yang digunakan.

Bahan pengencer semen yang sering digunakan dalam inseminasi buatan adalah kuning telur karena kuning telur mengandung lesitin yang dapat melindungi spermatozoa dari cekaman dingin. Namun penggunaan bahan kuning telur dalam pengencer dapat menularkan bibit penyakit. Beberapa negara melarang eksport maupun import semen anjing yang menggunakan bahan campuran kuning telur. Oleh sebab itu digunakan bahan lesitin nabati yang diperoleh dari sari kacang kedelai. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan sari kecang kedelai sebagai bahan campuran pengencer semen anjing kintamani.

Anjing yang digunakan adalah anjing kintamani yang sehat serta pengambilan ulang sperma minimal 1 minggu sekali di Asu Bali Kennel Gianyar. Namun sebelum dilakukan penelitian, sperma anjing harus diperiksa secara makrokopis (warna dan kekentalan) dan mikrokopis (konsentrasi, motilitas, persentase hidup dan integritas DNA) untuk mengetahui standar sperma anjing kintamani. Rasio pengencer yang digunakan berbeda yaitu 1:2 dan 1:3, kemudian pengencer disimpan dengan suhu 5oC. Faktor yang diamati adalah motilitas, persentase hidup dan integritas DNA. Waktu pengamatan yaitu 0,3 dan 6 jam setelah pengenceran. Motilitas dan persentase hidup dilakukan pengamatan langsung di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 400X, namun pemeriksaan persentase hidup ditambahkan pewarna eosin nigrosin. Bila spermatozoa yang mati ditandai dengan kepala spermatozoa berwarna merah dan yang hidup berwarna putih, sedangkan pemeriksaan integritas DNA dilakukan di bawah mikroskop flouresensi dengan menggunakan pewarnaan acridine orange. Bila DNA spermatozoa rusak ditandai dengan warna merah sedangkan DNA spermatozoa yang baik berwarna hijau.

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa jenis pengencer berpengaruh nyata (p<0,01) terhadap motilitas, persentase hidup dan integritas DNA spermatozoa anjing kintamani. Perbedaan rasio pengencer dan waktu penyimpanan juga berpengaruh nyata (p<0,01) terhadap kualitas spermatozoa. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bahan pengencer dari kuning telur mampu lebih baik mempertahankan motilitas dan persentase hidup spermatozoa dari pada sari kacang kedelai sedangkan pengencer dari sari kacang kedelai mampu lebih baik mempertahankan integritas DNA dibandingkan kuning telur. Penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pengencer tris sitrat glukosa sari kacang kedelai mampu mempertahankan motilitas, viabilitas dan integritas DNA spermatozoa anjing kintamani pada suhu 5o_{C. Penelitian kedepannya} dapat di induksikan untuk mengevaluasi kemampuan fertilisasi spermatozoa dengan pengencer ini.

xii DAFTAR ISI

Halaman

SAMPUL DALAM ... i

PRASYARAT GELAR ... ii

LEMBARAN PENGESAHAN ... iii

PENETAPAN PANITIA PENGUJI ... iv

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ... v

RIWAYAT HIDUP ... vi

UCAPAN TERIMA KASIH ... vii

ABSTRAK ... viii

ABSTRACT ... ix

RINGKASAN ... x

DAFTAR ISI ... xi

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

BAB I Pendahuluan ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah ... 3

1.3 Tujuan Penelitian ... 3

1.4 Manfaat Penelitian ... 4

BAB II Kajian Pusataka ... 5

2.1 Anjing Kintamani ... 5

2.2 Alat Reproduksi Anjing Jantan ... 6

2.2.1 Testis ... 6

2.2.2 Epididimis ... 7

2.2.3 Duktus Deferent ... 8

2.2.5 Urethra ... 10

2.2.6 Penis ... 11

2.3 Spermatogenesis dan Spermatozoa ... 11

2.4 DNA Spermatozoa ... 13

2.5 Semen Cair ... 15

2.6 Penampungan Semen ... 16

2.7 Bahan Pengencer Semen ... 17

2.7.1 Pengencer Sari Kacang Kedelai ... 18

2.7.2 Pengencer Kuning Telur ... 19

BAB III Kerangka Berpikir, Konsep, dan Hipotesis Penelitian ... 20

3.1 Kerangka Berpikir... 20

3.2 Konsep ... 22

3.3 Hipotesis ... 22

BAB IV Materi dan Metode ... 23

4.1 Rancangan Penelitian ... 23

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ... 23

4.3 Penentuan Sumber Data ... 24

4.4 Besar Sampel ... 24

4.5 Variabel Penelitian ... 24

4.6 Definisi Operasional Variabel ... 25

4.7 Bahan Penelitian ... 25

4.8 Alat Penelitian ... 26

4.9 Prosedur Penelitian ... 26

4.9.1 Koleksi Semen ... 26

4.9.2 Pembuatan Pengencer Tris-Sitrat-Sari Kacang Kedelai-Glukosa... 26

4.9.3 Pembuatan Pengencer Sitrat Kuning Telur-Glukosa ... 27

4.9.4 Pengencer Semen ... 28

xiv

4.9.5.1 Motilitas ... 28

4.9.5.2 Jumlah Persentase Hidup ... 28

4.9.5.3 Integritas DNA ... 29

4.10 Analisis Data ... 29

BAB V Hasil Penelitian ... 30

5.1 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Persentase Motilitas Spermatozoa ... 30

5.2 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Persentase Hidup Spermatozoa ... 31

5.3 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Integritas DNA Spermatozoa ... 33

BAB VI Pembahasan ... 36

6.1 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Persentase Motilitas Spermatozoa Anjing Kintamani ... 36

6.2 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Persentase Hidup Spermatozoa Anjing Kintamani ... 37

6.3 Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Integritas DNA Spermatozoa Anjing Kintamani ... 38

BAB VII Simpulan dan Saran ... 40

7.1 Simpulan ... 40

7.2 Saran ... 40

DAFTAR PUSTAKA ... 41

DAFTAR TABEL

4.1 Tabel Rancangan Penelitian ... 23 5.1 Rata-rata motilitas hidup spermatozoa anjing kintamani pada jenis

dan tingkat pengenceran dan lama waktu berbeda pada suhu 5o_{C... 31} 5.2 Rata-rata persentase hidup spermatozoa anjing kintamani pada jenis

dan tingkat pengenceran dan lama waktu berbeda pada suhu 5o_{C ... 31} 5.3 Rata-rata integritas DNA spermatozoa anjing kintamani pada jenis

xvi

DAFTAR GAMBAR

3.1 Kerangka Konsep Penelitian ... 22 5.1 Spermatozoa mati dan hidup dengan pewarnaan eosin nigrosin ... 32 5.2 DNA Spermatozoa yang mulai terdenaturasi dan normal dengan

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Anjing kintamani merupakan salah satu ras anjing asli Indonesia. Anjing ras Anjing Kintamani adalah sebutan kelompok anjing lokal jenis pegunungan yang hidup di sekitar Desa Sukawana, Kecamatan Kintamani, Kabupaten Bangli, Bali (Gunawan, 2013). Anjing ras ini sering dikaitkan dengan hasil persilangan anjing chow chow dengan anjing lokal yang ada di Bali. Namun, hasil penelitian menyebutkan bahwa anjing Kintamani berasal dari anjing lokal bali yang mengalami kehilangan keragaman genetik ( Puja et al., 2005).

Para pecinta anjing mulai mengembangbiakan anjing kintamani. Namun pengembangbiakannya, para pecinta anjing kintamani masih menggunakan cara perkawinan alami menggunakan pejantan. Para pecinta anjing sering mendatangkan pejantan dari tempat yang jauh untuk mendapatkan pejantan yang unggul. Cara konvensional ini membawa dampak dan berbagai permasalahan yang timbul karena transportasi hewan hidup dalam jarak yang jauh berisiko menimbulkan stres pada pejantan itu disamping penggunaan ini kurang praktis (Gunawan, 2013).

Solusi untuk hal tersebut yaitu dengan cara inseminasi buatan (IB). Inseminasi buatan pada anjing telah dipraktikkan secara rutin di banyak negara terutama untuk menghindari beberapa kesulitan perkawinan dan untuk

2

penggunaan semen impor (Junaidi, 2006). Keberhasilan IB pada anjing telah banyak dilaporkan baik yang menggunakan semen segar, dingin (Tsutsui et al.,

2003) maupun semen beku (Hayashi et al., 2013). Penggunaan semen dingin, biasanya sudah melalui proses pengenceran. Penggunaan pengencer pada semen dingin dimaksud untuk menambah volume semen, mempertahankan motilitas dan viabilitas spermatozoa (Wiyanti et al., 2013)

Telah banyak pengencer dingin pada semen anjing dievaluasi, tampaknya kuning telur tris merupakan pengencer paling baik pada penyimpanan dingin semen anjing (Stro”m Holst et al, 2000). Kuning telur paling umum digunakan sebagai campuran pengencer semen anjing untuk memproteksi spermatozoa dari cekaman dingin. Tetapi adanya wabah avian influenza, lalulintas semen dingin dan beku yang mengandung kuning telur mengalami kesulitan. Bahan kuning telur berasal dari produk unggas. Bahan pengencer yang menggunakan kuning telur ditemukan bakteri salmonella sebanyak 67,09 CFU/cm (Froning, 1998) Jika bahan ini tercampur agen penyakit dapat menularkan bibit penyakit sehingga mempengaruhi kualitas spermatozoa (Ariantie et al., 2014).

Beberapa negara telah melarang ekspor maupun import semen anjing yang mengandung kuning telur (Abe et al., 2008). Karena itu, perlu dikembangkan pengencer semen anjing tanpa kuning telur. Sebagai alternatif, tampaknya sari kacang kedelai cocok digunakan sebagai pengencer, Sari kacang kedelai mengandung lesitin nabati yang fungsinya sama dengan kuning telur yaitu melindungi membran plasma spermatozoa (Aires et al., 2003) dan melindung akrosom terhadap cold shock (Amirat et al., 2004).

3

Berdasarkan latar belakang tersebut penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan pengencer campuran sari kacang kedelai dengan rasio pengencer berbeda sebagai medium untuk pengenceran semen anjing Kintamani dalam mempertahankan viabilitasnya

1.2 Rumusan Masalah

1.2.1 Bagaimanakah pengaruh Tris-Sitrat-Glukosa-Sari kacang kedelai dan tingkat pengenceran terhadap viabilitas spermatozoa anjing Kintamani.

1.2.2 Bagaimanakah pengaruh Tris-Sitrat-Glukosa-Sari Kacang Kedelai dan tingkat pengenceran terhadap Integritas DNA spermatozoa anjing Kintamani.

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Melihat formulasi pengencer dalam upaya mempertahankan kualitas semen anjing kintamani selama penyimpanan

1.3.2 Tujuan Khusus

1. Mengetahui pengaruh Tris-Sitrat-Glukosa-Sari Kacang Kedelai dan tingkat pengenceran terhadap viabilitas spermatozoa anjing Kintamani.

2. Mengetahui pengaruh Tris-Sitrat-Glukosa-Sari Kacang Kedelai dan tingkat pengenceran terhadap Integritas DNA spermatozoa anjing Kintamani

4

1.4 Manfaat Penelitian

Dari hasil penelitian ini diharapkan akan dihasilkan pengencer semen alternatif yang murah dan efektif bagi pecinta anjing anjing kintamani serta memberikan sumbangsih ilmu pengetahuan dan teknologi sehingga dapat meningkatkan angka keberhasilan inseminasi buatan pada anjing ras ini.

5

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

2.1 Anjing Kintamani

Anjing Kintamani Bali, adalah plasma nutfah Indonesia, yang sangat berpotensi dikembangkan untuk tujuan komersial. Habitat aslinya di daerah sekitar desa Sukawana, Kecamatan Kintamani, Bangli. Anjing Kintamani Bali yang dahulu dikenal dengan sebutan anjing Gembrong (bulu panjang dan lebat) Karena keistimewaanya, anjing Kintamani Bali digunakan sebagai maskot fauna Kabupaten Bangli, Bali. Suatu penghargaan yang tinggi dari Pemerintah Bangli untuk anjing Kintamani. Hal ini dapat dimaklumi mengingat anjing Kintamani Bali merupakan satu – satunya anjing kuno (ancient dog) yang ada di Bali terutama di Kintamani. Ada anggapan bahwa anjing Kintamani berasal dari persilangan anjing Chow-Chow dengan anjing lokal yang ada di Bali. Namun, hasil penelitian menyebutkan bahwa anjing Kintamani berasal dari anjing lokal bali yang mengalami kehilangan keragaman genetik ( Puja et al., 2005). Anjing Kintamani Bali merupakan satu – satunya anjing asli Indonesia yang mempunyai penampilan yang menarik yang telah ditetapkan sebagai anjing ras pertama Indonesia oleh PERKIN (Perkumpulan Kinologi Indonesia) pada tahun 2006.

Anjing Kintamani berpenampilan indah dengan ukuran kecil sampai ukuran sedang . Ukuran tinggi anjing Kintamani jantan rata – rata 51,25 cm dengan berat badan rata – rata 15,90 kg. Ukuran tinggi anjing betina rata – rata 44,65 cm dengan berat badan rata – rata 13,24 kg. Bulu tampak indah, tebal, dan

6

panjang terutama pada daerah punduk, ekor dan kaki belakang bagian belakang. Warna bulu anjing Kintamani adalah putih, hitam, coklat atau campuran. Telinga berdiri tegak dan berbentuk segitiga. Ukuran kepala anjing Kintamani sangat proporsional dengan ukuran tubuhnya dengan dahi lebar tanpa kerutan. Badan lurus dan kuat. Bulu ekor tebal dan berbetuk bulan sabit (Puja, 2007a).

2.2 Alat reproduksi Anjing Jantan

Sistem reproduksi jantan terdiri dari : (1) Testis yang dikelilingi tunika vaginalis dan selubung testis, (2) epididimis, (3) Duktus deferens, (4) kelenjar prostat, (5) urethra dan (6) penis yang dilindungi oleh preputium (Dellmann dan Brown, 1992; Junaidi, 2006)

2.2.1 Testis

Testis merupakan organ reproduksi yang utama pada hewan jantan. Testis mempunyai dua fungsi utama yaitu sebagai penghasil spermatozoa dan hormon sex jantan (Androgen). Spermatozoa dihasilkan oleh testis melalui serangkaian pembelahan sel spermatogonia pada tubulus semeniferus menjadi spermatozoa (Evans, 1993)

Setiap hewan mamalia domestik memiliki sepasang testis yang berbentuk bulat atau lonjong dan terletak di dalam skrotum. Testis anjing memiliki ukuran yang bervariasi tergantung dari ukuran tubuh anjing, ada korelasi yang positif diantara berat badan dan berat testikuler, volume testikuler, berat total epididimal dan total lebar skrotal pada anjing jantan normal. Sehingga pengukuran berat badan dan lebar total skrotum bisa untuk menentukan ukuran testikuler normal.

7

Ukuran testis anjing berkisar antara panjang, lebar dan tebal adalah 3x2x1.5 cm (Junaidi , 2006).

Testis dibungkus oleh jaringan yang bersifat serosa yang disebut dengan tunika vaginalis. Tunika vaginalis memiliki lapis yang terdiri atas mesotel dan jaringan ikat yang melekat pada tunika albugenia. Tunika albugenia merupakan lapisan pembungkus testis paling luar yang merupakan suatu membrana putih dan disusun oleh jaringan ikat elastis (Puja, 2007b_).

Parenkim testis terdiri atas tubulus semeniferus, dan dikelilingi oleh jaringan interstitial yang mengandung sel leydig, pembuluh darah, limfe dan jaringan saraf. Sel leydig menghasilkan hormon testoteron, progesteron, dan kemungkinan hormon estrogen (Puja, 2007b). Sel Leydig berbentuk polihedral dan tidak teratur berinti bulat dibagian tengah dengan kromatin yang tersebar di luar membran inti (Peter et al., 2001).

2.2.2 Epididimis

Epididimis mamalia merupakan alat kelamin aksesori dinamik, tergantung pada androgen testikularis untuk menjaga status deferensiasi epitel. Terdiri dari sejumlah (8-25) duktus eferentis dan duktus epididimis yang panjang berliku liku. Secara makroskopis epididimis terdiri dari kepala (caput), badan (corpus), dan ekor (cauda) muncul secara medial dan berlokasi di permukaan dorsolateral testis dan terbungkus oleh tunika albugenia yang terdiri dari jaringan ikat padat tidak teratur, dibalut oleh selaput visceral (Dellman dan Brown, 1992; Junaidi, 2006).

Lebih lanjut Junaedi (2006) menyatakan kepala epididimis berada pada craniomedial testikel dan ini merupakan bagian terbesar dari epididimis. Badan

8

epididimis berada pada dorsomedial sepanjang testikel dan berlanjut dengan ekor epididimis yang berada pada caudal ekstremitas dari testis, corda spermatikus keluar dari ekor epididimis pada aspek caudomedial dari testis dan memperluas ke medial testis sampai pada saluran inguinal ke cincin inguinal. Ligamentum dari ekor epididimis melekat ke testis dan epididimis ke tunika vaginalis.

Duktuli eferentes merupakan penghubung rete testis dengan duktus epididimis. Epitel duktuli eferentes berbentuk epitel sebaris yang mengandung silia. Sel yang bersilia itu membantu pergerakan spermatozoa ke duktus epididimis. Duktuli eferentes dan bagian awal dari duktus epididimis mengandung kepala epididimis (Evans, 1993).

Lebih lanjut Evans (1993) menyatakan duktus epididimis sangat berkelok kelok dan mengulir. Panjang duktus epididimis sangat bervariasi tergantung pada spesies hewan. Bagian badan epididimis merupakan bagian yang paling sempit diantara kepala dan ekor epididimis. Duktus epididimis dibalut oleh epitel banyak lapis, dikelilingi oleh jaringan ikat longgar dan otot polos dengan susunan melingkar. Dua tipe sel terdapat pada epitel, yaitu sel utama berbentuk silinder dan sel basal berbentuk poligonal

2.2.3 Duktus Deferent

Duktus deferens merupakan kelanjutan dari duktus epididimis yang setelah membuat lengkung tajam pada ujung ekor, kemudian berlanjut lurus membentuk duktus deferens dengan ciri histologinya. Bagian awal duktus deferens terdapat dalam funikulus spermatikus. Dalam rongga perut, berlanjut membentuk lipatan peritoneum ( plica duktus deferensis). Ujung terminal duktus deferens membentuk

9

ampula (pada kuda, ruminansia, anjing). Pada anjing dan kambing, kelenjar dikelilingi oleh jaringan ikat periglanduler tanpa sel otot polos (Dellmann dan Brown,1992).

2.2.4 Kelenjar – Kelenjar Aksesoris

Kelenjar aksesori pada hewan jantan terdiri atas kelenjar ampula, vesikularis, kelenjar prostat dan kelenjar bulbouretralis. Kelenjar aksesoris kelamin tersebut berperan sebagai organ penghasil plasma semen (Hafez, 2000). Sekreta kelenjar aksesori menghasilkan volume terbesar (60-90%) dari volume total plasma semen. Plasma semen yang disekresikan ke lumen uretra merupakan medium yang sesuai bagi spermatozoa ketika diejakulasi menuju organ reproduksi betina (Aughey dan Frye, 2001). Motilitas dan aktivitas metabolik spermatozoa dapat berlangsung dengan adanya sekreta kelenjar aksesori yang bercampur dengan sekreta yang berasal dari testis dan ductus epididimis (Pineda, 2003).

Keberadaan setiap kelenjar aksesori kelamin pada beberapa hewan bervariasi. Domba memiliki keempat kelenjar (ampula, kelenjar vesikularis, kelenjar prostat yang berbentuk pars diseminata, dan kelenjar bulbouretralis), sedangkan anjing hanya memiliki kelenjar prostat berbentuk korpus (Colville dan Bassert, 2002).Kelenjar prostat tidak dilaporkan keberadaanya pada rusa pampas (Ungerfeld et al, 2008), sedangkan rusa timor memiliki kelenjar prostat berbentuk korpus tetapi tidak dijumpai adanya kelenjar bulbouretralis (Nalley, 2006). Selain terdapat variasi keberadaan kelenjar aksesori, morfologi dan histologi kelenjar aksesori kelamin juga bervariasi pada mamalia jantan (Chugtai et al, 2005; Thomson dan Marker, 2006). Kelenjar prostat dibagi ke dalam dua lobus utama

10

oleh septum fibrosa medial. Kelenjar ini terletak di bagian tengah pelvis atau 1 cm di belakang leher kantung kencing, berbentuk globular dan simetris. Ukuran kelenjar ini bervariasi dengan volume kira kira 6-15 ml dan berat 1,7-14,5 gram (Puja, 2007b).

Prostat memegang peranan penting terhadap volume dari ejakulat anjing. Cairan prostat berwarna bening, cairan ini dieksresikan pada fraksi pertama dan terakhir dari ejakulat. Sekresi cairan ini mengandung laktat, kholesterol, enzim dan sedikit gula. Cairan ini secara konstan disekresikan ke dalam duktus sekretorius prostatik (Junaidi, 2006). Menurut Puja (2007b) cairan prostat dapat menetralisasi plasma semen dan membuatnya asam dengan akumulasi karbondioksida dan asam laktat, serta untuk merangsang gerak spermatozoa ejakulat.

2.2.5 Urethra

Urethra merupakan saluran yang berfungsi untuk menyalurkan urine dan semen. Urethra anjing dibagi menjadi segmen prostat, membranosa dan spongiosa. Segmen prostat menjulur dari kandung kemih ke pinggir caudal kelenjar prostat. Segmen membranosa berawal dari daerah pinggir kaudal kelenjar prostat dan berakhir di urethra yang memasuki bulbus glandis.

Seluruh mukosa urethra membentuk lipatan memanjang yang memipih dan lenyap selama berlangsung proses ereksi dan urinasi. Pada anjing jantan, duktus deferent bermuara pada urethra. Sel mukosa urethra dibalut oleh epitel pipih peralihan. Perototan urethra terdiri dari lapisan otot polos di daerah kantung kemih dan otot kerangka di bagian sisi urethra (Evans, 1993)

11

2.2.6 Penis

Penis merupakan organ untuk kopulasi pada anjing jantan. Penis anjing diklasifikasikan antara tipe vaskuler dan tipe fibroelastik. Tipe vaskuler banyak ditemukan pada penis kuda jantan. Pada tipe vaskuler banyak ditemukan adanya pembuluh darah pada korpus cavernosa. Tetapi pada tipe fibroelastis mengandung sedikit pembuluh darah dan banyak jaringan ikat (Evans, 1993).

Penis anjing terdiri dari tiga bagian utama yaitu radix, corpus, dan gland penis. Pada akhir proksimal dari ekor penis terdapat dua badan erektil kavernosa vaskularis, korpora kavernosa diletakkan oleh jaringan konektif yang tebal ke sisi kiri dan kanan dari arkus ischiadikus diantara tuberositas ischialis (Johnston et al,

2001).

2.3 Spermatogenesis dan spermatozoa.

Spermatogenesis terjadi didalam tubulus seminiferus testis. Proses ini mulai saat hewan mencapai puncak pubertas dan terus berlanjut selama umur reproduktif hewan. Pada anjing waktu yang diperlukan dalam proses spermatogenesis diperkirakan 61 hari. Pada umur 4 bulan anjing sudah mengalami proses spermatogenesis, tetapi spermatozoanya tidak nampak pada ejakulat sampai umur 10-12 bulan (Allen, 1992).

Spermatogenesis dimulai dari proses diferensiasi sel-sel germinal pre mordial menjadi spermatogonium. Spermatogonium ini mempunyai jumlah kromosom diploid (2n). Spermatogonia ini menempati membran basal atau bagian terluar dari tubulus seminiferus. Spermatogonia ini akan mendapatkan nutrisi dari sel-sel sertoli dan berkembang menjadi spermatosit primer. Spermatogonia akan

12

bermitosis berkali-kali mebentuk spermatosit primer. Spermatosit primer mengandung kromosom diploid (2n) pada inti selnya dan mengalami meiosis. Satu spermatosit akan menghasilkan dua sel anak, yaitu spermatosit sekunder (Hewitt,1997)

Proses pembentukan spermatosit sekunder, dimulai saat spermatosit primer menjauhi dari lamina basalis, sitoplasma makin banyak, dan terjadilah meiosis pertama membentuk dua spermatosit sekunder yang masing-masing memiliki kromososm haploid (n). Proses meiosis pertama ini langsung diikuti dengan pembelahan meiosis kedua yang membentuk empat spermatid masing-masing dengan kromosom haploid. Akhirnya spermatid akan bertransformasi membentuk spermatozoa. Proses spermatogenesis ini terjadi pada suhu normal tetapi lebih rendah dari pada suhu tubuh, dan proses ini juga dipengaruhi oleh sel sertoli (Hewitt, 1997).

Spermatozoa secara struktural terdiri dari kepala sperma yang mengandung nukleus dan akrosom, middle piece yang mengandung mitokondria untuk metabolisme spermatozoon, dan ekor sperma (Junaidi, 2006). Akrosomal yang terbentuk dari badan golgi dan mengandung enzim hyaluronidase yang berfungsi untuk melisiskan cumulus ooforus dan zona pelucida dari ovum. Pada bagian ini juga terdapat inti sperma yang menyimpan sejumlah kode/informasi genetik yang akan diwariskan kepada keturunannya. Bagian ekor merupakan alat gerak sperma menuju ovum (Puja, 2007b).

Volume ejakulat dapat bervariasi sesuai dengan tingkat kedewasaan dan faktor kesehatan anjing jantan, tingkat rangsangan seksual pada saat koleksi

13

semen. Untuk memperkirakan konsentrasi spermatozoa di dalam ejakulat, digunakan alat penghitung sel darah merah (haemocytometer). Prinsip kerja alat ini sama dengan penghitungan sel darah merah. Rata-rata konsentrasi spermatozoa dari berbagai ras adalah 125 x 106 spermatozoa/ml dengan kisaran 4 – 540 x 106 spermatozoa/ ml (Puja, 2007b), sedangkan menurut Junaidi (2006) jumlah total spermatozoa anjing normal antara 300 x 106– 2 x 109.

2.4DNA Spermatozoa

Kerusakan spermatozoa dapat disebabkan oleh beberapa hal diantaranya faktor hormonal, faktor umur, infeksi, tingginya kadar reactive oxygen species

(ROS), pemaparan zat kimia/pemaparan racun, rokok, obat-obatan, hipertermia testis, apoptosis dan kekurangan protamin saat spermatogenesis (Purwaningsih dan Siswanto, 2011) kerusakan spermatozoa jika melebihi 30-40% akan menyebabkan infertilisasi dan tidak disarankan untuk dijadikan semen beku (Evenson et al, 1999; Spano et al, 2000).

Protamin adalah suatu protein utama di dalam inti spermatozoa yang

mengikat DNA (Aulanni’am et al, 2011). Pada manusia dan tikus terdapat dua

jenis protamin P1 dan protamin P2 (Corzett et al, 2002), dan pada sapi hanya satu tipe yaitu protamin P1 (Beletti et al, 2005). Protamin berperan penting untuk pembentukan kromatin yang diperlukan pada fungsi normal spermatozoa. Ekspresi abnormal protamin menyebabkan terjadinya penurunan jumlah spermatozoa, motilitas, morfologi, dan peningkatan kerusakan kromatin spermatozoa (Mangual et al, 2003), penurunan viabilitas dan meningkatnya kerusakan DNA (Aoki et al, 2006). Selama tahap elongasi spermatid pada saat

14

spermiogenesis sekitar 85% inti spermatozoa histon akan diganti oleh protamin

(Aulanni’am et al, 2011).

Keseluruhan genom spermatozoa terdapat di dalam pilinan DNA dengan panjang rata-rata 27 kilobite. Pilinan DNA ini berikatan dengan elemen struktural inti yang disebut matriks inti. Beberapa faktor yang menyebabkan terganggunya proses spermatogenesis seperti stress lingkungan, mutasi gen, dan abnormalitas kromosom berpotensi merusak struktural kromatin yang berhubungan dengan kejadian infertilisasi. Abnormalitas kromatin inti dapat juga disebabkan oleh radikal bebas (Lewis dan Aitken, 2005). Atau akibat apoptosis. Salah satu agen oksidasi adalah reactive oxygen species (ROS) yang dalam kadar tinggi dapat bersifat toksik terhadap spermatozoa (Saleh et al, 2002). Seperti halnya agen oksidasi yang lain (hidrogen piroksida, superoksidasi dan radikal bebas), ROS sangat reaktif. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron bebas yang tidak berpasangan (Warren et al, 1987)

Kantor (1995) menyatakan bahwa kerusakan DNA dapat diartikan sebagai semua bentuk perubahan polimer DNA. Secara alamiah DNA terus menerus terpapar pada lingkungan fisik dan kimia yang sangat bervariasi dan berpotensi mengubah struktur alamiah DNA tersebut. Perubahan ini dapat memengaruhi proses replikasi dan traskripsi DNA yang mengarah pada kerusakan DNA. Konsekuensi biologisnya dapat mengubah kejadian mutasi atau kematian sel bahkan kanker, kemunduran mental dan terkait pertumbuhan dan perkembangan. Lebih lanjut dikatakan bahwa kerusakan modifikasi struktur DNA diinduksi oleh beberapa penyebab seperti radiasi, panas, tekanan, dan bahan kimia. Bentuk

15

kerusakan yang lain adalah terputusnya struktur polimer DNA. Pemanasan yang melebihi 37o_{C menyebabkan terputusnya ikatan glikosida yang menghubungkan} antara basa nitrogen dan struktur gula fosfat sehingga basa nitrogen akan hilang.

Pemeriksaan kerusakan DNA spermatozoa telah banyak dilakukan dengan berbagai metode analisis antara lain Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) (Evenson et al, 2002), Acridine Orange Test (AO) (Tejada et al, 1984) Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Nick and Labelling (TUNEL) (Gorcyza et al,

1993), Toluidine Blue (TB) Test (Erenpreisa et al, 2003), Comet Assay (Fraser dan Strzezek, 2004), dan Kit Halomax® (Langdon, 2012).

2.5Semen Cair

Semen cair adalah semen segar yang telah ditambahkan suatu bahan pengencer yang dapat mempertahankan daya hidup spermatozoa lebih lama dari pada ketahanan aslinya (Junaidi 2006). Preservasi semen cair umumnya dilakukan pada suhu 3 – 5oC. Menurut Mc. Kinnon (1999), setiap penurunan suhu 10oC akan menurunkan metabolisme spermatozoa sampai 50%. Terhambatnya metabolisme spermatozoa, maka akan dapat mempertahankan viabilitas beberapa hari sampai saat digunakan untuk IB. Selama penyimpanan, spermatozoa harus ditambahkan media berupa bahan pengencer yang harus mengandung sumber energi, buffer atau larutan penyangga, komponen isotonis dan pelindung terhadap kejutan dingin (cold shock) yang terjadi selama penyimpanan pada suhu rendah.

16

Semen yang diperoleh dari pejantan harus diencerkan dengan pengencer tertentu agar dapat didistribusikan ke beberapa betina dalam rangkaian program IB. Selain untuk memperbanyak volume, pengencer tersebut harus memenuhi beberapa kriteria yaitu, 1) mengandung sumber energi untuk kelangsungan hidup spermatozoa antara lain : fruktosa, glukosa, dan laktosa. 2) mengandung anti kejutan dingin (cold shock) antara lain : lipoprotein dan lesitin. 3) mempunyai kemampuan sebagai larutan penyangga antara lain : sitrat, Tris, dan phosphate. 4) memiliki keseimbangan elektrolit. 5) mengandung antibiotika yang melindungi semen dari kontaminasi mikroba (Herdis et al. 2003).

2.6 Penampungan Semen

Penampungan semen menurut Konrad (2007) adalah sebagai berikut: mula-mula penis digenggam dan preputium ditarik ke belakang di belakang bulbus glandis. Setelah itu, ibu jari dan keempat jari menggenggam penis dengan pijatan yang cukup dibelakang bulbus glandis sehingga menghasilkan ereksi penuh. Biasanya ereksi diikuti secara spontan dan dengan tetap memberikan rangsangan pada preputium. Hal ini memang diperlukan pada beberapa anjing, demikian halnya dengan stimulasi pada daerah perineal ataupun pada gland penis. Karena ejakulasi berfraksi, pemisahan koleksi dari setiap fraksi dapat dilakukan dengan mengganti tabung koleksi. Sesudah fraksi kedua, maka penampung semen harus dihentikan untuk menghindari sekresi dari glandula prostat atau fraksi ketiga yang jernih dan transparan

Metode lain yang sering digunakan dengan vagina buatan. Vagina buatan merupakan tiruan dari vagina alami. Vagina buatan biasanya dibuat dari bahan

17

karet. Ukuran dan bentuknya disesuaikan dengan jenis hewan yang akan diambil semennya. Pada anjing biasanya digunakan tipe harrop. Vagina buatan sebaiknya diberi pelumas sebelum digunakan, biasanya dengan vaselin. Apabila penis telah nampak ereksi masukkan penis ke vagina buatan. Dengan adanya rangsangan pijatan oleh vagina buatan anjing dapat mengalami ejakulasi. Semen yang keluar ditampung dengan tabung gelas (Puja, 2007b).

Produksi semen sangat berkaitan dengan berat testis, sedangkan berat testis berkolerasi dengan berat badan. Dengan demikian berat badan berkolerasi dengan produksi semen. Karena itu produksi semen harian akan lebih banyak pada anjing ras besar jika dibandingkan dengan anjing ras kecil. Disamping ukuran tubuh, umur dapat pula mempengaruhi ukuran testis dan mempengaruhi produksi semen (Puja, 2007b_).

2.7 Bahan Pengencer Semen

Salah satu media pengencer yang umum digunakan adalah Tris. Tris memiliki toksisitas rendah dan sistem penyanggah yang baik dengan mempertahankan pH, tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit (Affandhy et al. 1999). Sebagai pengencer semen cair, Tris sering dicampur dengan karbohidrat yang berfungsi sebagai sumber energi bagi spermatozoa. Beberapa penelitian

buffer spermatozoa yang dilakukan oleh Baran et al. (2004) menggunakan campuran Tris dengan fruktosa, sedangkan Axnér et al. (2004) menggunakan campuran Tris dengan glukosa serta Tris dengan laktosa yang dilakukan oleh Axnér dan Linde-Forsberg (2002).

18

2.7.1 Pengencer Sari Kacang Kedelai

Menurut Aboagla dan Terada (2004), anti cold shock perlu ditambahkan dalam bahan pengencer agar dapat melindungi spermatozoa pada saat perubahan suhu dari suhu ruang (28oC) pada saat pengolahan ke suhu ekulibrasi (5oC). Anti

cold shock yang umum ditambahkan adalah kuning telur ataupun kacang kedelai yang dapat melindungi membran spermatozoa pada saat pendinginan atau pembekuan. Khasiat utama kuning telur ataupun kacang kedelai adalah kandungan lesitin (phosphatidylcholine) yang bersifat membran coating untuk tetap mempertahankan konfigurasi normal phospholipid bilayer yang merupakan susunan utama membran spermatozoa. Kedelai memiliki kecenderungan terkontaminasi bakterial lebih kecil daripada kuning telur. Lesitin dari kacang kedelai merupakan pilihan yang tepat sebagai sumber lesitin bahan pengencer semen dimasa yang akan datang (Aires et al., 2003). Kacang kedelai juga mampu menekan stres oksidatif (Ogbuewu et al., 2010). Kacang kedelai yang belum maupun yang sudah mengalami penyulingan memiliki kandungan phospholipid

antara lain phosphatidylcholine 17.50% dan 23.00%, phosphatidylethanolamine

15.00% dan 20.00%, glikolipid 13-16%, phospholipid lainnya 14-18% dan trigliserida 2-4% (Shurtleff dan Aoyagi 2004).

Lesitin kacang kedelai memiliki bahan-bahan yang mirip dengan lesitin pada kuning telur yang digunakan untuk perlindungan terhadap cold shock pada saat kriopreservasi (Thun et al. 2002; Aires et al. 2003 ). Meskipun lesitin dari bahan nabati seperti lesitin dari kacang kedelai banyak tersedia, akan tetapi lesitin

19

dari kuning telur masih banyak digunakan untuk pembekuan semen (Aires et al., 2003).

2.7.2 Pengencer Kuning telur

Kuning telur merupakan komponen yang paling umum digunakan pada bahan pengencer untuk kriopreservasi karena terbukti memiliki efek yang menguntungkan sebagai pelindung dari membran plasma dan akrosom terhadap

cold shock (Amirat et al. 2004). Kandungan phospholipid, kolesterol dan low-density lipoprotein pada kuning telur berfungsi melindungi spermatozoa dari kejutan dingin selama proses pembekuan.

Kuning telur mempunyai sifat sebagai penyangga tekanan osmotik sehingga spermatozoa lebih toleran terhadap lingkungan yang hipotonik atau hipertonik (Khalifa dan El-Saidy, 2006). Komposisi phospholipid kuning telur menurut Juneja et al. (1994) terdiri atas phosphatidylcholine (lesitin) 80.8%,

phosphatidylethanolamine 11.7%, lysophosphatidylcholine 1.9%, sphingomyelin

1.9%, serta lemak netral (nonpolar) dan bahan lain 3.7%. Menurut Dong et al.

(2006), komposisi phospholipid kuning telur terdiri atas 77% phosphatidylcholine (lesitin), 3% sphingomyelin, dan 18% phosphatidylethanolamine.

spermiogenesis sekitar 85% inti spermatozoa histon akan diganti oleh protamin (Aulanni’am et al, 2011).

Keseluruhan genom spermatozoa terdapat di dalam pilinan DNA dengan panjang rata-rata 27 kilobite. Pilinan DNA ini berikatan dengan elemen struktural inti yang disebut matriks inti. Beberapa faktor yang menyebabkan terganggunya proses spermatogenesis seperti stress lingkungan, mutasi gen, dan abnormalitas kromosom berpotensi merusak struktural kromatin yang berhubungan dengan kejadian infertilisasi. Abnormalitas kromatin inti dapat juga disebabkan oleh radikal bebas (Lewis dan Aitken, 2005). Atau akibat apoptosis. Salah satu agen oksidasi adalah reactive oxygen species (ROS) yang dalam kadar tinggi dapat bersifat toksik terhadap spermatozoa (Saleh et al, 2002). Seperti halnya agen oksidasi yang lain (hidrogen piroksida, superoksidasi dan radikal bebas), ROS sangat reaktif. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron bebas yang tidak berpasangan (Warren et al, 1987)

Kantor (1995) menyatakan bahwa kerusakan DNA dapat diartikan sebagai semua bentuk perubahan polimer DNA. Secara alamiah DNA terus menerus terpapar pada lingkungan fisik dan kimia yang sangat bervariasi dan berpotensi mengubah struktur alamiah DNA tersebut. Perubahan ini dapat memengaruhi proses replikasi dan traskripsi DNA yang mengarah pada kerusakan DNA. Konsekuensi biologisnya dapat mengubah kejadian mutasi atau kematian sel bahkan kanker, kemunduran mental dan terkait pertumbuhan dan perkembangan. Lebih lanjut dikatakan bahwa kerusakan modifikasi struktur DNA diinduksi oleh beberapa penyebab seperti radiasi, panas, tekanan, dan bahan kimia. Bentuk

kerusakan yang lain adalah terputusnya struktur polimer DNA. Pemanasan yang melebihi 37o_{C menyebabkan terputusnya ikatan glikosida yang menghubungkan} antara basa nitrogen dan struktur gula fosfat sehingga basa nitrogen akan hilang.

Pemeriksaan kerusakan DNA spermatozoa telah banyak dilakukan dengan berbagai metode analisis antara lain Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) (Evenson et al, 2002), Acridine Orange Test (AO) (Tejada et al, 1984) Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Nick and Labelling (TUNEL) (Gorcyza et al, 1993), Toluidine Blue (TB) Test (Erenpreisa et al, 2003), Comet Assay (Fraser dan Strzezek, 2004), dan Kit Halomax® (Langdon, 2012).

2.5Semen Cair

Semen cair adalah semen segar yang telah ditambahkan suatu bahan pengencer yang dapat mempertahankan daya hidup spermatozoa lebih lama dari pada ketahanan aslinya (Junaidi 2006). Preservasi semen cair umumnya dilakukan pada suhu 3 – 5oC. Menurut Mc. Kinnon (1999), setiap penurunan suhu 10oC akan menurunkan metabolisme spermatozoa sampai 50%. Terhambatnya metabolisme spermatozoa, maka akan dapat mempertahankan viabilitas beberapa hari sampai saat digunakan untuk IB. Selama penyimpanan, spermatozoa harus ditambahkan media berupa bahan pengencer yang harus mengandung sumber energi, buffer atau larutan penyangga, komponen isotonis dan pelindung terhadap kejutan dingin (cold shock) yang terjadi selama penyimpanan pada suhu rendah.

Semen yang diperoleh dari pejantan harus diencerkan dengan pengencer tertentu agar dapat didistribusikan ke beberapa betina dalam rangkaian program IB. Selain untuk memperbanyak volume, pengencer tersebut harus memenuhi beberapa kriteria yaitu, 1) mengandung sumber energi untuk kelangsungan hidup spermatozoa antara lain : fruktosa, glukosa, dan laktosa. 2) mengandung anti kejutan dingin (cold shock) antara lain : lipoprotein dan lesitin. 3) mempunyai kemampuan sebagai larutan penyangga antara lain : sitrat, Tris, dan phosphate. 4) memiliki keseimbangan elektrolit. 5) mengandung antibiotika yang melindungi semen dari kontaminasi mikroba (Herdis et al. 2003).

2.6 Penampungan Semen

Penampungan semen menurut Konrad (2007) adalah sebagai berikut: mula-mula penis digenggam dan preputium ditarik ke belakang di belakang bulbus glandis. Setelah itu, ibu jari dan keempat jari menggenggam penis dengan pijatan yang cukup dibelakang bulbus glandis sehingga menghasilkan ereksi penuh. Biasanya ereksi diikuti secara spontan dan dengan tetap memberikan rangsangan pada preputium. Hal ini memang diperlukan pada beberapa anjing, demikian halnya dengan stimulasi pada daerah perineal ataupun pada gland penis. Karena ejakulasi berfraksi, pemisahan koleksi dari setiap fraksi dapat dilakukan dengan mengganti tabung koleksi. Sesudah fraksi kedua, maka penampung semen harus dihentikan untuk menghindari sekresi dari glandula prostat atau fraksi ketiga yang jernih dan transparan

Metode lain yang sering digunakan dengan vagina buatan. Vagina buatan merupakan tiruan dari vagina alami. Vagina buatan biasanya dibuat dari bahan

karet. Ukuran dan bentuknya disesuaikan dengan jenis hewan yang akan diambil semennya. Pada anjing biasanya digunakan tipe harrop. Vagina buatan sebaiknya diberi pelumas sebelum digunakan, biasanya dengan vaselin. Apabila penis telah nampak ereksi masukkan penis ke vagina buatan. Dengan adanya rangsangan pijatan oleh vagina buatan anjing dapat mengalami ejakulasi. Semen yang keluar ditampung dengan tabung gelas (Puja, 2007b).

Produksi semen sangat berkaitan dengan berat testis, sedangkan berat testis berkolerasi dengan berat badan. Dengan demikian berat badan berkolerasi dengan produksi semen. Karena itu produksi semen harian akan lebih banyak pada anjing ras besar jika dibandingkan dengan anjing ras kecil. Disamping ukuran tubuh, umur dapat pula mempengaruhi ukuran testis dan mempengaruhi produksi semen (Puja, 2007b_).

2.7 Bahan Pengencer Semen

Salah satu media pengencer yang umum digunakan adalah Tris. Tris memiliki toksisitas rendah dan sistem penyanggah yang baik dengan mempertahankan pH, tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit (Affandhy et al. 1999). Sebagai pengencer semen cair, Tris sering dicampur dengan karbohidrat yang berfungsi sebagai sumber energi bagi spermatozoa. Beberapa penelitian buffer spermatozoa yang dilakukan oleh Baran et al. (2004) menggunakan campuran Tris dengan fruktosa, sedangkan Axnér et al. (2004) menggunakan campuran Tris dengan glukosa serta Tris dengan laktosa yang dilakukan oleh Axnér dan Linde-Forsberg (2002).

2.7.1 Pengencer Sari Kacang Kedelai

Menurut Aboagla dan Terada (2004), anti cold shock perlu ditambahkan dalam bahan pengencer agar dapat melindungi spermatozoa pada saat perubahan suhu dari suhu ruang (28oC) pada saat pengolahan ke suhu ekulibrasi (5oC). Anti cold shock yang umum ditambahkan adalah kuning telur ataupun kacang kedelai yang dapat melindungi membran spermatozoa pada saat pendinginan atau pembekuan. Khasiat utama kuning telur ataupun kacang kedelai adalah kandungan lesitin (phosphatidylcholine) yang bersifat membran coating untuk tetap mempertahankan konfigurasi normal phospholipid bilayer yang merupakan susunan utama membran spermatozoa. Kedelai memiliki kecenderungan terkontaminasi bakterial lebih kecil daripada kuning telur. Lesitin dari kacang kedelai merupakan pilihan yang tepat sebagai sumber lesitin bahan pengencer semen dimasa yang akan datang (Aires et al., 2003). Kacang kedelai juga mampu menekan stres oksidatif (Ogbuewu et al., 2010). Kacang kedelai yang belum maupun yang sudah mengalami penyulingan memiliki kandungan phospholipid antara lain phosphatidylcholine 17.50% dan 23.00%, phosphatidylethanolamine 15.00% dan 20.00%, glikolipid 13-16%, phospholipid lainnya 14-18% dan trigliserida 2-4% (Shurtleff dan Aoyagi 2004).

Lesitin kacang kedelai memiliki bahan-bahan yang mirip dengan lesitin pada kuning telur yang digunakan untuk perlindungan terhadap cold shock pada saat kriopreservasi (Thun et al. 2002; Aires et al. 2003 ). Meskipun lesitin dari bahan nabati seperti lesitin dari kacang kedelai banyak tersedia, akan tetapi lesitin

dari kuning telur masih banyak digunakan untuk pembekuan semen (Aires et al., 2003).

2.7.2 Pengencer Kuning telur

Kuning telur merupakan komponen yang paling umum digunakan pada bahan pengencer untuk kriopreservasi karena terbukti memiliki efek yang menguntungkan sebagai pelindung dari membran plasma dan akrosom terhadap cold shock (Amirat et al. 2004). Kandungan phospholipid, kolesterol dan low-density lipoprotein pada kuning telur berfungsi melindungi spermatozoa dari kejutan dingin selama proses pembekuan.

Kuning telur mempunyai sifat sebagai penyangga tekanan osmotik sehingga spermatozoa lebih toleran terhadap lingkungan yang hipotonik atau hipertonik (Khalifa dan El-Saidy, 2006). Komposisi phospholipid kuning telur menurut Juneja et al. (1994) terdiri atas phosphatidylcholine (lesitin) 80.8%, phosphatidylethanolamine 11.7%, lysophosphatidylcholine 1.9%, sphingomyelin 1.9%, serta lemak netral (nonpolar) dan bahan lain 3.7%. Menurut Dong et al. (2006), komposisi phospholipid kuning telur terdiri atas 77% phosphatidylcholine (lesitin), 3% sphingomyelin, dan 18% phosphatidylethanolamine.