Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Daun Tumbuhan Benalu Nangka (Macrosolen Cochinchinensis (Lour). Van Tiegh) Chapter III V
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat- alat
1. Spektrofotometer FT-IR
2. Spektrofotometer UV-Vis
3. Spektrometer 1H-NMR
4. Kolom kromatografi
5. Rotarievaporator
6. Labu Alas Rotarievaporator
7. Lampu Ultraviolet
8. Neraca analitis
9. Chamber
10. Maserator
11. Rangkaian alat destilasi
12. Corong pisah
13. Penangas air
14. Gelas ukur
15. Gelas beaker
16. Labu Erlenmeyer
17. Corong kaca
18. Tabung reaksi
19. Pipet tetes
20. Pipa kapiler
21. Spatula
22. Botol vial
23. Statif dan Klem
24. Batang pengaduk
25. Plat Aluminium KLT
26. Plat KLTP
27. Kapas Pembalut
Shimadzu
Jeol/Delta2NMR
500 Mhz
1000 mL
254/356 nm
Büchi R-114
Schoot Duran
UVGL 58
1L
Pyrex
100 mL
1000 mL
500 mL
Pyrex
Pyrex
Pyrex
Pyrex
0,5 mm
Silika Gel 60 F 254
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-bahan
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Daun Tumbuhan Benalu Nangka
Metanol
Etilasetat
Aquadest
N-heksana
Kloroform
FeCl3 5 %
HCl 2 N
Silika Gel 40 (70-230 mesh)ASTM
Destilasi
Teknis
Teknis
Teknis
Teknis
KgaA
Universitas Sumatera Utara
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan Benalu Nangka (M. cochincinensis) yang
diperoleh dari pekarangan kampus Fakultas Ekonomi dan Bisnis, Universitas
Sumatera Utara. Daun ini kemudian dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan
dengan blender hingga diperoleh serbuk daun benalu Nangka sebanyak 2000 g.
3.3.2 Uji Flavonoida terhadap Daun Tumbuhan Benalu Nangka
Untuk mengetahui adanya terkandung senyawa flavonoida pada daun tumbuhan
benalu Nangka dilakukan dengan uji flavonoida secara kualitatif, yang dilakukan
dengan cara: dimasukkan masing-masing 10 g serbuk kering daun benalu Nangka ke
dalam erlenmeyer I dan II, ditambahkan 100 mL pelarut metanol ke dalam erlenmeyer
I dan 100 mL pelarut etilasetat ke dalam erlenmeyer II, didiamkan lalu disaring.
Dimasukkan masing-masing filtrat yang diperoleh ke dalam tabung reaksi I dan II, lalu
ditambahkan pereaksi FeCl3 5% ke dalam masing-masing tabung reaksi, dihasilkan
larutan berwarna hitam untuk ke dua larutan dalam tabung reaksi.
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Benalu Nangka
3.3.3.1 Ekstraksi Maserasi dengan Pelarut Metanol
Serbuk daun benalu Nangka ditimbang sebanyak 2100 g, kemudian dimaserasi dengan
pelarut metanol sebanyak 6 L sampai sampel terendam seluruhnya dan dibiarkan
selama ± 24 jam. Perendaman dilakukan secara berulang-ulang hingga ekstrak
menunjukkan hasil negatif bila diuji dengan pereaski FeCl3 5%. Maserat ditampung
dan dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan diatas penangas air hingga
seluruh pelarut metanol menguap dan diperoleh ekstrak pekat metanol.
3.3.3.2 Pemisahan Tanin
Pada ekstrak pekat metanol dari serbuk daun benalu Nangka dilakukan pemisahan
tanin dengan cara melarutkan ekstrak pekat metanol dengan pelarut etilasetat untuk
memisahkan tanin dengan flavonoid, dimana tanin merupakan senyawa polifenol yang
tidak dapat larut dalam pelarut polar aprotik (misalnya etilasetat), sedangkan flavonoid
dapat larut, dengan cara inilah tanin dipisahkan dari flavonoid. Kemudian disaring.
Selanjutnya filtrat dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan diatas penangas
air hingga seluruh pelarut etilasetat habis menguap sehingga dihasilkan ekstrak pekat
etilasetat bebas tanin sebanyak 92,40 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.3.3 Ekstraksi Partisi dengan Pelarut N-Heksana
Ekstrak pekat etilasetat bebas tanin kemudian dilarutkan dengan pelarut metanol.
Ekstrak metanol kemudian diekstraksi partisi dengan pelarut n-heksana menggunakan
corong pisah. Ekstraksi partisi dilakukan secara berulang kali. Ektraksi partisi
dihentikan apabila ekstrak metanol menunjukkan hasil yang negatif bila diuji dengan
pereaksi FeCl3 5%. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana. Lapisan
metanol tersebut kemudian dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol bebas
nonpolar (ekstrak flavonoid glikosida).
3.3.3.4 Hidrolisa
Ekstrak pekat metanol bebas nonpolar kemudian dihidrolisa (diputuskan ikatan
gulanya) dengan menggunakan HCl 2 N sambil dipanaskan diatas penangas air selama
± 1 jam setelah ekstrak mendidih dan sambil diaduk. Kemudian disaring sehingga
diperoleh ekstrak metanol bebas gula (ekstrak aglikon flavonoid).
3.3.3.5 Ektraksi Partisi dengan Pelarut Kloroform
Ekstrak metanol bebas gula diekstraksi partisi denganpelarut kloroform secara
berulang kali sampai lapisan metanol asam menunjukkan hasil negatif apabila diuji
dengan pereaski FeCl3 5%. Kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan diatas
penangas air sampai seluruh pelarut kloroform menguap, sehingga diperoleh ekstrak
pekat kloroform sebanyak 0,84 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.4 Analisa Kromatografi Lapis Tipis
Analisa kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform dengan
menggunakan fase diam silike gel 60 GF254 Merck dan dengan fase gerak campuran
pelarut n-heksana : etilasetat dengan perbandingan (9:1); (8:2); (7:3); dan (6:4)v/ v .
Analisa ini dilakukan untuk mencari fase gerak yang sesuai dalam analisa
kromatografi kolom.
Dimasukkan 10 mL campuran pelarut n-heksana : etilasetat dengan
perbandingan (9:1)v/ v ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan
ekstrak pekat kloform pada plat KLT, dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah
berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi hingga pelarut
mencapai batas atas pada plat KLT yang telah ditetapkan sebelumnya. Setelah fase
gerak mencapai batas atas plat KLT, plat diangkat dan dikeringkan kemudian difiksasi
dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang dihasilkan dan dihitung harga
Rf dari bercak yang dihasilkan. Dilakukan perlakuan yang sama untuk campuran
pelarut n-heksana : etilasetat dengan perbandingan (8:2), (7:3), dan (6:4)v/ v .
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida terhadap ekstrak pekat kloroform secara kromatografi
kolom, dengan menggunakan fase diam silika gel 60G dan fase gerak pelarut nheksana 100%, campuran pelarut n-heksana : etilasetat dengan perbandingan
(90:10)v/ v, (80:20)v/ v , (70:30)v/ v , dan (60:40) v/ v.
Dirangkai alat kolom. Kemudian dibuburkan silika gel sebanyak 30 g dengan
menggunakan pelarut n-heksana, diaduk hingga homogen, lalu dimasukkan ke dalam
tabung kolom. Kemudian dielusi dengan n-heksana 100% hingga silika gel dipastikan
sudah padat dan homogen. Dilarutkan ekstrak pekat kloroform daun benalu Nangka
dengan kloroform lalu dimasukkan ke dalam tabung kolom yang telah berisi buburan
silika gel.
Dimasukkan kapas sebagai pembatas antara sampel dan fase gerak sebelum
ditambahkan fase gerak berupa pelarut n-heksana : etilasetat dengan perbandingan
(90:10)v/ v secara perlahandan diaturaliran pelarut dengan kran sedemikian rupa.
Ditingkatkan kepolaran dengan cara menambahkan fase gerak n-heksana : etilasetat
dengan perbandingan (80:20)v/ v , (70:30)v/ v, dan (60:40) v/ v.
Eluat yang diperoleh ditampung dalam botol vial sebanyak ±10 mL per botol vial
dan diperoleh hasil sebanyak 110 botol vial. Kemudian fraksi diuji dengan pereaksi
FeCl3 5% dan diperoleh hasil yang positif yaitu dari fraksi 25-110.
Universitas Sumatera Utara
3.3.6 Uji Kemurnian Senyawa Hasil Isolasi dengan KLT
Selanjutnya fraksi-fraksi yang positif (fraksi 25-110) di KLT dan digabungkan fraksifraksi dengan harga Rf dan yang memiliki pola noda yang sama. Dihasilkan 4 fraksi
penggabungan yakni fraksi I (fraksi 25-50), fraksi II (fraksi 51-55), fraksi III (fraksi
56-60) dan fraksi IV (61-110). Diuapkan semua fraksi penggabungan yang dihasilkan
diatas penangas air sampai kering dan ditimbang massa tiap fraksi. Dihasilkan berupa
pasta berwarna kuning, yang kemudian dilarutkan dengan pelarut etilasetat untuk diuji
KLT untuk mengetahui kemurnian senyawa dan untuk menentukan fase gerak yang
sesuai untuk kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP).
3.3.7 Pemurnian Senyawa Hasil Isolasi dengan KLTP
Pada uji kemurnian senyawa hasil isolasi dengan KLT, dihasilkan dua noda pada
kromatogram fraksi 25-50. Maka dilakukan permunian dengan cara preparatif. Pasta
hasil isolasi tersebut dilarutkan dengan etilasetat, lalu ditotolkan pada plat preparatif
yang berukuran 20×20 cm berupa garis di sepanjang batas bawah yang telah
ditentukan sebelumnya, ditotolkan berulang-ulang dan secara merata dengan
menggunakan pipa kapiler. Dibiarkan mengering sampai sampel yang ditotolkan
diserap oleh silika.
Dimasukkan plat KLTP yang telah kering ke dalam chamber yang berisi fase
gerak yang sesuai yaitu n-heksana : etilasetat (80:20)v/ v , ditutup chamber, dibiarkan
sampai pelarut mencapai batas atas yang telah ditentukan, diangkat plat, didiamkan,
kemudian dimasukkan kembali ke dalam chamber, diulangi sebanyak 3 kali supaya
noda benar-benar terpisah dengan baik. Kemudian plat dikeringkan, disinari dengan
lampu UV, ditandai daerah-daerah noda yang telah terpisah dengan pensil, dihasilkan
dua daerah noda, lalu dikerok silika pada daerah-daerah yang telah ditandai tersebut.
Silika tersebut kemudian dielusi diatas corong kaca kecil yang menggunakan kapas
sebagai penyaring dan pelarut metanol:etilasetat (1:1) v/ v yang dituangkan setetes demi
setetes dengan pipet tetes. Ditampung filtrat didalam erlenmeyer kecil. Filtrat yang
dihasilkan kemudian diuapkan kembali hingga kering hingga terbentuk pasta. Di KLT
kembali untuk menguji apakah pasta yang dihasilkan tersebut sudah murni dan
dihasilkan hanya satu noda yang berarti pasta sudah murni, dan diuji juga dengan
pereaksi FeCl3 5% dan dihasilkan warna hitam yang berarti pasta tersebut positif
senyawa flavonoid.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisa dengan alat spektrofotometer Ultraviolet-Visible (UV-Vis) diperoleh dari
Laboratorium Kimia FMIPA ITB, Bandung dengan menggunakan pelarut metanol.
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR)
Analisa dengan alat Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR) diperoleh dari
Laboratorium Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Komplek PUSPIPTEK, Serpong,
Tangerang dengan menggunakan KBr.
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
(1H-NMR)
Analisa
dengan
alat
Spektrometer
Resonansi
Magnetik
Inti
Proton
(1H-NMR) diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Komplek
PUSPIPTEK, Serpong, Tangerang dengan menggunakan pelarut metanol.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Uji Flavonoida
3.4.1 Bagan Uji Flavonoida dengan Pelarut Metanol
Serbuk Daun
Benalu Nangka
diekstraksi maserasi dengan metanol
disaring
dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Ekstrak Metanol
diamati
warna
larutan
ditambahkan
pereaksi
FeCl3 5%
diamati
perubahan
warna
Larutan Hitam
Positif Polifenol
3.4.2 Bagan Uji Flavonoida dengan Pelarut Etilasetat
Serbuk Daun
Benalu Nangka
diekstraksi maserasi dengan etilasetat
disaring
dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Ekstrak Etilasetat
diamati
warna
larutan
ditambahkan
pereaksi
FeCl3 5%
diamati
perubahan
warna
Larutan Hitam
Positif Flavonoid
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian
2000 gram Serbuk Daun Benalu Nangka
(Macrosolen cochinchinensis (Lour). Van Tiegh)
dimaserasi dengan metanol sampai sampel terendam
didiamkan selama ± 24 jam
diulangi sebanyak 3 kali
disaring
Ampas
Ekstrak Metanol
diuji dengan FeCl3 5%
dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan hingga seluruh pelarut metanol menguap
Ekstrak Pekat Metanol
dilarutkan dengan etil asetat sampai larutan negatif bila diuji dengan FeCl3 5%
disaring
Residu
Ekstrak Etil Asetat
diuji dengan FeCl3 5%
dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan hingga seluruh etil asetat menguap
Ekstrak Pekat Etil Asetat
dilarutkan dengan metanol
diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai larutan negatif bila diuji dengan FeCl3 5%
Lapisan n-Heksana
( tidak dilanjutkan)
Lapisan Metanol
diuji dengan FeCl3 5%
dipekatkan dengan rotarievaporator
dihidrolisis dengan HCl 6% sambil dipanaskan selama 1 jam
didinginkan
disaring
Residu
Ekstrak Metanol Asam
diekstraksi partisi dengan kloroform hingga lapisan kloroform negatif bila diuji dengan FeCl3 5%
Lapisan Kloroform
Universitas Sumatera Utara
Lanjutan
Lapisan Kloroform
diuji dengan FeCl3 5% (+)
dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak Pekat Kloroform
diuji dengan FeCl3 5% (+)
diuji KLT dengan eluent n-heksana : etil asetat (90:10; 80:20; 70:30; 60:40) v/v
dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksana : etil asetat (90:10; 80:20; 70:30; 60:40) v/v
ditampung tiap fraksi sebanyak ±10 mL dalam botol vial
duji KLT untuk mengetahui harga Rf yang sama
digabungkan fraksi dengan harga Rf yang sama
Fraksi 25 - 50
(86, 30 mg)
diuji dengan FeCl3 5%
Hasil positif
Fraksi 51 - 60
(37,60 mg)
diuji dengan FeCl3 5%
Hasil positif
Fraksi 61 -110
(232,20 mg)
diuji dengan FeCl3 5%
Hasil positif
dianalisa kromarografi lapis tipis
dipreparatif dengan eluen n-heksana : etilasetat (80:20) v/v
dikeringkan
disinari dibawah lampu UV
digerus preparat dari plat
dielusi dengan eluen campuran metanol:etilasetat 1:1
disaring
diuapkan
dianalisa kromatografi lapis tipis
Senyawa Hasil
Isolasi
dianalisa dengan spektrofotometer UV-Visible,
spektrofotometer Inframerah (FT-IR), dan
sepktrometer 1H-NMR.
Hasil Analisa
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
Hasil uji kualitatif flavonoida terhadap ekstrak metanol dan etilasetat dari daun
tumbuhan Benalu Nangka (M. cochincinensis) menunjukkan bahwa sampel positif
terhadap pereaksi FeCl3 5%.
Hasil elusi dari perbandingan pelarut n-heksana : etilasetat 70:30 (v/ v ) pada fraksi
25-50, dilakukan KLT preparatif dengan eluen n-heksana : etilasetat 80:20 (v/ v) untuk
mendapatkan senyawa murni. Dan diperoleh senyawa murni berupa pasta berwarna
kuning kecoklatan dengan massa 2 mg dan nilai Rf = 0,36.
Spektrum UV-Visible senyawa hasil isolasi menggunakan pelarut metanol
ditunjukkan pada Gambar 4.1 dibawah ini :
Gambar 4.1 Spektrum UV-Vsible Senyawa Hasil Isolasi
dengan Menggunakan Metanol
Universitas Sumatera Utara
Panjang gelombang dan absorbansi UV-Vis senyawa hasil isolasi dapat dilihat
pada tabel dibawah ini:
Tabel 4.1 Panjang Gelombang dan Absorbansi UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi
Dari
Panjang Gelombang (nm)
Absorbansi
264
0,279
hasil
karakterisasi
dan
elusidasi
menggunakan
Spektrofotometer
Ultraviolet-Visible (UV-Vis) menunjukkan adanya satu serapan panjang gelombang
maksimum (λ maks) yaitu pada pita II menunjukkan panjang gelombang 264 nm.
Spektrum FT-IR pasta hasil isolasi memberikan puncak-puncak serapan daerah
bilangan gelombang (cm-1) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.2 berikut :
Gambar 4.2 Spektrum Inframerah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi
Menggunakan KBr Pellet
Universitas Sumatera Utara
Hasil analisa Spektrofotometer FT-IR dari pasta hasil isolasi menghasilkan pita
serapan pada daerah bilangan gelombang pada Tabel 4.2 sebagai berikut:
Tabel 4.2 Hasil Analisa Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi
Gugus Fungsi
Intensitas
Bilangan Gelombang (cm-1)
─OH (stretching)
Sedang
3419,79 – 3363,86
―CH═CH―
Tajam
2926,01
C─H alifatis
Rendah
2864,29
C═O (keton)
Tajam
1720,50
C═C aromatik
Sedang
1448,54 – 1377,17
C─OH (alkohol)
Rendah
1278,81
C─O─C
Rendah
1197,79
Berdasarkan data hasil analisa spektrofotometer inframerah diatas menunjukkan
bahwa senyawa hasil isolasi memiliki gugus-gugus fungsi yang lazim ditemukan pada
senyawa flavonoida.
Universitas Sumatera Utara
Hasil analisa spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) terhadap
hasil senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut metanol (CD 3 OD) dan TMS
menunjukkan sinyal-sinyal pergeseran kimia pada daerah (ppm) yang ditunjukkan
pada Gambar 4.3 berikut ini:
Gambar 4.3 Spektrum 1 H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
dengan Menggunakan Pelarut Metanol
Universitas Sumatera Utara
Berikut merupakan Tabel 4.3 yang menunjukkan pergeseran kimia dan jenis
peak 1H-NMR senyawa hasil isolasi :
Tabel 4.3 Pergeseran Kimia dan Jenis Peak 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
Daerah Pergeseran Kimia (ppm)
δ = 8,0038
δ = 7,5797 – 7,5680
δ = 7,3929 – 7,3786
δ = 6,8053 – 6,7884
δ = 6,5096 – 6,4771
δ = 4,6067
δ = 3,8310
δ = 1,3095
Jenis Peak
Puncak singlet
Puncak doublet
Puncak doublet
Puncak doublet
Puncak doublet
Puncak singlet
Puncak singlet
Puncak singlet
4.2 Pembahasan
Isolasi senyawa flavonoida dari 2000 g daun tumbuhan Benalu Nangka pada tahap
awal dilakukan uji kualitatif polifenol dan flavonoida dengan merendam serbuk daun
tumbuhan Benalu Nangka dengan pelarut metanol dan etilasetat lalu ditambahkan
pereaksi FeCl3 5%, dan didapatkan hasil yang positif. Dilakukan uji kualitatif
flavonoida dengan pelarut etilasetat selain dengan pelarut metanol, dikarenakan pada
ekstrak metanol masih terkandung senyawa polifenol lainnya (misalnya tanin,
senyawa poilfenol yang sering terdapat bersamaan dengan flavonoid), sedangkan pada
ekstrak etilasetat tidak terkandung tanin karena tanin tak dapat larut dalam pelarut
polar aprotik sedangkan flavonoid dapat larut, sehingga jika didapatkan hasil yang
positif dengan pereaksi FeCl3 5% maka dapat dipastikan bahwa dalam sampel
terkandung flavonoid.
Setelah dipastikan sampel mengandung flavonoid, kemudian di ekstraksi
maserasi dengan menggunakan pelarut metanol dan dipekatkan. Lalu dilarutkan
dengan etilasetat untuk memisahkan tanin dari flavonoid. Ekstrak etilasetat bebas tanin
dilarutkan dengan metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan pelarut n-heksana
untuk memisahkan senyawa-senyawa nonpolar (seperti lemak, klorofil, terpen) yang
mungkin terkandung dalam ekstrak sampel.
Universitas Sumatera Utara
Ekstrak pekat metanol bebas nonpolar dilanjutkan dengan dihidrolisis dengan
HCl 2 N untuk memutuskan ikatan gula dengan flavonoid (karena flavonoid di alam
biasanya terikat dengan gula). Dilanjutkan dengan diekstraksi partisi dengan pelarut
kloroform dan dipekatkan. Dianalisa KLT untuk mencari perbandingan pelarut yang
sesuai untuk eluen dalam kromatografi kolom. Dari hasil KLT, didapatkan bahwa
perbandingan pelarut yang baik untuk memisahkan flavonoida dari daun tumbuhan
Benalu Nangka adalah n-heksana : etilasetat dengan perbandingan 70:30 (v/ v), yang
menunjukkan
pemisahan
yang
lebih
baik
dari
noda
yang
dihasilkan
( lihat Lampiran 3 ).
Kemudian dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom. Fraksi-fraksi yang
dihasilkan kemudian dianalisa KLT untuk digabungkan fraksi dengan nilai Rf dan
pola noda yang sama ( lihat Lampiran 4 ).
Fraksi yang dilanjutkan adalah fraksi 25-50 dengan massa = 86,3 mg, karena
pemisahan noda yang dihasilkan lebih baik dan noda berada ditengah plat bila
dibandingkan dengan fraksi-fraksi lainnya (lihat Lampiran 5). Tidak dipilih fraksi
yang lebih bawah dikarenakan kemungkinan dalam fraksi tersebut terkandung
senyawa-senyawa polifenol lainnya, seperti asam-asam fenolik yang sangat polar,yang
terpecah pada saat dihidrolisa.
Kemudian dipreparatif dengan sistem pelarut n-
heksana : etilasetat dengan perbandingan 80:20 (v/ v), kromatogram disinari dengan
lampu UV, kemudian dikerok bagian yang diinginkan dan dielusi dengan metanol :
etilasetat dengan perbandingan 1:1 (v/ v) didalam corong kecil. Senyawa yang
diperoleh kemudian diuji kemurniannya dengan eluen n-heksana : etilasetat dengan
perbandingan 80:20 (v/ v ) dan dihasilkan hanya satu noda (lihat Lampiran 6).
Universitas Sumatera Utara
Untuk menganalisa struktur senyawa flavonoida hasil isolasi diperlukan alat
spektrofotometer UV-Visible, Inframerah (FT-IR) dan spektrometer
1
H-NMR.
Spektrofotometer UV-Vis digunakan untuk menentukan golongan senyawa flavonoida
yang diperoleh melalui panjang gelombang maksimum pita serapan yang dihasilkan.
Spektofotometer Inframerah (FT-IR) digunakan untuk menganalisa gugus-gugus
fungsi dari senyawa hasil isolasi. Dan spektrometer 1H-NMR digunakan untuk
menentukan jenis proton senyawa melalui atom C tetangga.
Dari hasil interpretasi spektrum UV-Visibel dengan pelarut metanol (Gambar
4.1) memberikan panjang gelombang maksimal (λ maks ) = 264 nm (pada Tabel 4.1).
Hal ini menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi sesuai dengan spektrum UV-Visibel
pada senyawa pembanding flavonoid (Lampiran 7), dan dari pembanding didapatkan
bahwa senyawa hasil isolasi kemungkinan merupakan senyawa flavanoid golongan
isoflavon.
Hasil interpretasi spektrum Inframerah (FT-IR) dan
1
H-NMR dengan
menggunakan pelarut metanol (CD 3 OD) diuraikan melalui penjelasan berikut:
Pergeseran kimia pada δ = 1,3095 ppm terdapat puncak singlet, menunjukkan
proton dari CH 3 dari vinilik. Hal ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan
gelombang2864,29 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ─CH
ulur
alifatis.
Pergeseran kimia pada δ = 3,8310 ppm terdapat puncak singlet, menunjukkan
proton dari ─OCH 3 . Hal ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan gelombang
2864,29 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ulur─CH alifatis, pada
bilangan gelombang 1377,17 cm-1puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi tekuk
─CH 3 dan pada bilangan gelombang 1197,79 cm-1 puncak rendah menunjukkan
adanya vibrasi ulur dari C─O─C.
Universitas Sumatera Utara
Pergeseran kimia pada δ = 4,6067 ppm terdapat puncak singlet, menunjukkan
proton dari vinilik. Hal ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan gelombang
═CH―. Dan hal
2926,01 cm-1puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur ―CH
ini didukung oleh Lampiran 13.
Pergeseran kimia pada δ = 6,5096 – 6,4771 ppm terdapat puncak doublet dan
δ = 6,8053 – 6,7884 ppm terdapat puncak doublet, yang menunjukkan proton yang
berjodohan antara proton H-6 dan H-8 dari cincin A, dikarenakan adanya
kemungkinan subtituen OH pada C-7 dan─OCH
3
pada C-5 yang menyebabkan
pergeseran kimia yang hampir sama. Hal ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan
gelombang 1448,54 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ikatan rangkap
C═C dari sistem aromatik dan pada bilangan gelombang 981,77 cm-1 puncak rendah
menunjukkan adanya vibrasi ulur
─CH.
Dan sesuai dengan pembanding pada
Lampiran 12.
Pergeseran kimia pada δ = 7,3786 – 7,3929 ppm terdapat puncak doublet,
menunjukkan proton yang berjodohan antara proton H-3’ dan H-5’ pada cincin B. Hal
ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan gelombang 1448,54 cm-1 puncak sedang
menunjukkan adanya vibrasi ikatan rangkap═C
C dari sistem aromatik dan pada
bilangan gelombang 981,77 cm-1 puncak rendah menunjukkan adanya vibrasi ulur
─CH. Dan sesuai dengan pembanding pada Lampiran 12.
Pergeseran kimia pada δ = 7,5797 – 7,5680 ppm terdapat puncak doublet,
menunjukkan proton yang berjodohan antara proton H-2’ dan H-6’ pada cincin B. Hal
ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan gelombang 1448,54 cm-1 puncak sedang
menunjukkan adanya vibrasi ikatan rangkap═C
C dari sistem aromatik dan pada
bilangan gelombang 981,77 cm-1 puncak rendah menunjukkan adanya vibrasi ulur
─CH. Dan sesuai dengan pembanding pada Lampiran 12.
Pergeseran kimia pada
δ =
8,0038 ppm terdapat puncak singlet yang
menunjukkan proton dari H-2 pada cincin C. Hal ini ditinjau dari data pembanding
(Lampiran 11).
Universitas Sumatera Utara
Pada spektrum NMR, terlihat ada dua peak pada 8 ppm dan juga terlihat banyak
peak lainnya pada pergeseran kimia yang lain, hal ini dikarenakan kurang murninya
sampel, dan diduga terdapat senyawa isomer isoflavon yang tergabung didalamnya
dengan harga Rf yang sangat berdekatan sehingga sulit untuk dipisahkan dengan cara
KLT preparatif dan juga dikarenakan sangat sedikitnya massa senyawa hasil isolasi
yang diperoleh.
Berdasarkan analisa data dan interpretasi yang dilakukan pada spektrum UVVisibel, FT-IR dan 1H-NMR, pasta yang diisolasi dari daun tumbuhan Benalu Nangka
adalah senyawa flavonoida golongan isoflavon dengan dugaan struktur sebagai
berikut:
R
7
8
1
A
C
6
O
4
2
H
2'
3
1'
O
R =
OH ,
CH3
C
H
R
5'
6'
Ar
Keterangan :
4'
B
5
OCH3
3'
C
CH3
Gambar 4.4 Kemungkinan Struktur Senyawa Hasil Isolasi (Isoflavon)
Universitas Sumatera Utara
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Hasil uji kualitatif flavonoida menggunakan pereaksi FeCl3 5% menunjukkan
bahwa daun Benalu Nangka mengandung senyawa flavonoida.
2. Hasil isolasi yang diperoleh dari 2000 g daun Benalu Nangka berupa pasta
berwarna kuning kecoklatan sebanyak 2 mg, dengan harga Rf = 0,36 dengan
eluen n-heksana : etilasetat 80:20 (v/ v ).
3. Hasil analisa dengan spektrofotometer Infra Merah (FT-IR), UV-Visible dan
spektrometer Resonansi Inti Magnetik Inti Proton (1H-NMR) menunjukkan
bahwa senyawa hasil isolasi dari daun Benalu Nangkamerupakan flavonoida
golongan isoflavon.
4. Kemungkinan struktur senyawa hasil isolasi :
R
7
8
1
A
C
6
O
4
2
H
2'
3
1'
O
4'
B
5
OCH3
3'
5'
6'
Ar
Keterangan :
R =
OH ,
CH3
C
H
R
C
CH3
5.2 Saran
Untuk lebih mendukung struktur senyawa flavonoida hasil isolasi, maka sebaiknya
perlu dilakukan analisa Spektrometer Karbon (13C-NMR) dan Spektroskopi Massa
(MS).
Universitas Sumatera Utara
METODE PENELITIAN
3.1 Alat- alat
1. Spektrofotometer FT-IR
2. Spektrofotometer UV-Vis
3. Spektrometer 1H-NMR
4. Kolom kromatografi
5. Rotarievaporator
6. Labu Alas Rotarievaporator
7. Lampu Ultraviolet
8. Neraca analitis
9. Chamber
10. Maserator
11. Rangkaian alat destilasi
12. Corong pisah
13. Penangas air
14. Gelas ukur
15. Gelas beaker
16. Labu Erlenmeyer
17. Corong kaca
18. Tabung reaksi
19. Pipet tetes
20. Pipa kapiler
21. Spatula
22. Botol vial
23. Statif dan Klem
24. Batang pengaduk
25. Plat Aluminium KLT
26. Plat KLTP
27. Kapas Pembalut
Shimadzu
Jeol/Delta2NMR
500 Mhz
1000 mL
254/356 nm
Büchi R-114
Schoot Duran
UVGL 58
1L
Pyrex
100 mL
1000 mL
500 mL
Pyrex
Pyrex
Pyrex
Pyrex
0,5 mm
Silika Gel 60 F 254
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-bahan
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Daun Tumbuhan Benalu Nangka
Metanol
Etilasetat
Aquadest
N-heksana
Kloroform
FeCl3 5 %
HCl 2 N
Silika Gel 40 (70-230 mesh)ASTM
Destilasi
Teknis
Teknis
Teknis
Teknis
KgaA
Universitas Sumatera Utara
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan Benalu Nangka (M. cochincinensis) yang
diperoleh dari pekarangan kampus Fakultas Ekonomi dan Bisnis, Universitas
Sumatera Utara. Daun ini kemudian dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan
dengan blender hingga diperoleh serbuk daun benalu Nangka sebanyak 2000 g.
3.3.2 Uji Flavonoida terhadap Daun Tumbuhan Benalu Nangka
Untuk mengetahui adanya terkandung senyawa flavonoida pada daun tumbuhan
benalu Nangka dilakukan dengan uji flavonoida secara kualitatif, yang dilakukan
dengan cara: dimasukkan masing-masing 10 g serbuk kering daun benalu Nangka ke
dalam erlenmeyer I dan II, ditambahkan 100 mL pelarut metanol ke dalam erlenmeyer
I dan 100 mL pelarut etilasetat ke dalam erlenmeyer II, didiamkan lalu disaring.
Dimasukkan masing-masing filtrat yang diperoleh ke dalam tabung reaksi I dan II, lalu
ditambahkan pereaksi FeCl3 5% ke dalam masing-masing tabung reaksi, dihasilkan
larutan berwarna hitam untuk ke dua larutan dalam tabung reaksi.
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Benalu Nangka
3.3.3.1 Ekstraksi Maserasi dengan Pelarut Metanol
Serbuk daun benalu Nangka ditimbang sebanyak 2100 g, kemudian dimaserasi dengan
pelarut metanol sebanyak 6 L sampai sampel terendam seluruhnya dan dibiarkan
selama ± 24 jam. Perendaman dilakukan secara berulang-ulang hingga ekstrak
menunjukkan hasil negatif bila diuji dengan pereaski FeCl3 5%. Maserat ditampung
dan dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan diatas penangas air hingga
seluruh pelarut metanol menguap dan diperoleh ekstrak pekat metanol.
3.3.3.2 Pemisahan Tanin
Pada ekstrak pekat metanol dari serbuk daun benalu Nangka dilakukan pemisahan
tanin dengan cara melarutkan ekstrak pekat metanol dengan pelarut etilasetat untuk
memisahkan tanin dengan flavonoid, dimana tanin merupakan senyawa polifenol yang
tidak dapat larut dalam pelarut polar aprotik (misalnya etilasetat), sedangkan flavonoid
dapat larut, dengan cara inilah tanin dipisahkan dari flavonoid. Kemudian disaring.
Selanjutnya filtrat dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan diatas penangas
air hingga seluruh pelarut etilasetat habis menguap sehingga dihasilkan ekstrak pekat
etilasetat bebas tanin sebanyak 92,40 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.3.3 Ekstraksi Partisi dengan Pelarut N-Heksana
Ekstrak pekat etilasetat bebas tanin kemudian dilarutkan dengan pelarut metanol.
Ekstrak metanol kemudian diekstraksi partisi dengan pelarut n-heksana menggunakan
corong pisah. Ekstraksi partisi dilakukan secara berulang kali. Ektraksi partisi
dihentikan apabila ekstrak metanol menunjukkan hasil yang negatif bila diuji dengan
pereaksi FeCl3 5%. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana. Lapisan
metanol tersebut kemudian dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol bebas
nonpolar (ekstrak flavonoid glikosida).
3.3.3.4 Hidrolisa
Ekstrak pekat metanol bebas nonpolar kemudian dihidrolisa (diputuskan ikatan
gulanya) dengan menggunakan HCl 2 N sambil dipanaskan diatas penangas air selama
± 1 jam setelah ekstrak mendidih dan sambil diaduk. Kemudian disaring sehingga
diperoleh ekstrak metanol bebas gula (ekstrak aglikon flavonoid).
3.3.3.5 Ektraksi Partisi dengan Pelarut Kloroform
Ekstrak metanol bebas gula diekstraksi partisi denganpelarut kloroform secara
berulang kali sampai lapisan metanol asam menunjukkan hasil negatif apabila diuji
dengan pereaski FeCl3 5%. Kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan diatas
penangas air sampai seluruh pelarut kloroform menguap, sehingga diperoleh ekstrak
pekat kloroform sebanyak 0,84 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.4 Analisa Kromatografi Lapis Tipis
Analisa kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform dengan
menggunakan fase diam silike gel 60 GF254 Merck dan dengan fase gerak campuran
pelarut n-heksana : etilasetat dengan perbandingan (9:1); (8:2); (7:3); dan (6:4)v/ v .
Analisa ini dilakukan untuk mencari fase gerak yang sesuai dalam analisa
kromatografi kolom.
Dimasukkan 10 mL campuran pelarut n-heksana : etilasetat dengan
perbandingan (9:1)v/ v ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan
ekstrak pekat kloform pada plat KLT, dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah
berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi hingga pelarut
mencapai batas atas pada plat KLT yang telah ditetapkan sebelumnya. Setelah fase
gerak mencapai batas atas plat KLT, plat diangkat dan dikeringkan kemudian difiksasi
dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang dihasilkan dan dihitung harga
Rf dari bercak yang dihasilkan. Dilakukan perlakuan yang sama untuk campuran
pelarut n-heksana : etilasetat dengan perbandingan (8:2), (7:3), dan (6:4)v/ v .
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida terhadap ekstrak pekat kloroform secara kromatografi
kolom, dengan menggunakan fase diam silika gel 60G dan fase gerak pelarut nheksana 100%, campuran pelarut n-heksana : etilasetat dengan perbandingan
(90:10)v/ v, (80:20)v/ v , (70:30)v/ v , dan (60:40) v/ v.
Dirangkai alat kolom. Kemudian dibuburkan silika gel sebanyak 30 g dengan
menggunakan pelarut n-heksana, diaduk hingga homogen, lalu dimasukkan ke dalam
tabung kolom. Kemudian dielusi dengan n-heksana 100% hingga silika gel dipastikan
sudah padat dan homogen. Dilarutkan ekstrak pekat kloroform daun benalu Nangka
dengan kloroform lalu dimasukkan ke dalam tabung kolom yang telah berisi buburan
silika gel.
Dimasukkan kapas sebagai pembatas antara sampel dan fase gerak sebelum
ditambahkan fase gerak berupa pelarut n-heksana : etilasetat dengan perbandingan
(90:10)v/ v secara perlahandan diaturaliran pelarut dengan kran sedemikian rupa.
Ditingkatkan kepolaran dengan cara menambahkan fase gerak n-heksana : etilasetat
dengan perbandingan (80:20)v/ v , (70:30)v/ v, dan (60:40) v/ v.
Eluat yang diperoleh ditampung dalam botol vial sebanyak ±10 mL per botol vial
dan diperoleh hasil sebanyak 110 botol vial. Kemudian fraksi diuji dengan pereaksi
FeCl3 5% dan diperoleh hasil yang positif yaitu dari fraksi 25-110.
Universitas Sumatera Utara
3.3.6 Uji Kemurnian Senyawa Hasil Isolasi dengan KLT
Selanjutnya fraksi-fraksi yang positif (fraksi 25-110) di KLT dan digabungkan fraksifraksi dengan harga Rf dan yang memiliki pola noda yang sama. Dihasilkan 4 fraksi
penggabungan yakni fraksi I (fraksi 25-50), fraksi II (fraksi 51-55), fraksi III (fraksi
56-60) dan fraksi IV (61-110). Diuapkan semua fraksi penggabungan yang dihasilkan
diatas penangas air sampai kering dan ditimbang massa tiap fraksi. Dihasilkan berupa
pasta berwarna kuning, yang kemudian dilarutkan dengan pelarut etilasetat untuk diuji
KLT untuk mengetahui kemurnian senyawa dan untuk menentukan fase gerak yang
sesuai untuk kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP).
3.3.7 Pemurnian Senyawa Hasil Isolasi dengan KLTP
Pada uji kemurnian senyawa hasil isolasi dengan KLT, dihasilkan dua noda pada
kromatogram fraksi 25-50. Maka dilakukan permunian dengan cara preparatif. Pasta
hasil isolasi tersebut dilarutkan dengan etilasetat, lalu ditotolkan pada plat preparatif
yang berukuran 20×20 cm berupa garis di sepanjang batas bawah yang telah
ditentukan sebelumnya, ditotolkan berulang-ulang dan secara merata dengan
menggunakan pipa kapiler. Dibiarkan mengering sampai sampel yang ditotolkan
diserap oleh silika.
Dimasukkan plat KLTP yang telah kering ke dalam chamber yang berisi fase
gerak yang sesuai yaitu n-heksana : etilasetat (80:20)v/ v , ditutup chamber, dibiarkan
sampai pelarut mencapai batas atas yang telah ditentukan, diangkat plat, didiamkan,
kemudian dimasukkan kembali ke dalam chamber, diulangi sebanyak 3 kali supaya
noda benar-benar terpisah dengan baik. Kemudian plat dikeringkan, disinari dengan
lampu UV, ditandai daerah-daerah noda yang telah terpisah dengan pensil, dihasilkan
dua daerah noda, lalu dikerok silika pada daerah-daerah yang telah ditandai tersebut.
Silika tersebut kemudian dielusi diatas corong kaca kecil yang menggunakan kapas
sebagai penyaring dan pelarut metanol:etilasetat (1:1) v/ v yang dituangkan setetes demi
setetes dengan pipet tetes. Ditampung filtrat didalam erlenmeyer kecil. Filtrat yang
dihasilkan kemudian diuapkan kembali hingga kering hingga terbentuk pasta. Di KLT
kembali untuk menguji apakah pasta yang dihasilkan tersebut sudah murni dan
dihasilkan hanya satu noda yang berarti pasta sudah murni, dan diuji juga dengan
pereaksi FeCl3 5% dan dihasilkan warna hitam yang berarti pasta tersebut positif
senyawa flavonoid.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisa dengan alat spektrofotometer Ultraviolet-Visible (UV-Vis) diperoleh dari
Laboratorium Kimia FMIPA ITB, Bandung dengan menggunakan pelarut metanol.
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR)
Analisa dengan alat Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR) diperoleh dari
Laboratorium Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Komplek PUSPIPTEK, Serpong,
Tangerang dengan menggunakan KBr.
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
(1H-NMR)
Analisa
dengan
alat
Spektrometer
Resonansi
Magnetik
Inti
Proton
(1H-NMR) diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Komplek
PUSPIPTEK, Serpong, Tangerang dengan menggunakan pelarut metanol.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Uji Flavonoida
3.4.1 Bagan Uji Flavonoida dengan Pelarut Metanol
Serbuk Daun
Benalu Nangka
diekstraksi maserasi dengan metanol
disaring
dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Ekstrak Metanol
diamati
warna
larutan
ditambahkan
pereaksi
FeCl3 5%
diamati
perubahan
warna
Larutan Hitam
Positif Polifenol
3.4.2 Bagan Uji Flavonoida dengan Pelarut Etilasetat
Serbuk Daun
Benalu Nangka
diekstraksi maserasi dengan etilasetat
disaring
dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Ekstrak Etilasetat
diamati
warna
larutan
ditambahkan
pereaksi
FeCl3 5%
diamati
perubahan
warna
Larutan Hitam
Positif Flavonoid
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian
2000 gram Serbuk Daun Benalu Nangka
(Macrosolen cochinchinensis (Lour). Van Tiegh)
dimaserasi dengan metanol sampai sampel terendam
didiamkan selama ± 24 jam
diulangi sebanyak 3 kali
disaring
Ampas
Ekstrak Metanol
diuji dengan FeCl3 5%
dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan hingga seluruh pelarut metanol menguap
Ekstrak Pekat Metanol
dilarutkan dengan etil asetat sampai larutan negatif bila diuji dengan FeCl3 5%
disaring
Residu
Ekstrak Etil Asetat
diuji dengan FeCl3 5%
dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan hingga seluruh etil asetat menguap
Ekstrak Pekat Etil Asetat
dilarutkan dengan metanol
diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai larutan negatif bila diuji dengan FeCl3 5%
Lapisan n-Heksana
( tidak dilanjutkan)
Lapisan Metanol
diuji dengan FeCl3 5%
dipekatkan dengan rotarievaporator
dihidrolisis dengan HCl 6% sambil dipanaskan selama 1 jam
didinginkan
disaring
Residu
Ekstrak Metanol Asam
diekstraksi partisi dengan kloroform hingga lapisan kloroform negatif bila diuji dengan FeCl3 5%
Lapisan Kloroform
Universitas Sumatera Utara
Lanjutan
Lapisan Kloroform
diuji dengan FeCl3 5% (+)
dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak Pekat Kloroform
diuji dengan FeCl3 5% (+)
diuji KLT dengan eluent n-heksana : etil asetat (90:10; 80:20; 70:30; 60:40) v/v
dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksana : etil asetat (90:10; 80:20; 70:30; 60:40) v/v
ditampung tiap fraksi sebanyak ±10 mL dalam botol vial
duji KLT untuk mengetahui harga Rf yang sama
digabungkan fraksi dengan harga Rf yang sama
Fraksi 25 - 50
(86, 30 mg)
diuji dengan FeCl3 5%
Hasil positif
Fraksi 51 - 60
(37,60 mg)
diuji dengan FeCl3 5%
Hasil positif
Fraksi 61 -110
(232,20 mg)
diuji dengan FeCl3 5%
Hasil positif
dianalisa kromarografi lapis tipis
dipreparatif dengan eluen n-heksana : etilasetat (80:20) v/v
dikeringkan
disinari dibawah lampu UV
digerus preparat dari plat
dielusi dengan eluen campuran metanol:etilasetat 1:1
disaring
diuapkan
dianalisa kromatografi lapis tipis
Senyawa Hasil
Isolasi
dianalisa dengan spektrofotometer UV-Visible,
spektrofotometer Inframerah (FT-IR), dan
sepktrometer 1H-NMR.
Hasil Analisa
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
Hasil uji kualitatif flavonoida terhadap ekstrak metanol dan etilasetat dari daun
tumbuhan Benalu Nangka (M. cochincinensis) menunjukkan bahwa sampel positif
terhadap pereaksi FeCl3 5%.
Hasil elusi dari perbandingan pelarut n-heksana : etilasetat 70:30 (v/ v ) pada fraksi
25-50, dilakukan KLT preparatif dengan eluen n-heksana : etilasetat 80:20 (v/ v) untuk
mendapatkan senyawa murni. Dan diperoleh senyawa murni berupa pasta berwarna
kuning kecoklatan dengan massa 2 mg dan nilai Rf = 0,36.
Spektrum UV-Visible senyawa hasil isolasi menggunakan pelarut metanol
ditunjukkan pada Gambar 4.1 dibawah ini :
Gambar 4.1 Spektrum UV-Vsible Senyawa Hasil Isolasi
dengan Menggunakan Metanol
Universitas Sumatera Utara
Panjang gelombang dan absorbansi UV-Vis senyawa hasil isolasi dapat dilihat
pada tabel dibawah ini:
Tabel 4.1 Panjang Gelombang dan Absorbansi UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi
Dari
Panjang Gelombang (nm)
Absorbansi
264
0,279
hasil
karakterisasi
dan
elusidasi
menggunakan
Spektrofotometer
Ultraviolet-Visible (UV-Vis) menunjukkan adanya satu serapan panjang gelombang
maksimum (λ maks) yaitu pada pita II menunjukkan panjang gelombang 264 nm.
Spektrum FT-IR pasta hasil isolasi memberikan puncak-puncak serapan daerah
bilangan gelombang (cm-1) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.2 berikut :
Gambar 4.2 Spektrum Inframerah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi
Menggunakan KBr Pellet
Universitas Sumatera Utara
Hasil analisa Spektrofotometer FT-IR dari pasta hasil isolasi menghasilkan pita
serapan pada daerah bilangan gelombang pada Tabel 4.2 sebagai berikut:
Tabel 4.2 Hasil Analisa Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi
Gugus Fungsi
Intensitas
Bilangan Gelombang (cm-1)
─OH (stretching)
Sedang
3419,79 – 3363,86
―CH═CH―
Tajam
2926,01
C─H alifatis
Rendah
2864,29
C═O (keton)
Tajam
1720,50
C═C aromatik
Sedang
1448,54 – 1377,17
C─OH (alkohol)
Rendah
1278,81
C─O─C
Rendah
1197,79
Berdasarkan data hasil analisa spektrofotometer inframerah diatas menunjukkan
bahwa senyawa hasil isolasi memiliki gugus-gugus fungsi yang lazim ditemukan pada
senyawa flavonoida.
Universitas Sumatera Utara
Hasil analisa spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) terhadap
hasil senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut metanol (CD 3 OD) dan TMS
menunjukkan sinyal-sinyal pergeseran kimia pada daerah (ppm) yang ditunjukkan
pada Gambar 4.3 berikut ini:
Gambar 4.3 Spektrum 1 H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
dengan Menggunakan Pelarut Metanol
Universitas Sumatera Utara
Berikut merupakan Tabel 4.3 yang menunjukkan pergeseran kimia dan jenis
peak 1H-NMR senyawa hasil isolasi :
Tabel 4.3 Pergeseran Kimia dan Jenis Peak 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
Daerah Pergeseran Kimia (ppm)
δ = 8,0038
δ = 7,5797 – 7,5680
δ = 7,3929 – 7,3786
δ = 6,8053 – 6,7884
δ = 6,5096 – 6,4771
δ = 4,6067
δ = 3,8310
δ = 1,3095
Jenis Peak
Puncak singlet
Puncak doublet
Puncak doublet
Puncak doublet
Puncak doublet
Puncak singlet
Puncak singlet
Puncak singlet
4.2 Pembahasan
Isolasi senyawa flavonoida dari 2000 g daun tumbuhan Benalu Nangka pada tahap
awal dilakukan uji kualitatif polifenol dan flavonoida dengan merendam serbuk daun
tumbuhan Benalu Nangka dengan pelarut metanol dan etilasetat lalu ditambahkan
pereaksi FeCl3 5%, dan didapatkan hasil yang positif. Dilakukan uji kualitatif
flavonoida dengan pelarut etilasetat selain dengan pelarut metanol, dikarenakan pada
ekstrak metanol masih terkandung senyawa polifenol lainnya (misalnya tanin,
senyawa poilfenol yang sering terdapat bersamaan dengan flavonoid), sedangkan pada
ekstrak etilasetat tidak terkandung tanin karena tanin tak dapat larut dalam pelarut
polar aprotik sedangkan flavonoid dapat larut, sehingga jika didapatkan hasil yang
positif dengan pereaksi FeCl3 5% maka dapat dipastikan bahwa dalam sampel
terkandung flavonoid.
Setelah dipastikan sampel mengandung flavonoid, kemudian di ekstraksi
maserasi dengan menggunakan pelarut metanol dan dipekatkan. Lalu dilarutkan
dengan etilasetat untuk memisahkan tanin dari flavonoid. Ekstrak etilasetat bebas tanin
dilarutkan dengan metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan pelarut n-heksana
untuk memisahkan senyawa-senyawa nonpolar (seperti lemak, klorofil, terpen) yang
mungkin terkandung dalam ekstrak sampel.
Universitas Sumatera Utara
Ekstrak pekat metanol bebas nonpolar dilanjutkan dengan dihidrolisis dengan
HCl 2 N untuk memutuskan ikatan gula dengan flavonoid (karena flavonoid di alam
biasanya terikat dengan gula). Dilanjutkan dengan diekstraksi partisi dengan pelarut
kloroform dan dipekatkan. Dianalisa KLT untuk mencari perbandingan pelarut yang
sesuai untuk eluen dalam kromatografi kolom. Dari hasil KLT, didapatkan bahwa
perbandingan pelarut yang baik untuk memisahkan flavonoida dari daun tumbuhan
Benalu Nangka adalah n-heksana : etilasetat dengan perbandingan 70:30 (v/ v), yang
menunjukkan
pemisahan
yang
lebih
baik
dari
noda
yang
dihasilkan
( lihat Lampiran 3 ).
Kemudian dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom. Fraksi-fraksi yang
dihasilkan kemudian dianalisa KLT untuk digabungkan fraksi dengan nilai Rf dan
pola noda yang sama ( lihat Lampiran 4 ).
Fraksi yang dilanjutkan adalah fraksi 25-50 dengan massa = 86,3 mg, karena
pemisahan noda yang dihasilkan lebih baik dan noda berada ditengah plat bila
dibandingkan dengan fraksi-fraksi lainnya (lihat Lampiran 5). Tidak dipilih fraksi
yang lebih bawah dikarenakan kemungkinan dalam fraksi tersebut terkandung
senyawa-senyawa polifenol lainnya, seperti asam-asam fenolik yang sangat polar,yang
terpecah pada saat dihidrolisa.
Kemudian dipreparatif dengan sistem pelarut n-
heksana : etilasetat dengan perbandingan 80:20 (v/ v), kromatogram disinari dengan
lampu UV, kemudian dikerok bagian yang diinginkan dan dielusi dengan metanol :
etilasetat dengan perbandingan 1:1 (v/ v) didalam corong kecil. Senyawa yang
diperoleh kemudian diuji kemurniannya dengan eluen n-heksana : etilasetat dengan
perbandingan 80:20 (v/ v ) dan dihasilkan hanya satu noda (lihat Lampiran 6).
Universitas Sumatera Utara
Untuk menganalisa struktur senyawa flavonoida hasil isolasi diperlukan alat
spektrofotometer UV-Visible, Inframerah (FT-IR) dan spektrometer
1
H-NMR.
Spektrofotometer UV-Vis digunakan untuk menentukan golongan senyawa flavonoida
yang diperoleh melalui panjang gelombang maksimum pita serapan yang dihasilkan.
Spektofotometer Inframerah (FT-IR) digunakan untuk menganalisa gugus-gugus
fungsi dari senyawa hasil isolasi. Dan spektrometer 1H-NMR digunakan untuk
menentukan jenis proton senyawa melalui atom C tetangga.
Dari hasil interpretasi spektrum UV-Visibel dengan pelarut metanol (Gambar
4.1) memberikan panjang gelombang maksimal (λ maks ) = 264 nm (pada Tabel 4.1).
Hal ini menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi sesuai dengan spektrum UV-Visibel
pada senyawa pembanding flavonoid (Lampiran 7), dan dari pembanding didapatkan
bahwa senyawa hasil isolasi kemungkinan merupakan senyawa flavanoid golongan
isoflavon.
Hasil interpretasi spektrum Inframerah (FT-IR) dan
1
H-NMR dengan
menggunakan pelarut metanol (CD 3 OD) diuraikan melalui penjelasan berikut:
Pergeseran kimia pada δ = 1,3095 ppm terdapat puncak singlet, menunjukkan
proton dari CH 3 dari vinilik. Hal ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan
gelombang2864,29 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ─CH
ulur
alifatis.
Pergeseran kimia pada δ = 3,8310 ppm terdapat puncak singlet, menunjukkan
proton dari ─OCH 3 . Hal ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan gelombang
2864,29 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ulur─CH alifatis, pada
bilangan gelombang 1377,17 cm-1puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi tekuk
─CH 3 dan pada bilangan gelombang 1197,79 cm-1 puncak rendah menunjukkan
adanya vibrasi ulur dari C─O─C.
Universitas Sumatera Utara
Pergeseran kimia pada δ = 4,6067 ppm terdapat puncak singlet, menunjukkan
proton dari vinilik. Hal ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan gelombang
═CH―. Dan hal
2926,01 cm-1puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur ―CH
ini didukung oleh Lampiran 13.
Pergeseran kimia pada δ = 6,5096 – 6,4771 ppm terdapat puncak doublet dan
δ = 6,8053 – 6,7884 ppm terdapat puncak doublet, yang menunjukkan proton yang
berjodohan antara proton H-6 dan H-8 dari cincin A, dikarenakan adanya
kemungkinan subtituen OH pada C-7 dan─OCH
3
pada C-5 yang menyebabkan
pergeseran kimia yang hampir sama. Hal ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan
gelombang 1448,54 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ikatan rangkap
C═C dari sistem aromatik dan pada bilangan gelombang 981,77 cm-1 puncak rendah
menunjukkan adanya vibrasi ulur
─CH.
Dan sesuai dengan pembanding pada
Lampiran 12.
Pergeseran kimia pada δ = 7,3786 – 7,3929 ppm terdapat puncak doublet,
menunjukkan proton yang berjodohan antara proton H-3’ dan H-5’ pada cincin B. Hal
ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan gelombang 1448,54 cm-1 puncak sedang
menunjukkan adanya vibrasi ikatan rangkap═C
C dari sistem aromatik dan pada
bilangan gelombang 981,77 cm-1 puncak rendah menunjukkan adanya vibrasi ulur
─CH. Dan sesuai dengan pembanding pada Lampiran 12.
Pergeseran kimia pada δ = 7,5797 – 7,5680 ppm terdapat puncak doublet,
menunjukkan proton yang berjodohan antara proton H-2’ dan H-6’ pada cincin B. Hal
ini didukung oleh spektrum IR pada bilangan gelombang 1448,54 cm-1 puncak sedang
menunjukkan adanya vibrasi ikatan rangkap═C
C dari sistem aromatik dan pada
bilangan gelombang 981,77 cm-1 puncak rendah menunjukkan adanya vibrasi ulur
─CH. Dan sesuai dengan pembanding pada Lampiran 12.
Pergeseran kimia pada
δ =
8,0038 ppm terdapat puncak singlet yang
menunjukkan proton dari H-2 pada cincin C. Hal ini ditinjau dari data pembanding
(Lampiran 11).
Universitas Sumatera Utara
Pada spektrum NMR, terlihat ada dua peak pada 8 ppm dan juga terlihat banyak
peak lainnya pada pergeseran kimia yang lain, hal ini dikarenakan kurang murninya
sampel, dan diduga terdapat senyawa isomer isoflavon yang tergabung didalamnya
dengan harga Rf yang sangat berdekatan sehingga sulit untuk dipisahkan dengan cara
KLT preparatif dan juga dikarenakan sangat sedikitnya massa senyawa hasil isolasi
yang diperoleh.
Berdasarkan analisa data dan interpretasi yang dilakukan pada spektrum UVVisibel, FT-IR dan 1H-NMR, pasta yang diisolasi dari daun tumbuhan Benalu Nangka
adalah senyawa flavonoida golongan isoflavon dengan dugaan struktur sebagai
berikut:
R
7
8
1
A
C
6
O
4
2
H
2'
3
1'
O
R =
OH ,
CH3
C
H
R
5'
6'
Ar
Keterangan :
4'
B
5
OCH3
3'
C
CH3
Gambar 4.4 Kemungkinan Struktur Senyawa Hasil Isolasi (Isoflavon)
Universitas Sumatera Utara
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Hasil uji kualitatif flavonoida menggunakan pereaksi FeCl3 5% menunjukkan
bahwa daun Benalu Nangka mengandung senyawa flavonoida.
2. Hasil isolasi yang diperoleh dari 2000 g daun Benalu Nangka berupa pasta
berwarna kuning kecoklatan sebanyak 2 mg, dengan harga Rf = 0,36 dengan
eluen n-heksana : etilasetat 80:20 (v/ v ).
3. Hasil analisa dengan spektrofotometer Infra Merah (FT-IR), UV-Visible dan
spektrometer Resonansi Inti Magnetik Inti Proton (1H-NMR) menunjukkan
bahwa senyawa hasil isolasi dari daun Benalu Nangkamerupakan flavonoida
golongan isoflavon.
4. Kemungkinan struktur senyawa hasil isolasi :
R
7
8
1
A
C
6
O
4
2
H
2'
3
1'
O
4'
B
5
OCH3
3'
5'
6'
Ar
Keterangan :
R =
OH ,
CH3
C
H
R
C
CH3
5.2 Saran
Untuk lebih mendukung struktur senyawa flavonoida hasil isolasi, maka sebaiknya
perlu dilakukan analisa Spektrometer Karbon (13C-NMR) dan Spektroskopi Massa
(MS).
Universitas Sumatera Utara