Isolasi dan Uji EkstrakBA Perairan Tawar dalam Mengendalikan Biofilm Aeromonas salmonicida Pada Berbagai Permukaan Padat

51

Lampiran 1. Alur Kerja Isolasi Bakteri Asam Laktat (Bucio et al. 2006)

Bagian usus ikan mas
(C. carpio)

dicuci dan dibersihan dengan akuades steril
dikerik dinding mukosa usus dengan spatula steril
diambil cairan mukosa usus sebanyak 1 mL
dihomogenkan di dalam 9 mL larutan PBS (phosphat buffer saline)
menit
dilakukan pengenceran hingga 10-8 secara berseri
dari setiap pengenceran 10-4 hingga 10-8 diambil 0,1 ml dan
disebarkan pada medium MRS agar
diinkubasi pada suhu 28 0C selama 24-48 jam

Koloni BAL

disubkultur pada media MRSA baru sampai diperoleh biakan murni

Hasil

Lampiran 2. Alur Kerja Karakterisasi BAL
Isolat murni BAL

dikarakterisasi berdasarkan struktur dan
warna koloni

Pewarnaan Gram

Uji Biokimia

diamati dengan
mikroskop

Uji sitrat
Uji gelatin

Hasil

Uji motilitas

Uji katalase
Uji TSIA

Hasil

Lampiran 3. Alur Kerja Seleksi BAL Potensial dalam Menghambat
Pertumbuhan A. salmonicida

Media MHA

diinokulasikan mikroba patogen dengan
metode usap menggunakan cotton bud
dengan absorbansi 0,5 standar McFarland 108 CFU/ml
diletakkan cakram kertas yang telah
ditetesi dengan suspensi BAL pada jarak
yang telah ditentukan
diletakkan cakram pembanding yaitu
khloramphenikol

Hasil

diinkubasi pada suhu 28-30 oC selama 3
hari
diamati dan diukur zona hambat yang
terbentuk

Lampiran 4. Alur kerja Kurva Pertumbuhan BAL
Kultur BAL
terpilih

dimasukkan kedalam 30 mL media cair MRSB
diinkubasi pada 28 0C
dihitung nilai kerapatan optik atau optical density (DO)
isolat terpilih BAL dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm,
pada rentang waktu 3 jam selama 24 jam
Hasil

Lampiran 5. Alur Kerja Produksi Senyawa Antimikroba BAL

Kultur cair BAL
berumur 21 jam

diinokulasikan sebanyak 10 mL kedalam 400 media NB

diinkubasi pada suhu 28 0C selam 15 jam

disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu
4 0C selama 15 menit sebanyak 100 mL kultur

disaringan senyawa antimikroba dengan kertas saring
0,22 µm (MS® Syringe filter)
Hasil

Lampiran 6. Uji Aktivitas Ekstrak Kasar Senyawa Antimikroba BAL dalam
menghambat pertumbuhan bakteri A. salmonicda

Media
MHA

Media
MHA
dituang ke dalam cawan petri

dibiarkan memadat
Media MHA Padat

diinokulasi bakteri patogen Aeromonas salmonicida
diletakkan cakram yang telah ditetesi dengan
senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL pada
jarak yang telah ditentukan

diletakkan cakram pembanding Khlorampenikol

diinkubasi pada suhu 28-30 oC selama 3 hari

diamati dan diukur zona hambat yang terbentuk

Hasil

Lampiran 7. Alur Kerja Pembentukan Biofilm Aeromonas salmonicida
Lempeng PVC dan
sisik ikan

Dipotong seluas 1cm2 dan dicuci pada
bak sonikator selama 15 menit
di autoklaf kedua lempeng selama 15
menit, tekanan 1 atm pada suhu 121 0C.
ditumbuhkan A. salmonicida pada media
NB sebanyak 50 ml dengan konsentrasi
sel 108 CFU/ml dalam labu erlenmeyer.
Biofilm terbentuk
1,3, dan 5 hari

diangkat dari kultur, masing-masing
dibilas
sebanyak 3 kali dengan 10
ml akuades steril
dimasukkan ke 9 ml larutan garam
fisiologis NaCl 0,85 % yang ditambah

dengan 0,5 g manik-manik kaca mikro
(glass bead),
dihomogenkan untuk melepas sel
biofilm selama 2 menit.
dilakukan pengenceran berseri.
disebar 0,1 ml kultur pada media PCA,
diinkubasi pada suhu 28 0C selama 24
jam.
dilakukan perhitungan jumlah sel
dengan metode TPC

Jumlah Sel
Biofilm

Lampiran 8. Bagan Alir Pengendalian Sel Biofilm oleh biomassa sel BAL

Lempeng Biofilm

dipreparasi berdasarkan perlakuan
sebelumnya

dibilas 3x dengan akuades steril untuk
melepas sel plantonik
dimasukkan dalam masing-masing tabung
steril,
ditambahkan 9 mL kultur BAL dengan
kepadatan 108 CFU/mL yang berasal dari
kurva pertumbuhan
dibilas 3x dengan akuades steril untuk
melepas sel plantonik
dimasukkan ke dalam 9 ml NaCl 0,9% dan
0,5 g serbuk kaca (glass bead)
dilakukan pengenceran berseri
disebar 0,1 ml dari tiap pengenceran pada
media PCA
diinkubasi pada suhu 28oC selama 24 jam.
dihitung jumlah koloni yang tumbuh
Jumlah
sel
Jumlah Sel
biofilm

Biofilm