KADAR MDA SPERMATOZOA SETELAH PROSES PEMBEKUAN

  

KADAR MDA SPERMATOZOA SETELAH PROSES PEMBEKUAN

_{1) 2) 3) 4) 1),2),3),4)}

Khairatul Insani , Sri Rahayu , Agung Pramana , Aries Soewondo .

   Laboratorium Biomolekuler dan Seluler, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, _{1) 2) 3) 4)}

Universitas Brawijaya, Malang 65145, Jawa Timur, Indonesia.

  

E-mail: Khairatul.if@gmail.com , srahayu@ub.ac.id , junstone21@yahoo.com , soewondo@ub.ac.id

ABSTRAK

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efek lama pembekuan semen terhadap kadar MDA

spermatozoa dan persentase viabilitas spermatozoa. Sampel yang digunakan berupa semen beku sapi

Limousin dengan lama pembekuan 2 bulan dan 3 bulan yang dikoleksi dari BBIB Singosari. Semen beku

yang telah di thawing diencerkan dengan Phosphate Buffer Saline (PBS) kemudian disentrifugasi untuk

memisahkan spermatozoa dan seminal plasma. Kadar MDA spermatozoa diukur dengan menggunakan uji

TBA dan spektrofotometer. Pengamatan viabilitas spermatozoa dilakukan dengan menggunakan pewarnaan

eosin-negrosin. Data berupa kadar MDA spermatozoa dan persentase viabilitas dianalisis dengan uji-t

berpasangan dan korelasi pearson menggunakan spss 16.0. Hasil analisis menunjukkan bahwa kadar MDA

spermatozoa pada lama pembekuan 2 bulan (0,0777±0,008 nM) dan 3 bulan (0,0919±0,016 nM) tidak berbeda

nyata (p<0,05). Terdapat korelasi negatif antara persentase viabilitas dan kadar MDA pada spermatozoa.

  Kata kunci: MDA, semen beku, spermatozoa

ABSTRACT

The aim of this research was to determine the effect of long-term freezing on MDA levels of spermatozoa and

spermatozoa viability. Frozen semen of cattle limousine that had been stored for 2 and 3 months were

collected from BBIB Singosari used in this study. The frozen-thawed semen was diluted with Phosphate

Buffer Saline (PBS) and then centrifuged to separate the spermatozoa and seminal plasma. The MDA levels of

spermatozoa were measured by TBARS Assay and spectrophotometer. Spermatozoa viability was assessed

using Eosin-Negrosin staining. The data such as MDA’s level and viability percentage were analyzed using

paired t-test and Pearson correlation employing SPSS 16.0 for Windows. The result showed that MDA levels

of spermatozoa for 2 months storage (0.0777 ± 0.008 nM) and 3 months storage (0.0919 ± 0.016 nM) were not

significant differences (p<0.05). There is negative correlation between the percentage of viability andMDA

levels of spermatozoa.

  Keywords: MDA, frozen semen, spermatozoa

  dalam waktu tidak terbatas, semen dapat dikoleksi

  PENDAHULUAN

  setiap saat dan dapat digunakan sewaktu Berbagai metode bioteknologi reproduksi dibutuhkan [4]. Namun pembekuan dapat telah digunakan dalam meningkatkan kuantitas mengakibatkan menurunnya viabilitas, fungsi hewan ternak, salah satunya adalah inseminasi mitokondria dan motilitas sperma [5]. buatan [1]. Inseminasi Buatan (IB) merupakan

  Pembekuan sel dapat menyebabkan salah satu usaha penerapan teknologi tepat guna terbentuknya kristal-kristal es dan penumpukan dan menjadi pilihan utama untuk meningkatkan elektrolit serta bahan terlarut lainnya di dalam populasi serta mutu genetik ternak. Guna larutan atau di dalam sel. Kristal es intraseluler peningkatan populasi ternak tersebut maka yang dapat merusak sperma secara mekanik. dapat dilakukan adalah dengan memanfaatkan

  Konsentrasi elektrolit yang berlebihan akan teknologi reproduksi peternakan melalui teknik IB melarutkan selubung lipoprotein membran sel dengan menggunakan semen beku [2]. sperma sehingga permeabilitas membran sel

  Semen beku adalah semen yang diencerkan sperma akan mengalami perubahan dan kemudian dibekukan dan disimpan didalam menyebabkan kematian sel [6]. Spermatozoa nitrogen cair pada suhu -1960C[3]. Semen beku manusia akan mengalami penurunan motilitas dari memiliki kelebihan diantaranya dapat disimpan

  40, 2% sebelum pembekuan menjadi 24,8% setelah pembekuan [5]. Spermatozoa manusia juga mengalami penurunan viabilitas dari 80% sebelum dibekukan menjadi 50% setelah pembekuan [7]. Penelitian sebelumnya membuktikan bahwa penurunan motilitas sperma beku setelah thawing berhubungan dengan destabilisasi membran yang mengakibatkan peningkatan permeabilitas terhadap ion-ion [8] dan produksi ROS [9]. Produksi ROS pada sperma adalah sebagai hasil proses fisiologi normal untuk reaksi akrosom dan kapasitasi sperma [10]. Namun produksi ROS berlebih pada sperma akan menjadi bahaya diakibatkan oleh efek merugikan pada jumlah sperma fungsional [11].

  Membran spermatozoa mamalia rentan teroksidasi oleh keberadaan ROS dikarenakan kaya akan asam lemak tak jenuh [12]. Reaksi rantai peroksidasi lipid ini berlangsung terus menerus (autokatalitik) karena setiap reaksi menghasilkan radikal bebas baru yang mengakibatkan reaksi peroksidasi lipida baru hingga akhirnya merusak seluruh membran plasma sel spermatozoa [13]. Peroksidasi lipid dapat menyebabkan terjadinya perubahan fungsi membran yang berakibat terhadap penurunan metabolisme sperma, morfologi sperma, motilitas sperma dan fertilitas [14].

  Malondiladehid (MDA) adalah suatu senyawa aldehid hasil dari peroksidasi lipid yang bersifat toksik terhadap sel. Senyawa MDA menyebabkan kerusakan membran spermatozoa dan penurunan integritas membran spermatozoa sehingga terjadi penurunan kualitas sperma [15]. Hasil penelitian Chen et al. (16) menunjukkan bahwa lama penyimpanan semen dalam kondisi beku berpengaruh terhadap kadar MDA. Penyimpanan selama 73 bulan menunjukkan kadar MDA lebih tinggi ( 3.22 ±0.05nmol/ mgprot) dibandingkan penyimpanan 26 bulan (2.48 ± 0.19) dan 13 bulan (2.06 ± 0.16).

  METODE PENELITIAN Sampel Penelitian

  Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 5 semen yang dibekukan selama 2 bulan dan 5 semen yang dibekukan selama 3 bulan sapi Limousin yang dikoleksi dari Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB) Singosari, Malang.

  Evaluasi Viabilitas Spermatozoa Setelah Pmebekuan

  Viabilitas sperma pada penelitian ini diketahui dengan menggunakan metode berdasarkan [17] Partodiharjo (1992). Satu tetes semen diteteskan pada gelas objek dan ditambahkan satu tetes larutan eosin negrosin. Dilakukan smear dan ditutup dengan kaca penutup untuk kemudian diamati dengan menggunakan mikroskop perbesaran 400x. Diamati kurang lebih 200 spermatozoa dan dihitung spermatozoa yang hidup (tidak menyerap warna) dan spermatozoa yang mati (menyerap warna) kemudian dihitung persentasenya.

  Analisis Kadar MDA Preparasi untuk Memisahkan antara Spermatozoa dan Seminal Plasma

  Semen beku yang akan dipreparasi terlebih dahulu di thawing yaitu dengan cara dimasukkan ke dalam water bath yang berisi air bersuhu 37-380C selama 15 detik. Digunting kemasan semen beku pada ujung dan juga sedikit pada bagian tengahnya, kemudian diteteskan pada tube[18]. Untuk memisahkan antara seminal plasma dengan spermatozoa pada semen beku dilakukan dengan cara sentrifugasi pada 1800 x g selama 10 menit dan diresuspensi dalam 2 ml phosphat buffered saline (PBS pH 7,2) [19].

  Pembuatan Kurva Standar MDA

  Pembuatan kurva standar MDA yaitu dengan 100ul kit MDA dengan konsentrasi 0,1,2,3,4,5,6,7,8 mg/ml kemudian ditambahkan 550 ml akuades dan 100ul asam trikloroasetat 20% dan dilakukan homogenasi selama 30 detik. Kemudian ditambahkan dengan 250ul HCL 1N, dihomogenkan, ditambah 100ul natrium thiobarbiturat 1%, dihomogenkan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 500 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil diinkubasi pada penangas air 1000C selama 30 menit, dibiarkan pada suhu ruang. Sampel yang berubah warna diamati dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 533 nm. Diperoleh nilai absorbansi standar dan kurva standar MDA [20].

  Penghitungan Kadar MDA Spermatozoa

  2 Bulan 0,0777±0,008 64±1,29

  Hubungan Antara Viabilitas dan Kadar MDA

  dan fungsi sel. Membran akan kehilangan permeabilitasnya sehingga menye-babkan terlepasnya banyak komponen seluler diantaranya lipid, protein dan ion [24]. Hal ini menyebabkan spermatozoa rentan terhadap serangan oksidatif dikarenakan besarnya jumlah asam lemak tak jenuh pada membrannya [25]. Selain itu seminal plasma sebagai sumber utama antioksidan untuk mekanisme pertahanan telah terpapar pada kondisi aerobik selama proses sebelum pembekuan. Sperma akan memiliki sedikit antioksidan untuk menjaga dari aktivitas ROS yang tidak menguntungkan. Sehingga mengakibatkan terjadinyastress oksidatif dan mengawali adanyaperoksidasi lipid yang hasilnya dapat diketahui melalui terbentuknya MDA [26]. Peroksidasi lipid (pembentukan MDA) berkorelasi positif dengan abnormalitas sel yang dapat dilihat dari morfologi dan motilitasnya [27].

  cold shock akan menyebabkan kerusakan struktur

  Waktu penyimpanan sperma berpengaruh signifikan pada kualitas sperma setelah thawing [16]. Tingginya kadar MDA spermatozoa dan seminal plasma setelah pembekuan diakibatkan oleh aktivitas ROS yang menyerang lipid pada membran spermatozoa pasca thawing. Adanya

  (24 jam) 0.33±0.11 nmol/50 x 10 ⁶ spermatozoa.

  3 Bulan 0,0919±0,016 45,0±1,40 Penelitian sebelumnya oleh Partyka et al. [23] berpendapat bahwa kadar MDA spermatozoa pada semen segar ayam hutan adalah 0.28±0.11 nmol/50 x 10 ⁶ spermatozoa dan pada semen beku

  Viabilitas spermatozoa (nM) (%)

  Kadar MDA spermatozoa diketahui dengan cara uji TBA menurut Serafini-Cessi dan Cessi (1968) yang telah dimodifikasi oleh Morte et al. [21]. Masing-masing tube hasil preparasi (spermatozoa) sebanyak 450µl ditambahkan 2ml reagen TTH (18,8 ml TCA 40% dingin, 28,7 ml TBA 1%, 0,25N HCl). Campuran spermatozoa dan reagen TTH dipanaskan dalam penangas air bersuhu 100oC selama 10 menit. Setelah dingin, disentrifugasi pada 1500x g selama 10 menit. Sampel yang telah berubah warna selanjutnya diamati dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm.

  Lama pembekuan Kadar MDA Spermatozoa

  Tabel 1. Kadar MDA Spermatozoa

  1. Kadar MDA spermatozoa pada semen yang dibekukan selama 2 bulan adalah 0,0777±0,008 nM dan 3 bulan adalah 0,0919±0,016 nM. Berdasarkan hasil yang didapatkan, kadar MDA spermatozoa yang dibekukan selama 2 bulan berbeda dengan yang dibekukan selama 3 bulan, namun hasil analisis statistika menunjukkan perbedaan yang tidak signifikan(p<0,05). Hasil berbeda ditemukan pada hasil penelitian sebelumnya [22] bahwa pada pembekuan 0 jam kadar MDA spermatozoa adalah 99,83±2,69 (nM/10 ⁹ ) dan kadar MDA seminal plasma 191.98±11.58 nM yang meningkat tajam setelah 96 jam pembekuan. Hal ini menunjukkanbahwa lama pembekuan akan berpengaruh terhadap kadar MDA.

  Pengukuran kadar MDA spermatozoa pada semen dengan pembekuan 2 bulan dan 3 bulan ditunjukkan pada tabel

  HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Lama Pembekuan pada Viabilitas Spermatozoa

  Data berupa kadar MDA dan viabilitas diuji statistika dengan menggunakan uji-t berpasangan dengan taraf nyata 5% dan korelasi pearson menggunakan program SPSS 16.0.

  Analisa Statistik

  Persentase viabilitas spermatozoa dapat dilihat dari jumlah spermatozoa hidup dibandingkan dengan spermatozoa yang mati dari 200 spermatozoa. spermatozoa hidup memiliki kepala spermatozoa yang berwarna putih sedangkan spermatozoa mati diketahui dengan melihat kepala spermatozoa berwarna ungu setelah diwarnai dengan eosin-negrosin (Gambar 1). Hal ini disebabkan oleh membran kepala spermatozoa yang telah mati mengalami kerusakan sehingga permeabel terhadap pewarna eosin-negrosin [28].

  Gambar 1. Spermatozoa dengan Pewarnaan Eosin-Negrosin, Perbesaran 400x Keterangan: (A) Spermatozoa hidup

  (B) Spermatozoa mati

  Viabilitas sperma semen beku dengan lama pembekuan 2 bulan dan 3 bulan setelah thawing ditunjukkan pada tabel 1. Dari tabel 1 dapat terlihat bahwa viabilitas spermatozoa semen beku dengan lama pembekuan 2 bulan dan 3 bulan tidak signifikan, yakni 64±1,29 nM pada semen beku 2 bulan dan pada semen beku 3 bulan sebesar 45,0±1,40 nM. Hasil analisis dengan menggunakan SPSS 16.0 menunjukkan bahwa terdapat korelasi negatif antara viabilitas dan kadar MDA spermatozoa. Semakin tinggi viabilitas, semakin rendah kadar MDA spermatozoa. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Guthrie dan Welch [29] yang membuktikan bahwa terdapat korelasi negatif antara viabilitas sperma dan kadar MDA semen babi.

  Hasil penelitian sebelumnya oleh Martorana dan Kelly [30] membuktikan bahwa semakin besar motilitas dan viabilitas sperma menunjukkan semakin kecil peroksidasi lipid yang terjadi. Hal tersebut mengindikasikan ketidaksesuaian dengan data yang terdapat pada tabel 1. Viabilitas spermatozoa pada semen yang dibekukan selama 2 bulan dan semen yang dibekukan selama 3 bulan menunjukkan tidak adanya perbedaan secara signifikan. O'Connell et al. [5] membuktikan bahwa proses pembekuan dan thawing pada sperma manusia dapat menyebabkan menurunnya morfologi sperma, motilitas dan viabilitas.

  Pembekuan semen menyebabkan kerusakan ultrastruktural, biokemikal dan fungsional pada spermatozoa [31]. Berbagai organel sperma diketahui rentan terhadap efek pembekuan diantaranya terjadinya perubahan fungsi mitokondria, kegagalan dekondensasi kromatin dan induksi reaksi akrosomal dini oleh karena perubahan permeabilitas membran plasma, sehingga dapat berpengaruh pada viabilitas dan fertilitas sel sperma [32]. Terjadinya kerusakan ini oleh karena terbentuknya kristal es ekstraseluler dari air dalam medium pembekuan semen.

  Pembentukan kristal es ekstraseluler ini dapat meningkatkan konsentrasi terlarut diantaranya gula, garam dan protein. Terjadinya tekanan gradien osmotik ini menyebabkan air dalam spermatozoa akan dikeluarkan dari bagian kepala melewati plasma membran semi-permeabel disebabkan air dalam spermatozoa lebih lambat membentuk kristal es daripada air dalam medium sehingga mengakibatkan spermatozoa menjadi dehidrasi [33].

  Plasma membran spermatozoa rentan terhadap peroksidasi lipid oleh aktivitas ROS. Proses peroksidasi lipid ini terjadi pemecahan asam lemak tak jenuh (PUFA) sebagai penyusun terbesar membran plasma yang mengelilingi sel dan organel sel. PUFA terutama terletak dalam fosfolipid membran plasma spermatozoa dan rentan terhadap serangan ROS [34]. Untuk menanggulangi efek kerusakan dari ROS, berbagai macam antioksidan telah tersedia dalam seminal plasma dan spermatozoa [35].

  KESIMPULAN

  Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa pembekuan semen selama 2 bulan dan 3 bulan menunjukkan tidak adanya perbedaan kadar MDA secara signifikan. Terdapat korelasi negatif antara viabilitas dan kadar MDA spermatozoa. Semakin kecil viabilitas spermatozoa, semakin besar kadar MDAnya.

UCAPAN TERIMA KASIH

  Terima kasih kepada pihak Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB) Singosari yang telah memberikan izin melakukan koleksi semen.

DAFTAR PUSTAKA

  [1] ISAA. 2013. Pocket K No. 40: Biotechnology for the Livestock Industry .http://www.isaaa.org/resources/publications

  /pocketk/40/default.asp. Diakses pada tanggal 24 Desember 2013. [2] Said, S., Gunawan M., Kaiin E.M. dan Tappa

  Biologyand Medicine . 21:495–504

  Sandra G. and Joao R.S. 2008. The Quantification of Lipid and Protein Oxidation in Stallion Spermatozoa and Seminal Plasma: Seasonal Distinctions and Correlations With DNA Strand Break.

  Differential Incorporation of Fatty Acids In to and Peroxidative Loss of Fatty Acids from Phospholipids of Human Spermatozoa Mol. Reprod. Dev. 42:334-345. [21] Morte, M.I., Ana M.R., Diana S., Ana S.R.,

  [19] Mossa M.M., Dkhel Haussin H. and Azzawi M.H. 2011. The effect of oxidative stress on semen parameters of normal & infertile men in Tikrit city. Tikrit Medical Journal. 17(1):1-10. [20] Alvarez, J.G. and Storey B.T. 1995.

  Veterinary Medica . vol 6(1): 69-74.

  Kualitas Semen Beku Kambing Peranakan Etawa dalam Berbagai Macam Pengencer.

  Jakarta. [18] Rosida A., Husni A., Sri H. dan Pudji S. 2013.

  [17] Partodihardjo, S. 1992. Ilmu Reproduksi Hewan. Ed. Ke-3. Mutiara Sumber Widya.

  major ) sperm. Cryobiology. 61:189-193.

  [16] Chen Y.K., Qing Hua Liu, Jun Li, Zhi Zhong Xiao, Shi Hong Xu, Xue Hui Shi and Dao Yuan Ma. 2010. Effect of long-term cryopreservation on physiological characteristics, antioxidant activities and lipid peroxidation of red seabream (Pagrus

  Endocrinol 2 : 12-19.

  [15] Sanocka D. and kurpisz M. 2004. Reactive oxygen species and sperm cells. Reprod Biol

  1994. Molecular Biology of Human Male Infertility: Links with Aging, Mitochondrial Genetics and Oxidative Stress. Mol Reprod Dev . 37:345-62.

  [14] Cummins, J.M., Jequier A.M. and Kan R.

  [13] Holt, W.V. 2000. Basic Aspects of Frozen Storage of Semen. Animal Reproduction Science, v.62. p.3-22. http://www.ejpau.media.pl/volume10/issue2 /art-08.html. Diakses pada tanggal 16 Juli 2014.

  [12] Aitken, R.J., Buckingham D.W., Carreras A. and Irvine D.S. 1996. Superoxide dismutase in human sperm suspensions: relationships with cellular composition, oxidative stress and sperm function. Free Radical

  B. 2005. Daya Tahan Sperma Cair Sapi Simental yang Disimpan dalam Straw pada Temperatur 5°C. Pusat Penelitian Bioteknologi. LIPI. Buletin Peternakan.

  Recent Advances in Boar Semen Cryopreservation.Society of Reproduction and Fertility Supplement . 66:51–66.

  [11] Rath, D., Bathgate R., Rodriguez-Martinez H., Roca J., Strzezek J. and Waberski D. 2009.

  C. 1999. Nitric Oxide Regulates Human Sperm Capacitation and Protein-Tyrosine Phosphorylation in Vitro. Biology of Reproduction 61. 575–581.

  [10] Herrero, M.B., de Lamirande E. and Gagnon

  [9] Awda, Basim J, Meghan Mackenzie-Bell and Marry M. Buhr. 2009. Reactive Oxygen Species and Boar Sper Function. Journal Biolreprod . 81:553 – 561.

  Bearing Spermatozoa. In Reproduction in Farm Animal. 8th ed. Lea and Febiger Philadelphia. USA.

  33 (6): 1371-1378. [8] Hafez, E.S.E. 2004. X-and Y-Chromosome-

  Cryopreservation of Human Spermatozoa Decreases the Number of Motile Normal Spermatozoa, Induces Nuclear Vacuolization and Chromatin Decondensation. Journal of Andrology, Vol.

  [7] Boitrelle F., Martine A., Claire T., Fatma F., Marianne B., Franc, Ois V., Robert W., Marc B. and Jacqueline S. 2012.

  17(3): 704-709. [6] Toelihere. M. R.1993. Inseminasi Buatan Pada Ternak. Penerbit Angkasa. Bandung.

  2002. The Effects of Cryopreservation on Sperm Morphology, Motility and Mitochondrial Function. Hum.Reprod.

  [5] O'Connell, M., N. McClure and S.E. Lewis.

  vitrofertilization, transfer embrio dan pembekuan embrio. PAU-IPB, Bogor.

  16:58-73. [3] BSN. 2014. Semen beku - Bagian 2: Kerbau. http://sisni.bsn.go.id/index.php?/sni_main/sn i/detail_sni/7785. Diakses pada tanggal 20 Agustus 2014. [4] Supriatna, I., dan F. Pasaribu. 1992. In

  Animal Reproduction Science. 106 :36–47.

  [22] Kumaresan, A., G. Kadirvel, K.M. [32] Watson P.F. 2000. The causes of reduced Bujarbaruah, R.K. Bardoloi, Anubrata Das, fertility with cryopreservation semen.

  Satish Kumar and S. Naskar. 2008. Animal Reproduction Science 60–61:481– 492. Preservation of boar semen at 18◦C induces lipid peroxidation and apoptosis like [33] Andrabi S.M.H. 2007. Fundamental principles changes in spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. of cryopreservation of Bos taurus and Bos doi:10.1016/j.anireprosci.2008.01.006. indicus bull spermatozoa. Mini review. Int.

  Diakses pada tanggal 8 Mei 2014. J. Agri. and Biol . 9:367-369 [23] Partyka, Agnieszka, Ewa Łukaszewiczb, and [34] Drevet J.R. 2006. The antioxidant glutathione

  Wojciech Niza˙ nski. 2012. Lipid peroxidase family and spermatozoa: a Peroxidation and Antioxidant Enzymes complex story. Mol Cell Endocrino. 250: Activity in Avian Semen. Animal 70–79.

  Reproduction Sci. [35] Lewis, S. E., Sterling, E. S., Young, I. S. and

  http://dx.doi.org/10.1016/j.anireprosci.2012. Thompson, W. 1997. Comparison of 07.007. Diakses pada tanggal 8 Mei 2014. individual antioxidants of sperm and [24] Amann, R.P. 1999. Cryopreservation of seminal plasma in fertile and infertile men. sperm. Encyclopedia Reprod. 1(7):73–83. Fertility and Sterility . 67:142–147 [25] Maldjian, A., Pizzi F, Gliozzi T, Cerolini S. and Penny P. 2005. Changes in sperm quality and lipid composition during cryopreservation of boar semen.

  63(2): 411–421.

  Theriogenology.

  [26] Foote, R.H., Brockett, C.C. and Kaproth, M.T.

  2002. Motility and fertility of bull sperm in whole milk extender containing antioxidants. Anim Reprod Sci. 71(1-2):13- 23. [27] Gomez, E., Irvine, D.S. and Aitken, R.J. 1998.

  Evaluation of a spectrophotometric assay for the measurement of malondialdehyde and 4- hydroxyalkenals in human spermatozoa: relationships with semen quality and sperm function. Int. J. Andro. 21:81–94. [28] Garner, D.L. & E.S.E Hafez. 2000.

  Spermatozoa and Seminal Plasma. In: Reproduction in Farm animals. 7th Ed. Hafes E.S.E & B Hafez (Eds). Williams & Wilkins: Baltomore. [29] Guthrie, H.D. and Welch, G.R. 2012. Effects of reactive oxygen species action on sperm function in spermatozoa. Theriogenology. 78(8):1700-1708. [30] Martorana and Kelly, M.S. 2014. Oxidative

  Studies in Cryopreserved Mammalian Spermatozoa. Dissertation and Thesis. http://gradworks.umi.com/15/53/1553358.ht ml. Diakses pada tanggal 19 Juli 2014. [31] Leboeuf, B., Restall, B. and Salamon, S.

  2000. Production and storage of goat semen for artificial insemination. Anim. Reprod.

  Sci. 6 :113-141.