Eksplorasi dan Pengembangan Bakteri Asam Laktat Isolat Lokal Sumatera Utara sebagai Biokontrol Bakteri Patogen pada Budi Daya Ikan Air Tawar

- - - - -

-------

LAPORAN AKHIR PENELITIAN
HmAH BERSAING

EKSPLORASI DAN
ASAM
LAKTAT ISOLAT LOKAL SUMATERA UTARA SEBAGAI
BIOKONTROL BAKTERIPATOGEN PADA lKAN AIR TAWAR

Tabuo ke-2 dari reocaoa 2 tabuo

Ketua

: Dr. It Jamilah, M.Sc.
NIDN: 0012106305

Aoggota: Prof. Dr. Dwi Suryaoto
NIDN: 0009046404

Dibiayai oleh DIPA Direktorat Penelitian Pengabdian Pada Masyarakat Tahun
Anggaran 2015, sesuai dengan Surat Petjanjian Penugasan Pelaksanaan Hibah
Penelitian Bagi Dosen Perguruan Tinggi Batch I USU Nomor:
120/SP2HIPLlDit.LitabmasIII12015, tanggal 05 Pebruari 2015

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
Oktober, 2015

HALAMAN PENGESAHAN
: Eksplorasi dan Pengembangan Bakteri Asam Laktat Isolat
Lokal Sumatera Utara sebagai Biokontrol Bakteri Patogen
pada Budi Daya Ikan Air Tawar

Judul

PenelitilPelaksana
Nama Lengkap
Perguruan Tinggi
NIDN

Jabatan Fungsional
Program Studi
NomorHP
Alamat sure1 (e-mail)
Anggota (1)
Nama Lengkap
NIDN
Perguruan Tinggi
Institusi Mitra (jika ada)
Nama Institusi Mitra
Alamat
Penanggung Jawab
Tahun Pelaksanaan
Biaya Tahun BeIjalan
Biaya Keseluruhan

:
:
:
:

:
:
:

Dra. IT JAMILAH M.Sc.
Universitas Surnatera Utara
0012106305
Lektor
Biologi
081387839793
itjamilah@yahoo.com

: DWI SURYANTO
: 0009046404
: Universitas Sumatera Utara

: Tahun ke 2 dari rencana 2 tahun
: Rp 61.000.000,00
: Rp 132.000.000,00

Mengetahu'
Dekall FMIP -USU

(Dr. Suta . . ?fl, M.Sc.)
NIP/NIK·196310261991 031 00 1

Copyright(c): Ditlitabmas 2012. 1lpdaled 2015

Me/ian, Sumatera Utara, 1 - 12 - 2015
Ketua,

4k

(Dra. IT JAMILAH M.Sc.)
ｎｉｐｾｋＱＹＶＳＰＲ＠

DAFTARISI

Halaman

HALAMAN SAMPUL ............................................................................................... .
LEMBAR PENGESAHAN .........................................................................................

11

RINGKASAN ........ ........... ................. ........................................................ .... ..... .......

111

PRAKATA..................................................................................................................

IV

DAFTAR lSI ............................................................................................................... v
DAFTAR TABEL ....................................................................................................... vi
DAFTAR GAMBAR .................................................................................................. vi
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... .................... vii
BAB 1. PENDAHULUAN.......................................................................................... 1
BAB 2. TINJAUANPUSTAKA ................................................................................. 4
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN ................................................... 9

BAB 4. METODE PENELITIAN .............................................................................. 10
BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................... 16
BAB 6. RENCANA T AHAP BERIKUTNYA....... ............... ...................... ....... ....... 25
BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................................... 26
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 27
LAMPIRAN ............................................................................................................... 31

vi

PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah Tuhan Yang Maha Esa, penelitian ini dapat
dilaksanakan sampai selesai. Penelitian ini merupakan penelitian Tahap II (tahun ke-2)
dari 2 tahun yang direncanakan. Eksplorasi isolat-isolat bakteri lokal Indonesia sangat
dianjurkan untuk digali dan dilihat karakteristiknya. Hal ini dapat dijadikan landasan
dasar baik untuk konservasi keanekaragaman hayati, iklim dan pemanfatanya dalam
pertanian, industri dan kesehatan. Kelompok bakteri asam laktat (BAL) sudah sangat
banyak dilaporkan merupakan bakteri-bakteri yang sangat bermanfaat atau sering
disebut "bakteri haik" atau bakteri «probiotik". Awalnya pemanfaatanya lebih terfokus
terhadap kesehatan manusia kemudian ke hewan, tetapi tiga dekade terakhir sudah

dilaporkan probiotik juga berperan besar dalam mendukung kehidupan di lingkungan
budi daya perairan (akuakultur). Aplikasi probiotik pada akuakultur berbeda dengan
pada manusia dan hewan teresteria1. Penelitian ini merupakan salah satu upaya mencari
isolat-isolat BAL yang akan dimanfaatkan sebagai biokontrol pada lingkungan
akuakultur, untuk mendukung produksi ikan budi daya air tawar di Indonesia umumnya
dan Sumatera Utara khususnya.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kementrian Ristek-Dikti yang telah
menggagas dan mendukung proyek ini, selanjutnya kepada Universitas Sumatera Utara
khususnya Lembaga Penelitian yang sudah bekeIja keras melakukan pengarahan dan
pengawasan terhadap pelaksanaan penelitian ini.

Selanjutnya kepada semua pihak

yang telah membantu terlaksananya penelitian ini, penulis mengucapkan terima kasih
dan mohon maaf jika terdapat kekurangan dari kami.
Akhimya penuJis berharap semoga laporan penelitian ini dapat bermanfaat
walaupun masih banyak kekurangan. Penulis sedang berusaha menulis artikel ilmiah
yang baik untuk dapat diterbitkan di jurnal bereputasi haik.

Medan,l Desember 20] 5

Pe.nulis

jA
ｊｹＯＱＩｾ＠
------/

It Jamilah

v

('--

L. plan/arum dilakukan terhadap bibit ikan Nila in vitro. Produk penelitian tahap-2 ini

ialah model kapsul probion untuk budi daya ikan air tawar.
Hasil penelitian menunjukan bahwa bola kapsul yang dihasilkan berukuran d=
2.0-5 mm, warna krem keputihan, tekstur kenyal. Jumlah sel terperangkap ± 9 log
CFU/ml/gram kapsul. Pengeringan kapsul selama 4 jam pada suhu 40 DC masih dapat

mempertahankan viabilitas sel dalam kapsul sekitar 8 log CFU/ml. Setelah itu viabilitas

mulai menurun. Penyimpanan kapsul pada suhu ruang dan suhu 4 DC

( dalam

refrigerator) selama 4 minggu dapat mempertahankan sel probiotik hingga 85-90%.
Kontaminasi kapang tidak ditemukan selama penyimpanan, namun ditemukan ragi pada
penyimpanan pada suhu ruang (28°C) mulai minggu ke-3 sampai minggu ke-4 dalam
jumlah yang sangat rendah (1,0 -1,5 log CFU/ml/g bola kapsul).

Kecepatan

Pembebasan sel dari kapsul pada simulasi pH usus (PBS pH 7.4) mulai 30 menit
sebanyak 45-50% dan maksimal pada jam ke 2,5 dan ke-3, setelah itu stabil sampai 4
jam (±100%). Kapsul sinbiotik dapat melindungi sel dari pH asam lambung dan
membebaskan sel pada pH cairan usus. Kapsul sinbiotik yang diperoleh sangat
berpotensi dapat digunakan sebagai probiotik pada budi daya perikanan air tawar.

iv

RlNGKASAN

Perkembangan penyakit bakteri pada sistim budi daya ikan dapat menurunkan
produksi ataupun kualitas produk perikanan. Tingkat pencemaran air pada budi daya
perikanan oleh berbagai limbah masih sangat tinggi di Indonesia. Sistim budi daya
perikananan intensif, dapat pula berdampak negatif terhadap tingginya polutan organik
di air, karena pasokan pakan hampir 100% dari luar kolam. Pakan yang sebagian besar
terdiri atas protein dapat memacu perkembangan bakteri patogen di perairan.
Isolat BAL lokal Sumatera Utara yang diisolasi dari lingkungan kolam ikan Nila
yaitu Lactobacillus aCidophilus, Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus agi/is
dilaporkan potensial dalam menghambat perkembangan bakteri patogen ikan air tawar
berturut-turut Aeromonas hydrophila (Harahap et al. 2013), Streptococcus agalactiae
(Mayasari et al. 2013) dan Mycobacterium fortuitum (Sitepu et al. 2013). Tiga laporan
di atas merupakan sebahagian penelitian Tahap I dari penelitian ini. Selain itu telah
diperoleh pula dua isolat BAL lokal Sumatera Utara yang potensial dalam menghambat
patogen ikan yang diisolasi dari ikan Mas (kode UMl) dan ikan Gurame (Kode SP 7)
yang masing-masing menghambat patogen Aeromonas salmonicida dan Edwarsiella
tarda dengan zona hambat 8 mm dan 8.15 mm pada uji tantang in vitro. Kedua isolat

ini diidentifikasi berdasarkan sekuen gcn 16S rRNA (Hasil sekuen belum membcrikan
hasil yang memuaskan dan sedang dilakukan pengulangan, hasil akan diterbitkan dalam
artikel).

Teknologi enkapsulasi probiotik dapat meningkatkan ketahanan atau viabilitas
sel probiotik selama proses penyimpanan maupun aplikasi. Tujuan penelititian ini ialah
mengembangkan teknologi enkapsulasi terhadap sel BAL potensial probiotik yang
sudah diperoleh pada tahun I; Lactobacillus plantarum, L. agilis, isolat UMI dan Sp7
dengan bahan kalsiurn alginat, penyalut tambahan tepung gum Arab dan atau susu skim
dan penambahan prebiotik (tepung inulin). Produk ini dikenal sebagai "sinbiotik".
Selanjutnya dilakukan karakterisasi kapsul simbiotik dan uji viabilitasnya selama masa
pengeringan, penyimpanan pada suhu ruang dan 4°C, melihat waktu pembebasan sel,
dan ketahanan sel pada simulasi kond;si pH asam lambung (pH 2), dan pH cairan usus
(pH 6,8). Selain itu dilihat juga tingkat kontaminasi kapang/khamir selama
penyimpanan. Uji patogenitas dan potensi sebagai agen biokontrol dari isolat

iii

BABI. PENDAHULUAN
Penyakit ikan yang ditimbulkan akibat serangan bakteri patogen merupakan
salah satu permasalahan serius karena sangat berpotensi menimbulkaan kerugian yang
besar. Penurunan tingkat produksi, kualitas bahkan kegagalan panen akibat kematian
dapat teIjadi. Moti! Aeromonas Septicemia (MAS) merupakan penyakit ikan yang
disebabkan oleh bakteri

Aeromonas merupakan rnikroorganisme yang banyak

ditemukan pada perairan tawar terutarna yang mengandung bahan organik tinggi
(Ayuningtyas, 2008). Bakteri ini dapat menginfeksi banyakjenis ikan air tawar seperti
Catfish, Cyprinidae, Cichlidae, Rainbow trout, Salmodae, katak, siput dan udang air.

Selain itu bakteri patogen penyebab penyakit ikan ialah Streptococcus agalactiae yang
menyebabkan penyakit streptococcosis (Taukhid, 2009).
Laporan penelitian tentang usaha untuk mengatasi perkembangan bakteri
patogen pada sistim akuakultur sudah banyak dilakukan, salah satunya adalah dengan
pemanfaatan bakieri probiotik (Veschuere et af. 2000). Pengkajian bakteri probiotik
telah dilakukan dalarn berbagai disiplin ilmu rnikrobiologi, mulai dari eksplorasi dan
penapisan (Widiyanto et al. 1998, Widiyanto 2005, Laloo et af. 2007, Jamilah et af
2009, Jamilah & Nunuk 2012), rekayasa (Widanarni et af. 2005), karakterisasi (Vmar et
af.2001, Jamilah 2011 dan aplikasi (Wang et al. 1998, Vaseharan & Ramasamy 2003,

ZiaiNejad et af. 2006, Zhou et af. 2009).
Pemanfaatan probiotik pada sistim akuakultur berbeda dengan pada manusia
dan hewan teresterial. Pada inang ini probiotik diaplikasikan pada saluran pencemaan
sedangkan pada budi daya perairan probiotik diaplikasikan pada air, permukaan tubuh
hewan, maupun melalui makanan (Verschuere et al. 2000). Aksi bakteri probiotik pada
akuakultur dapat melalui beberapa cara (i) menghasilkan senyawa antimikrob, (ii)
kompetisi senyawa kimia, atau energi tersedia (iii) kompetisi daerah pelekatan, (iv)
memacu respon imun, (v) meningkatkan kualitas air, (vi) interaksi dengan fitoplankton,
(vii) sllmber makro dan mikronutrient dan (viii) kontribusi enzimatik untuk pencernaan.
Kehadiran bakteri penghasil senyawa antimikrob di usus, media kultur, pennukaan
tubuh memberikan perlindungan terhadap perkembangan patogen maupun oportunis
(Veschuere et af. 2000).

Bakteri asam laktat (BAL) dikenal sebagai salah satu bakteri probiotik yang
umumnya digunakan untuk pemerosesan makanan dari bahan susu, sayuran, daging,
dan ikan. Saat ini BAL tidak hanya dikenal sebagai probiotik pada usus hewan dan
manusia tetapi juga dapat berperan sebagai probiotik pada sistim budi daya air
(akuakultur) (Veschuere et aZ. 2000). Bakteri Asam Laktat (BAL) dikenal sebagai
bakteri probiotik yang salah satu perananya sebagai agen biokontrol patogen. Efektifitas
BAL sebagai probiotik di perairan sudah banyak dilaporkan (Gracia de la Banda et al.
1992; Gatesoupe 1991; Harzevelli et al. 1998). BAL berpotensi memproduksi senyawa
antibakteri seperti bakteriosin yang potensial menjadi biopreservatif yang menghambat
mikroorganisme patogen yang berbahaya (Savadogo et aI., 2006). Hasil penelitian
Wardani (2013) menunjukkan bahwa bakteri Lactobacillus dan Micrococcus mampu
mengbambat Vibrio aZginolyticus sehingga mampu memproteksi ikan bandeng melalui
mekanisme produksi senyawa antibakteri. Hasil penelitian Ratentondok (2011 )
menunjukkan bahwa udang windu mempunyai beberapa macam bakteri di dalam
salman pencemaannya dimana berdasarkan uji in vitro diperoleh tiga isolat potensial
bakteri sebagai agen probiotik yang memiliki daya hambat terhadap perkembangan V.

harveyi, yakui bakteri dari genus Bacillus, Lactobacillw; dan Staphylococcus.
Teknologi mikroenkapsulasi sudah digunakan secara luas untuk melindungi
mikroorganisme, sel maupun jaringan dari degradasi lingkungan maupun fisiologi.
Mikroenkapsulasi dapat meningkatkan ketahanan atau viabilitas sel probiotik selama
proses penyimpanan maupun aplikasi. Teknik yang tersedia untuk imobilisasi sel hidup
ialah penjeratan dalam bola-bola kalsium alginat yang sering dilakukan terhadap bakteri
asam laktat (Chandramouli et al. 2004). Alginat tidak toksik terhadap sel yang
diimobilisasi, dan sudah diterima sebagai zat tambahan pada makanan (Prevost dan
Divies, 1992).
Enkapsulasi adalah proses dimana bahan aktif (contoh probiotik) dijerat atau
dibungkus dengan bahan matrik (mis. protein dan/polisakarida) (Risch 1995). Probiotik
yang digabung dengan bahan prebiotik pada enkapsulasi dapat meningkatkan ketahanan
sel dalam simulasi asam lambung (Wood 2010). Bahan yang membentuk bungkus
disebut dengan bahan penyalut, membran atau jaket. Hidrokoloid adalah bahan
penyalut yang sering digunakan untuk makanan (Roberfroid 2000; Anal & Singh 2007).
Bahan alami lebih disukai untuk membuat pembungkus bahan aktif (sel probiotik)

untuk makanan terdiri atas pati, maltodekstrin, tepung gum (Arabic gum), selulosa,
gelatin, karagenan, alginat ect. (Sheu & Marshall, 1993).

Tujuan penelititian ini ialah : mengembangkan teknologi enkapsulasi terhadap sel BAL
potensial menghambat patogen (penelitian Tahap I) yang ditambahkan dengan prebiotik
(sinbiotik) dan karakterisasi kapsul simbiotik untuk uji viabilitasnya selama masa
pengeringan, penyimpanan pada suhu ruang dan 4°C, mengetahui waktu pembebasan
sel, dan melihat ketahanan sel pada simulasi kondisi pH lambung (asam) dan usus
(netral). Produk tahap ke-2 penelitian ini ialah model kapsul probion untuk budi daya
ikan air tawar. Metode enkapsulasi sel BAL terpilih dilakukan dengan penambahan
konsentrasi sel dengan bahan prebiotik (tepung inulin), bahan penyalut tambahan
(tepung gum atau susu skim) kemudian ditambahkan kalsium alginat (Reyed, 2007
dengan modifikasi penambahan prebiotik). Kapsul sinbiotik kemudian dikarakterisasi
sesuai kondisi aplikasi penyimpanan (suhu, kadar air dan tingkat pencernaranjamur).

Bakteri Asam Laktat (BAL)
Bakteri asam laktat adalah sejumlah bakteri Gram positif, tidak membentuk
spora, memproduksi asam laktat sebagai hasil akhir fermentasi glukosa. Bakteri asam
laktat bersifat katalase negatif. Fermentasi glukosa dibedakan dalam dua jalur utama
yaitu glikolisis (Embden-Meyer Pathway) yang menghasilkan produk akhir asam laktat
secara keseluruhan (homofermentatif) dan jalur 6-phosphogluconatl phosphoketolase
yang juga menghasilkan sejumlah besar produk akhir lainnya, seperti etanol, asam
asetat dan CO2 . Beberapa genus penting yang tergolong dalam bakteri asam laktat
antara lain Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Paralactobacillus, Pediococcus, Streptococcus dan Weissella (Leistner, 2000). Genus
Leuconostoc dan beberapa spesies anggota genus Lactobacillus dikategorikan dalam

jenis heterofermentatif obligat (Caplice and Fitzgerald, 1999), bakteri genus ini
mendegradasi heksosa menjadi asam laktat dan produk sampingan lainnya seperti asam
asetat, etanol, CO2, H20 2 dan bakteriosin serta mendegradasi pentosa menjadi asam
laktat dan asam asetat (Lyhs et al. 2002).
BAL mampu memproduksi substansi antimikroba yang dapat menekan
pertumbuhan bakteri patogen. Selain itu BAL memiJiki kemampuan untuk menempel
pada sel epitel usus, serta akan teIjadi peningkatan sel lempengan peyer sebagai
indikasi tersekresinya

immunoglobulin (lgA) yaitu suatu reaksi terbentuknya

kekebalan terhadap infeksi bakteri (Salminem et at. 2004). Bakteri asam laktat tersebar
sebagai mikrobiota normal pada usus

beberapa jenis ikan (Ringo and Gatesoupe,

1998). Mikrobiota di usus dapat mempengaruhi pertumbuhan dan kesehatan ikan.

Bakteri ini dikarakterisasi sebagai bakteri Gram positif, tidak bergerak (non motd),
tidak menghasilkan spora dan memproduksi asam laktat sebagai produk utama
fermentasi di dalam proses metabolisme (Azizpour, 2009). Senyawa metabolit yang
dihasilkan

diantaranya

memiliki

kemampuan

penghambatan

pertumbuhan

mikroorganisme lainnya yang dikenal dengan senya.va antimikroba. Selain asam laktat
bakteri ini juga menghasilkan beberapa komponen antimikroba yaitu karbondioksida,
hidrogen peroksida, diasetil, reuterin dan bakteriosin serta asam organik lainnya
(Amezquita and Brashears, 2002).

Dari isolasi bakteri yang dilakukan terhadap usus ikan Kerapu Macan

(Ephinephelu,> foscogatus) didapatkruJ 9 spesies bakteri yang 5 spesies diantaranya
merupakan BAL yaitu Lactococcus

ｾｰＮＬ＠

Carnobacterium sp., Lactobacillus sp.,

Micrococcus sp., dan Bifidobacterium sp. serta kelompok lainnya juga sebagai flora
nonnal yaitu Staphylococcus sp., Bacillus sp., Eubacterium sp., Pseudomonas sp.,

Micrococcus sp., (Feliatra dkk, 2004). Studi isolasi juga dilakukan pada berbagai
spesies ikan air tawar oleh Cai et al. (1999) menggambarkan kehadiran genus

Lactobacillus sebagai mikrobiota usus paling dominan pada ikan mas (Cyprinus
carpio).

Enkapsulasi

Enkapsulasi adalah proses atau teknik untuk menyalut inti yang berupa suatu
senyawa aktif padat, cair, gas, ataupun sel dengan suatu bahan pelindung tertentu yang
dapat

mengurangi

kerusakan senyawa aktif tersebut.

Enkapsulasi

membantu

memisahkan material inti dengan lingkungannya hingga material tersebut terlepas

(release) ke lingkungan. Material inti yang dilindungi disebut core dan struktur yang
dibentuk oleh bahan pelindung yang menyelimuti inti disebut sebagai dinding,
membran, atau kapsul (Kailasapathy 2002, Krasaekoopt et aJ. 2003). Kapsul merupakan
bahan semipenneabel, tipis, berbentuk bulat dan kuat dengan diameter bervariasi daTi
beberapa mikrometer hingga millimeter (Anal dan Singh 2007).
Enkapsulasi dapat dilakukan pada bakteri probiotik untuk memberikan
perlindungan terhadap bakteri probiotik dari kondisi lingkungan yang tidak
menguntungkan seperti panas dan bahan kimia (Frazier dan Westhoff 1998).
Enkapsulasi probiotik telah banyak dilakukan untuk meningkatkan ketahanan atau
viabilitas sel probiotik selama proses pembuatan produk dan penyirnpanan (Homayouni

et al. 2008a, Capela el al. 2006; Krasaekoopt et al. 2006), serta meningkatkan
ketahanan se1ama dalam jalur pencemaan (pH rendah dan cairan empedu) (Sultana et

al. 2000, Picot dan Lacroix 2004, Mandai et al. 2006, Castilla et al. 2010). Enkapsulasi
beberapa kultur ba:,teri termasuk probiotik dilakukan untuk memperpanjang umur
simpan dan mengubah menjadi bentuk serbuk agar Iebih mudah dalam penggunaan
(Krasaekoopt

el

al. 2003). Enkapsulasi probiotik dapat diaplikasikan untuk produksi

kultur starter susu fermentasi dan produksi makanan-minuman probiotik yang
menekankan aspek peningkatan viabilitas sel dalam produk dan saluran pencemaan,

serta untuk meningkatkan sifat sensorik produk (Mortazavian et al. 2007).
Teknologi untuk enkapsulasi probiotik dapat dibagi rnenjadi dua bagian, yaitu:
1) Enkapsulasi probiotik di dalam larutan bahan pengkapsul, 2) Pengeringan larutan
bahan pengkapsul (Mortazavian et af. 2007). Tahapan enkapsulasi probiotik dapat
dilakukan dengan dua teknik, yaitu ekstrusi dan emulsi (Krasaekoopt et al. 2003).
Teknik ekstrusi dilakukan dengan cara menambahkan mikroorganisme probiotik ke

dalam larutan hidrokoloid natrium alginat, kemudian diteteskan ke dalam larutan
pengeras (CaC12) menggunakan syringe sehingga terbentuk beads. Ukuran dan bentuk
beads yang dihasilkan bergantung pada diameter jarum dan jarak tetes jarum dengan

larutan CaC12 (Krasaekoopt et al. 2003). Berbeda dengan teknik ekstrusi, teknik emulsi
dilakukan dengan menyuspensikan sebagian kecil polirner (alginat) ke dalam minyak
nabati seperti minyak kedelai, minyak bunga matahari, minyak conola, atau minyak
jagung, kemudian dihomogenisasi dalam bentuk water in oil (w/o). Emulsi tersebut
akan membentuk droplet. Ukuran beads pada metode emulsi ditentukan oleh ukuran
droplet emulsi yang terbentuk. Ukuran droplet emulsi dapat dikontrol dengan kecepatan

pengadukan saat emulsifikasi (Krasaekoopt et al. 2003).
Pada tahap pengeringan bahan pengkapsul berisi sel probiotik untuk
mendapatkan sel terenkapsulasi berbentuk serbuk atau granul dapat dilakukan dengan
beberapa teknik, yaitu freeze drying, pencampuran suspensi sel mikrob ke natrium
alginate. Suspensi sel diteteskan ke dalam Iarutan CaCh (Sultana et af. 2000, Capela et
al. 2006) dan Spray drying (Lian et al. 2003, Picot dan Lacroix 2004). Enkapsulasi

probiotik dengan teknik pengering semprot dan pengering beku menghasilkan probiotik
terenkapsulasi kering dalam bentuk serbuk atau granul, sedangkan teknik emulsi dan
ekstrusi menghasilkan probiotik terenkapsulasi dalam bentuk jel (hydrocolloid beadr;)
(Krasaekoopt et af. 2003). Namun, penggunaan teknikfreeze drying relatif mahal dan
sangat sulit diaplikasikan pada skala industri (Mortazavian et af. 2007), sedangkan
penggunaan teknik spray drying membutuhkan suhu operasi yang tinggi sehingga
kurang cocok diaplikasikan untuk enkapsulasi probiotik (Kailasapathy 2002). Beberapa
metode pengeringan yang telah digunakan untuk mengeringkan jel kalsium alginat
(beads) adalah hot air oven, vacuum drying, dan microwave (Shariff et af. 2007).

Keefektifan dari bahan dan teknik enkapsulasi yang digunakan untuk
menghasilkan probiotik terenkapsulasi dapat dievaluasi dari beberapa parameter
kualitatif, diantaranya viabilitas sel probiotik selama proses enkapsulasi dan

ｰ･ｮｧｲｩｾ＠

pembuatan produk dan penyimpanan, kelarutan beads dan kemampuan sel
untuk release serta sifat mikrogeometri beads (bentuk dan ukuran) (Mortazavian et al.

2007). Tingkat ketahanan bakteri probiotik setelah diberi beberapa perlakuan dapat
diukur dengan metode plate count (Roka dan RantaAN"maki 2010).

PETA JALAN PENELITIAN

,
ｾ＠

'''I''ii
1

--J

Mei- Juni 2014

,-/7.-,.,-,,...·.-1'3•. 3. ..•• ,)•. __ ' ....• _.__ r_._>:' .. _._ ..•. "." 5':'."'., . . ;'".

'_,.,,-

.. , .. .I:;-" ..

Q,_

.}.,_

L5
.

Maret - Mei 20 ＱＵＢｾ｝＠

_-November
ﾷＺｏｾＢ［Ｍ｟ＮＬＥ＼ｩ＾｣ＧＷＡ＠

2015

ｾＭＧｊｴＮ

.. , ...t.•-'''-:.·.,",

__ ... __ '....｟ＢＧＮｾｌ＾Ｚ＠

BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

Tujuan Penelitian

Tujuan khusus yang ingin dicapai ialah:
1) identifikasi isolat-isolat BAL potensial dalam mengendalikan sel bakteri
patogen ikan air tawar asal Sumatera Utara.
2) mengetahui patogenisitas isolat-isolat BAL terpilih terhadap bibit ikan nila
3) enkasuplasi isolat BAL terpilih dengan penyalut tambahan (susu skim/gum Arabic) dan
prebiotik (inulin) dengan teknik
4) melihat ukuran, bentuk, tekstur bola kapsul sinbiotik, viabilitas sel selama pengeringan,
penyimpanan pada suhu dan waktu tertentu, tingkat pencemaran mikroba Gamur dan
ragi) selama masa simpan, kecepatan pembebasan sel pada simulasi pH lambung dan
usus

Manfaat Penelitian

1. memperoleh isolat BAL lokal Sumatera Utara sebagai probiotik yang
menghasilkan senyawa antimikrob yang potensial dalam mengendalikan
bakteri patogen ikan air tawar (Tahap I)
2. menghasilkan produk kapsuk sinbiotik BAL yang memiliki ciri-ciri terukur dan
berkualitas baik untuk memperpanjang masa simpan maupun dalam aplikasinya
sebagai agen biokontrol pada akuakultur air tawar (Tahap TI).

BAB 4. METODE PENELITIAN

Pemeriksaan Kemurnian dan Persiapan Kultur Bakteri Asam Laktat
Isolat-isolat murni BAL Lactobacillus plantarum. L. agilis. UM1 dan Sp7 dari kultur
stok, diremajakan dalam media MRSB (deMan Ragosa Sharp Broth), kemudian diinkubasi
selama

24-48

jam pada suhu 37°C. Kemumian kultur dilakukan untuk memastikan

kemumian kultur, yang dilakukan melalui pemeriksaan morfologi seeara mikroskopis dengan
metode pewamaan Gram, dan uji katalase. Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri
Gram positif dan umumnya katalase negatif (Syahrurahman, 1994). Setlah itu dilanjutkan
dengan pemanenan biomassa seI. Pemanenan biomassa sel dilakukan setelah mengkultur
BAL dalam 10 ml MRSB selama 24 jam pada suhu 37°C. Satu ml dari kultur diinokulasikan
ke dalam 100 ml MRSB, yang digunakan sebagai kultur antara. Sebanyak 10 mI kultur antara
ditumbuhkan pada 1000 ml MRSB (1: 100) yang digunakan untuk produksi biomassa.
Biomassa dipanen pada akhir fase logaritmik (kultur berumur 14 jam). Sel dipanen dengan
cara disentrifugasi pada kecepatan 4500 xg selama 15 menit pada suhu 4

°c

(Thermoscientific, USA), kemudian dicuci dengan PBS 0.1 M sebanyak 3 x (Li & Chen
2009).

Uji Patogenitas sel BAL terhadap Ikan Nila
Sel BAL yang diuji patogenisitasnya ialah AK5 (L. plan/arum. Ikan

UJl

yang

digunakan ialah bibit ikan Nila monoseks (all male) dengan yang berumur 3 bulan sebanyak
150 ekor. Ikan-ikan tersebut didatangkan dari tempat pembenihan ikan rakyat, di Deli Tua,
Medan. Ikan dipelihara pada suhu ruang yakni antara 28-30

°c

dalam ruangan tertutup

dengan peneahayaan alami di siang hari.
Uji dilakukan pada skala laboratorium yang dipelihara pada akuarium 30 x 20 x 20
em, yang diisi masing-masingnya 10 L dengan air mineral isi ulang. Pada akuarium dipasang
aerasi pada salah satu sisinya. Kepadatan ikan diatur 10 ekor/akuarium. Introduksi bakteri
BAL

ＨＢｾ｣｡ｲ＠

tunggal dilakukan ke air pemeliharaan dengan selang introduksi 1 kalilminggu
sebanyak 2 mIlL starter bakteri dalam media NB dengan kepadatan sellOs CFU/m]. Inokulasi

BAL pertama akan dimasukkan setelah 3 hari pengkulturan ikan, kemudian sekali 3 hari air
diganti dan dilakukan inok-ulasi ulang isolat BAL melalui pakan (Agaru™) yang berupa

pelet. Sel BAL dilengketkan ke pelet dengan eara melumuri pelet dengan koeokan telur
kemudian direndam dalam kultur BAL dengan kosentrasi 108 CPU/m1.
EnkapsuJasi dan Pengeringan Sinbiotik dengan Teknik Ekstrusi (Reyed, 2007 yang
dimodifikasi)
Sel bakteri yang diperoleh dari hasil sentrifugasi dilarutkan pada 100 ml campuran
yang terdiri atas tepung kacang arab /skim milk 2% (b/v), gliseroI 5% (v/v), inulin 2% (b/v)
dan CaC03 0,1% (b/v), diperangkap selama 45 menit di dalam 100 mllarutan a1ginat steri1
dengan konsentrasi 3% (b/v). Campuran tersebut diteteskan pada CaCh (0,1 M) dengan
menggunakan jarum suntik dengan jarak tetes ± IDem dan dilakukan pengadukan 150-200
rpm menggunakan magnetic stirrer. Pengerasan ge] dilakukan se]ama 1 jam (Li et af. 2009).
Gel yang terbentuk dipindahkan dalam larutan NaCI fisiologis (0,85 %) untuk mendapatkan
struktur gel yang kompak. Beads yang terbentuk selanjutnya dimasukkan ke air destilasi dan
diputar secara perlahan selama satu jam untuk menghilangkan residu CaCho Penghitungan
jumlah sel yang terenkapsulasi dalam beads mengaeu pada metode Sheu dan Marshal (1993).
Sebanyak 1 gram beads basah disuspensikan ke dalam 9 m1 PBS (0,1 M, pH 7,1) lalu
diguncang dengan vorteks selama 30 menit hingga beads hancur dan diencerkan berseri
menggunakan garam fisiologis. Sebanyak 1 m] dari pengenceran diinokuIasikan pada MRS
agar dengan metode tuang, diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam dan dihitung jumlah
koloni bakteri yang tumbuh. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan ukuran dan bentuk
mikrokapsul.

3.2.3 Pengeringan MikrokapsnI
Pengeringan dilakukan dengan metode Iwt air oven pada suhu 40°C. Pengeringan
dilakukan hingga dieapai jumlah sel BAL yang eenderung stabil sebelum akhimya
mengalami penurunan. Mikrokapsul disebarkan ke dalam eawan petri steril kemudian
dimasukan ke dalam oven bersuhu 40°C. Setiap 30 menit diIakukan penghitungan jumlah
sel.
Sebelum dan setelah proses pengenngan dilakukan penghitungan jumlah sel
terenkapsulasi untuk menguji pengaruh enkapsulasi terhadap ketahanan atau viabilitas sel
selama proses pengeringan. Penghitungan jumlah sel yang bertahan setelah proses
pengeringan dilakukan dengan mensuspensikan 0,1 gram beads kering ke dalam 9,9 ml PBS
(0,] M, pH 7,1) lalu diguncang dengan vorteks selama 30 menit hingga heady hancur dan
diencerkan berseri menggunakan garam fisiologis. Sebanyak J ml dari pengenceran

diinokulasikan pada MRS agar dengan metode tuang dinkubasi pada suhu 37°C selama 48
jam dan dihitung jumlah populasi yang tumbOO (Sheu dan Marshal, 1993). Persentase
ketahanan atau viabilitas sel bakteri setelah proses pengeringan adalah sebagai berikut:

Ketahanan (%) =

Log cfu/gran: kaps:.Il Ee'telah pengeringsn X 1 (10%
Logrfu;'gram k&;Jwl sebelum penger.ngan
.

3.2.4 Uji Viabilitas Sinbiotik BAL Setelah Enkapsulasi
Pengujian viabilitas terhadap sOOu dan masa simpan dilakukan dengan cara
menyimpan kapsul dalam wadah steril selama 4 minggu pada suhu 4 °C dan suhu ambient.
Penurunan viabilitas sel dihitung setiap 1 minggu. Satu gram mikrokapsul dimasukkan dalam
9 ml PBS lalu diguncang dengan vorteks selama 30 menit, dibuat seri pengenceran dan
diinokulasikan pada MRS agar diinkubasi selama 24-48 jam pada sOOu 37°C. Persentase
ketahanan atau viabilitas sel dinyatakan sebagai berikut:
Ketahanan (%) = l.o.!;cfu/r;ran:: kap..-.sl "eulah penyi=?AnAD pad ... w.:ktu t" X lOOI}-iJ
ｌｵｾ＠

ｌＺｦｵＯｾ＠

......u ｫｾｊｬｵＢＬＭｷＮｉ＠

:>«u"lw..u P.,.U}"iI..J.JlllUtj..

3.2.5 Analisis Total Kapangl Khamir Pengkontaminan Mikrokapsul
Mikrokapsul yang telah disimpan selama 1, 2, 3, dan 4 minggu pada suhu 4 °C dan
soou ambient, diambil sebanyak 1 g dimasukkan ke dalam 9 m} PBS, diinkubasi 24 jam.
Setelah itu diguncang menggunakan vortex, dibuat pengenceran berseri, lalu di sebar di
media PDA diinkubasi selama 48 jam di suhu mango Total kapang dan khamir dihitung
berdasarkan standar plate count (Fardiaz, 1992).

3.2.6 Uji Viabilitas Sel Bebas dan Sinbiotik
Lambung dan Cairan Usus Ikan

ｔ･ｲｮｫ｡ｰｾｵｬｳｩ＠

pada Simulasi pH Asam

Sel bebas dalam larutan NaCl fisiologis (10 8_10 9 cfu/ml) dan 1 gram kapsul masingmasing dimasukkan ke dalam 9 mL akuades pH 2 (simulasi asam lambung) yang diatur
dengan menggunakan HCl 1M, diinkubasi selama 30, 60, 90, dan 120 menit pada suhu 37°C.
Kemudian kapsul ditransfer ke dalam larutan PBS pH 6,8 (simulasi cairan usus), diinkubasi
selama 180 menit pada suhu 37°C (Rodrigues et aI., 2006; Li et al., 2009). Populasi sel yang
bertahan di dalam kapsul dihitung setiap 30 menit dengan cawan hitung pada media MRS
agar lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.

Analisis Kecepatan Release Sel Terenkapsulasi
Sebanyak 1 gram kapsul dimasukkan ke dalam tabung berisi 9 ml PBS pH 7,4
(disesuaikan dengan pH cairan intestinal), diinkubasi pada suhu 37°C dengan kecepatan 100
rpm. Jumlah sel bakteri yang terlepas (release) dihitung setiap 30 menit hingga dicapai
persentase sel terlepas sebesar 100% dengan metode hitungan cawan pada media MRS agar
setelah diinkubasi pada 37°C selama 48 jam. Penghitungan persentase sel terlepas pada
waktu-t adalah sebagai berikut:
Sel terle as (%) =
P

Logcfu/ml Elfl release pads wa.lrtll-! X 100%
ｌｯｾ｣ｦｵＯｭｬ＠
lIel temnkapsulasi

Identifikasi Isolat Terpilih

Isolat-isolat yang diidentifikasi ialah SP 7 dan UM 1, sedangkan isolat EK 5 dan EK 2
sudah diidentifikasi secara fisiologis (Mayasari 2013 et af. 2013; Sitepu et al. 2013) dan
teridentifikasi sebagai Lactobacillus plantarum dan L.agilis.

Identifikasi Isolat UMI dan SP7 Berdasarkan Sekuen Gen Penyandi 16S-rRNA
Ekstraksi DNA dilakukan menurut metode Murray Thompson (Cetyl Trimethyl
Ammonium bromide, CTAB) (Sambrook & Russel 2001). Kultur bakteri dari hasil

pengkulturan selama 18 jam (fase log) pada media Luria Bertani (LB) dengan penggoyangan
berkecepatan 120 rpm, dimasukkan ke tabung mikro, disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm
selama 5 menit. Supematan dibuang, pelet dicuci dengan 760 Jl} 10 mM bufer tris-EDTA (YE
IX), diresuspensi, kemudian ditambahkan 16 JlL lisozim, di inkubasi selama 30 menit sambil
dibolak- balik setiap 15 menit. Setelah itu sampel ditambahkan dengan 40 JlI 10% SDS dan 8
-I

0

JlI proteinase-K (10 mg mL ), kemudian diinkubasi 1 jam pada suhu 37 C dAn dibolak balik
()

setiap 15 menit. Kemudian sampeI ditamhahkan dengan 100 JlL CTAB pada suhu 65 C,
o

dibolak-halik dan diinkubasi pada suhu 65 C selama 20 menit. Selanjutnya ke dalam sampel
ditamhahkan 0.5 m]

chloroform:isoamilalkohol (CI) 24:1, diholak-balik kemudian

disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Bagian fase cair dipindahkan ke

tabung mikro bam kemudian ditambahkan dengan 0.6 mL isopropanol dingin dan dibolakbalik hingga nampak benang-benang DNA, kemudian dibiarkan seIama 20 menit pada suhu
mango Setelah itu dilakukan sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 5000 rpm. Supematan
dibuang dan pelet ditambahkan 0.5 JlL 70 % etanol dingin kemudian disentrifus 5 menit pada
5000 rpm. Etanol dibuang dan pelet DNA dikering anginkan pada subu mango Kemudian
pelet DNA diresuspensi dengan 25 JlL ddH 0 steril selanjutnya disimpan di lemari pernbeku
2

o

pada suhu -20 C.
Amplifikasi gen 16S-rRNA menggunakan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR)
(Gene Amp PCR system 2400, Perkin Elmer, Biosystem, USA) dengan primer universal
spesifik untuk bakteri (Research Biolab, Singapore) yaitu 63f (5' -CAG GCC TAA CAC
ATG CAA GTC-3') dan 1387r (5'-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3') (Marchesi et al.
1998). Sejumlah 25 JlI master mix dimasukan ke dalam tabung mikro bam yang terdiri atas
15.5

J.tL ddH20

2.5

J.tL

lOx bufer, 1 JlL 10 mM dNTP, masing-masing 1.25

dan 1387r, 0.5 JlL Taq Pol dan 3

J.tL

primer 63f,

J.tL DNA template dimasukkan ke mesin PCR. Kondisi PCR

0

0

0

adalah: pre PCR (94 C, 2 menit), denaturasi (92 C, 30 detik), elongasi (75 C, 1 menit) dan
o

post PCR (75 C,5 menit) denganjumlah siklus 30. Hasil amplifikasi gen diverifikasi dengan
elektroforesis menggunakan gel agarose 0.7% dengan penanda DNA 1 kb lader (Promega,
USA). Amplikon DNA gen 16S-rRNA akan muncul pada posisi 1.3 kb. SampeI kemudian
dimurnikan (Promega, USA), untuk selanjutnya disekuen dengan DNA sequencer (ABI Prism

3100-Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystem, USA) di PT. Charoen Pokphand Thk,
Jakarta Data sekuen di bandingkan dengan data di GenBank dari database The National

Center for Biotechnology Information (NCBI) (bttp:llwww.ncbi.nlm.nih.gov), menggunakan
program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) untuk mengetahui kemiripan spesies
isolat uji dengan spesies Bacillus lainnya. Analisis kekerabatan (filogenetika) dilakukan
dengan terlebih dahulu melakukan multiple sequence ailigment dengan program ClustalW
dari European Biotechnology Information (EBI) (www.ebi.ac.uklclustalw) kemudian data
digunakan untuk pembuatan pohon filogenetik dengan program TreeCon (Van de Peer &
Watcher 1997).

Flowchart (Diagram Alir Penelitian)

Isolat murni patogen :

Sampel usus ikan Nila, air kolam
dan sedimen.

A.hydrophila, Mfortuitum, s.aga/actiae
A. Sa/monicida, Edwarsiella tarda

Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Asam Laktat

Isolat Bakteri
Asam Laktat mumi

/
r-----------------------,
Seleksi BAL potensial dengan
metode cakram (uji tantang)

1

ｲＭｾ］

Pembentukan
Biofilm patogen
pada
berbagai
permukaan padat
(plastik dan sisik
ikan)

IsolatBAL
Biokontrol
Potensial

J
Pengendalian biofilm patogen
(dengan biomassa sel BAL dan
senyawa antimikrob

- + Luaran tahun I

Uji patogenitas

Identifikasi

Enkapsulasi dan

Karak;terisasi
Kapsul Probiotik

Luaran Tahun

n

BAB5
BASIL DAN DISKUSI

Perneriksaan Kern urnian Kultur BAL Potensial
Untuk memastikan kemurnian isolat BAL yang diuji dilakukan peremajaan
isolat dan dilakukan karakterisasi dengan uji pewarnaan Gram dan uji katalase (Tabel 1).
Hasil yang diperoleh menunjukan isolat memiliki ciri-ciri umum bakteri asam laktat,
Gram positif, katalase negatif dan koloni bewarna krem-putih, sedangkan bentuk sel
batang. Isolat EK2 dan AK5 sudah diidentifikasi sebagai Lactobacillus agilis dan L.
plantarumn (Sitepu et af. 2013; Mayasari et al. 2013). Isolat Sp7 dan UM 1 be]um

teridentifikasi, namun sudah dikarakterisasi secara morfologi (Sitinjak 2015; Hutagaol
2015).

Tabel 1 Pemeriksaan Ulang Karakteristik Kultur Bakteri Asam Laktat
Pewarnaan Gram
Bentuk Koloni
Uji Kaialase
Jenis Isolat
AK5
Gram positif
Batang
Negatif
Gram positif
Batang
Negatif
EK2
Sp.7
Gram positif
Batang
Negatif
UMI
Gram positif
Batang
Negatif
Sp 7 dan UMI belum teridentifikasi
EKz Lactobacillus agilis
EK5 Lactobacillus plantarum

4.1

Patogenisitas Lactobacillus plantarum terhadap Bibit lkan Nila
Salah satu syarat kandidat probiotik ialah tidak patogen terhadap inang. Basil uji

patogenisitas isolat BAL terpilih

L. plantarum dengan inokulasi kultur ke air

pemeliharaan bibit ikan Nila menunjukan tidak terdapat gejaJa penyakit terhadap ikan
seielah pengkulturan bersama selama 20 hari. Angka laju ketahanan ikan didapatkan
97%, sedangkan kontrol negatif (tanpa inokulasi BAL) didapatkan laju ketahanan yang
lebih rendah yaitu 66%. Hal ini menunjukkan isolat L. plantarum tidak patogen,
malahan meningkatkan laju ketahanan ikan. Namun berbeda dengan ketahanan, laju
pertumbuhan spesifik perlakuan dengan isolat BAL, lebih rendah daripada kontrol
negatif (Tabe12). L. agilis juga tidak patogen terhadap ikan (hasil tidak ditampilkan).

Tabel 2. Uji patogenisitas isolat kandidat probiotik (Lactobacillus plantarum) terhadap
ikan setelah kontak 20 hari

Perlakuan

Kontrol negatif
Kontrol patogen
Pemberian isolat BAL

Laju Ketahanan
Ikan (%)

90
64
93

Laju Perturnbuhan
Spesifik Ikan (%)

2,46
1,81
1,94

Enkapsulasi Sinbiotik dengan Teknik Esktrusi
Enkapsulasi dilakukan terhadap 4 isolat BAL potensial asal kolam ikan Nila
(EK2, AK5), usus ikan Gurame (Sp7) dan usus ikan Mas (UM!) yang telah diuji daya
hambatnya berturut-turut terhadap patogen ikan seperti Streptococcus agalactiae,

Mycobacterium !urluitum, Aeromonas salmonicida,

dan Edwarsiella tarda. Setelah

dilakukan enkapsulasi dengan metode ekstruksi diperoleh kapsul sinbiotik yang memiliki
jumlah sel masing-masing isolat sekitar log 9 log CFU/ml (Tabel 3). Jumlah ini sudah
memenuhi standar jumlah sel untuk suatu probiotik. Ukuran bola kapsul 2-5 mm, warna
krem keputihan dan tekstur kenyaL Kapsul terdiri atas 2 lapis bahan penyalut, tepung
gumfsusu skim serta tepung inulin sebagai prebiotik. Penyalut isolat AK5 dan UMl
terdiri atas tepung gum dan alginat sedangkan isolat EK2 dan dan SP} disalut dengan
susu skim dan alginat.

Gambar 1. Bola-bola kapsul isolat-isolat BAL yang disalut dengan tepung gum/skim,
alginat dan tepung inulin sebagai prebiotik (Perbesaran lOx)

Tabel 3. lumlah sel terenkapsulasi dengan teknik ekstrusi menggunakan bahan
pengkapsul Ca-alginat dan penambahan prebiotik*
Populasi Sel

Isolat
EK2

2,7 x 109 CFU/g kapsul basah
9

Log CFU/ml/g
9,43

AK5

3,2 x 10 CFU/g kapsul basah

9,51

Sp. 7

2,4 X 109 CFU/g kapsul basah

9,38

UMl

2,2 x 109 CFU/g kapsul basah

9,34

EK2 = L.agilis
AK5 = L. plantarum

Sp 7 dan UMI = belum teridentifikasi

4.2 Pengeringan Mikrokapsul
Pengeringan dilakukan terhadap kapsul sinbiotik untuk mencegah kontaminasi
kapang-kamir, akan tetapi periu diperhatikan beberapa hal dalam pengeringan yaitu
SUh11. sehing}!8 tidak

melnbunuh sel atau menlsak bpsul. Sehingga pengeringan

....---------------------, .---------------------------------------------------,I
Grafik Penurunan Populasi Sel SP 7 Setelah
Pengeringan

Grafik Penurunan Populasi Sel UM 1Setelah
Pengeringan

10g,38 9.37 9,36 9,33 9,3 9,28 9,15 9,12 9,17 9.14 906

•

9 •

•

•

•

•

•

•

•

•

E

e
ｾ＠
ｾ＠

•

Ｍｾ＠

'

US

ｾ＠

ＸｾＹ＠

8,07 -

ｾ＠

E
ｾ＠
ｾ＠

7

.
s:"

c

B

5·

.
ｾ＠

ｾ＠

Ii

8,5

!

;;

on

8,81 8,79

...v

g

6

9

I

::l

.

v

E.

9,59,34 9,339;32 9,3 9 n
, 9,23
919
ｾ＠
........- ' 9,14 9 11 909
'
, 9,03

8

..
1/1

.!

..."ｾ＠

7,5 -

1 :

o;
o

7 30

60

90

120 150 180 210 240 170 300 360 390 420 450 480

• • ｭｾ＠
ｯｭＶＰＹｾｷ＠

Waktu{jarn)

Waktu (menit)

Gambar 2. Ketahanan populasi sel BAL selama pengeringan pada suhu 40°C
Viabilitas mulai turun pada pengeringan setelah 3 jam namun penurunan tidak signifikan.
Sampai jam ke-9 (540 mnt) pada isolat AK 5 dan UM 1 masih terdapat sekitar 8 log dari
sekitar 10 log CFU/ml pada kapsul segar (Tabel 5). Ke-empat isolat memperlihatkan
ketahanan yang hampir sarna di dalarn kapsul selama pengeringan. Zayed

& Roos

(2004) menyatakan penambahan disakarida Trehalosa ke dalam bahan penyalut bertindak
sebagai pelindung terhadap sel ragi terhadap tekanan lingkungan seperti panas, dehidrasi
dan suhu beku. Pada penelitian ini ditambahkan tepung gum atau Trehalosa.
Pengaruh subu penyimanan terhadap viabilitas sel dalam kapsuJ
Hanya dua macam temperatur yang dipakai sebagai temperatur uji yaitu suhu
kulkas 4 °c dan suhu ruang (±28 DC). Penyimpanan di kulkas meupakan tempat yang
umum, sedangkan pengujian pada suhu kamar lebih kepada melihat kemungkinan
penyimpanan yang paling murah dan mudah. Semua isolat terenkapsulasi sinbiotik
memperlihatkan kecenderungan viabilitas yang sarna, penyimpanan pada suhu dingin
dalam kulkas lebih dapat mempertahankan viabilitas daripada di suhu ruang. Pada
pengujian selama 4 minggu dengan pengamatan setiap 1 minggu, terlihat jumlah sel
menurun secara gradual, namun jumlah penurunan tidak signifikan. Ketahanan sel isolat

AK 5 dalam kapsul sinbiotik setiap minggunya hanya berkurang sekitar ] -2% pada suhu
4°C, hingga menyisakan sekitar 95% viabilitas setelah penyimpanan 4 minggu.

Penyimpanan pada suhu ruang penurunan setiap minggunya berkurang sekitar 2-4%.
Berbeda dengan isolat EK 2 pada suhu kamar jumlah sel pada minggu 1-3 relatif stabil
tapi setelah minggu ke 3 sampai minggu ke-4 penurunan mencapai hampir 10%.
Grafik Ketahanan Sel AI( 5Terenkapsulasi 5etelah Penyimpanan
ｾｲ｡ｦｩｫ＠

lOO)m
100.00\,

llUJ'{

Ketahanan Sel EK 2TerenkapsulasiSetelah Penyimpanan
.

ＮｾｬＡｉ＠

lt16',

ｾ＠

ｾ＠

.
.!

'iO.iXJ';

i
;

ｓｎｾＭ

JS.w.,

Grafik Ketahanan Sel SP 7Terenkapsulasi Setelah Penyimpanan

Imfik ｋ･ｴ｡ｨＺｾＮｓｉ＠

lOO.fl)S

100M

ｾ＠

ｬｉｏｊｲ［ＬＮＺＢＧＭｾ＠

UM 1Terenkapsulasi Setelah Penyimpalian

ＥＩｾＮ＠

ｾＬ＠

' - , 'J4,l%

'-...,"

ｾＢ＠

!I),w,;

,26';

••<

·
;

! 85M
••

..... ＵｯＮｉＺｾｴ＠
ｑｬｾＫｳＮ｟＠

''''-!9.l.'',
ｾ＠

Ｘ｜ｊｾＭＫｬｵｨＬＨＴＢＱ＠

ｾＱｬｙＬ［＠

811.00\,

Gambar 3. Grafikjumlah populasi sel BAL terenkapsulasi selama waktu
penyimpanan pada suhu ruang dan 4 °c

..... ｬｵｨＢ＾Ｎｾ＠

Penurunan jumlah sel isolat SP 7 pada penimpanan pada suhu dingin hanya sekitar 24%, sedangkan pada suhu ruang penurunanya sekitar 2-6%. Untuk isolat UMI
viabilitas sel selama penyimpanan pada suhu dingin dan suhu ruang tidak jauh
berbeda dengan isolat SP 7. Secara umum viabilitas pada suhu dingin setelah 4
minggu masih 90% sedangkan pada suhu ruang sekitar 85%.
Tingkat Kontaminasi Kapang

Pennasalahan dalam masa simpan produk kapsul berbahan dasar polisakarida
hidrokoloid ialah kontaminasi jamur. Kapsul yang diperoleh dalam penelitian ini
berupa gel yang kenyal dengan kadar air yang diduga cukup tinggi (ada penelitian
ini tidak dilakukan pengukuran kadar air). Pengamatan terhadap kontaminasi
jamur dan khamir dilakukan terhadap sinbiotik isolat-isolat BAL terpilih AK5,
EK2, UM1 dan Sp7 selama masa penyimpanan (4 minggu) pada 2 macam suhu uji
4

°c

dan suhu ruang (±28 DC). Hasil pengamatan menunjukan kontaminasi

umumnya terjadi pada penyimpanan pada suhu ruang. Kelompok pengkontaminan
didapatkan hanya dari kelompok khamir, tidak ditemukan jamur. Tingkat
kontaminasi termasuk katagori rendah yaitu sekitar 1-1.6 log CFU/g dimulai pada
minggu ke-3 dan meningkat pada minggu ke-4.
Tabe14. Tingkat kontaminasi khamir pada kapsul sinbiotik isolat-isolat BAL
selama masa penyimpanan.
Total khamir (CFU/gram)/
minggu
Kode
Isolat

Suhu
(0C)

2

3

Ruang

4

2

3

11

4

EK2

Log CFU/gram/minggu
4

1,04

10

34

1,00

1,53

13

45

1,11

],65

4

AK. 5

Ruang

10

4
SP 7

Ruang

1,00

10

39

],00

],59

12

40

1,08

1,60

4
UMI

Ruang

Kecepatan Sel Terbebas pada pH Netral
Kecepatan sel terbebas dari bola kapsul sinbiotik yar:.g diinkubasi pada pH
7.4 (PBS) bervariasi untuk setiap isolat, walaupun pada menit ke-30 umumnya sel
terdeteksi sudah bebas pada kisaran 35-50% dari jumlah awal antara log 8-9
CFU/ml/g. Setelah itu teIjadi peningkatan secara teratur seiring dengan peningkatan

waktu inkubasi. Isolat EK2 terbebas hampir 90% pada menit ke-90 dan hampir
sempuma pada menit ke-180 dan hal ini stabil sampai menit ke 300. Hal ini berbeda
dengan isolat AK5, SP7 dan UMI yang barn terbebas sekitar 70-75% pada menit ke
90 dan baru mendekati 100% pada menit ke 180. Mulai dari men it ke 180 sampai
menit ke-300 pembebasan sel dari kapsul pada semua isolat stabil
Tabel5. Persentase sel terbebaskan selama waktu inkubasi dalam PBS pH 7.4
Persentase sel terbebaskan (%/menit)
Isolat
ＭｾＮＢ＠

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

EK2

45,13

74,23

89,45

92,]2

98,19

98,25

98,29

98,33

98,45

99,63

AK5

49,18

63,98

77,69

82,99

97,17

98,10

98,15

98,39

98,54

99,42

SP 7

35,59

56,88

76,89

88,45

91,75

98,10

98,19

98,67

98,86

99,87

UM I

41,43

67,34

72,99

85,77

96,83

97,12

98,40

98,99

99,15

99,75

Ketabanan Sel Bebas dan Terenkapsulasi pada Simulasi pH Iambung dan usus
Pada Tabe1 5 dapat dilihat bahwa pada simulasi pH asam lambung (pH 2)
viabilitas sel bebas menurun secara pasti setiap menit pengamatan. Pada 1 jam pertama
viabilitas turun sekitar 2 log CFU/ml dan 1 jam berikutnya turon 5 log CFU/ml dan
jumlah awal 10 log CFU/ml. Kalau dibandingkan dengan sel yang disalut dengan alginat
dan tepung b'1lll1 Arabic/susu skim, sel bertahan dalam kapsul dalam jumlah yang cukup
tinggi selama pengamatan yaitu 8 log CFUi.nl selama 1,5 jam dan hanya turun sekitar 1
log CFU/ml setelah 2 jam. Jadi imobilisasi sel dengan kapsul alginat dan tepung gum
Arabic/susu skim efektif meJindungi se] dari pH asam lambung.
Pada kondisi pH cairan usus (pH 6.8) seJ bebas hanya tersisa sekitar 50% dan

jumlah sel awal (10 log CFU/ml), sedangkan sel terenkapsulasi yang bertahan dalam
kapsul, pada pH lambung mulai turun. Pada 30 menit pertama terdapat sel hidup sekitar
7 log CFU/ml kernudian menurun cepat setiap 30 menit berikutnya. Pada menit ke-180
jmlah sel hidup dalam kapsul tersisa sekitar 2 log CFU/ml. Hal ini menandakan bahwa
pori kapsul alginat merenggang pada pH usus sehingga mernbebaskan sel-sel yang
terperangkap. Artinya kapsul sinbiotik dapat melindungi dan menjaga viabilitas sel dalam
kapsul dan melepas sel pada tempat yang sesuai yaitu di usus, dimana peran probiotik
diharapkan dapat bekeIja.

Uji Viabilitas Sel Bebas dan Sinbiotik Terenkapsulasi dalam Simulasi pH Asaro Larobung dan Cairan Usus Ikan

Tabel 6. Viabilitas Sel Bebas (log CFU/ml) Terhadap Cairan Asam Lambung Tiruan (pH 2) dan Cairan Usus Tiruan (pH 6,8)
Cairan Asam Lambung Tiruan (pH 2) selama 2 jam

Cairan Usus Tiruan (pH 6,8) selama 3 jam

Isolat
0

30

60

90

120

30

60

90

120

150

180

EK2

10,32

9,08

7,56

6,79

5,99

4,32

4,12

4,45

4,67

4,71

4,69

AK5

10,67

9,34

7,86

6,30

6,04

5,78

4,91

4,67

4,75

4,71

4,63

SP 7

10,13

8,95

7,12

5,87

5,12

4,45

4,06

4,12

4,10

4,04

3,99

UM1

10,28

9,43

8,16

6,92

5,60

4,98

4,38

4,17

4,28

4,29

4,19

Tabel 7. Viabilitas Sel Terenkapsulasi (log CFU/ml) Terhadap Cairan Asam Lambung Tiruan (pH 2) dan Cairan Usus Tiruan (pH 6,8)
Cairan Usus Tiruan (pH 6,8) selama 3 jam

Cairan Asam Lambung Tiruan (pH 2) selama 2 jam
Isolat
0

30

60

90

120

30

60

90

120

150

180

EK2

8,17

8,11

8,03

7,98

7,74

7,19

6,45

4,98

3,12

2,95

2,01

AK5

8,28

8,16

8,08

8,01

7,81

7,34

6,95

5,11

4,01

2,43

2,25

SP 7

8,07

8,01

7,92

7,89

7,71

7,32

6,24

5,59

4,04

3,11

2,29

UMl

8,09

8,04

7,95

7,80

7,68

7,21

6,48

5,12

4,67

3,09

2,38

BAB6

KESllWPULANDANSARAN
•

Bahan pengkapsul Ca-alginat, kacang arab dan prebiotik inulin dengan teknik
ekstrusi menghasilkan kapsul dengan ciri yang memenuhi standar: ukuran, jumlah
sel terperangkap

•

Pengeringan selama 4.5 jam pada suhu 40°C masih memberikanjumlah sel yang
cukup untuk probiotik tapi optimal pada 3 jam
Penyimpanan kapsul probiotik selama 1 bulan pada suhu ruang masih
menyisakan sel 87 % CFU/mI, pada 4 OC menyisakan sellog 95%
Tidak ada kontaminasi kapanglkhamir pada penyimpanan 1 bulan pada 4 OC, tapi
pada suhu ruang terdapat kontaminasi yang sangat rendah 10-50 sel selama
inkubasi

•
•

•

•

Pelepasan sel pada pH 7.4 (usus) mulai setelah 30 mnt dan maksimal setelah 2.5
jam sampai 4.5 jam

DAFTARPUSTAKA

Anal, A K, and H. Singh. 2007. Recent advantages in microencapsulation of probiotics
for industrial applications and targeted delivery review. Trends in Food Science
and Technology. 18: 240-251.
Ayuningtyas AK., 2008. Efektifitas campuran meniran Phyllanthus niruri dan bawang
putih Allium sativa untuk pengendalian infeksi bakteri Aeromonas hydrophila
pada ikan Iele dumbo Clarias sp. Skripsi. Departemen Budidaya Perairan,
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Azizpour, K, 2009. Biochemical characterization of lactic acid bacteria isolated from
Rainbow trout (Oncorinchus mykiss) of West Azarbaijin, Iran. Res . .J. BioI. SCi.,
4(3) : 324-326
Cai