Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa - USD Repository
UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH
EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU DAN TEH HITAM DENGAN METODE
DEOKSIRIBOSA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :
Carla Kuntari NIM : 028114097
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH
EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU DAN TEH HITAM DENGAN METODE
DEOKSIRIBOSA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :
Carla Kuntari NIM : 028114097
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
SKRIPSI
UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH
EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU DAN TEH HITAM DENGAN METODE
DEOKSIRIBOSA
Oleh : Carla Kuntari
NIM : 028114097 Telah disetujui oleh :
When you walk through a storm,keep your head up high
and don’t be afraid of the dark. At the end of the storm is a golden sky
and the sweet silver song of lark. Walk on through the wind, walk on
through the rain, tho’ your dream be tossed and blown. Walk on, walk
on with hope in your heart. And you’ll never walk alone.
O s - c a r H . -
- O s c a H - r .
Kupersembahkan karyaku ini kepada: kedua orangt uaku, Drs. B. Rahmant o, M. Hum. dan A. M. Budiart i, AMK. kakakku Lukas Priyambodo, S. E. , sahabat ku Danang Hendro Pamungkas, almamat erku, t erima kasih at as doa, semangat , bant uan, dan perhat ian yang besar selama
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan yang telah melimpahkan berkat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa” dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari peran serta berbagai pihak yang telah memberikan bimbingan, dorongan, dan saran. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan banyak terima kasih kepada :
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
2. Dra. A. Nora Iska Harnita, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing atas bimbingan, saran, dan kritik selama penelitian sampai penyusunan skripsi ini.
3. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen penguji atas saran dan kritik terhadap skripsi ini.
4. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku dosen penguji atas saran dan kritik terhadap skripsi ini.
5. Enade Perdana I, S.F., Apt. dan Romo Drs. P. Sunu H., SJ. atas diskusi, kritik, saran, dan pencarian jurnal-jurnal yang turut mendukung dalam penyusunan skripsi ini.
6. PT. Pagilaran yang telah memberikan ijin kepada penulis untuk mempelajari proses pengolahan teh hijau dan teh hitam di pabrik teh PT. Pagilaran Banjarnegara, Jawa Tengah dan Samigaluh, Yogyakarta.
7. Bapak Mukmin, Bapak Prapto, Mas Parlan, Mas Kunto, Bapak Kasiran, Mas Kayat, Mas Wagiran, dan Mas Ottok atas pendampingan dan bantuan selama penelitian.
8. Rekan kerja saat penelitian : Nana, Leny, Ardhyan, dan Vini, terima kasih atas bantuan selama bekerja di “rumah kedua” dan selama penyusunan skripsi ini.
9. Sahabat-sahabat penulis : Rendeng, Bertha, Winda, Lisa, Novi, Anno, terima kasih atas jalinan persahabatan yang indah selama ini.
10. Bapak Yus, Arya, Heri, Danang, dan Kris atas bantuannya selama kunjungan di PT. Pagilaran.
11. Teman-teman praktikum kelompok D dan teman-teman Farmasi angkatan 2002, atas kebersamaannya selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, terima kasih atas segala dukungan moril dan materiilnya.
Penulis
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, Februari 2007 Penulis
Carla Kuntari
INTISARI
Radikal hidroksil merupakan radikal bebas yang sangat reaktif. Radikal hidroksil dapat memecah rantai DNA dan berperan dalam karsinogenik, mutagenik serta sitotoksik. Dalam tubuh, radikal hidroksil ditangkap oleh sistem antioksidan. Saat jumlah radikal bebas melampaui kapasitas sistem antioksidan, diperlukan antioksidan eksogen. Salah satu antioksidan eksogen adalah polifenol yang terdapat pada teh hijau maupun teh hitam. Polifenol dapat bereaksi dengan radikal hidroksil membentuk produk yang kurang reaktif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil dinyatakan dalam persen penangkapan (% scavenging) dan nilai penangkapan efektif (effective scavenging) radikal hidroksil sebesar 50% (ES 50 ).
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena ada subjek uji yang dikenakan manipulasi perlakuan. Metode penangkapan radikal hidroksil yang digunakan adalah metode deoksiribosa. Prinsip metode ini adalah degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil, yang dihasilkan oleh reagen Fenton, membentuk malondialdehid (MDA) yang dalam suasana asam dan adanya asam tiobarbiturat (TBA) menghasilkan kromogen merah muda yang diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 532 nm. Nilai ES dihitung
50
dari persamaan regresi linear antara konsentrasi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam terhadap % scavenging pada berbagai konsentrasi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil dengan nilai ES
50 (hasil
ekstrapolasi) ekstrak etanol teh hijau adalah 0,281 mg/ml dan ekstrak etanol teh hitam adalah 0,344 mg/ml. Kata kunci : radikal hidroksil, antioksidan, polifenol, ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam, metode deoksiribosa.
ABSTRACT
Hydroxyl radical is very reactive free radical. Hydroxyl radical could break DNA chains and play role in carcinogenic, mutagenic, and cytotoxic. Inside the body, antioxidant system can reduce hydroxyl radical but when there is imbalance between the extent of hydroxyl radical and the antioxidant system capacity, body needs exogenous antioxidants. One of them is polyphenols that can be found in green-or black-tea. Polyphenols can react with free radical to form less reactive products. The objective of this research is to know the hydroxyl radical scavenging activity of green-and black-tea ethanolic extract. Hydroxyl radical scavenging activity expressed as percent scavenging and 50 % hydroxyl radical effective scavenging (ES
50 ).
This research is a kind of experimental research, because there is treatment to the research subject. The radical scavenging activity method was measured by the deoxyribose method. The principle of this method is degradation of deoxyribose by hydroxyl radical, which generates from Fenton Reagent, to form malondialdehid (MDA) that upon heating with thiobarbituric acid (TBA) at low pH, yield pink chromogen which can be measured in maximum wavelength at 532 nm. The ES
50 value can be count by regeresion linear between green-or black-tea ethanolic extract concentration and percent scavenging in each concentration.
The result of this research indicated that both of green-and black-tea ethanolic extract have hydroxyl radical scavenging activity with ES
50
(extrapolated) value of green tea ethanolic extract is 0.281 mg/ml and black tea ethanolic extract is 0.344 mg/ml. Keywords : hydroxyl radical, antioxidant, polyphenols, green-and black-tea ethanolic extract, deoxyribose method.
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL........................................................................................ ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. iii HALAMAN PENGESAHAN.......................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... v PRAKATA....................................................................................................... vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... viii
INTISARI......................................................................................................... ix
ABSTRACT ....................................................................................................... x
DAFTAR ISI.................................................................................................... xi DAFTAR TABEL............................................................................................ xv DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................... xvii BAB I PENGANTAR ......................................................................................
1 A. Latar Belakang ...........................................................................................
1 1. Permasalahan .......................................................................................
4 2. Keaslian penelitian ...............................................................................
4 3. Manfaat penelitian................................................................................
4 B. Tujuan Penelitian .......................................................................................
5 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...............................................................
6 A. Radikal Bebas ............................................................................................
6
C. Teh .............................................................................................................
H. Landasan Teori........................................................................................... 30 I. Hipotesis.....................................................................................................
D. Bahan-Bahan Penelitian ............................................................................. 33
32 C. Definisi Operasional .................................................................................. 33
32 3. Variabel pengacau................................................................................
32 2. Variabel tergantung..............................................................................
32 1. Variabel bebas......................................................................................
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................. 32 B. Variabel-Variabel Penelitian......................................................................
31 BAB III METODE PENELITIAN .................................................................. 32
24 G. Spektrofotometri UV-Vis........................................................................... 25
11
22 2. Cairan penyari ......................................................................................
22 1. Cara penyarian .....................................................................................
19 F. Penyarian....................................................................................................
19 E. Metode Deoksiribosa .................................................................................
16 D. Metode Deteksi Radikal Hidroksil.............................................................
16 4. Reaksi radikal bebas dengan polifenol dalam teh ................................
2. Kandungan kimia dalam teh................................................................. 13 3. Manfaat teh ..........................................................................................
1. Klasifikasi dan pengolahan teh ............................................................ 11
E. Alat-Alat Penelitian.................................................................................... 34
F. Tata Cara Penelitian ................................................................................... 34
1. Pemilihan sampel ................................................................................. 34 2. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ...............................
35 3. Pembuatan bufer fosfat 20 mM............................................................
35 4. Pembuatan reagen ................................................................................
36 5. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM .............................................
37 6. Pembuatan larutan ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam 1 mg/ml ....
37 7. Optimasi metode ..................................................................................
38
8. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ........................................................................................
39 G. Analisis Hasil .............................................................................................
39 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .........................................................
41 A. Pemilihan Sampel ......................................................................................
41 B. Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam .................................................. 42 C. Optimasi Metode........................................................................................
44 1. Penentuan operating time (waktu operasional)....................................
44
2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum............................. 48
D. Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam............................................................................................
50 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN...........................................................
50 A. Kesimpulan ................................................................................................ 57 B. Saran ..........................................................................................................
57
LAMPIRAN..................................................................................................... 62 BIOGRAFI PENULIS .....................................................................................
76
DAFTAR TABEL
Tabel I. Reactive oxygen species (ROS)...................................................... 7 Tabel II. Proses pengolahan teh hijau ...........................................................
12 Tabel III. Proses pengolahan teh hitam..........................................................
12 Tabel IV. Komposisi dari pucuk daun teh segar ............................................
13 Tabel V. Karakteristik struktur flavonoid untuk aktivitas penangkapan radikal yang efektif ....................................................................................
17 Tabel VI. Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil .................................
19 Tabel VII. Pemilihan cara penyarian ...............................................................
24 Tabel VIII. Spektrum warna pada daerah visibel..............................................
29 Tabel IX. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan ekstrak etanol teh hijau pada berbagai konsentrasi.....................................
50 Tabel X. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan ekstrak etanol teh hitam pada berbagai konsentrasi ...................................
51 Tabel XI. Persen scavenging ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam .............
52 Tabel XII.Persamaan regresi linier ekstrak etanol teh hijau sebelum dan sesudah konversi ............................................................................
54 Tabel XIII.Persamaan regresi linier ekstrak etanol teh hitam sebelum dan sesudah konversi ............................................................................
54 Tabel XIV. Persentase penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50 % oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ...................................
55
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur kimia catechin dalam teh dan epimernya......................14 Gambar 2. Struktur kimia theaflavin (a) dan thearubigin (b) .......................
15 Gambar 3. Struktur kimia flavonol dalam teh ..............................................
15 Gambar 4. Gambaran gugus-gugus pada flavonoid yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas ................................................
18 Gambar 5. Mekanisme reaksi antara gugus catechol dengan radikal hidroksil ...................................................................................... 18 Gambar 6. Struktur deoksiribosa ..................................................................
19 Gambar 7. Reaksi penyerangan radikal hidroksil pada deoksiribosa ...........
21 Gambar 8. Reaksi pembentukan radikal gula peroksil .................................
21 Gambar 9. Struktur MDA .............................................................................
22 Gambar 10. Kurva hubungan waktu (menit) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA .................................................................................. 45 Gambar 11. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA ...............................
46 Gambar 12. Mekanisme reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA ............
47 Gambar 13. Struktur kromogen MDA-TBA...................................................
48 Gambar 14. Kurva hubungan panjang gelombang (nm) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA.................................................................
49 Gambar 15. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan absorbansi .................................
51 Gambar 16. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan % scavenging ............................ 55
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Foto ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ................................
62 Lampiran 2. Tabel Krejcie...............................................................................
63 Lampiran 3. Tabel random sampling .............................................................. 64 Lampiran 4. Contoh penimbangan bahan........................................................
65 Lampiran 5. Contoh perhitungan % scavenging ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam .....................................................................................
74 Lampiran 6. Contoh perhitungan ES
50 ............................................................ 75
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Radikal bebas merupakan spesi yang bersifat sangat reaktif karena
adanya elektron yang tak berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1986) dan mempunyai kemampuan untuk menimbulkan kerusakan, termasuk peroksidasi lipid, lesi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid), dan fragmentasi protein dalam sel. Akumulasi dari kerusakan makromolekuler intraseluler merupakan penyebab proses penuaan dini, keriput, noda hitam, dan beberapa penyakit degenerasi seperti kanker dan jantung koroner (Fulder, 2004; Syah, 2006).
Manusia mempunyai sistem antioksidan yang mampu melindungi tubuh dari radikal bebas. Sistem antioksidan ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok enzimatik dan non-enzimatik. Antioksidan enzimatik terdiri dari superoxide dismutase (SOD), katalase, dan glutathione peroxidase. Antioksidan non-enzimatik terdiri dari vitamin E, A, provitamin A (beta karoten), dan vitamin
C. Antioksidan enzimatik secara alamiah dihasilkan oleh tubuh sedangkan antioksidan non-enzimatik diperoleh dari luar tubuh (Fouad, 2005).
Selain penggolongan antioksidan di atas, dikenal pula senyawa antioksidan alami seperti senyawa polifenol yang terdapat pada teh, buah-buahan, sayuran, anggur, bir, dan kecap (Sofia, 2005) dan senyawa antioksidan sintetik, yang lazim digunakan pada industri makanan, seperti BHA (butylated diduga bersifat karsinogenik (Rajeshwar et al., 2005) dan bersifat toksik pada dosis tinggi (Halliwell dan Gutteridge, 1999) sehingga mendorong semakin banyak eksplorasi bahan alam (Kikuzaki dan Nakatani, 1993) seperti polifenol, vitamin C, dan beta karoten, sebagai sumber antioksidan. Penelitian ini merupakan salah satu perwujudan eksplorasi bahan alam khususnya teh hijau dan teh hitam sebagai sumber antioksidan.
Minuman teh dikonsumsi di banyak negara, termasuk Indonesia, serta di berbagai lapisan masyarakat. Semua jenis teh dibuat dari sumber yang sama yaitu pucuk dan daun muda tanaman teh (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze.). Berdasarkan proses pengolahannya, produk teh dibagi menjadi tiga jenis yaitu teh hijau (tidak difermentasi), teh oolong (semifermentasi), dan teh hitam (fermentasi) (Tuminah, 2004).
Teh mempunyai banyak manfaat pada kesehatan, diantaranya sebagai antioksidan (Hartoyo, 2003). Manfaat teh sebagai antioksidan disebabkan oleh adanya senyawa polifenol yang berperan sebagai penangkap radikal bebas, seperti radikal hidroksil (Fulder, 2004). Fenol-fenol, senyawa dengan suatu gugus –OH yang terikat pada karbon cincin aromatik, merupakan antioksidan yang efektif. (Fessenden dan Fessenden, 1986). Senyawa-senyawa ini bereaksi dengan radikal bebas dan membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik (Cuvelier et al., 1994).
Senyawa polifenol di dalam teh sebagian besar merupakan senyawa golongan flavonoid subgolongan flavan-3-ol dan flavonol. Adanya banyak gugus bersifat polar sehingga dapat larut dalam pelarut seperti etanol atau air. Hal ini menjadi dasar pembuatan ekstrak teh hijau dan teh hitam menggunakan kombinasi cairan penyari etanol dan air. Diharapkan di dalam ekstrak etanol teh hijau maupun teh hitam senyawa polifenol dapat tersari dengan optimal. Teh hijau dan teh hitam, yang merupakan dua jenis teh yang populer di Indonesia, mengandung senyawa polifenol (pada persentase yang berbeda antara teh hijau dan teh hitam) sehingga ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam diduga memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal hidroksil.
Metode pengujian yang dipilih adalah metode deoksiribosa. Metode ini menggunakan deoksiribosa sebagai model biomolekul dari gula DNA yang terdapat di dalam tubuh sehingga secara tidak langsung memberikan gambaran reaksi radikal hidroksil dalam tubuh. Selain itu, metode ini relatif sederhana dan mudah. Prinsip metode ini adalah degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil, yang dihasilkan oleh reagen Fenton, menghasilkan malondialdehid (MDA) yang dapat bereaksi dengan asam tiobarbiturat (TBA) dalam suasana asam membentuk kromogen berwarna merah muda yang menyerap pada panjang gelombang maksimum 532 nm (Kunchandy and Rao, 1990). Adanya aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam diketahui dengan persen scavenging yang diperoleh dari selisih absorbansi larutan kontrol (tanpa sampel) dan larutan dengan sampel dibagi larutan kontrol dikalikan 100%. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil dapat dinyatakan dalam aktivitas penangkapan efektif 50% radikal hidroksil atau effective scavenging 50% (ES
50 ).
1. Permasalahan
a. Apakah ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam % scavenging?
b. Berapa nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan sebagai ES
50 ?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh pengetahuan penulis, uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa belum pernah dilakukan. Adapun penelitian yang telah dilakukan adalah aktivitas antioksidan dari berbagai macam ekstrak teh dikaitkan dengan aktivitas antimutageniknya (Yen dan Chen, 1995) dan validasi metode deoksiribosa sebagai uji penangkapan radikal hidroksil oleh vitamin C secara in vitro (Purwantoko, 2006).
3. Manfaat
a. Manfaat teoritis Mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam yang dinyatakan dengan % scavenging dan ES
50 . b. Manfaat metodologis Memberikan dukungan dari segi penelitian mengenai aplikasi uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil pada bahan-bahan alam khususnya ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam.
c. Manfaat praktis Memberikan pertimbangan mengenai penggunaan teh hijau dan teh hitam sebagai sumber antioksidan alami.
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk:
1. Mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan sebagai %
scavenging .
2. Mengetahui nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam ES 50 .
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Radikal Bebas Radikal bebas adalah spesi yang dapat berdiri sendiri yang merujuk kepada
atom atau gugus atom apa saja yang memiliki satu atau lebih elekron tak berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1986; Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Meskipun suatu radikal bebas tidak bermuatan positif atau negatif, spesi semacam ini sangat reaktif karena adanya elektron yang tak berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1986).
Radikal dapat dibentuk dari spesi non-radikal yang kehilangan satu elektronnya, penggabungan dengan satu elektron, atau terputusnya ikatan kovalen melalui peristiwa fisi homolitik (homolytic fission). Peristiwa ini terjadi apabila satu elektron dari pasangan elektron terikat pada masing-masing atomnya (Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Sumber radikal bebas, baik endogen maupun eksogen terjadi melalui sederetan mekanisme reaksi yaitu pembentukan awal radikal bebas (inisiasi), lalu perambatan atau terbentuknya radikal baru (propagasi), dan tahap terakhir (terminasi), yaitu pemusnahan atau pengubahan menjadi radikal bebas stabil dan tak reaktif (Sofia, 2005).
Reactive Oxygen Spesies (ROS) adalah suatu istilah yang digunakan para
peneliti untuk mencakup tidak hanya radikal oksigen tetapi juga beberapa spesi non-
Tabel I. Reactive oxygen species (ROS) (Halliwell dan Gutteridge, 1999; Sofia, 2005)
Radikal Non-radikalSuperoksida, Hidrogen peroksida, H
2 O
2 O
2 Hidroksil, Asam hipoklorit, HOCl
OH
Peroksil, Ozon, O
3 RO
2 Alkoksil, RO Oksigen singlet,
2
∆gO
- Hidroperoksil, Peroksinitrit, ONOO
HO
2 Oksigen aktif dalam bentuk superoksida, hidrogen peroksida, dan radikal
hidroksil merupakan hasil sampingan metabolisme normal dan menyerang molekul biologis yang dapat menyebabkan kerusakan sel atau jaringan (Yen dan Chen, 1995; Cerutti cit. Yen dan Chen, 1995). Radikal hidroksil merupakan bentuk yang amat reaktif dan dihasilkan oleh fotolisis ultraviolet hidrogen peroksida dan dapat berlaku sebagai toksikan primer dan sebagai sumber toksikan sekunder. Radikal hidroksil yang dihasilkan dekat DNA secara perlahan-perlahan dapat memecah rantai DNA dan berperan dalam karsinogenik, mutagenik serta sitotoksik (Rafat et al., cit. Roy et al., 2001).
Dalam sel, ROS sangat cepat ditangkap oleh sistem pertahanan antioksidan (antioxidant defense system). Saat peningkatan pembentukan ROS tidak dapat ditanggulangi oleh sistem pertahanan antioksidan, tercetus situasi yang disebut stress oksidatif. Semua ROS bersifat sangat reaktif karena memiliki konfigurasi elektron yang tidak stabil sehingga mampu menarik elektron dari molekul lainnya dan menciptakan radikal-radikal bebas lain yang mampu bereaksi dengan lebih banyak molekul lainnya (Blokhina, 2000). peroksida karena bereaksi dengan radikal bebas sehingga mempercepat penuaan. Kanker disebabkan oleh oksigen reaktif yang intinya memacu zat karsinogenik, sebagai faktor utama kanker. Oksigen reaktif dapat meningkatkan kadar LDL (low
density lipoprotein) yang kemudian menjadi penyebab penimbunan kolesterol pada
dinding pembuluh darah dengan akibat timbulnya atherosklerosis (Sofia, 2005).Radikal bebas yang dikenal sangat reaktif adalah radikal hidroksil. Nilai standar potensial reduksinya adalah 2,31 V. Radikal hidroksil bereaksi sangat cepat dengan hampir semua tipe molekul dalam sel hidup, yaitu gula, asam amino, fosfolipid, basa DNA, dan asam organik. Reaksi radikal hidroksil dengan DNA mengakibatkan kerusakan penting dalam sel, mengingat kerusakan rantai DNA tidak dapat dengan mudah diperbaiki oleh sel (Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Radikal hidroksil dapat dihasilkan dari reaksi Fenton atau reaksi fisi homolitik ikatan O-O pada H O .
2
2 2+ ˙
Reaksi Fenton: H
2 O 2 + Fe OH
→ Fe(III) + OH ¯ +
UV
2 OH H O O H
Fisi homolitik: Selain itu, radikal hidroksil juga dapat dibentuk dari reaksi H
2 O 2 dengan adanya ion-
- ion logam Cu (Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Reaksi radikal hidroksil dapat dikelompokkan menjadi tiga macam yaitu: abstraksi (pemisahan) hidrogen, adisi, dan transfer (perpindahan) elektron. Reaksi radikal bebas dengan spesi non-radikal menghasilkan radikal bebas baru yang kurang atau sama-sama reaktif dibandingkan radikal bebas awal. Contoh reaksi abstraksi menjadi sangat penting karena memiliki hubungan secara biologis dengan terjadinya peroksidasi lipid (Halliwell dan Gutteridge, 1999).
H H H + H O H C C O H OH H C C O H +
2 H H H H radikal hidroksietil
Reaksi adisi radikal hidroksil dapat terjadi pada reaksi radikal hidroksil dengan senyawa aromatik. Contohnya adisi radikal hidroksil pada cincin purin pada basa purin DNA menghasilkan radikal
δ-hidroksiguanin. Radikal hidroksil juga mengalami reaksi adisi pada atom yang mempunyai ikatan rangkap.
HO C C + OH C C
Jika radikal hidroksil menyerang DNA yang menyebabkan kerusakan pada basanya (dan gula deoksiribosa) maka hal ini akan memacu pecahnya ikatan pada DNA (Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Radikal hidroksil berperan pada transfer elektron, contohnya pada reaksi dengan ion halida. Reaksi transfer elektron dapat terjadi pada reaksi antara radikal hidroksil dengan ion halida dan dengan ion nitrit. Contoh reaksi radikal hidroksil dengan ion halida adalah sebagai berikut:
- OH Cl Cl OH +
- Cl Cl Cl
2 Reaksi antara radikal hidroksil dengan ion nitrit adalah sebagai berikut:
B.
Antioksidan
Istilah antioksidan sering digunakan namun sangat jarang didefinisikan secara jelas. Menurut Fessenden dan Fessenden (1986), antioksidan merupakan suatu inhibitor reaksi radikal bebas yang kadang-kadang dirujuk sebagai suatu “perangkap” radikal bebas. Kerja yang lazim suatu inhibitor radikal bebas adalah bereaksi dengan radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas tak reaktif dan relatif stabil. Menurut Halliwell dan Gutteridge (1999), antioksidan adalah substansi yang bila diberikan pada konsentrasi rendah dibandingkan substrat yang mudah dioksidasi, secara signifikan menunda atau menghambat oksidasi substrat tersebut.
Ada dua kategori antioksidan yaitu antioksidan enzim dan antioksidan non- enzimatik (Harman, 1981). Antioksidan enzim mencakup superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), dan glutation peroksidase (GPx). Superoksida dismutase mengubah superoksida menjadi hidrogen peroksida; katalase dan glutation peroksidase mengubah hidrogen peroksida dari reaksi SOD menjadi air. Sebagai tambahan, glutatione peroksidase dapat menurunkan peroksidasi lipid secara langsung (Blokhina, 2000).
Antioksidan non-enzimatik mencakup vitamin E, vitamin C, beta karoten, glutation, asam urat, dan albumin. Bersama-sama, enzim-enzim dan antioksidan non enzimatik mengubah ROS menjadi komponen yang lebih aman sebelum ROS menyebabkan kerusakan pada sel dan jaringan (Fouad, 2005).
Selain penggolongan antioksidan di atas, dikenal pula senyawa antioksidan alami seperti senyawa polifenol yang terdapat pada teh, buah-buahan, sayuran, digunakan pada industri makanan, seperti BHA (butylated hydroxyanisole) dan BHT (butylated hydroxytoluene).
C.
Teh
Semua jenis produk teh berasal dari sumber yang sama yaitu pucuk dan daun muda tanaman teh (Camellia sinensis). Keberagaman berbagai jenis teh yang ada disebabkan karena adanya perbedaan dalam proses pengolahannya (Werkhoven, 1988).
1. Klasifikasi dan pengolahan teh Secara umum, daun teh diolah menjadi teh hijau, teh oolong, dan teh hitam.
Teh hijau dan teh hitam telah umum diproduksi di Indonesia sedangkan teh oolong diproduksi di China. Perbedaan antara teh hijau dan teh hitam adalah pada ada tidaknya reaksi enzimatik yang berlangsung selama proses pengolahan teh. Pada teh hitam, dikenal adanya proses fermentasi sedangkan pada teh hijau proses fermentasi justru dicegah (Werkhoven, 1988). Pada teh oolong, proses pemanasan daun terjadi dalam waktu singkat setelah penggulungan sehingga disebut teh semifermentasi.
Karakteristiknya berada di antara teh hitam dan teh hijau (Syah, 2006). Proses pengolahan teh hijau dapat dilihat pada tabel II sedangkan proses pengolahan teh hitam dapat dilihat pada tabel III.
Pada proses fermentasi dalam pengolahan teh hitam, enzim polifenol oksidase akan mengubah senyawa polifenol menjadi theaflavin dan thearubigin.
Secara umum, theaflavin berperan dalam kecerahan (brightness) dan ketajaman kontak langsung dengan polifenol karena polifenol terdapat dalam vakuola sel sedangkan enzim polifenol oksidase terdapat dalam sitoplasma (Werkhoven, 1988; Syah, 2006).
Tabel II. Proses pengolahan teh hijau (Hartoyo, 2003) Tahap Tujuan Pelaksanaan pengolahan Pemanasan Menginaktifkan enzim oksidase dan Daun segar dimasukkan dalam rotary mengurangi kadar air daun sehingga panner suhu 90-100°C selama 5 mudah digulung. menit. Penggulungan Membuat bentuk daun menjadi ter- Daun digulung dengan orthodox gulung dan memeras cairan sel ke per- roller kecil selama 10-20 menit. mukaan. Pengeringan Mengurangi kadar air, mematikan Pengeringan secara bertahap. enzim yang mungkin masih punya 1.
Tahap 1: menggunakan pengering aktivitas, memperpanjang masa sim- sinambung suhu 100 °C selama pan, dan membentuk daun menjadi 20-22 menit. keriting dan berbutir.
2. Tahap 2 : menggunakan penge- ring berputar (rotary drier atau boll tea) dengan suhu 80°C selama 60-80 menit.
Sortasi Memisahkan partikel bukan teh, Mengayak, menghembus, menghi- menyeragamkan ukuran dan bentuk langkan serat dan tangkai, dan
partikel, dan menggolong-golongkan memotong (bila perlu).
dalam grade teh.Tabel III. Proses pengolahan teh hitam (Hartoyo, 2003; Werkhoven, 1988; Syah, 2006) Tahap Tujuan Pelaksanaan pengolahan Pelayuan Mengurangi kadar air daun sehingga Daun segar dialiri udara hangat ( ≤ mudah digulung dan dihancurkan.
30°C) dan kelembaban moderat (RH 60%) selama 18-20 jam. Penggulungan Memperkecil ukuran partikel daun dan Pucuk layu digulung bertahap dengan menciptakan kondisi fisik terbaik untuk mesin ortodhox roller (Primary mempertemukan polifenol dengan enzim rolling selama 40 menit, rotavane polifenol oksidase. selama 2 menit, dan secondary rolling selama 15 menit).
Fermentasi Mempertemukan polifenol dengan enzim Meletakkan pucuk tergulung pada
polifenol oksidase. baki selama 30 menit dengan suhu ruangan 26-28°C dan kelembaban 85-95%.Pengeringan Menghentikan aktivitas enzim dan Pengeringan secara sinambung
memperpanjang umur simpan. dengan suhu 90-100°(inlet) selama25-30 menit. Sortasi Memisahkan partikel bukan teh, Mengayak, menghembus, menghi- menyeragamkan ukuran dan bentuk langkan serat dan tangkai, dan
2. Kandungan kimia dalam teh Daun teh memiliki banyak senyawa kimia yang merupakan zat bioaktif.
Gambaran mengenai komposisi pucuk daun teh segar disajikan pada tabel IV.
Tabel IV. Komposisi dari daun teh segar (Werkhoven, 1988)
Senyawa % Senyawa %Polifenol yang dapat difermentasi
20 Fiber kasar, selulosa, lignin
22 Polifenol lain
10 Protein
16 Kafein
4 Lemak
8 Gula dan zat bergetah
3 Klorofil dan pigmen 1,5 Asam amino
7 Pektin
4 Mineral
4 Amilum 0,5 Larut dalam air, total
48 Tidak larut dalam air, total
52 Polifenol, kafein, asam amino, asam organik, mineral, dan gula terdapat dalam vakuola sel. Enzim-enzim terdapat dalam sitoplasma. Protein, lemak, dan tepung terdapat dalam protoplasma. Selulosa, pektin terdapat terdapat dalam dinding sel (Syah, 2006).
Secara garis besar, senyawa-senyawa aktif dalam daun teh dapat digolongkan menjadi empat kelompok, yaitu: substansi fenol, substansi bukan fenol, substansi penyebab aroma, dan enzim (Syah, 2006).
a. Substansi fenol. Polifenol dalam teh terdiri dari senyawa golongan flavonoid terutama subgolongan flavanol dan flavonol. Flavanol dalam teh secara struktural termasuk subgolongan flavan-3-ol. Catechin utama dalam teh terdiri dari (-)-Epicatechin, (-)-Epigallocatechin, (-)-Epicatechin 3-gallate, (-)-Epigallocatechin
3-gallate (Hartoyo, 2003; Syah, 2006). Kandungan catechin dalam produk teh hijau
adalah 16-30% berat kering teh (Syah, 2006). Gambar struktur kimia senyawa
Dalam proses pengolahan teh hitam, catechin dioksidasi oleh enzim polifenol oksidase menjadi theaflavin dan thearubigin. Secara garis besar, theaflavin terdiri dari theaflavin, theaflavin 3-galat, theaflavin 3´galat, theaflavin 3,3´ digalat, yang terbentuk karena adanya reaksi yang terjadi antara quinon (turunan catechin) dengan gallocatechin (Roy et al., 2001; Hartoyo, 2003).
OH OH
OH OH HO O HO O R R 1 1 OR OR 2 2 OH OH O OH O OH
X = OH Galat (X) = OH OH OH (-)-Epicatechin: R = R = H (-)-Catechin: R = R = H
1
2
1
2 (-)-Epigallocatechin: R = OH, R = H (-)-Gallocatechin: R = OH, R = H
1
2
1
2 (-)-Epicatechin gallate: R = H, R = X (-)-Catechin gallate: R = H, R = X
1
2
1
2 (-)-Epigallocatechin gallate: R = OH, R = X (-)-Gallocatechin gallate: R = OH, R = X
1
2
1
2 Gambar 1. Struktur kimia catechin dalam teh dan epimernya (Hartoyo, 2003)
Gambar struktur kimia theaflavin dan thearubigin dapat dilihat pada gambar
2. Kandungan theaflavin di dalam teh hitam adalah 0,3-2% dan thearubigin adalah 10-20% dari berat kering teh (Syah, 2006).
Flavonol utama dalam teh adalah quercetin, kaemferol, dan myricetin yang ada dalam jumlah 2-3%. Gambar struktur kimia flavonol dalam teh disajikan pada gambar 3. Flavonol ini, terutama terdapat dalam bentuk glikosidanya dan sedikit dalam bentuk aglikonnya (Hartoyo, 2003). Flavonol merupakan salah satu antioksidan alami yang terdapat dalam tanaman dan mempunyai kemampuan
OH OH
R OR 2 COOH OH HO O HO O COOH OH HO O HO O
O O
OH
R OH OR OH 1 O OH OH Galat =X =OH R = Galat
(a) (b)
Theaflavin: R = R = H
1
2 OH Theaflavin 3-galat: R = X, R = H
1
2 Theaflavin 3'-galat: R = H, R = X
1
2 Theaflavin 3,3'-digalat: R = X, R = X
1
2 Gambar 2. Struktur kimia theaflavin (a) dan thearubigin (b) (Hartoyo, 2003; Lambert dan Yang, 2003) R
2 B OH HO O R A C
3 R
1 OH O
Myricetin: R = R = R = OH
1
2
3 Quercetin: R = R =OH, R = H
1
2
3 Kaemferol: R = OH, R = R = H
1
2
3 Gambar 3. Struktur kimia flavonol dalam teh (Hartoyo, 2003)
b. Substansi bukan fenol. Termasuk di antaranya adalah karbohidrat (sukrosa, glukosa, dan fruktosa), pektin, alkaloid (kafein), klorofil, dan zat warna yang lain, protein dan asam amino, asam organik, substansi resin, vitamin (C, K, A, B1, dan B2), mineral (Mg, K, F, Na, Ca, Zn, Mn, Cu, dan Se). Selama proses c. Substansi penyebab aroma. Munculnya aroma pada teh hitam langsung atau tidak langsung selalu dihubungkan dengan terjadinya oksidasi senyawa
catechin. Substansi penyebab aroma teh digolongkan menjadi empat yaitu fraksi
karboksilat, fenolat, karbonil, dan fraksi netral bebas karbonil. Ada pendapat lain yang menyatakan bahwa aroma teh berasal dari penguraian protein, oksidasi karotenoid menjadi senyawa yang mudah menguap atau karena adanya minyak essensial dalam teh (Syah, 2006).
d. Kandungan enzim. Enzim yang terkandung dalam daun teh adalah invertase, amilase, β-glukosidase, oksimetilase, protease, dan peroksidase. Enzim lain yang tidak penting dalam proses kehidupan tanaman namun penting dalam proses pengolahan teh adalah polifenol oksidase (Syah, 2006).
3. Manfaat teh
Teh mempunyai banyak manfaat pada kesehatan, diantaranya antioksidan, menghambat oksidasi LDL (Low Density Lipoprotein), mereduksi kolesterol, antitrombosis, antimikroba, antivirus, memberikan perlindungan terhadap kanker, menurunkan tekanan darah, mengurangi kadar gula darah, mempertahankan berat tubuh ideal, dan mengurangi stress (Hartoyo, 2003).
4. Reaksi radikal hidroksil dengan polifenol dalam teh
Potensi teh sebagai antioksidan disebabkan oleh adanya senyawa polifenol yang merupakan senyawa flavonoid subgolongan flavan-3-ol dan flavonol. Senyawa terdapat dalam strukturnya. Reaksi antara gugus tersebut dengan radikal bebas akan membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik (Cuvelier et al., 1994). Tabel berikut menyajikan karakteristik dari struktur flavonoid yang turut menentukan aktivitas flavonoid sebagai penangkap radikal bebas yang efektif (Middleton et al., 2000). Gambaran gugus-gugus yang tercantum pada tabel V disajikan pada gambar 4. Menurut Ami