Uji aktivitas antioksidan ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora) dengan metode DPPH

vi

Riesky Beksono yang selalu mendukung dan menyayangi saya sehingga saya dapat menyelesaikan penelitian ini.

6. Suryani, S.Si yang sangat membantu saya dengan mengarahkan dan menyemangati saya dalam melakukan penelitian ini sehingga penelitian ini bisa selesai pada waktunya.

7. Lisna, S.Far yang mengajarkan saya dalam menjalankan penelitian ini. 8. Nilam Fajarwati selaku kakak tingkat yang membantu saya dalam

penelitian ini.

9. Bimo Dwi Pramesta, Muhammad Fahreza Kautsar, Dimas Bagus Pamungkas, Andhika Pangestu, Muhammad Arif Rahman, Nurul Khafidz, dan Lintang Suryaning Bumi selaku teman satu kontrakan GPL F45 yang selalu mendukung, membantu dan menyemangati saya dalam melakukan penelitian ini.

10.Muflikha Mayazi, Rahman Mukti Aji, Nurrohimah Fuad, Nurhabiba Edriana, dan Faizal Rachman selaku kelompok riset yang selalu memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian ini.

11.Nadisha Refira, Tiara Putri Methas, Ulfa Rosliana Putri, Aditya Bagus Wicaksono, Niken Nurul Paramesti, yang selalu menyemangati dan mambantu saya dalam melakukan penelitian ini.

12.Teman – teman SCORP CIMSA UIN.

13.Seluruh mahasiswa PSPD 2011 serta teman – teman yang tidak bisa saya sebutkan namanya satu persatu

Saya menyadari laporan penelitian ini masih jauh dari sempurna. Maka, penulis menerima adanya kritik dan saran yang berguna untuk penelitian ini.

Demikian laporan penelitian ini saya tulis, semoga bermanfaat bagi masyarakat dan para pembaca pada umumnya.

Ciputat, September 2014

vii ABSTRAK

Hanindyo Riezky. Program Studi Pendidikan Dokter. Uji aktivitas antioksidan ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora) dengan metode DPPH.

Radikal bebas adalah molekul yang dapat menyebabkan berbagai kerusakan molekular pada tubuh, sehingga dapat menimbulkan berbagai macam penyakit. Oleh karena itu banyak dilakukan penelitian mengenai radikal bebas dan antioksidan. Biji kopi robusta (Coffea canephora) diduga memiliki aktivitas antioksidan yang kuat sehingga mampu meredam aktivitas radikal bebas pada tubuh. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari ekstrak biji kopi robusta dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Cara maserasi dengan pelarut etanol dan air digunakan untuk membuat ekstrak. Konsentrasi yang digunakan pada uji aktivitas antioksidan ekstrak biji kopi robusta dimulai dari 50 ppm, 100 ppm, dan 200 ppm. Ekstrak biji kopi robusta dicampurkan dengan DPPH. Vitamin C dipilih sebagai kontrol positif. Spektrofotometer digunakan untuk pengukuran absorbansi dengan panjang gelombang 516 nm. Hasil penelitian ini menunjukan perubahan warna secara kualitatif pada ekstrak biji kopi dan vitamin C. Nilai IC50 ekstrak biji kopi robusta senilai 140,24 ppm dan termasuk aktivitas antioksidan sedang berdasarkan klasifikasi Blois.

Kata Kunci : antioksidan, ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora), DPPH ABSTRACT

Hanindyo Riezky. Medical Student Study Program. Antioxidant Activity Assay of Robusta Coffee Beans (Coffea canephora)Extract by DPPH Method. Free radicals can cause molecular damage to the body. The damage would cause various disease, so that many recent studies focused on antioxidant. Robusta coffee beans (Coffea canephora) is thought to have strong antioxidant activity that can reduce free radical activity in the body. The aim of this study is to know the antioxidant activity of extracts of Robusta coffee beans with DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). The extract was made by maceration with ethanol and water. The concentration used in the test of antioxdant activity of robusta coffee beans extract is strarting from 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm. Robusta coffee beans extract was added with DPPH. Spectrophotometer UV – Vis used to measure in maximum wave length 516 nm. Result of this study show color changed qualitatively both on coffee and vitamin C. IC50 value of robusta coffee beans is 140,24 ppm and classified as medium antioxidant according to Blois classification.

Keywords : Antioxidant, Coffee Robusta Beans (Coffea canephora) Extract, DPPH

viii DAFTAR ISI

Halaman

LEMBAR JUDUL...i

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... ii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

LEMBAR PENGESAHAN ... iv

KATA PENGANTAR ... v

ABSTRAK ... vii

ABSTRACT ... vii

DAFTAR ISI ... viii

DAFTAR TABEL ... xi

DAFTAR GAMBAR ... xii

BAB 1... 1

PENDAHULUAN... 1

1.1. Latar Belakang... 1

1.2. Rumusan Masalah ... 2

1.3. Tujuan Penelitian ... 3

1.3.1. Tujuan Umum ... 3

1.3.2. Tujuan khusus ... 3

1.4. Manfaat penelitian ... 3

1.4.1. Untuk Institusi ... 3

1.4.2. Untuk Mahasiswa ... 3

1.4.3. Untuk Masyarakat ... 3

BAB 2... 4

TINJAUAN PUSTAKA... 4

2.1. Kopi ... 4

2.2. Simplisia ... 6

2.3. Ekstrak dan Ekstraksi ... 6

2.3.1. Ekstrak... 6

ix

2.4. Antioksidan... 7

2.4.1. Vitamin C ... 8

2.5. Radikal Bebas ... 9

2.6. Uji Aktivitas Antioksidan ... 11

2.6.1. Metode DPPH ... 11

2.6.2. Metode ABTS ... 12

2.6.3. Metode Deoksiribosa ... 12

2.7. Spektrofotometer UV – VIS ... 12

2.8. Kerangka Teori ... 13

2.9. Kerangka Konsep ... 14

2.10. Definisi Operasional ... 15

BAB 3... 16

METODE PENELITIAN ... 16

3.1. Desain Penelitian ... 16

3.2. Waktu dan Tempat penelitian ... 16

3.3. Sampel ... 16

3.4. Alat dan Bahan Penelitian ... 16

3.4.1. Alat Penelitian ... 16

3.4.2. Bahan Penelitian... 16

3.5. Cara Kerja Penelitian ... 17

3.5.1. Penyiapan Sampel ... 17

3.5.2. Pembuatan ekstrak biji kopi ... 17

3.5.3. Pembuatan Larutan... 17

3.6. Pengukuran Absorbansi ... 18

3.7. Manajemen Analis Data Antioksidan ... 19

BAB 4... 20

HASIL DAN PEMBAHASAN ... 20

4.1. Hasil Ekstraksi Biji Kopi Robusta ... 20

4.2. Absorbansi dan Persen Penghambatan ... 20

4.3. Penetapan Nilai IC50 ... 23

BAB 5... 26

x

5.1. Simpulan ... 26

5.2. Saran ... 26

DAFTAR PUSTAKA ... 27

xi

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 3.1 Pembuatan larutan seri ekstrak biji kopi ... 18 Tabel 3.2 Pembuatan larutan seri vitamin C ... 18 Tabel 3.3 Klasifikasi aktivitas antioksidan ... 19 Tabel 4.1 Nilai absorbansi dan % penghambatan ekstrak biji kopi robusta ... 22 Tabel 4.2 Nilai absorbansi dan % penghambatan vitamin C ... 22 Tabel 4.3 Nilai IC50 ... 24

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Tanaman kopi robusta ... 4

Gambar 2.2 Biji kopi robusta ... 4

Gambar 2.3 Tanaman kopi arabika ... 5

Gambar 2.4 Biji kopi arabika ... 5

Gambar 2.5 Radikal DPPH dan bentuk stabilnya ... 11

Gambar 4.1 Larutan seri ekstrak konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm ... 20

Gambar 4.2 Larutan seri vitamin C 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm ... 21

Gambar 4.3 Persamaan regresi linear ekstrak biji kopi robusta ... 23

Gambar 4.4 Persamaan regresi linear vitamin C ... 23

Gambar 6.1 Hasil determinasi ... 30

Gambar 6.2 Larutan hasil maserasi ... 31

Gambar 6.3 Proses evaporasi ... 31

Gambar 6.4 Ekstrak biji kopi robusta ... 31

1 BAB 1

PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Kopi merupakan tanaman yang banyak ditemukan pada beberapa negara di belahan dunia dan telah dikonsumsi sebagai minuman. Negara maju dan negara berkembang, tidak ingin ketinggalan untuk mengkonsumsi kopi. Kopi yang paling sering beredar dipasaran berasal dari biji kopi robusta (Coffea canephora) dan biji kopi arabika (Coffea arabica).1 Kopi robusta memliki ketahanan yang lebih tinggi dibanding kopi arabika. Kopi robusta lebih tahan terhadap hama dan penyakit dibandingkan kopi arabika. Selain itu kopi robusta dapat tumbuh di iklim apapun, tidak seperti kopi arabika yang sangat tergantung iklim dan cuaca.2

Begitu banyak orang yang mengkonsumsi kopi tetapi juga tidak sedikit orang yang menghindari kopi karena hanya mengetahui efek negatif kopi. Beberapa laporan penelitian menyebutkan efek negatif dari kopi tersebut namun pada penelitian lainnya menunjukan bahwa kopi memiliki efek yang cukup baik bagi kesehatan. Kopi diteliti memiliki efek antimikroba seperti mengambat pertumbuhan bakteri Escherchia coli.3 Kandungan kafein dalam kopi diduga berperan dalam sistem saraf simpatik dan berperan dalam peningkatan tekanan darah dan terjadinya hipertensi pada beberapa orang.4 Penelitian epidemiologis sebelumnya menyebutkan bahwa kopi memiliki beberapa manfaat untuk kesehatan yaitu dapat mencegah penyakit kronik.5 Salah satu zat dari kopi yang bermanfaat bagi kesehatan yaitu kandungan antioksidan kopi yang cukup tinggi.6

Antioksidan merupakan pertahanan pertama tubuh kita terhadap kerusakan sel yang disebabkan oleh radikal bebas dan sangat penting untuk menjaga kesehatan tubuh agar optimum. Antioksidan mampu menginaktivasi atau menstabilisasi radikal bebas sebelum radikal bebas menyerang sel. Antioksidan sangat penting dalam menjaga sel dan kesehatan sistemik. Secara keseluruhan radikal bebas terlibat dalam patogenesis kebanyakan penyakit, namun pembentukan radikal bebas (dalam tubuh kita) dapat dikontrol oleh antioksidan dalam tubuh kita. Ketika kadar antioksidan dalam tubuh kita tidak terlalu banyak kerusakan yang

2

ditimbulkan oleh radikal bebas dapat berakumulasi dan menimbulkan dampak yang cukup serius terhadap kesehatan. Antioksidan dapat ditemukan dalam berbagai zat seperti vitamin C, vitamin E atau beberapa sumber makanan contohnya kopi.7

Beberapa penelitian menyebutkan kopi memiliki kandungan polifenol yang tinggi yang memainkan peran penting dalam kandungan antioksidan pada kopi. Zat seperti polifenol dan juga melanoid pada kopi ternyata memilik efek antioksidan yang tinggi. Zat polifenol tersebut terkandung dalam kopi seperti pada biji kopi robusta dan biji kopi arabika.8 Polifenol diteliti memiliki efek antioksdian yang baik untuk kesehatan yaitu sebagai pencegahan terhadap penyakit kardiovaskular, kanker, dan osteoporosis serta diduga berperan dalam pencegahan penyakit neuro degeneratif dan diabetes mellitus.6 Kandungan polifenol pada kopi juga diteliti berbeda beda bergantung pada wilayah dimana kopi ditanam. Kandungan asam klorogenik pada kopi yang berasal dari Meksiko dan India lebih tinggi dibanding yang terdapat di Cina.9

Berdasarkan uraian di atas telah jelas bahwa kopi selain memiliki beberapa efek negatif terhadap kesehatan akibat kandungan kafeinnya, ternyata kopi juga memiliki efek yang baik terhadap kesahatan terutama karena kandungan antioksidannya.6 Beberapa penelitian diluar negeri menyatakan bahwa biji kopi memiliki kandungan antioksidan didalamnya, namun di Indonesia belum ada penelitian yang menjelaskan mengenai kandungan antioksidan pada kopi robusta yang ditanam di indonesia. Oleh karena itu penulis ingin membuktikan apakah biji kopi robusta memiliki kandungan antioksidan atau tidak.

1.2.Rumusan Masalah

3

1.3.Tujuan Penelitian 1.3.1. Tujuan Umum

 Untuk mengetahui kadar antioksidan pada ekstrak biji kopi robusta dengan metode DPPH dengan berbagai konsentrasi larutan uji

1.3.2. Tujuan khusus

 Untuk mengetahui apakah kopi robusta tergolong menjadi antioksidan kuat, sedang atau lemah.

1.4.Manfaat penelitian 1.4.1. Untuk Institusi

 Memberi informasi mengenai kandungan antioksidan biji kopi robusta sehingga dapat bermanfaat untuk penelitian selanjutnya

1.4.2. Untuk Mahasiswa

 Untuk meningkatkan kemampuan penggunaan alat didalam laboratorium

 Menambah pengetahuan peneliti mengenai kandungan antioksidan pada kopi

1.4.3. Untuk Masyarakat

 Memberikan informasi kepada masyarakat bahwa kopi mengandung antioksidan

 Mengetahui kandungan antioksidan kopi robusta yang biasa dikonsumsi masyarakat

6

2.2. Simplisia

Simplisia terbagi menjadi 2 yaitu simplisia hewani dan simplisia nabati. Simplisia merupakan bahan dari alam baik dari tumbuhan ataupun hewan yang mengandung bahan aktif yang belum mengalami pemrosesan sama sekali kecuali dikeringkan.11

2.3. Ekstrak dan Ekstraksi 2.3.1. Ekstrak

Ekstrak merupakan sediaan pekat yang berasal dari simplisia. Simplisia mengandung senyawa aktif dan pelarut yang diuapkan hingga tersisa senyawa yang dibutuhkan. Simplisia dapat berasal dari simplisia hewani dan simplisia nabati.11

2.3.2. Ekstraksi

Ekstraksi merupakan pemisahan bagian bagian tanaman atau bahan bahan lain dari bagian inaktif dengan menggunakan pelarut selektif sesuai dengan prosedurnya. Ekstraksi dapat berupa dari solid menjadi liquid, liquid menjadi liquid dan juga ekstraksi asam basa. Pelarut yang biasanya digunakan dapat berupa metanol, etanol, dll.11

Beberapa metode uang biasa digunakan untuk ekstraksi adalah

 Maserasi

Maserasi merupakan teknik perendaman dimana zat yang sudah diperhalus (dalam partikel yang lebih kecil) direndam menggunakan pelarut seperti metanol dengan beberapa kali diaduk atau dikocok pada suhu ruangan, dengan metode ini tidak semua bahan aktif terekstraksi.11

 Perkolasi

Prosedur ini paling sering digunakan untuk bahan ekstrak yang berupa cairan. Dengan metode ini bahan yang ingin diekstraksi direndam dalam pelarut hingga seluruh bahan aktifnya tertarik. Salah satu ciri khas dari

7

metode ini adalah pelarut yang digunakan selalu baru. Metode ini biasanya dilakukan pada suhu kamar.11

 Infusi

Dilakukan dengan cara memaserasi material menggunakan air dingin atau air panas dalam waktu yang singkat.11

 Digesti

Bentuk dari maserasi dengan pemanasan selama proses ekstraksi.11

 Dekoktasi

Metode ini menggunakan cara perebusan material menggunakan air pada volume tertentu dan waktu yang telah ditetapkan selanjutnya didinginkan dan disaring.11

2.4. Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa dalam tubuh kita yang berperan sebagai pertahanan pertama tubuh terhadap radikal bebas, dan sangat penting untuk menjaga kondisi optimum dalam tubuh kita. Kebutuhan terhadap antioksidan menjadi sangat penting seiring dengan meningkatnya kadar radikal bebas oleh karena rokok, polusi, stres dll.7

Radikal bebas mampu menyerang sel pada tubuh, menyebabkan sel - sel tersebut kehilangan struktur dan fungsinya. Kerusakan sel akibat radikal bebas merupakan kontributor yang cukup besar terhadap penuaan dan atau penyakit degeneratif seperti penyakit kardiovaskular, katarak, penurunan sistem imun dan kanker. Untungnya pembentukan radikal bebas dalam tubuh kita dikontrol oleh antioksidan. Antioksidan mampu untuk menstabilkan atau menginaktivasi radikal bebas sebelum radikal bebas menyerang sel. Beberapa contoh antioksidan alami adalah vitamin E (tokoferol) yang larut dalam lemak serta vitamin C yang larut air.12

8

Antioksidan secara umum terbagi menjadi dua : 1. Antioksidan enzimatis

Contohnya superoksida dismutase, katalase dan glutation peroksidase.

 Superoksida dismutase berkerja dengan cara mengkonversi anion superoksida menjadi hidrogen peroksida dan O2, sering juga disebut pertahanan primer terhadap stress oksidatif karena superoksida adalah inisiator kuat reaksi berantai.

 Hidrogen peroksida sekali terbentuk harus direduksi menjadi air untuk mencegah terbentuknya radikal hidroksil. Salah satu enzim yang mampu mengurangi pembentukan hidrogen peroksida adalah katalase.

 Glutation merupakan salah satu zat yang berperan penting dalam perlindungan akibat kerusakan oksidatif. 12

2. Antioksidan Non Enzimatis

 Antioksidan non enzimatis merubah radikal bebas menjadi bentuk yang non radikal dan tidak toksik melalui cara non enzimatik, antioksidan non enzimatik menetralkan radikal bebas dengan menyumbangkan satu atom hidrogen kepada radikal bebas tersebut sehingga mengurangi radikal bebas dan mereka ikut teroksidasi bersama reaksi. Antioksidan non enzimatis dapat diperoleh secara endogen maupun dalam asupan makanan sehari hari. Asupan makanan sehari hari seperti vitamin E, vitamin C, karotenoid, dan flavonoid dan endogen berupa urat dan melatonin.12 2.4.1. Vitamin C

Meskipun vitamin C atau asam askorbat merupakan koenzim oksidasi – reduksi yang berfungsi dalam sintesis kolagen dan reaksi lainnya, vitamin C juga berperan dalam pertahanan terhadap radikal bebas. Pengurangan askorbat dapat meregenerasi bentuk tereduksi dari vitamin E melalui donasi elektron pada reaksi redoks. Vitamin C merupakan zat larut air dan bersirkulasi tanpa terikat pada darah dan cairan ekstraseluler, dan memiliki akses ke vitamin E melalui membran dan partikel lipoprotein.12,

9

2.5. Radikal Bebas

Radikal bebas didefinisikan sebagai suatu molekul yang mengandung satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan yang menempati molekul orbitalnya sendiri.13 Radikal bebas dan ROS lainnya merupakan derivat dari proses esensial metabolit normal pada tubuh manusia atau dari eksternal seperi paparan sinar X, ozon, merokok, polusi udara, dan zat kimia industri.7

Pembentukan radikal bebas pada sel terus menerus terjadi sebagai konsekuensi kedua reaksi enzimatik ataupun non enzimatik. Reaksi enzimatik yang menyebabkan sumber terbentuknya radikal bebas mencakup reaksi respiratori, fagositosis, sintesis prostaglandin dan sistem sitokrom P450. Radikal bebas juga dapat terbentuk melalui reaksi non - enzimatik oksigen dengan komponen organik.13

Beberapa sumber radikal bebas internal:

 Fagosit

 Xantin oksidase

 Reaksi yang melibatkan besi dan metal lainnya

 Jalur arakidonat

 Peroksisom

 Inflamasi

 Iskemik

Beberapa sumber radikal bebas eksternal

 Merokok

 Polusi lingkungan

 Radiasi

 Sinar UV

 Beberapa obat, pestisida dan anestesi

10

Beberapa contoh pembentukan radikal bebas

 Pembentukan radikal bebas enzimatik xantinoksdase

Xanthine + O2 + H2O urat + O2- + 2H+ NADPH + 2O2 NADPH oksidase NADP+ + 2O2- +H+

 Pembentukan radikal bebas non enzimatik Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH

Fe2+ + O2 Fe3+ + O2

-Radikal bebas dapat menyebabkan berbagai kerusakan molekular pada tubuh seperti pada lemak, protein, karbohidrat dan DNA.14 Penyakit yang dapat ditimbulkan pun dapat bermacam macam seperti :

 Penyakit kardiovaskular

Penyakit kardiovaskular dapat disebabkan oleh karena kerusakan pada endotel, yang dapat menyebabkan terjadinya hipertensi.14

 Penyakit Neurodegeneratif

Jaringan saraf termasuk otak sangat rentan terpapar oleh radikal bebas, diakibatkan karena tingginya kadar asam lemak tak jenuh.14

 Keganasan

DNA merupakan target utama dari radikal bebas. Kerusakan ini dapat menyebabkan terjadinya mutasi pada DNA tersebut sehingga memicu keganasan pada sel somatik.

Radikal bebas tidak hanya memberikan efek negatif pada tubuh, jumlah sedikit dari radikal bebas dalam tubuh dapat berfungsi sebagai :

1. Fosforilasi oksidatif 2. Apoptosis sel

12

Keuntungan metode ini adalah DPPH dapat direaksikan dengan bahan apapun dan dapat mendeteksi kadar antioksidan yang lemah sedikitpun. Konsentrasi awal DPPH yang diberikan harus memberikan hasil kurang dari 1 (50 - 100 μM). Molekul DPPH mudah terdegradasi sehingga harus dikerjakan dengan cepat dan hati – hati. 15

2.6.2. Metode ABTS

ABTS atau 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) merupakan metode lain yang dapat digunakan untuk mengukur kadar antioksidan. ABTS dan pottasium persulfat akan dicampur diruang gelap dengan temperatur ruangan selama 16 jam sebelum digunakan, nantinya akan menghasilkan radikal ABTS. Nantinya zat yang akan diuji direaksikan dengan radikal ABTS dan hasilnya akan diukur menggunakan spektrofotometer dan dibaca setelah 6 menit.17 2.6.3. Metode Deoksiribosa

Deoksiribosa akan teroksidasi ketika terpapar radikal hidroksil yang dihasilkan oleh reagen fenton. Hasilnya dapat dideteksi dengan pemanasan menggunakan 2 - thiobarbituric acid (TBA) dalam kondisi asam agar muncul warna merah muda chromogen dan absorbansinya diukur pada panjang gelombang 532 nm.18

2.7. Spektrofotometer UV – VIS

Spektrofotometer UV – Vis merupakan alat analisa kuantitatif dan semikualitatif yang sering digunakan. Bekerja dengan transisi molekul elektron dari cahaya yang diserap pada ultraviolet dan pada sinar yang tampak pada spektrum elektromagnetik. Panjang gelombang yang diukur menggunakan spektorfotometer diukur dalam satuan nanometer (nm). Pengukuran absorbansi oleh spektrofotometer berdasarkan hukum Lambert – Beer dimana absorbansi tergantung oleh cahaya yang melewati substansi, produk koefisien absorbansi dari substansi dan juga jarak cahaya melalui material.19

13

2.8. Kerangka Teori

Antioksidan

Endogen

Non enzimatis Enzimatis

Eksogen

Kandungan melanoid dan

polifenol Ekstrak Biji Kopi

DPPH+ + antioksidan  DPPH2 Terdapat elektron

bebas Metode DPPH

DPPH Bersifat antioksidan

Aktivitas antioksidan semakin banyak terhadap

DPPH

Perubahan warna dari violet menjadi

kuning Metode Deoksiribosa Metode ABTS

14

2.9. Kerangka Konsep

Ekstrak Biji kopi mengandung

antioksidan

analisis Spektrofotometer

15

2.10. Definisi Operasional

NO Variabel Definisi Cara Ukur Alat Ukur Skala Ukur Hasil ukur

1 Konsentr asi ekstrak biji kopi

Konsentrasi larutan yang diuji dalam ppm

Rumus V1 x M1= V2 x M2

- numerik 50 ppm

100 ppm 150 ppm 200 ppm 2 Absorba

nsi sampel

Nilai absorbansi tiap sampel Diukur mengguna kan spektrofoto meter

spektrofotometer numerik Nm

3 IC50 Kemampuan substrat atau ekstrak untuk menghambat reaksi biologi atau biokimia sebesar 50% Mengguna kan persamaan regresi linier

- Kategorik

ordinal

Klasifikasi Blois: IC50 < 50 μg/ml = sangat kuat IC50 50-100 μg/ml = kuat IC50 101-150 μg/ml= sedang IC50 151-200 μg/ml = lemah IC50> 200 μg/ml = tidak aktif

16 BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1.

Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian observasional untuk mengetahui kadar antioksidan biji kopi dengan menggunakan metode DPPH.

3.2.

Waktu dan Tempat penelitian

Penelitian di laksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Uin Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian dimulai dari bulan Januari hingga Agustus 2014.

3.3.

Sampel

Biji kopi robusta ini dideterminasi oleh Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bogor. Determinasi dilakukan untuk menentukan apakah spesies yang digunakan sesuai dengan bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini. Hasil determinasi menunjukan bahwa sampel yang diuji benar yaitu biji kopi robusta. Biji kopi robusta kemudian dibuat larutan ekstraknya dalam berbagai konsentrasi.

3.4.

Alat dan Bahan Penelitian

3.4.1.

Alat Penelitian

Timbangan analitik; tabung reaksi; tabung Erlenmeyer; cawan; gelas ukur; labu ukur 10 ml; kaca arloji; batang pengaduk; botol gelap; gelas beaker; mikropipet; tip; alumunium foil; kuvet; spektrofotometer UV-Vis Hitachi 2,2 solution 17; kertas saring; evaporator; shaker waterbath; termometer; dan hotplate with magnetic stirer.20

3.4.2.

Bahan Penelitian

17

3.5.

Cara Kerja Penelitian

3.5.1.

Penyiapan Sampel

Biji kopi robusta yang didapatkan di pasar dan sudah dideterminasi untuk selanjutnya disiapkan untuk diekstraksi.

3.5.2.

Pembuatan ekstrak biji kopi

Pembuatan ekstrak biji kopi dilakukan oleh peneliti di laboratorium biologi. Biji kopi pertama digiling lalu disimpan dalam lemari pendingin sampai dilakukannya analisis. Sampel kopi selanjutnya diekstrak dengan menggunakan pelarut etanol dan juga air, rasio perbadingan antara etanol dan air adalah 600 ml : 400 ml. Kopi sebanyak 20 gram dilarutkan dengan 1 liter (L) etanol dan air, dengan perbandingan yang telah disebutkan diatas, setelah itu larutan dihomogenkan menggunakan hot plate with magnetic stirer selama 3 jam dengan suhu 60° C setelahnya lakukan penyaringan dengan kertas saring. Setelah disaring lakukan evaporasi menggunakan evaporator.20

3.5.3.

Pembuatan Larutan

a) Pembuatan Larutan DPPH

 Timbang 0,0007 gram DPPH

 Larutkan dalam metanol sebanyak 14 ml

 Kocok larutan hingga homogen lalu masukan ke dalam botol gelap

 Ukur absorbansi dengan menggunakan spektrofomotometer agar mendapatkan panjang gelombang maksimum. 20

b) Pembuatan Larutan kontrol negatif

 2500 μl metanol dicampur dengan 500 μl larutan DPPH

18

c) Pembuatan Larutan uji 1. Larutan Induk (1000 ppm)

10 g ekstrak biji kopi dilarutkan kedalam 10 ml etanol = 1000 ppm 2. Larutan Seri

Tabel 3.1 Pembuatan larutan seri ekstrak biji kopi Konsentrasi

(ppm)

Larutan Induk Biji Kopi (μl)

Etanol (μl) DPPH (μl)

50 ppm 600 μl 1900 μl 500 μl

100 ppm 450 μl 2050 μl 500 μl

150 ppm 300 μl 2200 μl 500 μl

200 ppm 150 μl 2350 μl 500 μl

a. Pembuatan Larutan Kontrol Positif Vitamin C (Nabavi sf 2011)

1. Larutan Induk (100 ppm)

1 mg Vitamin C murni dilarutkan dalam 10 ml etanol 2 Larutan seri (2,4,6,8 ppm)

3.6.

Pengukuran Absorbansi

Seluruh larutan kontrol, larutan ekstrak biji kopi dan larutan standar positif (vitamin C) dikocok menggunakan shaker waterbath dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit dalam keadaan gelap (ditutup alumunium foil). Hal ini dilakukan karena radikal DPPH mudah didegradasi oleh cahaya.2 Ketika DPPH bereaksi dengan komponen, terjadi perubahan warna dan akan terbaca pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 516 nm. Selanjutnya ketika hasilnya sudah didapat dicari persen hambat masing masing larutan dengan menggunakan rumus16 :

Konsentrasi (ppm)

Larutan Induk Biji Kopi (μl)

Etanol (μl) DPPH (μl)

2 ppm 60 μl 2440 μl 500 μl

4 ppm 120 μl 2380 μl 500 μl

6 ppm 180 μl 2320 μl 500 μl

8 ppm 240 μl 2260 μl 500 μl

19

% penghambatan =

x 100%

Setelah didapatkan % aktivitas hambatan dicari nilai IC50 melalui persamaan regresi linier y = a + bx

3.7.

Analis Data Antioksidan

Data antioksidan pada radikal DPPH (% penghambatan) ekstrak biji kopi dianalisis dan dihitung nilai IC50 nya. Semakin kecil nilai IC50 maka aktivitas antioksidan semakin kuat. Penelitian ini menghitung dan menganalisis nilai IC50 dengan mengunakan persamaan regresi linear.16 Data % hambatan dan konsentrasi larutan digunakan untuk mencari nilai IC50 dengan persamaan regresi linear y = a + bx, dimana y adalah % hambat (senilai 50) dan x adalah nilai IC50.21 Dibawah ini tabel mengenai klasifikasi aktivitas antioksidan menurut Blois:

Tabel 3.3 Klasifikasi aktivitas antioksidan16,22:

No. Nilai IC50 Antioksidan

1. < 50 ppm Sangat kuat

2. 50-100 ppm Kuat

3. 100-150 ppm Sedang

22

Setelah dilihat secara kualitatif, seluruh larutan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 516 nm. Panjang gelombang 516 merupakan panjang gelombang maksimum dari DPPH, bertujuan untuk mendapatkan nilai absorbansi maksimum pada larutan yang akan diuji. Setelah didapatkan absorbansi dicari persentase penghambatan masing - masing konsentrasi.

Tabel 4.1 Nilai absorbansi dan persentase penghambatan ekstrak biji kopi

NO Konsentrasi

(ppm)

Rata – rata nilai absorbansi

% Penghambatan

1 50 ppm 0,294 8,97 %

2 100 ppm 0,198 38,69 %

3 150 ppm 0,152 52,94 %

4 200 ppm 0,0843 73,90/%

*Larutan kontrol = 0,323 nm

Tabel 4.2 Nilai absorbansi dan persentase penghambatan vitamin C

NO Konsentrasi

(ppm)

Rata – rata nilai absorbansi

% Penghambatan

1 2 ppm 0,1923 40,46%

2 4 ppm 0,166 48,60%

3 6 ppm 0,113 65,01%

4 8 ppm 0,073 77,39%

*Larutan kontrol = 0,323 nm

Berdasarkan tabel 4.1 dan 4.2 menunjukan bahwa semakin besar konsentrasi semakin kecil absorbansinya karena semakin tinggi konsentrasi larutan maka aktivitas antioksidan semakin tinggi. Ditandai dengan warna larutan DPPH yang semakin pucat dan semakin besarnya nilai % penghambatan.

Setelah mendapatkan hasil persentase penghambatan, dibuat grafik anatara konsentrasi larutan (x) dan % penghambatan (y), sehingga diapatkan persamaaan regresi linear. Grafik dibawah menunjukan persamaan regresi linear ekstrak biji kopi dan vitamin C.

23

Gambar 4.3 Persamaan regresi linear ekstrak biji kopi

Gambar 4.4 Persamaan regresi linear vitamin C

4.3. Penetapan Nilai IC50

Nilai IC50 didapatkan melalui persamaan regresi linear dengan menggunakan microsoft excel agar didapatkan persamaan regresi linear. Nilai IC50 yang semakin kecil menunjukan aktivitas antioksidan yang lebih besar.16

y = 0,4181x - 8,635 R² = 0,9804

0 20 40 60 80

0 50 100 150 200 250

% p e n g h a m b a ta n konsentrasi (ppm)

y = 6,36x + 26,065 R² = 0,9853

0 20 40 60 80 100

0 2 4 6 8 10

% p e n g h a m b a ta n konsentrasi (ppm)

24

Setelah dilakukan perhitungan, nilai IC50 dari biji kopi robusta dan vitamin C didapatkan data sebagai berikut :

Tabel 4.3 Nilai IC50

NO Bahan Nilai IC50

1 Ekstrak Biji Kopi Robusta 140,24 ppm

2 Vitamin C 3,76 ppm

Pada tabel 4.3 menunjukan biji kopi robusta memiliki nilai IC50 sebesar 140,24 ppm. Berdasarkan klasifikasi Blois maka aktivitas antioksidan dari biji kopi robusta tergolong dalam kategori antioksidan sedang. Hasil ini berbeda dengan penelitian Antonio Zuoro dkk yang menjelaskan bahwa aktivitas antioksidan biji kopi robusta dengan pelarut etanol dan air didapatkan nilai EC50 sebesar 0,86 – 7,53% dan tergolong ke dalam antioksidan sangat kuat.20 Lama penyimpanan dari biji kopi robusta juga mempengaruhi kandungan antioksidan yang terkandung dalam biji kopi robusta. Kadar polifenol dalam kopi akan semakin tinggi pada kopi yang disimpan dalam waktu singkat dibandingkan kopi yang disimpan dalam waktu yang lama.23 Biji kopi robusta memiliki kandungan antioksidan karena kandungan polifenolnya. Polifenol merupakan mikronutrien yang terdapat pada beberapa asupan makanan, dan flavonoid merupakan salah satu metabolit sekunder dari senyawa polifenol dan cenderung larut dalam pelarut polar.24,25 Polifenol bersifat antioksidan sehingga dapat meredam radikal bebas.6 Tabel diatas juga menunjukan nilai IC50 dari vitamin C sebesar 3,76 ppm yang menunjukan bahwa vitamin C tergolong sebagai antioksidan yang sangat kuat.

Miguel dkk dalam penelitiannya menjelaskan bahwa aktivitas antioksidan biji kopi arabika dengan metode ABTS dengan pelarut metanol dan air tergolong sebagai antioksidan kuat.26 Metode ABTS merupakan metode yang hampir mirip dengan metode DPPH. keduanya menggunakan radikal bebas, namun radikal ABTS harus dibuat dengan cara mencampurkan ABTS dengan kalium persulfat terlebih dahulu sebelum direaksikan dengan zat yang telah diekstraksi.17

Penelitian lain juga menyebutkan bahwa kadar antioksidan biji kopi robusta lebih tinggi dibandingkan biji kopi arabika. Namun ketika dilakukan

25

pemanggangan, kadar aktivitas antioksidan biji kopi arabika akan lebih tinggi dibandingkan dengan biji kopi robusta.27

Uji aktivitas antioksidan pada biji kopi arabika dan biji kopi robusta yang masih hijau dengan metode DPPH, menunjukan kadar antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan biji kopi arabika dan biji kopi robusta yang telah melalui proses pemanggangan.28

26 BAB 5

SIMPULAN DAN SARAN

5.1.Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, pada berbagai konsentrasi larutan uji ekstrak biji kopi robusta didapatkan aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 140,24 ppm dan tergolong sebagai antioksidan sedang menurut Kriteria Blois.

5.2.Saran

1. Perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui senyawa apa pada biji kopi robusta yang bersifat antioksidan.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap kandungan lain dari biji kopi robusta seperti kafein.

3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai manfaat biji kopi robusta sebagai antibakterial.

4. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut apakah biji kopi robusta dapat dijadikan obat.

27

DAFTAR PUSTAKA

1. Wang, Kan. Agrobacterium protocols. Edisi 2. Totowa New Jersey : Humana press inc 2006

2. Farah, A., Donangelo, C. M. Phenolic compounds in coffee. Braz. J. Plant Physiol 2006; 18, 23–36.

3. Fardiaz, srikandi. Antimicrobial activity of coffee (Coffea robusta) extract. ASEAN Food Journal 1995

4. Robertson D, Frolich JC, Carr RK, et al. Effects of caffeine on plasma renin activity, catecholamines and blood pressure. N Engl J Med 1978 ; 298:181– 186

5. Jane V. Higdon, Balz frei. Coffee and health: A review of recent human research. Taylor and Francis Group, LLC 2006; 101–123.

6. Claudia Anesini, Graciela E. Ferraro , Rosana Fillip. Total polyphenol content and antioxidant capacity of commercially available tea (Camellia sinensis) in argentina. Jurnal of Agricurtural and Food Chemistry 2008; 9225 – 9229. 7. Percival, Marks. Clinical nutrition insight. Advanced Nutrition Publications,

Inc 1996.

8. Camerrer bettina, Lothar W. Kroh. Antioxidant activity of coffee brews.

Springer-Verlag. 2006; 496 – 474.

9. Mullen, W. Nemzer, B. Stalmach, A. Ali, S. Combet, E. Polyphenolic and hydroxycinnamate contents of whole coffee fruits from China, India, and Mexico. J. Agric. Food Chem 61 2013; 5298–5309

10.Aak. Budidaya tanaman kopi. Jogjakarta : Kanisius. 1988

11.Sukhdev Swami Handa, Suman Preet Singh Khanuja, Gennaro Longo, Dev Dutt Rakesh. Extraction technologies for medicinal and aromatic plants. International centre for science and high technology 2008

12.Marks. Marks' essential medical biochemistry, 2nd Edition. Lippincott Williams & Wilkins 2007

13.Yun Zhong et al. Free radicals, antioxidants, and nutrition. Elsevier Science Inc 2002;18:872–879

28

14.Devasagayam et al. Free radicals and antioxidants in human health: Current status and future prospects. Jounal of the Association of Physician of India; 2004

15.Kadare, Sagar B. Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. Journal of Food Science and Technology August 2011;48(4): 412–422. 16.Molyneux P. The use of the stable free radical diphenylpicrylydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Jurnal Science Technology Mar-Apr 2004; 26(2): 212-8

17.Thaipong, Kriengsak et al. Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts. Journal of Food Composition and Analysis 19 2006; 669–675.

18.Cheng zhiyong, Yuanzong Li. Antioxidant activity of selected phenols estimated by ABTS and FRAP methods. Analytica Chimica Acta 2003; 129 – 137.

19.Rouessac Francis, Rouessac Annick. Chemical analysis modern instrumentation methods and techniques second edition. John Willey and Sons France 2007

20.Antonio Zuorro, Lavecchia Roberto. Influence of extraction conditions on the recovery of phenolic antioxidants from spent coffee grounds. American Journal of Applied Sciences 10 2013; (5): 478-486,

21.Reddy LJ, Jalli RD, Jose B, Gopu S. Evaluation of antibacterial & antioxidant activities of the leaf essential oil & leaf extract of citrus aurantifolia. Asian Journal of Biochemical and Pharmaceutical Research May 2012;2:346-53 22.Blois, MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical,

nature. 1958;1199-200

23.Votavová, L. Changes of antioxidant capacity of robusta coffee during roasting. Prague : Journal Food Science 2009

24.Nabavi SF, Nabavi SN, Ebrahimzadeh MA, Asgarirad H. The antioxidant activity of wild medlar (Mespilus germanical) fruits, stem bark and leaf. African Journal of Biotechnology 10 January 2011;Vol.10(2): 283-9.

25.Claudine, Manach. Polyphenols : food sources and bioavailability. American Society for Clinical Nutrition. 2004

29

26.Arellano-González, Miguel Angel. Antioxidant activity of fermented and

nonfermented coffee (Coffea arabica) pulp extracts. Mexico : Department of

Biotechnology, Metropolitan Autonomous University. 2011

27.Yashin, Alexander, et al. Antioxidant and antiradical activity of coffee. Moscow. 2013.

28.Hernández, et al. Phenolic characterization, melanoidins, and antioxidant activity of some commercial coffees from Coffea arabica and Coffea canephora. Sociedad Química de México. 2012

32

Lampiran 3 Riwayat Penulis

IDENTITAS

Nama : Hanindyo Riezky Beksono

Jenis Kelamin : Laki – Laki

Tempat, Tanggal Lahir : Surabaya, 03 Maret 1994

Agama : Islam

Alamat : Kota Wisata Monaco W.1/36 RT01 RW15

Kab. Bogor

Email : hanindyo.rb@gmail.com

RIWAYAT PENDIDIKAN

1997 – 1999 : TK Tadika Puri Surabaya 1999 – 2005 : SDN Kertajaya XII Surabaya 2005 – 2008 : SMPN 147 Cibubur Jakarta Timur 2008 – 2011 : SMAN 39 Cijantung Jakarta Timur

2011 – Sekarang : Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR PUSTAKA

1. Wang, Kan. Agrobacterium protocols. Edisi 2. Totowa New Jersey : Humana press inc 2006

2. Farah, A., Donangelo, C. M. Phenolic compounds in coffee. Braz. J. Plant Physiol 2006; 18, 23–36.

3. Fardiaz, srikandi. Antimicrobial activity of coffee (Coffea robusta) extract. ASEAN Food Journal 1995

4. Robertson D, Frolich JC, Carr RK, et al. Effects of caffeine on plasma renin activity, catecholamines and blood pressure. N Engl J Med 1978 ; 298:181– 186

5. Jane V. Higdon, Balz frei. Coffee and health: A review of recent human research. Taylor and Francis Group, LLC 2006; 101–123.

6. Claudia Anesini, Graciela E. Ferraro , Rosana Fillip. Total polyphenol content and antioxidant capacity of commercially available tea (Camellia sinensis) in argentina. Jurnal of Agricurtural and Food Chemistry 2008; 9225 – 9229. 7. Percival, Marks. Clinical nutrition insight. Advanced Nutrition Publications,

Inc 1996.

8. Camerrer bettina, Lothar W. Kroh. Antioxidant activity of coffee brews. Springer-Verlag. 2006; 496 – 474.

9. Mullen, W. Nemzer, B. Stalmach, A. Ali, S. Combet, E. Polyphenolic and hydroxycinnamate contents of whole coffee fruits from China, India, and Mexico. J. Agric. Food Chem 61 2013; 5298–5309

10.Aak. Budidaya tanaman kopi. Jogjakarta : Kanisius. 1988

11.Sukhdev Swami Handa, Suman Preet Singh Khanuja, Gennaro Longo, Dev Dutt Rakesh. Extraction technologies for medicinal and aromatic plants. International centre for science and high technology 2008

12.Marks. Marks' essential medical biochemistry, 2nd Edition. Lippincott Williams & Wilkins 2007

13.Yun Zhong et al. Free radicals, antioxidants, and nutrition. Elsevier Science Inc 2002;18:872–879

14.Devasagayam et al. Free radicals and antioxidants in human health: Current status and future prospects. Jounal of the Association of Physician of India; 2004

15.Kadare, Sagar B. Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. Journal of Food Science and Technology August 2011;48(4): 412–422. 16.Molyneux P. The use of the stable free radical diphenylpicrylydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Jurnal Science Technology Mar-Apr 2004; 26(2): 212-8

17.Thaipong, Kriengsak et al. Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts. Journal of Food Composition and Analysis 19 2006; 669–675.

18.Cheng zhiyong, Yuanzong Li. Antioxidant activity of selected phenols estimated by ABTS and FRAP methods. Analytica Chimica Acta 2003; 129 – 137.

19.Rouessac Francis, Rouessac Annick. Chemical analysis modern instrumentation methods and techniques second edition. John Willey and Sons France 2007

20.Antonio Zuorro, Lavecchia Roberto. Influence of extraction conditions on the recovery of phenolic antioxidants from spent coffee grounds. American Journal of Applied Sciences 10 2013; (5): 478-486,

21.Reddy LJ, Jalli RD, Jose B, Gopu S. Evaluation of antibacterial & antioxidant activities of the leaf essential oil & leaf extract of citrus aurantifolia. Asian Journal of Biochemical and Pharmaceutical Research May 2012;2:346-53 22.Blois, MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical,

nature. 1958;1199-200

23.Votavová, L. Changes of antioxidant capacity of robusta coffee during roasting. Prague : Journal Food Science 2009

24.Nabavi SF, Nabavi SN, Ebrahimzadeh MA, Asgarirad H. The antioxidant activity of wild medlar (Mespilus germanical) fruits, stem bark and leaf. African Journal of Biotechnology 10 January 2011;Vol.10(2): 283-9.

25.Claudine, Manach. Polyphenols : food sources and bioavailability. American Society for Clinical Nutrition. 2004

26.Arellano-González, Miguel Angel. Antioxidant activity of fermented and nonfermented coffee (Coffea arabica) pulp extracts. Mexico : Department of Biotechnology, Metropolitan Autonomous University. 2011

27.Yashin, Alexander, et al. Antioxidant and antiradical activity of coffee. Moscow. 2013.

28.Hernández, et al. Phenolic characterization, melanoidins, and antioxidant activity of some commercial coffees from Coffea arabica and Coffea canephora. Sociedad Química de México. 2012

Lampiran 3 Riwayat Penulis

IDENTITAS

Nama : Hanindyo Riezky Beksono

Jenis Kelamin : Laki – Laki

Tempat, Tanggal Lahir : Surabaya, 03 Maret 1994

Agama : Islam

Alamat : Kota Wisata Monaco W.1/36 RT01 RW15

Kab. Bogor

Email : hanindyo.rb@gmail.com

RIWAYAT PENDIDIKAN

1997 – 1999 : TK Tadika Puri Surabaya 1999 – 2005 : SDN Kertajaya XII Surabaya 2005 – 2008 : SMPN 147 Cibubur Jakarta Timur 2008 – 2011 : SMAN 39 Cijantung Jakarta Timur

2011 – Sekarang : Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta