IMUNOTERAPI IgY ASAL KUNING TELUR UNTUK MENINGKATKAN PROFIL LEUKOSIT ANJING YANG TERINFEKSI CANINE PARVOVIRUS.
251 / Kedokteran Hewan
!
"
# $$%&%'()$*
+,! -.
! "
# $$%'%%&/$0
1
2
'$%3
i
Halaman pengesahan …………………………………………………..
i
Daftar isi ………………………………………………………………..
ii
Ringkasan
iii
……………………………………………………………
Bab I. Pendahuluan
………………………………………………….
1
Bab II. Tinjauan Pustaka ………………………………………………..
3
Bab III. Metode Penelitian ………………………………………………
6
Rencana Penelitian Tahun I …………………………………………….
8
Rencana Penelitian Tahun II ……………………………………………
10
Bab 4. Biaya dan Jadwal Penelitian …………………………………...
13
4.1. Anggaran Penelitian ……………………………………………….
13
4.2. Jadwal Penelitian …………………………………………………..
14
Daftar Pustaka ………………………………………………………….
14
Lampiran 1 Rincian Anggaran …………………………………………
16
Lampiran 2 Ketersediaan sarana dan prasarana penelitian ……………...
14
Lampiran 3 Susunan organisasi tim peneliti dan pembagian tugas …….
14
Lampiran 4 Format Biodata Ketua dan Anggota peneliti ……………..
15
Lampiran 5 Surat Pernyataan
29
………………………………………
(CPV) adalah penyakit virus yang sangat infeksius dan
fatal pada anjing. Infeksi CPV ditandai dengan demam, muntah, diare berdarah,
leukopenia dan limfopenia. Morbiditas dapat mencapai 100% dan kematian
mencapai 90% pada anak anjing yang tidak divaksinasi. Vaksinasi terbukti efektif
dan metode paling ideal untuk mengendalikan infeksi CPV. Namun adanya
maternal antibodi dan perbedaan strain virus dalam vaksin dengan virus yang
menginfeksi anjing di lapangan menyebabkan kegagalan vaksinasi. Hingga saat
ini belum ada terapi yang efektif untuk mengobati infeksi CPV pada anjing.
Beberapa penelitian membuktikan antibodi yang diisolasi dari kuning telur
ayam (IgY) efektif untuk pencegahan dan pengobatan penyakit infeksius pada
manusia dan hewan. IgY memiliki keunggulan tidak mengaktivasi sistem
komplemen pada mamalia, sehingga aman diaplikasikan secara intravena.
Pengobatan IgY secara intravena diduga dapat memutus rantai infeksi CPV di
darah. Netralisasi IgY mencegah virus merusak organ limfoid dan saluran
pencernaan sehingga kematian anjing dapat dicegah. Adanya berbagai keunggulan
dan kemudahan produksi IgY dari kuning telur ayam dapat menjadi modalitas
baru untuk terapi infeksi CPV pada anjing.
Pada anjing sehat jumlah dan morfologi leukosit relatif stabil. Perubahan
jumlah dan morfologi leukosit memberikan informasi klinis tentang adanya suatu
penyakit. Perubahan nilai leukosit berguna untuk menentukan respon dan
keberhasilan suatu pengobatan dan menduga kesembuhan hewan. . .4 !
5. 6 !
untuk isolasi, pemurnian dan karakterisasi IgY anti CPV,
membuktikan efektivitas terapi IgY mencegah kematian anjing berdasarkan
indikator perbaikan profil leukosit anjing dan isolasi virus parvo lokal Bali untuk
uji tantang sehingga didapatkan isolat baru yang patogen. Isolat ini nantinya
dapat digunakan sebagai bibit vaksin yang homolog dengan virus yang
menginfeksi anjing di lapangan. Imunoterapi IgY secara intravena dilakukan pada
kelompok anjing setelah ditantang dengan CPV patogenik secara oral. . .4 !
!
# produksi IgY di ayam dengan cara imunisasi ayam menggunakan CPV
, pemurnian IgY dengan
, karakterisasi IgY
dengan SDS;PAGE dan spesifisitas IgY diuji dengan HI dan serum netralisasi
.
. .4 !
(SN) Penentuan
(PD50) IgY di
!
: isolasi, propagasi virus parvo lokal Bali di
, karakterisasi
virus dengan uji HI dan serum netralisasi. Penentuan dosis virus untuk uji tantang
dengan uji HA dan
dan uji tantang virus secara invivo di anjing.
! !,. .
!
!,! : differensial leukosit dihitung dengan pewarnaan
Giemsa, titer antibodi IgY dalam serum dengan uji HI dan Elisa dan titer virus
dalam feses anjing dengan uji HA.
! 4 7. .4 !
! !78! dapat
membuktikan perbaikan profil leukosit dapat dijadikan indikator efektivitas terapi
IgY sehingga dokter hewan dapat menduga kesembuhan anjing, diperoleh virus
parvo isolat lokal sebagai kandidat vaksin. Hasil penelitian ini sangat bermakna
di dunia kedokteran hewan karena akan mengurangi biaya dan waktu perawatan
anjing yang sangat mahal. Isolat lokal yang dihasilkan sangat tepat digunakan
sebagai bibit vaksin yang sesuai dengan virus yang menginfeksi anjing di
lapangan. ! . ! 4 7. .4 ! yaitu: Data efektivitas terapi IgY dan isolate
lokal Bali dapat dipublikasi di jurnal nasional dan internasional dan dihasilkan
satu buku ajar yang dapat digunakan oleh mahasiswa dan dokter hewan.
iii
Infeksi
(CPV) adalah penyakit infeksius yang sangat
fatal pada anjing. Penyakit ini ditemukan di seluruh dunia karena virus parvo
dapat bertahan dalam kondisi lingkungan yang ekstrem dan resisten terhadap
berbagai desinfektan (Goddard dan Leisewitz 2010). Secara alami CPV dapat
menginfeksi anjing domestik, anjing hutan, kucing, beruang dan serigala (Nandi
2010). Gejala klinis infeksi CPV pada anjing adalah demam, muntah, diare
berdarah, dehidrasi, leukopenia dan limfopenia (Decaro
CPV sangat merugikan pemilik dan
2006). Penyakit
anjing. Mortalitas pada anak anjing
umur 6 minggu sampai 6 bulan mencapai 100% (Godsall
. 2010). Vaksinasi
pada anak anjing telah dilakukan untuk mencegah infeksi CPV. Namun adanya
maternal antibodi di dalam tubuh anjing mengganggu respon pembentukan
antibodi sehingga terjadi kegagalan vaksinasi (Prittie 2004). Ketika titer antibodi
maternal turun, anak anjing sangat peka terhadap infeksi CPV. Kegagalan
vaksinasi menyebabkan anjing mengalami infeksi subklinis.
Anjing yang
terinfeksi CPV secara subklinis mengekskresikan virus infektif melalui fesesnya,
sedangkan anjing tersebut tidak menunjukkan gejala klinis sakit. Hal inilah yang
menyebabkan penyakit parvovirus pada anjing bersifat endemis di Indonesia
(Sendow & Syafriati 2004).
Penularan CPV pada anjing terjadi melalui mulut dan hidung (Prittie
.2004). Lingkungan yang terkontaminasi dapat menularkan virus parvo pada
anjing baik secara langsung dan tidak langsung. Virus parvo yang tertelan mula;
mula terkonsentrasi di jaringan limfoid orofaring, limfonodus mesenterika dan
timus. Virus melakukan replikasi, selanjutnya dikeluarkan ke pembuluh darah
sehingga terjadi viremia. Virus disebarkan ke jaringan limfoid, timus dan
limfonodus di seluruh tubuh. Infeksi CPV pada anjing bersifat sistemik karena
distribusi virus melalui viremia dan virus dapat diisolasi hampir di semua organ
tubuh seperti paru;paru, limpa, hati, ginjal dan jantung (Duffy
. 2010).
Anjing yang terinfeksi CPV mengalami neutropenia dan limfopenia akibat
kerusakan pada sel;sel kripte epitel usus halus, sel punca di sumsum tulang dan
timus (Ling
2012). Sel;sel kripte epitel mengalami pematangan di daerah
basal epitel usus halus. Selanjutnya sel kripte yang matang menuju ujung;ujung
vili usus dan melakukan fungsinya untuk absorbsi nutrisi. Infeksi CPV akan
merusak sel;sel kripte usus di bagian basal sehingga tidak berfungsi dan anjing
mengalami diare. Kerusakan epitel usus menjadi penyebab ditariknya netrofil
yang ada di peredaran darah menuju jaringan yang mengalami peradangan.
Infeksi CPV pada organ timus terjadi meluas di daerah germinal dan kortek. Pada
daerah kortek timus akan terjadi limfositolisis yang cepat. Ketidakseimbangan
antara produksi netrofil dan limfosit dengan kebutuhan tubuh untuk melawan
infeksi virus menyebabkan anjing mengalami neutropenia dan limfopenia.
Tingginya laju mitosis sel;sel limfoid dan epitel saluran pencernaan
berperan memperparah gejala klinis akibat infeksi CPV. Laju mitosis sel limfoid
yang tinggi berhubungan langsung dengan kecepatan replikasi virus dan
keparahan kerusakan organ (Ling
2012). Durasi neutropenia dan limfopenia
yang lama akan meningkatkan resiko kematian anjing akibat sepsis (Duffy
.
2010). Pengobatan yang cepat dan tepat untuk memperpendek waktu neutropenia
sangat dibutuhkan untuk mencegah kematian anjing. Pada anjing sehat jumlah
dan morfologi leukosit relatif stabil. Perubahan respon leukosit memberikan
informasi klinis adanya suatu penyakit. Perubahan nilai leukosit tidak menjadi ciri
khas suatu penyakit, tetapi dapat digunakan untuk diagnosa pembanding berbagai
penyakit, menentukan respon dan keberhasilan suatu pengobatan dan menduga
prognosis suatu penyakit (Goddard dan Leisewitz 2010).
Beberapa penelitian membuktikan bahwa IgY efektif untuk pencegahan
dan pengobatan penyakit infeksius pada manusia dan hewan. IgY memiliki
keunggulan tidak mengaktivasi sistem komplemen pada mamalia, sehingga aman
jika diaplikasikan secara intravena. Biaya produksi IgY dari kuning telur murah
dan mudah (Dubie
2014). Imunoglobulin Y memiliki spesifisitas yang
tinggi terhadap antigen dan terbukti efektif digunakan secara intravena
(Meenatchisundaram dan Michael 2010).
Pengobatan IgY secara intravena
diduga dapat memutus rantai infeksi CPV di darah. Netralisasi IgY akan menekan
kesempatan virus merusak organ limfoid dan saluran pencernaan sehingga
kematian anjing dapat dicegah.
Tujuan khusus penelitian ini adalah untuk membuktikan bahwa perbaikan
profil leukosit, titer antibodi dalam serum dan titer antigen di feses dapat
digunakan sebagai indikator efektivitas terapi IgY dalam mencegah kematian
anjing akibat infeksi CPV. Dapat diisolasi virus parvo isolate local yang nantinya
dapat digunakan sebagai kandidat vaksin yang homolog dengan isolate lapang.
9
:
Hingga saat ini belum ada terapi yang efektif dapat menyembuhkan anjing
dari infeksi
.
Terapi yang biasa dilakukan hanya untuk
menekan gejala klinis tetapi tidak dapat mencegah kematian anjing. Biaya terapi
yang dikeluarkan pemilik anjing sangat mahal sehingga pemilik hewan cenderung
membiarkan anjingnya mati daripada mengobati. Hal ini dirasa sangat merugikan
ketika harga anjing yang dimiliki mencapai jutaan rupiah.
Provinsi Bali memiliki plasma nutfah yang sangat berharga yaitu anjing
kintamani. Dari informasi dokter hewan di daerah Sukawana, populasi anjing
kintamani menurun drastis akibat penyakit rabies dan pemusnahan massal.
Dinformasikan pula bahwa anjing kintamani banyak yang terinfeksi canine
parvovirus sehingga sangat perlu dilakukan pencegahan dan terapi anjing ,baik
melaui vaksinasi dan terapi. Anjing kintamani sebagai plasma nutfah Bali yang
sudah diakui sebagai anjing trah asli Asia dan hanya ada di Bali sangat perlu
dijaga kesehatan dan kelestariannya.
. !,!! 7. .4 ! ini adalah terapi infeksi CPV dengan IgY secara
intravena memberi peluang sembuh pada anjing.
Efektivitas terapi dapat
diketahui melalui indikator perbaikan profil leukosit darah anjing, titer antibodi
dan titer virus di feses. Isolat virus lokal yang berhasil diisolasi dapat digunakan
sebagai bibit virus dalam vaksin sehingga homolog dengan virus parvo yang
menginfeksi anjing di lapangan.
Penyakit menular yang mematikan merupakan masalah serius dalam
pengembangan ilmu kedokteran manusia dan hewan. Terapi sering tidak
berkhasiat akibat kuman yang resisten, ketiadaan obat yang efektif untuk sebagian
besar penyakit virus, atau akibat patogenesis agen yang berkembang dengan
sangat cepat dan menginfeksi organ vital (Dubie
. 2014).
Imunisasi pasif buatan dengan pemberian antibodi untuk pencegahan dan
pengobatan penyakit infeksius telah dilakukan sejak jaman dahulu (Carlander
2000). Pengobatan dengan antibodi pasif disebut juga serum terapi karena
antibodi yang digunakan berasal dari serum manusia atau hewan yang sudah
dikebalkan (Baxter 2007). Produksi antibodi pasif memerlukan biaya yang sangat
mahal karena memerlukan donor yang banyak dan proses isolasi yang sulit
(Goddard
2006). Kendala produksi dan biaya menyebabkan pemanfaatan
antibodi sangat terbatas. Pengobatan dengan antibodi pasif mulai ditinggalkan
sejak ditemukannya antibiotik.
Namun penggunaan antibiotik yang tidak
terkendali menyebabkan sebagian besar kuman menjadi resisten, sehingga
pengobatan menjadi tidak efektif (Carlander
2000).
Antibodi pasif kembali menjadi pilihan untuk pengobatan infeksi virus,
gangguan inflamasi dan tumor (Michael
. 2010). Pengobatan dengan antibodi
menjadi pilihan karena memiliki spesifisitas yang tinggi pada agen target, dapat
digunakan dalam dosis tinggi dan tidak bersifat toksik (Casadevall 1999).
Masalah utama dalam imunoterapi adalah
dan hilangnya daya;
guna pada pemberian berulang dalam waktu yang lama. Walau demikian, potensi
antibodi sebagai bahan biologik yang efektifitasnya tidak tergantikan oleh bahan
kimia apapun, perlu dimanfaatkan dengan menemukan bahan atau cara yang dapat
menekan dampak jangka panjang. Ketersediaan antibodi pasif sangat dibutuhkan
untuk pencegahan dan pengobatan berbagai penyakit.
Imunoglobulin yang berasal dari bangsa burung, yang dikenal sebagai IgY
(Grindstaff
. 2003) tampaknya berpotensi untuk menekan biaya produksi dan
dampak samping sebagai agen imunoterapi yang berkhasiat dan aman. Secara
alami, immunoglobulin dari serum induk ayam ditransfer pada kuning telur
sebagai bentuk kekebalan pasif alami untuk anak ayam setelah menetas (Kovac
. 2005). Karenanya, IgY khas terhadap agen yang diinginkan dan mudah
diperoleh dengan imunisasi induk ayam (Carlander
2002).
Penggunaan IgY untuk imunoterapi juga bukan hal baru. IgY ayam
terbukti efektif untuk pencegahan dan pengobatan berbagai penyakit (Kovacs
2005).
Antibodi ini efektif mencegah infeksi saluran pencernaan yang
disebabkan oleh
caries gigi yang disebabkan oleh
,inaktivasi urease dari
(Al;Adwani
pada anjing. (Nguyen
2006). Secara in vitro, IgY anti
terbukti efektif mencegah terjadinya
sel lestari
(Suartini
. 2013) dan infeksi
pada
2015).
IgY memiliki keunggulan dibandingkan IgG yaitu tidak mengaktivasi
sistem komplemen pada mamalia (Carlander 2002) sehingga memungkinkan
aplikasinya secara intravena. Pada mencit IgY terbukti tidak menimbulkan reaksi
anafilaktik dan serum sikness ketika diaplikasikan secara intravena mencegah
terjadinya (Menaatchisundaram 2010).
Tropisme CPV adalah pada jaringan yang sel;selnya sedang aktif
membelah seperti epitel kripta usus halus, limfoid orofaring, limfoglandula
mesenterika dan sumsum tulang belakang (Meunier
1985). Replikasi virus
yang terjadi di seluruh jaringan limfoid dan saluran pencernaan menyebabkan
lonjakan jumlah virus yang diekskresikan melalui feses. Anjing akan mengalami
imunosupresif dan diare berdarah akibat kerusakan se;sel limfoid dan epithel
saluran pencernaan.
Secara klinis infeksi CPV ditandai dengan leukopenia dan limfopenia
(Prittie
. 2004). Infeksi CPV pada jaringan limfoid dan sumsum tulang
menyebabkan cadangan leukosit dan limfosit berkurang. Kerusakan epitel usus
halus menyebabkan migrasi netrofil di sumsum tulang dan darah menuju tempat
terjadinya infeksi. Ketidakseimbangan jumlah netrofil yang dihasilkan di sumsum
tulang dan migrasi netrofil menuju jaringan yang terinfeksi menyebabkan
neutropenia.
Infeksi CPV menyebabkan kerusakan sel;sel limfoblas di jaringan limfatik
dan sel;sel myeloblas sumsum tulang.
Kerusakan tersebut menyebabkan anjing
mengalami limfopenia dan netropenia pada 1;4 hari setelah infeksi. Panlekopenia
dapat terjadi akibat invasi virus pada jaringan limfoid dan hematopoietik. Derajat
panlekopaenia terjadi bertingkat dan mencapai puncaknya ketika gejala klinis
paling parah. Netropenia terjadi akibat ditariknya netrofil menuju daerah infeksi
di saluran pencernaan. Pada infeksi parvovirus lekopenia terjadi pada hari 5;8
pasca infeksi.
Anjing yang terinfeksi CPV memiliki total sel darah putih di bawah 2.0 x
9
10 /l (normalnya: 6.0;15.0 x 109/l). Total sel darah putih antara 0.5;0.2 x 109/l
terutama terjadi pada puncak infeksi. Leukopenia yang terjadi pada infeksi CPV
sebanding dengan keparahan gejala klinis yang ditimbulkannya. Mekanisme
terjadinya neutropenia pada infeksi CPV sebagai berikut: (1) invasi virus pada sel;
sel hematopoietik dan pusat proliferasi netrofil di sumsum tulang memicu
terjadinya neutropenia 5;8 hari pasca infeksi. (2) turunnya jumlah cadangan
netrofil di sumsum tulang akibat jaringan yang mengalami radang membutuhkan
banyak netrofil. Hal ini sering dijumpai pada kasus septikemia dan infeksi bakteri
saluran pencernaan. (3) perpindahan netrofil dari sirkulasi menuju ujung;ujung
pembuluh darah sebagai respon adanya endotoksemia dan migrasi netrofil ke
jaringan. (4) granulopoiesis yang tidak efektif akibat meningkatnya fagositosis
netrofil oleh makrofag di sumsum tulang. Pengobatan pendukung pada infeksi
CPV akan meningkatkan jumlah leukosit pada hari 1;6 pasca infeksi ditandai
peningkatan jumlah leukosit yang drastis (Goddard dan Leisewitz 2006).
Jumlah dan morfologi leukosit pada individu sehat relatif stabil.
Perubahannya yang drastis pada individu sakit dapat digunakan untuk diagnosa
secara klinis. Walaupun respon leukosit pada individu sakit bukan penciri utama
suatu penyakit namun perubahan keseimbangannya dapat memberikan informasi
klinis, sebagai diagnosa banding dan untuk mengetahui respon indivudu terhadap
suatu pengobatan (Goddard dan Leisewitz 2006).
Untuk mencapai hasil yang diharapkan maka perlu dilakukan tahapan;
tahapan penelitian yang runut dengan memberikan penekanan;penekanan khusus
pada setiap tahapan penelitian (Tabel 1).
!5.4 %
! !7! 7. .4 ! 7! ! !
Tahapan
Penelitian
1 Preparasi
antigen
No
Penjelasan
Indikator capaian
Preparasi antigen
pada biakan lestari
Mendapatkan antigen yang
imunogenik dan antigenic
dengan titer tinggi
2 Produksi IgY Produksi IgY spesifik dilakukan dengan Mendapatkan IgY dalam
jumlah besar dan titer
spesifik anti
cara imunisasi ayam dengan
tinggi.
parvovirus
dosis 213 HA secara
intramuskuler dan koleksi IgY dari
pada telur
serum dan telur yang dihasilkan
ayam.
Dilakukan menggunakan teknik
3 Isolasi dan
Diperoleh IgY murni
pemurnian IgY presipitasi dengan ammonium sulfat,
spesifik
dari kuning
dialisis, kromatografi filtrasi gel. Tujuan
telur
untuk memastikan bahwa IgY yang
terbentuk spesifik terhadan
4 Identifikasi
kemurnian dan
Uji spesifisitas
IgY
Identifikasi kemurnian dengan SDS;
PAGE, penentuan kandungan protein
dengan metode Nano Drop, Uji
spesifisitas menggunakan Teknik HI
dan AGPT
6 Uji
Uji kemampuan netralisasi IgY secara in
kemampuan
vivo pada anak anjing dengan uji
netralisasi IgY haemaglutinasi inhibisi dan uji ELISA
anti parvovirus
secara in vivo
7 Produksi
massal IgY
pada telur
! !7!
Dilakukan dengan cara imunisasi ayam
dengan parvovirus intramuskuler dan
koleksi IgY dari telur yang dihasilkan
. .4 !
Diperoleh IgY murni
dengan spesifisitas tinggi
Diketahui kemampuan
netralisasi IgY secara in
vitro ,juga diketahui titer
optimal IgY untuk aplikasi
pencegahan dan
imunoterapi intravena
Produksi IgY secara massal
sehingga diperoleh
konsentrasi yang tinggi
untuk tujuan aplikasi
pencegahan dan
imunoterapi
!
No Tahapan Penelitian
Penjelasan
Indikator capaian
1 Isolasi virus parvo
Dilakukan dengan menanam Diperoleh virus parvo dengan
isolat lokal, propagasi virus pada biakan lestari FK, patogenitas dan titer yang
dan identifikasi virus identifikasi dengan uji HA/HI tinggi untuk uji tantang.
dan serum netralisasi
Diketahui efektivitas terapi
2 Uji tantang pada 16
Dilakukan dengan cekok
ekor anjing
virus dan terapi dengan IgY IgY
anti CPV
3 Deteksi titer IgY di
Dilakukan dengan uji HA/HI Diketahui efektivitas terapi
serum dan titer CPV di dan ELISA
IgY dari indiator antibodi dan
feses
antigen
4 Penghitungan/penentu Pewarnaan Giemsa dan
Diketahui efektivitas terapi
an profil leukosit
penghitungan diferensial
IgY dari indikator perbaikan
darah anjing
leukosit
profil leukosit setelah terapi
IgY
.,7!
! -!8
. .4 !
Penelitian akan dilakukan
di Laboratorium Bioteknologi Balai Besar
Veteriner Denpasar, Bali. Hewan dipelihara di kandang hewan coba Balai Besar
Veteriner Denpasar, Bali. Uji Serum Netralisasi, HA/HI dan isolasi virus di
laboratorium Virologi Balai Besar Penelitian Veteriner, Bogor.
Pembuatan
preparat ulas darah dilakukan di Balai Besar Veteriner Denpasar, Bali dan
penghitungan profil leukosit dan limfosit dilakukan di Laboratorium Fisiologi
FKH;IPB Bogor.
! !
!
4! 7. .4 !
! !
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: sepuluh ekor ayam
petelur
galur Isabrown umur 20 minggu, antigen parvovirus diperoleh dari
Bbalitvet;Bogor,
dan
!
isolat lapang yang diinaktivasi dengan formaldehid.
diperbanyak dalam kultur sel FK, diberi medium "
#
(DMEM) yang mengandung 2%
kimia untuk isolasi, karakterisasi kuning telur, %
$
. Virus berasal dari
Isolat parvovirus
#
(FBS). Bahan
(Promega) untuk
pemurnian antibodi. Bahan untuk elektroforesis SDS;PAGE. Bahan kimia untuk
AGPT. Bahan untuk uji HA/HI dan bahan untuk uji serum netralisasi.
. !4! !
Kandang, perlengkapan kandang ayam, Sentrifus dingin, mikrotiter, spuite
disposable needle, eppendorf, fintip, Elisa reader, plate Elisa, spectrophotometer.
&
incubator CO2, alat elektroforesis SDS;PAGE, tabung
dialysis, kertas saring, seperangkat glasswares, tabung reaksi serta raknya, tabung
erlemeyer dan corong gelas.
. ;! ! 7. .4 !
!
!4
. .4 !
Tabel 1. Jadwal Kegiatan Penelitian
. .4 !
+
!!
!
4!
. !!
%
'
/
*
3
(
&
0
)
%$
%%
%'
1. Persiapan di laboratorium
2. Persiapan pengadaan antigen
(
,
3. Produksi IgY dari kuning telur ayam
4. Isolasi, Pemurnian IgY,
karakterisasi dan penentuan dosis
terapi IgY
5. Persiapan dosis terapi IgY murni
yang steril
6. Laporan penelitian tahun I
. .4 !
+
1
2
3
4
5
6
!
!!
. !!
5 4!
% ' / * 3 ( & 0 ) %$ %%
Persiapan kandang ,pakan
dan hewan coba (anjing)
Uji tantang pada anjing
Koleksi serum dan feses
Analisis Laboratorium
Entry Data
Analisis Data dan Pelaporan
Al;Adwani SR, Crespo R, Shah DH (2013). Production and evaluation of chicken
egg;yolk;derived antibodies against Campylobacter jejuni colonization;
ssociatedproteins. Foodborne Pathogens Dis., 10: 624;631
Baxter, D. (2007).Active and passive immunity, vaccine types, excipents and
licensing. Occup. Med. (Lond). 57:552;556.
Carlander V. 2002. '
- .'
/
. Fakulty of Medicine
ACTA Universitatis Upsaliensis, UPPSALA. Swedia. Pp. 53.
Decaro N, Martella V, Desario C, Bellaciccio AL, Camero M, Manna L, d’Alojo
D, Buonavaglia C. 2006. First detection of
type 2c in
pups with haemorrhagic enteritis in Spain. 0 + # 53:468;472.
Dubie Teshager, Seid Yimer, Mulie Adugna ,Tesfaye Sisa. (2014). Advanced
Research Journal of Biochemistry and Biotechnology: Vol. 1(3): pp 018;
030
Duffy A, Dow S, Ogilvie G, Rao S, Hackett T . 2010. Hematologic improvement
in dogs with parvovirus infection treated with recombinant canine
granulocyte;colony stimulating factor. 0
)
&
. 33: 352–
356
Goddard A, Leisewitz AL, Christopher MM, Duncan NM, Becker PL. 2006.
Prognostic usefulness of blood leukocyte changes in
enteritis . 0 + # . 22:309;316.
Goddard A, Leisewitz AL. 2010.
.+
1
'
'
)
. 40: 1041;1053.
Godsall SA, Cleqq SR, Stavisky JH, Radford AD, Pinchbeck G. 2010.
Epidemiology of
and
in dogs presented
with severe diarrhoea to PDSA Pet Aid hospital. + 2 . 7: (6) 196;201.
Grindstaff JL, Brodie III, ED, Ellen DK (2003). Immune function across
generations: Integrating mechanism and evolutionary process in maternal
antibody transmission. Proc. Biol. Sci.,270:2309–2319.
Ling, M. Jacqueline M. Norris, Mark Kelman, Michael P. Ward. (2012). Risk
factor for death from canine parvoviral; related disease in Australia.
Veterinary Microbiology. 158: 280;290.
Mattjik AA, Sumertajaya IM. 2006. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS
dan MINITAB. Ed ke;3. Bogor. IPB Press.
Meenatchisundaram S, Michael A. 2010.
Comparison of four different
purification methods for isolation of anti
antivenom
antibodies from immunized chicken egg yolk. 0 $
. 8(1):
50;55.
Michael A, Meenatchisudaram S, Parameswari G, Subbraj T, Selvaku R,
amalingam S (2010). Chicken egg yolk antibodies (IgY) as an alternative
to mammalian antibodies. Indian J. Sci. Technol., 3: 468;474.
Nguyen VS, Umeda K, Yokoyama H, Tohya Y, Kodama Y. 2006. Passive
protection of dogs against clinical disease due to
;2 by
specific antibody from chicken egg yolk.
!
70: 62.
Prittie J. 2004.
enteritis: A review of diagnosis. Management,
and prevention. 0
+
14(3):167;176.
Sendow I, Syafriati T. 2004. Seroepidemiologi infeksi
pada
anjing. 0
&
+
Sodikoff CH. 1995. Laboratory Profiles of Small Animal Disease. A Guide to
Laboratory to Laboratory Diagnosis. Ed 2. USA: Mosby.
!,7 ! %
RINCIAN ANGGARAN
%
%%
!6
. .4
.4!8 ! !
. !!
Ketua
Anggota
Teknisi
,4!
. +
4
1
,
1
2
,4!
9 4
4!
8. 6!
!,9,
4
8
10
4
4
8
4
10
10
5 + !4
%'
+
! !
8 ! !
!5
!!
1. Ayam Isa Brown
2. pakan ayam
Kandang ayam dan
3.
perlengkapannya
Adjuvant complete dan
4.
incomplete
5. Spuite disposible syring
6. Kapas, alcohol, cotton bud
7. Kertas saring
8. Botol sampel
9. Tabung ependorf
10 Kit EGGstract Purification
11 ELISA Kit
12. Tissue culture flask
13. Plate HA/HI
14. Media DMEM
15. Foetal Calf Serum
16. Agarosa serva
17. Millipore Sartorius
18. Fintips 200 ul
19. Fintips 1000 ul
5 +
7!
+ !4 ! !
!,9,
< 7=
< 7=
20.000; 6.400.000.;
15.000.; 4.800.000.;
12.500,; 4.000.000,;
%3 '$$ $$$"
2
!8!
1+4 ,.
! ! ! ! < 7=
10 ekor
5 zak
100.000,;
250.000,;
1.000.000,;
1.250.000,;
1.000.000,;
1.000.000,;
200.000,;
800.000,;
150.000,;
300.000,;
3000,;
3000,;
300.000,;
8.000.000,;
3.000.000,;
1.500.000,;
750.000,;
1.000.000,;
5.000.000
2.000.000,;
1000.000,;
350.000,;
450.000,;
450.000,;
300.000,;
300.000,;
450.000,;
1.200.000,;
8.000.000,;
3.000.000,;
1.500.000,;
750.000,;
2.000.000,;
2.500.000.;
2.000.000,;
1.000.000,;
700.000,;
900.000,;
') %$$ $$$"2
1 set
4 vial
3 box
1 set
100 lembar
150 buah
4 box
1 paket
1 Paket
1 Box
1 Box
2 box
0,5 botol
1 Botol
1 Box
2 Box
2 Box
!4
! !< 7=
%/
! !
+
+8! 9
.
8 . 6!4! !
.
8 !
6 !
,4!
.. !
.8 .
. 6!4! !
! !
! ! < 7=
+ !4 ! !
< 7=
. 6!4! !
1. Denpasar; Pesawat
Jakarta pp Terbang
Ke lokasi
penelitian
1 orang
peneliti
1 kali
3.000.000,;
3.000.000,;
2. Denpasar; Pesawat
Jakarta pp Terbang
Seminar
hasil
1 orang
peneliti
1 kali
3.000.000,;
3.000.000,;
3 Denpasar; Pesawat
Jakarta pp Terbang
Seminar
Nasional
1 orang
peneliti
1 kali
4.000.000,;
4.000.000,;
%$ $$$"$$$.;
5 + !4
%*
! !
8 .
+
.4 ! ! 4! 24!
!!
.7. 4 !
1. Dokumentasi hasil
Dokumentasi
Pengolahan data dan
2.
Pembuatan laporan
penulisan laporan
3. Penggandaan laporan
Penggandaan laporan
4. Publikasi ilmiah
Publikasi ilmiah
5 Seminar Nasional
Biaya Seminar
5 + !4
+ !4
! ! !
!
"
# $$%&%'()$*
+,! -.
! "
# $$%'%%&/$0
1
2
'$%3
i
Halaman pengesahan …………………………………………………..
i
Daftar isi ………………………………………………………………..
ii
Ringkasan
iii
……………………………………………………………
Bab I. Pendahuluan
………………………………………………….
1
Bab II. Tinjauan Pustaka ………………………………………………..
3
Bab III. Metode Penelitian ………………………………………………
6
Rencana Penelitian Tahun I …………………………………………….
8
Rencana Penelitian Tahun II ……………………………………………
10
Bab 4. Biaya dan Jadwal Penelitian …………………………………...
13
4.1. Anggaran Penelitian ……………………………………………….
13
4.2. Jadwal Penelitian …………………………………………………..
14
Daftar Pustaka ………………………………………………………….
14
Lampiran 1 Rincian Anggaran …………………………………………
16
Lampiran 2 Ketersediaan sarana dan prasarana penelitian ……………...
14
Lampiran 3 Susunan organisasi tim peneliti dan pembagian tugas …….
14
Lampiran 4 Format Biodata Ketua dan Anggota peneliti ……………..
15
Lampiran 5 Surat Pernyataan
29
………………………………………
(CPV) adalah penyakit virus yang sangat infeksius dan
fatal pada anjing. Infeksi CPV ditandai dengan demam, muntah, diare berdarah,
leukopenia dan limfopenia. Morbiditas dapat mencapai 100% dan kematian
mencapai 90% pada anak anjing yang tidak divaksinasi. Vaksinasi terbukti efektif
dan metode paling ideal untuk mengendalikan infeksi CPV. Namun adanya
maternal antibodi dan perbedaan strain virus dalam vaksin dengan virus yang
menginfeksi anjing di lapangan menyebabkan kegagalan vaksinasi. Hingga saat
ini belum ada terapi yang efektif untuk mengobati infeksi CPV pada anjing.
Beberapa penelitian membuktikan antibodi yang diisolasi dari kuning telur
ayam (IgY) efektif untuk pencegahan dan pengobatan penyakit infeksius pada
manusia dan hewan. IgY memiliki keunggulan tidak mengaktivasi sistem
komplemen pada mamalia, sehingga aman diaplikasikan secara intravena.
Pengobatan IgY secara intravena diduga dapat memutus rantai infeksi CPV di
darah. Netralisasi IgY mencegah virus merusak organ limfoid dan saluran
pencernaan sehingga kematian anjing dapat dicegah. Adanya berbagai keunggulan
dan kemudahan produksi IgY dari kuning telur ayam dapat menjadi modalitas
baru untuk terapi infeksi CPV pada anjing.
Pada anjing sehat jumlah dan morfologi leukosit relatif stabil. Perubahan
jumlah dan morfologi leukosit memberikan informasi klinis tentang adanya suatu
penyakit. Perubahan nilai leukosit berguna untuk menentukan respon dan
keberhasilan suatu pengobatan dan menduga kesembuhan hewan. . .4 !
5. 6 !
untuk isolasi, pemurnian dan karakterisasi IgY anti CPV,
membuktikan efektivitas terapi IgY mencegah kematian anjing berdasarkan
indikator perbaikan profil leukosit anjing dan isolasi virus parvo lokal Bali untuk
uji tantang sehingga didapatkan isolat baru yang patogen. Isolat ini nantinya
dapat digunakan sebagai bibit vaksin yang homolog dengan virus yang
menginfeksi anjing di lapangan. Imunoterapi IgY secara intravena dilakukan pada
kelompok anjing setelah ditantang dengan CPV patogenik secara oral. . .4 !
!
# produksi IgY di ayam dengan cara imunisasi ayam menggunakan CPV
, pemurnian IgY dengan
, karakterisasi IgY
dengan SDS;PAGE dan spesifisitas IgY diuji dengan HI dan serum netralisasi
.
. .4 !
(SN) Penentuan
(PD50) IgY di
!
: isolasi, propagasi virus parvo lokal Bali di
, karakterisasi
virus dengan uji HI dan serum netralisasi. Penentuan dosis virus untuk uji tantang
dengan uji HA dan
dan uji tantang virus secara invivo di anjing.
! !,. .
!
!,! : differensial leukosit dihitung dengan pewarnaan
Giemsa, titer antibodi IgY dalam serum dengan uji HI dan Elisa dan titer virus
dalam feses anjing dengan uji HA.
! 4 7. .4 !
! !78! dapat
membuktikan perbaikan profil leukosit dapat dijadikan indikator efektivitas terapi
IgY sehingga dokter hewan dapat menduga kesembuhan anjing, diperoleh virus
parvo isolat lokal sebagai kandidat vaksin. Hasil penelitian ini sangat bermakna
di dunia kedokteran hewan karena akan mengurangi biaya dan waktu perawatan
anjing yang sangat mahal. Isolat lokal yang dihasilkan sangat tepat digunakan
sebagai bibit vaksin yang sesuai dengan virus yang menginfeksi anjing di
lapangan. ! . ! 4 7. .4 ! yaitu: Data efektivitas terapi IgY dan isolate
lokal Bali dapat dipublikasi di jurnal nasional dan internasional dan dihasilkan
satu buku ajar yang dapat digunakan oleh mahasiswa dan dokter hewan.
iii
Infeksi
(CPV) adalah penyakit infeksius yang sangat
fatal pada anjing. Penyakit ini ditemukan di seluruh dunia karena virus parvo
dapat bertahan dalam kondisi lingkungan yang ekstrem dan resisten terhadap
berbagai desinfektan (Goddard dan Leisewitz 2010). Secara alami CPV dapat
menginfeksi anjing domestik, anjing hutan, kucing, beruang dan serigala (Nandi
2010). Gejala klinis infeksi CPV pada anjing adalah demam, muntah, diare
berdarah, dehidrasi, leukopenia dan limfopenia (Decaro
CPV sangat merugikan pemilik dan
2006). Penyakit
anjing. Mortalitas pada anak anjing
umur 6 minggu sampai 6 bulan mencapai 100% (Godsall
. 2010). Vaksinasi
pada anak anjing telah dilakukan untuk mencegah infeksi CPV. Namun adanya
maternal antibodi di dalam tubuh anjing mengganggu respon pembentukan
antibodi sehingga terjadi kegagalan vaksinasi (Prittie 2004). Ketika titer antibodi
maternal turun, anak anjing sangat peka terhadap infeksi CPV. Kegagalan
vaksinasi menyebabkan anjing mengalami infeksi subklinis.
Anjing yang
terinfeksi CPV secara subklinis mengekskresikan virus infektif melalui fesesnya,
sedangkan anjing tersebut tidak menunjukkan gejala klinis sakit. Hal inilah yang
menyebabkan penyakit parvovirus pada anjing bersifat endemis di Indonesia
(Sendow & Syafriati 2004).
Penularan CPV pada anjing terjadi melalui mulut dan hidung (Prittie
.2004). Lingkungan yang terkontaminasi dapat menularkan virus parvo pada
anjing baik secara langsung dan tidak langsung. Virus parvo yang tertelan mula;
mula terkonsentrasi di jaringan limfoid orofaring, limfonodus mesenterika dan
timus. Virus melakukan replikasi, selanjutnya dikeluarkan ke pembuluh darah
sehingga terjadi viremia. Virus disebarkan ke jaringan limfoid, timus dan
limfonodus di seluruh tubuh. Infeksi CPV pada anjing bersifat sistemik karena
distribusi virus melalui viremia dan virus dapat diisolasi hampir di semua organ
tubuh seperti paru;paru, limpa, hati, ginjal dan jantung (Duffy
. 2010).
Anjing yang terinfeksi CPV mengalami neutropenia dan limfopenia akibat
kerusakan pada sel;sel kripte epitel usus halus, sel punca di sumsum tulang dan
timus (Ling
2012). Sel;sel kripte epitel mengalami pematangan di daerah
basal epitel usus halus. Selanjutnya sel kripte yang matang menuju ujung;ujung
vili usus dan melakukan fungsinya untuk absorbsi nutrisi. Infeksi CPV akan
merusak sel;sel kripte usus di bagian basal sehingga tidak berfungsi dan anjing
mengalami diare. Kerusakan epitel usus menjadi penyebab ditariknya netrofil
yang ada di peredaran darah menuju jaringan yang mengalami peradangan.
Infeksi CPV pada organ timus terjadi meluas di daerah germinal dan kortek. Pada
daerah kortek timus akan terjadi limfositolisis yang cepat. Ketidakseimbangan
antara produksi netrofil dan limfosit dengan kebutuhan tubuh untuk melawan
infeksi virus menyebabkan anjing mengalami neutropenia dan limfopenia.
Tingginya laju mitosis sel;sel limfoid dan epitel saluran pencernaan
berperan memperparah gejala klinis akibat infeksi CPV. Laju mitosis sel limfoid
yang tinggi berhubungan langsung dengan kecepatan replikasi virus dan
keparahan kerusakan organ (Ling
2012). Durasi neutropenia dan limfopenia
yang lama akan meningkatkan resiko kematian anjing akibat sepsis (Duffy
.
2010). Pengobatan yang cepat dan tepat untuk memperpendek waktu neutropenia
sangat dibutuhkan untuk mencegah kematian anjing. Pada anjing sehat jumlah
dan morfologi leukosit relatif stabil. Perubahan respon leukosit memberikan
informasi klinis adanya suatu penyakit. Perubahan nilai leukosit tidak menjadi ciri
khas suatu penyakit, tetapi dapat digunakan untuk diagnosa pembanding berbagai
penyakit, menentukan respon dan keberhasilan suatu pengobatan dan menduga
prognosis suatu penyakit (Goddard dan Leisewitz 2010).
Beberapa penelitian membuktikan bahwa IgY efektif untuk pencegahan
dan pengobatan penyakit infeksius pada manusia dan hewan. IgY memiliki
keunggulan tidak mengaktivasi sistem komplemen pada mamalia, sehingga aman
jika diaplikasikan secara intravena. Biaya produksi IgY dari kuning telur murah
dan mudah (Dubie
2014). Imunoglobulin Y memiliki spesifisitas yang
tinggi terhadap antigen dan terbukti efektif digunakan secara intravena
(Meenatchisundaram dan Michael 2010).
Pengobatan IgY secara intravena
diduga dapat memutus rantai infeksi CPV di darah. Netralisasi IgY akan menekan
kesempatan virus merusak organ limfoid dan saluran pencernaan sehingga
kematian anjing dapat dicegah.
Tujuan khusus penelitian ini adalah untuk membuktikan bahwa perbaikan
profil leukosit, titer antibodi dalam serum dan titer antigen di feses dapat
digunakan sebagai indikator efektivitas terapi IgY dalam mencegah kematian
anjing akibat infeksi CPV. Dapat diisolasi virus parvo isolate local yang nantinya
dapat digunakan sebagai kandidat vaksin yang homolog dengan isolate lapang.
9
:
Hingga saat ini belum ada terapi yang efektif dapat menyembuhkan anjing
dari infeksi
.
Terapi yang biasa dilakukan hanya untuk
menekan gejala klinis tetapi tidak dapat mencegah kematian anjing. Biaya terapi
yang dikeluarkan pemilik anjing sangat mahal sehingga pemilik hewan cenderung
membiarkan anjingnya mati daripada mengobati. Hal ini dirasa sangat merugikan
ketika harga anjing yang dimiliki mencapai jutaan rupiah.
Provinsi Bali memiliki plasma nutfah yang sangat berharga yaitu anjing
kintamani. Dari informasi dokter hewan di daerah Sukawana, populasi anjing
kintamani menurun drastis akibat penyakit rabies dan pemusnahan massal.
Dinformasikan pula bahwa anjing kintamani banyak yang terinfeksi canine
parvovirus sehingga sangat perlu dilakukan pencegahan dan terapi anjing ,baik
melaui vaksinasi dan terapi. Anjing kintamani sebagai plasma nutfah Bali yang
sudah diakui sebagai anjing trah asli Asia dan hanya ada di Bali sangat perlu
dijaga kesehatan dan kelestariannya.
. !,!! 7. .4 ! ini adalah terapi infeksi CPV dengan IgY secara
intravena memberi peluang sembuh pada anjing.
Efektivitas terapi dapat
diketahui melalui indikator perbaikan profil leukosit darah anjing, titer antibodi
dan titer virus di feses. Isolat virus lokal yang berhasil diisolasi dapat digunakan
sebagai bibit virus dalam vaksin sehingga homolog dengan virus parvo yang
menginfeksi anjing di lapangan.
Penyakit menular yang mematikan merupakan masalah serius dalam
pengembangan ilmu kedokteran manusia dan hewan. Terapi sering tidak
berkhasiat akibat kuman yang resisten, ketiadaan obat yang efektif untuk sebagian
besar penyakit virus, atau akibat patogenesis agen yang berkembang dengan
sangat cepat dan menginfeksi organ vital (Dubie
. 2014).
Imunisasi pasif buatan dengan pemberian antibodi untuk pencegahan dan
pengobatan penyakit infeksius telah dilakukan sejak jaman dahulu (Carlander
2000). Pengobatan dengan antibodi pasif disebut juga serum terapi karena
antibodi yang digunakan berasal dari serum manusia atau hewan yang sudah
dikebalkan (Baxter 2007). Produksi antibodi pasif memerlukan biaya yang sangat
mahal karena memerlukan donor yang banyak dan proses isolasi yang sulit
(Goddard
2006). Kendala produksi dan biaya menyebabkan pemanfaatan
antibodi sangat terbatas. Pengobatan dengan antibodi pasif mulai ditinggalkan
sejak ditemukannya antibiotik.
Namun penggunaan antibiotik yang tidak
terkendali menyebabkan sebagian besar kuman menjadi resisten, sehingga
pengobatan menjadi tidak efektif (Carlander
2000).
Antibodi pasif kembali menjadi pilihan untuk pengobatan infeksi virus,
gangguan inflamasi dan tumor (Michael
. 2010). Pengobatan dengan antibodi
menjadi pilihan karena memiliki spesifisitas yang tinggi pada agen target, dapat
digunakan dalam dosis tinggi dan tidak bersifat toksik (Casadevall 1999).
Masalah utama dalam imunoterapi adalah
dan hilangnya daya;
guna pada pemberian berulang dalam waktu yang lama. Walau demikian, potensi
antibodi sebagai bahan biologik yang efektifitasnya tidak tergantikan oleh bahan
kimia apapun, perlu dimanfaatkan dengan menemukan bahan atau cara yang dapat
menekan dampak jangka panjang. Ketersediaan antibodi pasif sangat dibutuhkan
untuk pencegahan dan pengobatan berbagai penyakit.
Imunoglobulin yang berasal dari bangsa burung, yang dikenal sebagai IgY
(Grindstaff
. 2003) tampaknya berpotensi untuk menekan biaya produksi dan
dampak samping sebagai agen imunoterapi yang berkhasiat dan aman. Secara
alami, immunoglobulin dari serum induk ayam ditransfer pada kuning telur
sebagai bentuk kekebalan pasif alami untuk anak ayam setelah menetas (Kovac
. 2005). Karenanya, IgY khas terhadap agen yang diinginkan dan mudah
diperoleh dengan imunisasi induk ayam (Carlander
2002).
Penggunaan IgY untuk imunoterapi juga bukan hal baru. IgY ayam
terbukti efektif untuk pencegahan dan pengobatan berbagai penyakit (Kovacs
2005).
Antibodi ini efektif mencegah infeksi saluran pencernaan yang
disebabkan oleh
caries gigi yang disebabkan oleh
,inaktivasi urease dari
(Al;Adwani
pada anjing. (Nguyen
2006). Secara in vitro, IgY anti
terbukti efektif mencegah terjadinya
sel lestari
(Suartini
. 2013) dan infeksi
pada
2015).
IgY memiliki keunggulan dibandingkan IgG yaitu tidak mengaktivasi
sistem komplemen pada mamalia (Carlander 2002) sehingga memungkinkan
aplikasinya secara intravena. Pada mencit IgY terbukti tidak menimbulkan reaksi
anafilaktik dan serum sikness ketika diaplikasikan secara intravena mencegah
terjadinya (Menaatchisundaram 2010).
Tropisme CPV adalah pada jaringan yang sel;selnya sedang aktif
membelah seperti epitel kripta usus halus, limfoid orofaring, limfoglandula
mesenterika dan sumsum tulang belakang (Meunier
1985). Replikasi virus
yang terjadi di seluruh jaringan limfoid dan saluran pencernaan menyebabkan
lonjakan jumlah virus yang diekskresikan melalui feses. Anjing akan mengalami
imunosupresif dan diare berdarah akibat kerusakan se;sel limfoid dan epithel
saluran pencernaan.
Secara klinis infeksi CPV ditandai dengan leukopenia dan limfopenia
(Prittie
. 2004). Infeksi CPV pada jaringan limfoid dan sumsum tulang
menyebabkan cadangan leukosit dan limfosit berkurang. Kerusakan epitel usus
halus menyebabkan migrasi netrofil di sumsum tulang dan darah menuju tempat
terjadinya infeksi. Ketidakseimbangan jumlah netrofil yang dihasilkan di sumsum
tulang dan migrasi netrofil menuju jaringan yang terinfeksi menyebabkan
neutropenia.
Infeksi CPV menyebabkan kerusakan sel;sel limfoblas di jaringan limfatik
dan sel;sel myeloblas sumsum tulang.
Kerusakan tersebut menyebabkan anjing
mengalami limfopenia dan netropenia pada 1;4 hari setelah infeksi. Panlekopenia
dapat terjadi akibat invasi virus pada jaringan limfoid dan hematopoietik. Derajat
panlekopaenia terjadi bertingkat dan mencapai puncaknya ketika gejala klinis
paling parah. Netropenia terjadi akibat ditariknya netrofil menuju daerah infeksi
di saluran pencernaan. Pada infeksi parvovirus lekopenia terjadi pada hari 5;8
pasca infeksi.
Anjing yang terinfeksi CPV memiliki total sel darah putih di bawah 2.0 x
9
10 /l (normalnya: 6.0;15.0 x 109/l). Total sel darah putih antara 0.5;0.2 x 109/l
terutama terjadi pada puncak infeksi. Leukopenia yang terjadi pada infeksi CPV
sebanding dengan keparahan gejala klinis yang ditimbulkannya. Mekanisme
terjadinya neutropenia pada infeksi CPV sebagai berikut: (1) invasi virus pada sel;
sel hematopoietik dan pusat proliferasi netrofil di sumsum tulang memicu
terjadinya neutropenia 5;8 hari pasca infeksi. (2) turunnya jumlah cadangan
netrofil di sumsum tulang akibat jaringan yang mengalami radang membutuhkan
banyak netrofil. Hal ini sering dijumpai pada kasus septikemia dan infeksi bakteri
saluran pencernaan. (3) perpindahan netrofil dari sirkulasi menuju ujung;ujung
pembuluh darah sebagai respon adanya endotoksemia dan migrasi netrofil ke
jaringan. (4) granulopoiesis yang tidak efektif akibat meningkatnya fagositosis
netrofil oleh makrofag di sumsum tulang. Pengobatan pendukung pada infeksi
CPV akan meningkatkan jumlah leukosit pada hari 1;6 pasca infeksi ditandai
peningkatan jumlah leukosit yang drastis (Goddard dan Leisewitz 2006).
Jumlah dan morfologi leukosit pada individu sehat relatif stabil.
Perubahannya yang drastis pada individu sakit dapat digunakan untuk diagnosa
secara klinis. Walaupun respon leukosit pada individu sakit bukan penciri utama
suatu penyakit namun perubahan keseimbangannya dapat memberikan informasi
klinis, sebagai diagnosa banding dan untuk mengetahui respon indivudu terhadap
suatu pengobatan (Goddard dan Leisewitz 2006).
Untuk mencapai hasil yang diharapkan maka perlu dilakukan tahapan;
tahapan penelitian yang runut dengan memberikan penekanan;penekanan khusus
pada setiap tahapan penelitian (Tabel 1).
!5.4 %
! !7! 7. .4 ! 7! ! !
Tahapan
Penelitian
1 Preparasi
antigen
No
Penjelasan
Indikator capaian
Preparasi antigen
pada biakan lestari
Mendapatkan antigen yang
imunogenik dan antigenic
dengan titer tinggi
2 Produksi IgY Produksi IgY spesifik dilakukan dengan Mendapatkan IgY dalam
jumlah besar dan titer
spesifik anti
cara imunisasi ayam dengan
tinggi.
parvovirus
dosis 213 HA secara
intramuskuler dan koleksi IgY dari
pada telur
serum dan telur yang dihasilkan
ayam.
Dilakukan menggunakan teknik
3 Isolasi dan
Diperoleh IgY murni
pemurnian IgY presipitasi dengan ammonium sulfat,
spesifik
dari kuning
dialisis, kromatografi filtrasi gel. Tujuan
telur
untuk memastikan bahwa IgY yang
terbentuk spesifik terhadan
4 Identifikasi
kemurnian dan
Uji spesifisitas
IgY
Identifikasi kemurnian dengan SDS;
PAGE, penentuan kandungan protein
dengan metode Nano Drop, Uji
spesifisitas menggunakan Teknik HI
dan AGPT
6 Uji
Uji kemampuan netralisasi IgY secara in
kemampuan
vivo pada anak anjing dengan uji
netralisasi IgY haemaglutinasi inhibisi dan uji ELISA
anti parvovirus
secara in vivo
7 Produksi
massal IgY
pada telur
! !7!
Dilakukan dengan cara imunisasi ayam
dengan parvovirus intramuskuler dan
koleksi IgY dari telur yang dihasilkan
. .4 !
Diperoleh IgY murni
dengan spesifisitas tinggi
Diketahui kemampuan
netralisasi IgY secara in
vitro ,juga diketahui titer
optimal IgY untuk aplikasi
pencegahan dan
imunoterapi intravena
Produksi IgY secara massal
sehingga diperoleh
konsentrasi yang tinggi
untuk tujuan aplikasi
pencegahan dan
imunoterapi
!
No Tahapan Penelitian
Penjelasan
Indikator capaian
1 Isolasi virus parvo
Dilakukan dengan menanam Diperoleh virus parvo dengan
isolat lokal, propagasi virus pada biakan lestari FK, patogenitas dan titer yang
dan identifikasi virus identifikasi dengan uji HA/HI tinggi untuk uji tantang.
dan serum netralisasi
Diketahui efektivitas terapi
2 Uji tantang pada 16
Dilakukan dengan cekok
ekor anjing
virus dan terapi dengan IgY IgY
anti CPV
3 Deteksi titer IgY di
Dilakukan dengan uji HA/HI Diketahui efektivitas terapi
serum dan titer CPV di dan ELISA
IgY dari indiator antibodi dan
feses
antigen
4 Penghitungan/penentu Pewarnaan Giemsa dan
Diketahui efektivitas terapi
an profil leukosit
penghitungan diferensial
IgY dari indikator perbaikan
darah anjing
leukosit
profil leukosit setelah terapi
IgY
.,7!
! -!8
. .4 !
Penelitian akan dilakukan
di Laboratorium Bioteknologi Balai Besar
Veteriner Denpasar, Bali. Hewan dipelihara di kandang hewan coba Balai Besar
Veteriner Denpasar, Bali. Uji Serum Netralisasi, HA/HI dan isolasi virus di
laboratorium Virologi Balai Besar Penelitian Veteriner, Bogor.
Pembuatan
preparat ulas darah dilakukan di Balai Besar Veteriner Denpasar, Bali dan
penghitungan profil leukosit dan limfosit dilakukan di Laboratorium Fisiologi
FKH;IPB Bogor.
! !
!
4! 7. .4 !
! !
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: sepuluh ekor ayam
petelur
galur Isabrown umur 20 minggu, antigen parvovirus diperoleh dari
Bbalitvet;Bogor,
dan
!
isolat lapang yang diinaktivasi dengan formaldehid.
diperbanyak dalam kultur sel FK, diberi medium "
#
(DMEM) yang mengandung 2%
kimia untuk isolasi, karakterisasi kuning telur, %
$
. Virus berasal dari
Isolat parvovirus
#
(FBS). Bahan
(Promega) untuk
pemurnian antibodi. Bahan untuk elektroforesis SDS;PAGE. Bahan kimia untuk
AGPT. Bahan untuk uji HA/HI dan bahan untuk uji serum netralisasi.
. !4! !
Kandang, perlengkapan kandang ayam, Sentrifus dingin, mikrotiter, spuite
disposable needle, eppendorf, fintip, Elisa reader, plate Elisa, spectrophotometer.
&
incubator CO2, alat elektroforesis SDS;PAGE, tabung
dialysis, kertas saring, seperangkat glasswares, tabung reaksi serta raknya, tabung
erlemeyer dan corong gelas.
. ;! ! 7. .4 !
!
!4
. .4 !
Tabel 1. Jadwal Kegiatan Penelitian
. .4 !
+
!!
!
4!
. !!
%
'
/
*
3
(
&
0
)
%$
%%
%'
1. Persiapan di laboratorium
2. Persiapan pengadaan antigen
(
,
3. Produksi IgY dari kuning telur ayam
4. Isolasi, Pemurnian IgY,
karakterisasi dan penentuan dosis
terapi IgY
5. Persiapan dosis terapi IgY murni
yang steril
6. Laporan penelitian tahun I
. .4 !
+
1
2
3
4
5
6
!
!!
. !!
5 4!
% ' / * 3 ( & 0 ) %$ %%
Persiapan kandang ,pakan
dan hewan coba (anjing)
Uji tantang pada anjing
Koleksi serum dan feses
Analisis Laboratorium
Entry Data
Analisis Data dan Pelaporan
Al;Adwani SR, Crespo R, Shah DH (2013). Production and evaluation of chicken
egg;yolk;derived antibodies against Campylobacter jejuni colonization;
ssociatedproteins. Foodborne Pathogens Dis., 10: 624;631
Baxter, D. (2007).Active and passive immunity, vaccine types, excipents and
licensing. Occup. Med. (Lond). 57:552;556.
Carlander V. 2002. '
- .'
/
. Fakulty of Medicine
ACTA Universitatis Upsaliensis, UPPSALA. Swedia. Pp. 53.
Decaro N, Martella V, Desario C, Bellaciccio AL, Camero M, Manna L, d’Alojo
D, Buonavaglia C. 2006. First detection of
type 2c in
pups with haemorrhagic enteritis in Spain. 0 + # 53:468;472.
Dubie Teshager, Seid Yimer, Mulie Adugna ,Tesfaye Sisa. (2014). Advanced
Research Journal of Biochemistry and Biotechnology: Vol. 1(3): pp 018;
030
Duffy A, Dow S, Ogilvie G, Rao S, Hackett T . 2010. Hematologic improvement
in dogs with parvovirus infection treated with recombinant canine
granulocyte;colony stimulating factor. 0
)
&
. 33: 352–
356
Goddard A, Leisewitz AL, Christopher MM, Duncan NM, Becker PL. 2006.
Prognostic usefulness of blood leukocyte changes in
enteritis . 0 + # . 22:309;316.
Goddard A, Leisewitz AL. 2010.
.+
1
'
'
)
. 40: 1041;1053.
Godsall SA, Cleqq SR, Stavisky JH, Radford AD, Pinchbeck G. 2010.
Epidemiology of
and
in dogs presented
with severe diarrhoea to PDSA Pet Aid hospital. + 2 . 7: (6) 196;201.
Grindstaff JL, Brodie III, ED, Ellen DK (2003). Immune function across
generations: Integrating mechanism and evolutionary process in maternal
antibody transmission. Proc. Biol. Sci.,270:2309–2319.
Ling, M. Jacqueline M. Norris, Mark Kelman, Michael P. Ward. (2012). Risk
factor for death from canine parvoviral; related disease in Australia.
Veterinary Microbiology. 158: 280;290.
Mattjik AA, Sumertajaya IM. 2006. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS
dan MINITAB. Ed ke;3. Bogor. IPB Press.
Meenatchisundaram S, Michael A. 2010.
Comparison of four different
purification methods for isolation of anti
antivenom
antibodies from immunized chicken egg yolk. 0 $
. 8(1):
50;55.
Michael A, Meenatchisudaram S, Parameswari G, Subbraj T, Selvaku R,
amalingam S (2010). Chicken egg yolk antibodies (IgY) as an alternative
to mammalian antibodies. Indian J. Sci. Technol., 3: 468;474.
Nguyen VS, Umeda K, Yokoyama H, Tohya Y, Kodama Y. 2006. Passive
protection of dogs against clinical disease due to
;2 by
specific antibody from chicken egg yolk.
!
70: 62.
Prittie J. 2004.
enteritis: A review of diagnosis. Management,
and prevention. 0
+
14(3):167;176.
Sendow I, Syafriati T. 2004. Seroepidemiologi infeksi
pada
anjing. 0
&
+
Sodikoff CH. 1995. Laboratory Profiles of Small Animal Disease. A Guide to
Laboratory to Laboratory Diagnosis. Ed 2. USA: Mosby.
!,7 ! %
RINCIAN ANGGARAN
%
%%
!6
. .4
.4!8 ! !
. !!
Ketua
Anggota
Teknisi
,4!
. +
4
1
,
1
2
,4!
9 4
4!
8. 6!
!,9,
4
8
10
4
4
8
4
10
10
5 + !4
%'
+
! !
8 ! !
!5
!!
1. Ayam Isa Brown
2. pakan ayam
Kandang ayam dan
3.
perlengkapannya
Adjuvant complete dan
4.
incomplete
5. Spuite disposible syring
6. Kapas, alcohol, cotton bud
7. Kertas saring
8. Botol sampel
9. Tabung ependorf
10 Kit EGGstract Purification
11 ELISA Kit
12. Tissue culture flask
13. Plate HA/HI
14. Media DMEM
15. Foetal Calf Serum
16. Agarosa serva
17. Millipore Sartorius
18. Fintips 200 ul
19. Fintips 1000 ul
5 +
7!
+ !4 ! !
!,9,
< 7=
< 7=
20.000; 6.400.000.;
15.000.; 4.800.000.;
12.500,; 4.000.000,;
%3 '$$ $$$"
2
!8!
1+4 ,.
! ! ! ! < 7=
10 ekor
5 zak
100.000,;
250.000,;
1.000.000,;
1.250.000,;
1.000.000,;
1.000.000,;
200.000,;
800.000,;
150.000,;
300.000,;
3000,;
3000,;
300.000,;
8.000.000,;
3.000.000,;
1.500.000,;
750.000,;
1.000.000,;
5.000.000
2.000.000,;
1000.000,;
350.000,;
450.000,;
450.000,;
300.000,;
300.000,;
450.000,;
1.200.000,;
8.000.000,;
3.000.000,;
1.500.000,;
750.000,;
2.000.000,;
2.500.000.;
2.000.000,;
1.000.000,;
700.000,;
900.000,;
') %$$ $$$"2
1 set
4 vial
3 box
1 set
100 lembar
150 buah
4 box
1 paket
1 Paket
1 Box
1 Box
2 box
0,5 botol
1 Botol
1 Box
2 Box
2 Box
!4
! !< 7=
%/
! !
+
+8! 9
.
8 . 6!4! !
.
8 !
6 !
,4!
.. !
.8 .
. 6!4! !
! !
! ! < 7=
+ !4 ! !
< 7=
. 6!4! !
1. Denpasar; Pesawat
Jakarta pp Terbang
Ke lokasi
penelitian
1 orang
peneliti
1 kali
3.000.000,;
3.000.000,;
2. Denpasar; Pesawat
Jakarta pp Terbang
Seminar
hasil
1 orang
peneliti
1 kali
3.000.000,;
3.000.000,;
3 Denpasar; Pesawat
Jakarta pp Terbang
Seminar
Nasional
1 orang
peneliti
1 kali
4.000.000,;
4.000.000,;
%$ $$$"$$$.;
5 + !4
%*
! !
8 .
+
.4 ! ! 4! 24!
!!
.7. 4 !
1. Dokumentasi hasil
Dokumentasi
Pengolahan data dan
2.
Pembuatan laporan
penulisan laporan
3. Penggandaan laporan
Penggandaan laporan
4. Publikasi ilmiah
Publikasi ilmiah
5 Seminar Nasional
Biaya Seminar
5 + !4
+ !4
! ! !