1.Bagaimanakah cara untuk mengetahui kelainan pada molekul DNA? 2.Apakah yang disebut DNA probe dan apa syaratnya? 3.Apakah guna reporter dan dimana meletakkannya ? 4.Apakah gunaanya PCR, dan prosesnya ada berapa tahap ? - PERTEMUAN KE XIV

  KUIS

• 1.Bagaimanakah cara untuk mengetahui kelainan pada molekul DNA?
• 2.Apakah yang disebut DNA probe dan apa syaratnya?
• 3.Apakah guna reporter dan dimana meletakkannya ?
• 4.Apakah gunaanya PCR, dan prosesnya ada berapa tahap ?

PERTEMUAN KE XIV

  

Reverse Transcriptase Polymerase

Chain Reaction

(RT – PCR)

  RT - PCR

• > Pengertian :

• • adalah proses pembentukan cDNA dengan

  mRNA sebagai template.
• > Komponen yang diperlukan :
• – 1. sampel mRNA
• – 2. Enzim reverse transcriptase
• – 3.dNTP
• – 4. reaksi bufer
• – 5. oligo dT
• – 6. ion Mg++
• – 7. primer DNA
• – 8. enzim DNA polimerase ( Taq polimerase )

  

Tahapan dalam pembuatan

cDNA

• 1.Isolasi RNA total dari jaringa atau organ.
• 2. Elektrophoresis gel agarose untuk memonitor keberhasilan isolasi RNA.
• 3.Sintesis cDNA dari mRNA melalui proses RT- PCR.
• 4.Isolasi cDNA dari gel agarose.
• 5.Melabel cDNA

  

1. ISOLASI RNA TOTAL DARI _{• Jaringan / sebagian organ}

JARINGAN ATAU ORGAN _{• guanidium thiocynate -untk menghambat • Yg mengandung} • -digerus + bufer -detraksi/melisiskan sel _{• dihomogenasi ditanpung dalam • Hasil penggerusan jaringan} • aktivitas RNAase

_{• -Supernatan dibuang -endapan +lithiumclorid} • eppendorf & di setrifuge _{(untuk memisah DNA dari • Endapan /pellet mengandung RNA, • -supernatan dibuang(mengandung DNA)} RNA)& disentrifuge. _{• RNA murni ( mengandung tRNA,rRNA, mRNA) • tein} • + bufer untuk pencucian sisa DNA dan pro Syarat untuk isolasi RNA total: • 1. Kondisi lingkungan harus bebas dari RNase.

• 2. Sampel yang akan diisolasi harus bebas dari kontaminasi Rnase.
• 3. Alat-alat yang digunakan harus bebas dariRNase( diautoklaf atau disemprot ethanol 70%).

• • 4. Laboran / peneliti harus menggunakan sarung

  tangan untuk melindungi RNA hasil isolasi den terha dap kontaminasi dengan Rnase.

  

2. Elektrophoresis RNA murni hasil

isolasi

• RNA murni hasil isolasi
• gel loading bufer -untuk dimasukkan dalam sumuran +sinar UV elektr.
• Pada Gel Elektr tampak
• 2 pita rRNA (28S dan 18S) dan
• pita mRNA (ditas/dibawah/diantara pita rRNA)
>
• Pita mRNA diangkat
• (untuk dijadikan template pada pembentukan cDNA)

  

3.Sintesis cDNA dengan mRNA

sebagai template

• Fragmen mRNA (hasil isolasi)

• • + oligo dT -menempel pada ujung

  _{3(templete pada poli A}

  • tail).
• dNTP - Untuk bahan cDNA
• thermostabil - untuk sintesis cDNA dg
• reverse transk template mRNA
• ( RTth)
• mRNA berpasangan dengan cDNA
• RNase.H - Untuk melisiskan mRNA
• cDNA murni (untuk bahan PCR)

  

Nucleic acid Sequencing

(Sekuensing asam inti)

• Pengertian :
• Adalah cara untuk mengetahui atau mengung kapkan kode-kode genetik dari suatu molekul DNA.
• Macam metode sekuensing: 1 metode Allen Maxam & Walter Gilbert (1977).

2. Metode Frederick Sanger (1975)

  Metode Maxam - Gilbert

• 1. Fragmen DNA dimodivikasi dengan ujung yang berbeda: _{– b. Diberi ujung A & G, dengan bantuan asam formiat. – a. Diberi ujung G, dengan bantuan enzim dimetil sulfat.}
• _{– d. Pada sub. C, diberi medium dengan kadar garam tinggi yang akan} – c. Diberi ujung C & T, dihidrolisis dengan hidrosin.

  _{menghalangi reaksi dengan T sehingga akan terbentuk fragmen}

  _{• 2. FragmenDNA yang akan disequencing dilabel pada ujung 3’}

  _{dengan zat radioaktif (P32).}
  dengan ujung C saja.
• _{• a. Sumur I berisi fragmen DNA dengan ujung G} • 3. Kemudian masing –masing fragmen dengan ujung yang _{berbeda dimasukkan dalam elektrophoresis: • c. Sumur III berisi fragmen DNA dengan ujung C & T} • b. Sumur II berisi fragmen DNA dengan ujung A & G.
• d. Sumur IV berisi fragmen DNA dengan ujung T.

  

Hasil elektrophoresis Maxam-Gilbert

• G A & G C & T T • C • G G • A • T T

  

Metode Sanger

• • Metode ini memanfaatkan kemampuan 2 sifat

  dari DNA polimerase (Fragmen Klenow), yaitu:
• 1. Mampu mensintesis DNA dari dNTP
• 2. Ketidak mampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP.
• Catatan:
• dNTP kehilangan oksigen pada OH di C2 pentose
• ddNTP kehilangan 2 oksigen pada C2 dan C3

  Prosedure sequencing

Sanger

• • 1.Empat tabung masing-masing diisi dengan

  dATP + ddATP (sedikit); (perband: 50 : 1)
• dCTP + ddCTP “
• dGTP + dd GTP “
• dTTP + ddTTP, “
• Dengan demikian pada masing-masing tabung yang berisi DNA dengan ujung sama , akan terjadi reaksi yang akan

  menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang

  ukurannya tidak sama.

  

Metode Sanger (lanjut)

• Jika yang dirangkai oleh DNA polimerase adalah dNTP, maka akan terbentuk rangkaian DNA .
• Jika yang dirangkai oleh DNA polimerase adalah ddNTP maka akan menjadi terminal dan proses polimerisasi nukleotida akan berhenti disitu (pada ddNTP)

  _{Berdasarkan pemikiran tersebut diatas , maka metode sequencing •}

Metode Sanger (lanjut)

_{1. dATP + ddATP (sedikit) • terpisah, yang masing-masing mengandung :} menurut Sanger dapat dilakukan pada 4 tabung reaksi yang _{• 3. dGTP + ddGTP (sedikit) • 2. dCTP + ddCTP (sedikit)}
• _•

  4. dTTP + ddTTP (sedikit) _{Dengan cara tersebut diatas maka pada tiap tabung akan yang sama tetapi pada ujung 3’ dari tiap fragmen DNA mengan dung basa –N} dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang panjangnya tidak sama , _{DNA dari tiap tabung. gel poliakrilamit, sehingga terdapat pemisahan fragmen-fragmen Selanjutnya dilakukan pemisahan dengan elektrophoresis dengan}

• _•
_{1.Pada tabung satu ada empat fragmen DNA dengan ujung A •} Contoh :<
• _•

  2. pada tabung dua ada dua fragmen DNA dengan ujung C Prosedure Sanger (Lanjut)

  Penyusunan fragmen- fragmen DNA

• Setelah diketahui hasil pemisahan berdasar kan ukuran fragmen DNA pada gel poliakrilami de, lalu dilakukan pengurutan fragmen mulai dari yang paling pendek dan berakir pada fragmen yang paling panjang.
• Hasil penyusunan fragmen-fragmen itu meru pakan hasil sequencing.

• • Adapun struktur DNA yang dicari adalah

  komplemen dari hasil sequencing.

  3. Bagaimanakah cara memperoleh template asam inti utuk RT-PCR

  KUIS

• 1. Apakah beda PCR dengan RT-PCR
• 2. Apakah tujuan dilakukan RT-PCR?

  4 Bagaimanakah cara menghilangkan template pada RT-PCR

  

Mutasi

• Pengertian :
• Mutasi adalah perubahan materi genetik yang memberi bentuk alternative pada tiap gene.
• Beberapa keuntungan akibat mutasi bagi organisme:
• 1. dapat beradaptasi terhadap lingkungan
• 2. memungkinkan terjadinya diversitas genetik dalam populasi.
• 3. mencegah terjadinya kepunahan bagi suatu jenis organisme.
• 4. dapat memperbaiki sifat dari suatu jenis organisme.
• Beberapa kerugian akibat mutasi:
• 1. dapat menimbulkan kelainan-kelainan akibat mutasi

  • 2. menimbulkan sakit atau gangguan fsi maupun fsiologis.

  Macam mutasi

• A. Mutasi gene :

  &gt;karena adanya perubahan struktur gene.

• B. Mutasi chromosome: &gt;mutasi yang disebabkan oleh adanya perubahan struktur,

  ukuran , atau jumlah

A. Mutasi gene

• Sebab terjadinya mutasi
• A. 1 Faktor fsis ( sinar, suhu, dsb)
• 2. Faktor kimia ( cholkisin, zat antibiotik, dsb).
• B. Mekanisme mutasi dapat terjadi karena: 1. adanya kesalahan saat terjadi replikasi DNA 2. hilangnya basa-N pada gene (delisi) 3. tambahan /sisipan basa-N pada gene (insersi).

  4. penggantian basa-N pada gene /DNA (substitusi) 5. adanya perubahan struktur basa–N pada gene (misalnya : tautomeri) Macam mutasi gene

• 1. Point mutation; _{– karena perubahan salah satu basa-N pada gen – b.Nonesense mutation.}
• – a. Missense mutation
• – c. Samesense mutation. (Silent mutation) _{* Mutasi akibat insersi atau delisi suatu basa-N pada suatu gene}

  2. Frameshift mutation; _{sehingga menyebabkan berubahnya seluruh kodon pada} rangkaian nukleotida berikutnya. _{*Tautomeri adalah berpindahnya atom hidrogen pada basa –N}

  3. Tautomeri mutation; _{secara spontan sehingga menyebabkan terbentuk isomernya.} Point mutation

• a. Missense mutation:
• – Mutasi akibat terjadinya penggantian (substitusi) satu basa-N pada kodon, sehingga menyebabkan terjadinya

  perubahan kodon dan perubahan polipeptida yang

  dihasilkan.
• – Contoh :
• – Hb.A orang normal adalah :
• – 1 2 3 4 5 6 7
• – Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu - Glu – (GAG)
• – Hb.S pada penderita Sickle Cell Anaemia – 1 2 3 4 5 6 7
• – Val – His - Leu - Thr – Pro - Val - Glu

  = sabit) • 5. Dapat menyebabkan kematian.

  Sifat-sifat Sickle cell anaemia (Hb.S)

• 1. Eritrosit mudah pecah
• 2. eritrosit tidak mudah bergerak dalam kapiler darah.
• 3. Afnitas Hb terhadap oksigen rendah, sehingga penderita mengalami gejala seperti penderita anaemia.
• 4. Eritrosit berbentuk cresent ( sickle

b. Nonsense mutation

• Mutasi yang disebabkan adanya substitusi basa-N yang menyebabkan terbentuknya kodon terminasi

  (UAG, UGA atau UAA), sehingga pada saat proses translasi akan dihasilkan protein yang pendek.

• • Akibatnya protein tidak berfungsi dan kehilangan sifat

  biologisnya.
• Contoh:
• Varian β globin, yang dikenal sebagai Mc.Kees

  Rock kehilangan 2 asam amino terakhir sebelum kodon terminasi ( kodon ke 145 dan 146) karena adanya substitusi basa-N (U) pada kodon (UAU ) untuk tryonin, diganti dengan basa-N (A) sehingga terbentuk kodon UAA sebagai kodon terminasi.

c. Samesense mutation (Silent

  mutation:

• Mutasi yang menyebabkan terjadinya perubahan basa-N pada kodon, tetapi tidak merubah janis asam amino yang dikode.
• Contoh:
• Perubahan kodon GGA akibat substitusi menja di kodon GGC tidak akan merubah jenis asam amino yang dikode,yaitu Glycine

2. Frameshift mutation

• • Mutasi yang disebabkan oleh adanya insersi(sisipan)

  atau hilangnya(delisi) basa dari suatu kodon yang mengakibatkan berubahnya seluruh kodon pada rangkaian berikutnya.
• Contoh:
• Pada varian α globin abnormal : (terjadi delisi) yang dikenal sebagai Hb. Wayne I • No.kodon 138 139 140 141 142 147
• Normal UCC AAA UAC CGU UAA -
• Ser Lys Tyr Arg stop
• Mutasi UCC AAU ACC GUU AAG UAA

• • Ser Asn Thr Val Lys stop

3. Mutasi akibat Tautomeri

• Tautomeriadalah berpindahnya atom H

  pada basa –N secara spontan ,sehingga

  menyebab kan terbentuknya isomer dari basa-N tersebut.

• • Adenine dan Cytosine dari struktur amino

  dapat berubah menjadi struktur imino (sebagai isomernya)
• Guanine dan Thymine dari struktur keto dapat berubah menjadi struktur enol (sebagai isomerenya).

  

Perubahan

1. bentuk amino ke bentuk imino

2. bentuk keto ke bentuk enol

  

Mutasi (lanjut)

• Struktur imino dari Adenosine dapat berikatan dengan struktur amino dari Cytosine.
• Struktur imino dari Cytosine dapat berikatan dengan struktur amino dari Adenine.
• Struktur enol dari Guanine dapat berikatan dengan struktur keto dari Thymine.

  Wolf Hischhorn Syndrom (delisi chr. 4) Perubahan str.chromosome

Mutasi chromosome (lanjut) • 2. Mutasi karena perubahan struktur chromosome.
• – a. Inversi ( pembalikan gene ) pada chromosome.
• – b. Translokasi (berpindah lokasi): gene berpindah lokasi pada chromosome yang sama maupun chromosome yang berbeda.(yang homologe maupun tak homologe).
• – C. Insersi (tambahan gene pada chromosome) 3. Mutasi karena perubahan jumlah chromosome. Peristiwa ini dapat terjadi karena peristiwa non disjunction. Peristiwa ini dapat berupa monoploidi (N), Triploidi (2N
• 1) atau poliploidi ( untuk 3 N ke atas)

a. Pada jumlah gonosome ( sex chromosome ) b. Pada jumlah autosome .

  

Mutasi Perubahan jumlah gonosome

• a. Mutasi karena perubahan jumlah gonosome
• – 1. Turner syndrome,
• Monosomi sex chromosome X pada wanita, sehingga jumlah chromosomenya 44. X0 = (45).
• Sifat penderita ini adalah :
• Ovarium rudimenter
• mandul

2. Kleinefelter Syndrome, Trisomi pada gonosome laki-laki dengan jumlah chromosome 44 XXY = 47.

• * Sifat penderita ini adalah : * Testis tidak tumbuh.
• aspe>mandul
• tanda-tanda kelamin sekunder tidak tumbuh .

  Turner syndrome Kleinefelter syndrome

  

Mutasi Perubahan Jumlah autosome

• Tambahan jumlah autosome
• 1. Edward Syndrom :( 2N + 1) -&gt; 47. XX atau
• 47. XY, trisomi , pada autosome no. 16, 17 , atau no. 18.
• 2. Patau Syndrome : (2N +1) -&gt; 47.XX atau

47.XY, trisomi pada autosome no. 13, 14, atau

  no.15. ( jarang terjadi

• • 3. Down Syndrome : (2N + 1) -&gt; 47.XX atau 47.XY

• trisomi pada autosome No. 21
Perubahan jumlah chromosome (lanjut)
• b. Perubahan jumlah autosome:

1. Edward Syndrome : ( 2N + 1),

  

Pada chromosome no. 16, 17 , atau

18.
• – Ciri-ciri:
• tengkorak lonjong,
• dada pendek dan lebar,
• telinga rendah
• ada lipatan epikantik
• mikrognathia

  Edward syndrome (Trisomi 18)

2. Patau Syndrome

• Ciri-ciri:
• kepala kecil
• mata kecil * telinga rendah dan buruk.
• Sumbing dan bercelah pada langit- langit
• polidaktili * pertumbuhan tubuh lambat.
• kemunduran pada mental.

  Patau Syndrome (Trisomi 13)

3. Down Syndrome

• Ciri – ciri: * mata sipit danbiasanya juling.
• tubuh pendek
• kaki pendek
• Kepala agak bundar
• bibir tebal dan agak menggelambir;
• mulut suka menganga * leher pendek dan besar.
• telinga kecil * telapak tangan gemuk dan pendek.

• * jari kelingking bengkok ke dalam .

• gigi tak teratur
• kulit kasar dan kering
• otak kecil + pertumbuhan tubuh terganggu.

  Down Syndrome (trisomi 21)

• _{• Mutasi pada X chromosome dengan sisipan berulang(insersi)}

  Fragile-X syndrome
• _{• Ciri-ciri:} trinukleotida (CGG) pada gene FMRI. _{• &gt; tangan suka menggepak-gepak} • &gt; Gangguan mental _{• &gt; hiperaktif} • &gt; bicara sering diulang-ulang _{• &gt; emosi tidak terkendali} • &gt; perhatian tidak fokus _{• &gt; kaki fat} • &gt; muka lonjong _{• Catatan :} • &gt; laki-laki seperti perempuan dengan muka lomjong. _{• Premutasi dengan : 54 – 200 CGG} • Normal dengan : 6 – 54
• Mutasi : &gt; 200 CGG

  Fragile X syndrome.

  Fragile X syndrome