A. Replikasi Pola Semikonservatif - BAB04 Reproduksi Genom

  BAB REPLIKASI BAHAN GENETIK

  4 Kemampuan reproduksi merupakan salah satu ciri makhluk hidup. Reproduksi tingkat

  sel merupakan dasar dari reproduksi makhluk hidup. Pada eukariot bersel tunggal, sebagaimana juga pada bakteri, reproduksi sel sudah merupakan reproduksi makhluk hidup. Pada eukariot bersel ganda reproduksi sel merupakan satu bagian dari proses pertumbuhan dan perkembangan organisme. Pada titik tumbuh, seperti pada ujung akar atau pucuk, akan terjadi pembelahan sel secara berkelanjutan.

  Reproduksi selular akan diawali oleh reproduksi bahan genetik. Pada sel eukariot reproduksi sel mengikuti urutan tahapan berikut: G1 →S→G2→M (Gambar 1.7). Replikasi

  DNA, fase S, berjalan sebelum berlangsungnya pembelahan sel mitosis atau meiosis (fase M). Pada fase S akan terjadi sintesis atau replikasi DNA kromosom, sehingga pada masuk ke fase M (mitosis; meiosis) semua kromosom telah tergandakan.

  Pada sebagian besar organisme, eukariot, prokariot, dan virus, DNA menjadi bahan genetik; pada sebagian virus RNA menjadi bahan genetik. DNA genom diperbanyak dengan cara replikasi, sedangan RNA genom virus diperbanyak dengan dua cara, replikasi dan transkripsi balik. Pada bab ini akan dijelaskan mengenai replikasi bahan genetik organisme pada tingkat molekular

  Model Replikasi DNA

A. Replikasi Pola Semikonservatif

  Watson dan Crick mengemukakan bahwa struktur heliks ganda DNA menunjang proses reproduksi DNA melalu replikasi dengan pola semikonservatif. Pengertian replikasi semikonservatif ialah : bahwa dalam proses pembentukan DNA dari kedua utasan polinukleotida heliks ganda DNA hanya satu utasan yang disintesis sedangkan utasan yang lainnya berasal dari molekul DNA terdahulu (Gambar 4.8 dan 4.11). Sebagai perbandingan terhadap pola semikonservatif ini, pada Gambar 4.12 diperlihatkan dua pola yang lain, yaitu pola konservatif dan pola dispersif, dan sudah terbukti bahwa pola koservatiflah yang benar. Pola konservatif ternyata masih berlaku dalam proses reproduksi kromosom, yaitu digunakan dalam replikasi genom virus RNA.

  88 Genetika

  Semikonservatif Konservatif Disversif

Gambar 4.1. Replikasi DNA mengikuti pola semikonservatif, yaitu dari dua utasan polinukleotida

  penyusun DNA hanya satu yang disintesis sedangkan yang satunya lagi berasal dari DNA tetuanya. Sebagai perbandingan digambarkan dua pola lain, yaitu pada pola konservatif kedua utasan DNA berasal dari generasi yang sama, sedangkan pada pola disversif, kedua utasan DNA merupakan campuran dari fragmen yang baru dan fragmen DNA lama

  Pola semikonservatif dibuktikan mula-mula oleh Mathew Meselson dan Francis Stahl (1958). Mereka bekerja dengan bakteri E. coli telah menggunakan teknik radioisotop, sentrifugasi, dan densitometer, dengan tujuan untuk membedakan jenis DNA serta kuantitasnya. Pada garis besarnya yang mereka lakukan ialah menumbuhan E. coli pada kemudian pada setiap generasi yang berurutan dilakukan pemeriksaan kromosomnya dan dibandingkan satu generasi dengan yang lainnya

  15

  .Mula-mula bakteri ditumbuhkan secara berulang pada medium berat (radioisotop N)

  15 sampai semua bakteri mengandung N pada DNAnya. Kultur bakteri ini disebut generasi-0.

  15

  14 Kemudian bakteri N ini dibiakkan pada medium ringan atau berisotop N dan turunannya

  14

  (generasi-1) dibiakkan lagi pada medium N menghasilkan generasi-2, dan selanjutnya

  14 diulang lagi menghasilkan generasi-3, dan generasi-4 pada medium N.

  Meselson dan Stahl telah mengisolasi DNA bakteri dari generasi-tersebut di atas dengan teknik sentrifugasi kepekatan bertingkat, dan berhasil memisahkan DNA berdasarkan

  15

  15

  14

  14

  jenisnya atau bobotnya, yaitu DNA berat N, DNA hibrid N- N, dan DNA ringan N (Gambar 4.12). Kuantitas DNA yang terdapat dalam tabung kemudian ditentukan dengan bantuan teknik autoradiografi. DNA yang ada pada tabung sentrifugasi ditempelkan pada film negatif, memberi kesempatan sinar dari radioisotop untuk membakar film, kemudian kepekatan tanda yang terdapat pada foto digunakan sebagai penduga kuantitas DNA.

  Densitometer dapat mengukur kepekatan DNA yang terdapat pada foto tersebut.

Bab 4 Replikasi Bahan Genetik

  89 Bakteri kontrol ditumbuhkan ₁₄ pada medium ringan N

  Bakteri generasi-0 ditumbuh- ₁₅ kan pada medium berat N Bakteri generasi-1 ditumbuh- ₁₄

  (b) kan pada medium ringan N Bakteri generasi-2 ditumbuh- ₁₄ kan pada medium ringan N

  (a) Pita DNA berat Pita DNA hibrid Pita DNA ringan (15N-15N) (15N-15N) (15N-15N)

Gambar 4.2. (a) Sentrifugasi dengan tabung penyangga berkepekatan

  _{15 15} bertingkat berhasil memisahkan DNA berdasarkan beratnya, N (berat), N- _{14 14} N,(hibrid), dan N.(ringan) , dan kemudian (b) dan menangkap signal dengan film dan memriksa kepekatan dengan densitometer

  Bila pola semikonservatif itu benar maka seharusnya dari generasi-0 akan diperoleh

  15

  semua DNA bakteri mengandung N pada kedua utasannya, dan pada generasi-1 akan

  15

  14

  15

  diperoleh semua DNA dalam bentuk hibrid ( N- N), satu utasan mengandung N dan

  14

  utasan lainnya mengandung N. Pada generasi-2 akan diperoleh dua jenis DNA yaitu

  15

  pertama DNA hibrid N 14N, dan yang kedua DNA dengan kedua utasannya yang mengandung 14N. Kedua jenis DNA ini akan mempunyai nisbah (perbandingan) yang sama. Hal ini terjadi karena dari DNA hibrid 15N - 14N generasi-1 akan menyumbangkan satu utasan 15N dan satu utasan 14N, selanjutnya utasan 15N pada medium isotop 14N akan menghasilkan DNA hibrid 15N - 14N dan utasan 14N akan menghasilkan DNA 14N (kedua utasan mengandung 14N). Pada generasi-3 akan diperoleh kembali dua jenis DNA seperti pada generasi-2, tetapi dengan nisbah yang berbeda. Dari DNA hibrid pada generasi-2 akan dihasilkan DNA hibrid dan DNA 14N, sedangkan dari DNA 14N (generasi-2) dihasilkan seluruhnya DNA 14N. Jadi dilihat dari segi kuantitas akan terjadi peningkatan

  90 Genetika

  Generasi-0 : 100 % DNA berat (15N-15N) Generasi-1 : 100 % DNA hibrid (15N-14N) Generasi-2 : 50 % DNA hibrid (15N-14 N)

  50 % DNA ringan (14N-14N) Generasi-3 : 25 % DNA hibrid (15N-14N)

  75 % DNA ringan (14N-14N)

Gambar 4.3. Hasil percobaan Meselson & Stahl. Pemeriksaan densitometer terhadap

  fotoradiografi DNA, menunjukkan bahwa kuantitas jenis DNA dari beberapa generasi berurutan mendukung pola replikasi semikonservatif.

  DNA 14N dan penurunan DNA hibrid 15N - 14N. Pada generasi-3 ini pada pola semikonservatif akan diperoleh nisbah 3 : 1 antara DNA 14N dengan DNA 15N - 14N.

  Hasil percobaan Meselson dan Stahl telah membuktikan kebenaran semua hipotesis yang telah dijelaskan pada dua alinea sebelumnya. Pada generasi-0 diperoleh DNA yang setara

  15

  15

  14

  dengan DNA N; pada generasi-1 diperoleh seluruhnya DNA hibrid N- N; pada generasi-

  15

  14

  14

  2 terdapat DNA hibrid N- N dan DNA N dengan perbandingan 1:1; dan pada generasi-3

  14

  15

  14

  diperoleh DNA N dan DNA hibrid N- N dengan perbandingan 3:1 (Gambar 4.13). Jadi melalui percobaan Meselson dan Stahl telah terbukti kebenaran pola replikasi semikonservatif.

B. Sintesis dengan Arah Pertumbuhan 5-3

  Dalam keadaan bebas, nukleotida akan berada dalam bentuk nukleotida trifosfat. Dalam proses sintesis DNA, dua nukleotida digabungkan satu dengan yang lain dengan cara menghubungkan karbon gula kelima (C5) yang mengandung fosfat dari satu nukleotida kepada karbon gula ketiga (C3) yang mengandung OH dari nukleotida lain, membentuk ikatan 5--3 fosfodiester (Gambar 4.14). Ada dua cara yang mungkin dilakukan dalam menambahkan satu nukleotida ke dalam rantai polinukleotida yang sudah ada sebelumnya,

Bab 4 Replikasi Bahan Genetik

  91

Gambar 4.4. Pertumbuhan 5-3 pada sintesis polinukleotida. Nukleotida baru akan

  ditambahkan pada ujung 3'OH dari rangkaian nukleotida yang telah ada dan membentuk ikatan 5-3 fosfodiester. yaitu ditambahkan pada ujung 3'OH (pertumbuhan 5--3) atau ditambahkan pada ujung 5'P (pertumbuhan 3--5). dan secara kimia, pertumbuhan 5-3 adalah yang paling efisien.

  Pada situs awal replikasi polimerase DNA akan mengudar pilinan heliks ganda menjadi dua utasan tunggal. Dalam proses pengudaran ini akan terbentuk percabangan replikasi seperti huruf Y, dengan dua cabang utas tunggal dan batang utas ganda. Berdasarkan aturan antiparalel dari utas-utas heliks ganda DNA, maka pada percabangan replikasi akan terdapat dua cabang yang berbeda ujungnya yaitu ujung 3'OH dan ujung 5'P (Gambar 4.15). Akibat dari arah pertumbuhan DNA dari ujung 5'P ke ujung 3'OH; maka dalam percabangan replikasi akan terdapat dua pola sintesis DNA baru, yaitu pada cabang berujung 3'OH sintesis akan berjalan dari bagian ujung ke arah pangkal percabangan, sedangkan pada cabang 5'P sintesis akan dimulai dari pangkal percabangan dan bergerak ke arah ujung (Gambar 4.15). Cabang yang berujung 3'OH disebut cabang "Leading" sedangkan yang berujung 5'P disebut cabang "lagging". Pada utas "leading" karena arah sintesis berjalan dari ujung menuju pangkal percabangan, maka sintesis dapat berjalan seara kontinu sejalan dengan proses pengudaran pilinan heliks ganda. Pada utas "lagging" karena setiap tahap sintesis harus dimulai pada pangkal percabangan, dan bergerak ke arah ujung cabang, maka setiap saat seiring dengan pengudaran heliks ganda akan muncul titik awal baru pada pangkal

  92 Genetika

  percabangan yang diikuti oleh sintesis dengan arah ke bagian luar cabang. Jadi, pada utas lagging, sintesis akan berjalan secara diskontinyu. Oleh karena itu akan ditemukan berbagai fragmen DNA yang disebut fragmen Okazaki sesuai dengan nama penemunya Reiji Okazaki (Okazaki et al, 1969).

  Tahapan Replikasi dan Sistem Enzim

  Dalam replikasi DNA berlangsung tiga tahap atau proses penting, yaitu sebagai berikut: (i) Pengenalan situs awal replikasi; (ii) Pengudaran (Pemisahan) pilinan heliks ganda; dan (iii) Sintesis rantai polinukleotida baru. Kedalam tahapan tersebut dilibatkan sejumlah protein dan enzim (Gambar 4.15).

  A. Pengenalan Situs Awal Replikasi

  Syarat pertama agar suatu molekul DNA dapat bereplikasi ialah bahwa pada molekul tersebut terdapat situs awal replikasi. Hasil pengamatan terhadap kromosom E. coli memperlihatkan bahwa proses replikasi selalu dimulai dari satu titik awal (Cairn, 1963). Sekarang telah diketahui bahwa titik awal tersebut ternyata merupakan satu ruas yang mempunyai runtunan basa tertentu. Situs awal replikasi dikenal juga dengan istilah titik ori (kependekan dari origin of replication); sebagai contoh Ori C pada kromosom E. coli.

  Pengenalan situs awal replikasi E. coli dilakukan oleh satu protein, yaitu protein DnaA. yang dihasilkan oleh gen dnaA. DnaA dapat mengenali titik ori melalui interaksi khusus, yaitu dengan mengenali runtunan basa ruas ori. Perubahan yang terjadi pada runtunan basa ori atau konfigurasi DnaA dapat menyebabkan protein tersebut tidak dapat mengenali titik ori, dan akibatnya DNA tidak mampu bereplikasi. Jadi kecocokan antara situs awal replikasi dengan DnaA akan menentukan kemampuan suatu DNA untuk bereplikasi dalam suatu sel.

  B. Pengudaran (pemisahan) Pilinan Heliks Ganda

  Dalam struktur heliks ganda terlihat bahwa basa-basa berada di bagian dalam pilinan yang terlindung dari kontak dengan luar. Dalam proses replikasi, basa-basa yang terdapat pada rantai polinukleotida akan digandakan sebagai model dalam menyusun utasan nukleotida baru, sehingga pilinan heliks ganda harus dibuka dan dipisahkan utasan-utasannya menjadi utasan tunggal. Terdapat tiga protein dan enzim yang berperan dalam proses ini yaitu Helikase, Girase, dan Protein Pelindung Utas Tunggal (PPUT).

Bab 4 Replikasi Bahan Genetik

  93

  Helikase adalah kelompok protein yang berfungsi mengudar (memisahkan) pilinan heliks ganda dengan cara menghilangkan ikatan hidrogen, dan memisahkan utasan-utasannya menjadi utas tunggal. Sebagai contoh cara kerja helikase, pada E. coli helikase menempel pada wilayah salah satu utasan tunggal DNA dan kemudian bergerak dengan arah dari ujung 3 ke ujung 5, menuju bagian utas ganda dan membebaskan utasan-utasan dari pilinan heliks. Selanjutnya utasan tunggal yang telah terbebaskan akan ditempeli PPUT.

Gambar 4.5. Kegiatan yang berlangsung pada suatu percabangan replikasi; helikase dan girase

  

mengudar pilinan heliks ganda membentuk utas leading dan utas lagging. Protein SSB akan

menutupi utas tunggal yang terbentuk sebelum digunakan sebagai model catakan. Primer RNA

akan disintesisi untuk menolong Polimerase DNA mengaitkan nukleotida DNA dalam rangka

sintesis utasan baru. Sintesis berjalan dengan arah 5-3; pada utas leading berjalan dari ujung ke

pangkal percabangan sedangkan pada utas lagging dari pangkal ke ujung cabang. Sintesis

berjalan secara bertahap membentuk fragmen Okazaki.

  5’P 3’OH 3’OH 5’P

  3’OH 5’P Helikase Polimerase DNA

  RNA primer PPUT RNA primer Utas lagging Utas leading Fragmen

  Okazaki Utas DNA baru Polimerase DNA

  PPUT

  94 Genetika

  Girase adalah enzim yang berfungsi untuk menghilangkan tegangan pada percabangan replikasi. Di atas telah dijelaskan bahwa pilinan heliks ganda akan diuraikan oleh helikase. Penguraian pilinan heliks oleh helikase dapat menyebabkan terjadi ketegangan pada bagian pangkal percabangan replikasi. Akibat ketegangan tersebut akan terbentuk struktur superheliks. Girase akan menghilangkan ketegangan tersebut dengan cara melakukan rotasi pilinan ke arah yang berlawanan.

  Penempelan PPUT pada utas tunggal berfungsi untuk melindungi utas tunggal DNA yang telah diuraikan oleh helikase dari kemungkinan berpasangan kembali dengan utas pasangannya membentuk heliks ganda. Protein ini akan menempel dan berasosiasi dengan DNA utas tunggal begitu helikase selesai mengudar heliks ganda. Penempelan ini juga melindungi utas tunggal dari kemungkinan kerusakan oleh enzim nuklease, dan kemungkinan digunakan oleh transikriptase untuk melakukan transkripsi.

C. Sintesis Rantai DNA

  Dalam proses sintesis fragmen Okazaki tersebut di atas akan digunakan utas DNA lama sebagai model cetakan. Dalam proses sintesis ini akan dilibatkan sejumlah enzim. Sebagai contoh pada E. coli, sintesis DNA dapat dibagi menjadi empat tahap atau langkah dengan bantuan enzim yang berbeda-beda. Keempat langkah tersebut adalah (Gambar 4.16). (1) Inisiasi sintesis fragmen Okazaki oleh Polimerase RNA, (2) Sintesis perpanjangan DNA oleh Polimerase DNA III, (3) Pengisian celah oleh Polimerase DNA I, dan (4) Pematrian fragmen-fragemen Okazaki oleh ligase

  C1. Inisiasi Sintesis Fragmen Okazaki oleh Polimerase RNA

  Dalam proses replikasi, sintesis fragmen Okazaki diawali oleh sintesis rangkaian beberapa basa RNA primer. Hal ini diperlukan karena enzim pengkatalisis sintesis DNA yaitu polimerase DNA tidak mempunyai kemampuan mengawali sintesis, melainkan hanya memperpanjang rantai yang sudah ada. Jadi untuk mengawali sintesis DNA perlu dibentuk RNA primer yang terdiri dari beberapa basa yang akan menjadi tempat polimerase DNA mengkaitkan nukleotida DNA pertama. Polimerase RNA akan meletakkan ribonukleotida pada utas tunggal DNA hasil pengudaran (pemisahan) helikase leading atau lagging, dan mensintesis rangkaian beberapa basa dengan arah 5-3.

  C2: Sintesis Perpanjangan Rantai DNA oleh Polimerase DNA III

  Enzim ini akan bekerja begitu RNA primer selesai dibentuk, dengan cara mengaitkan deoksiribonukleotida pertama kepada ujung 3'OH RNA primer, yang kemudian dilanjutkan

Bab 4 Replikasi Bahan Genetik

  95 Polimerase RNA Polimerase RNA mensintesis RNA primer Polimerase DNA III mensintesis DNA dengan menyambungkan pada RNA primer

  Polimerase DNA I mengganti polimerase DNAIII saat Polimerase DNA I mengisi celah antara dua okazaki dan membuang RNA primer yang ada pada okzaki yang ada di depannya

  Ligase Ligase DNA menyambyngkan dua fragmen okazaki

Gambar 4.6. Langkah sintesis utasan baru DNA melibatkan empat enzim, Polimerase

  RNA mengawali sintesis, Polimerase DNA III memperpanjang rantai nukleotida, Polimerase DNA I membuang RNA primer dan mengisi celah dan Ligase menyambungkan dua fragmen Okazaki .

  dengan perpanjangan rantai DNA dengan pertumbuhan 5-3. Sintesis oleh Polimerase DNA

  III akan berjalan sampai pertumbuhan 5-3 tersebut mencapai RNA primer dari fragmen Okazaki yang terdapat di depannya. Polimerase DNA III akan berhenti melakukan sintesis karena terhalang oleh adanya RNA primer tersebut. Untuk melakukan sintesis lanjutan diperlukan adanya enzim lain yang mampu membuang basa-basa RNA, dan enzim tersebut adalah Polimerase DNA I. Oleh karena itu untuk menjalankan tugas selanjutnya Polimerase DIA III diganti oleh Polimerase DNA I.

  C3: Pembuangan RNA Primer dan Pengisian Celah oleh Polimerase DNA I

  Polimerase DNA I akan bekerja membuang RNA primer yang terdapat pada bagian depan setiap fragmen okazaki, dan mengisi celah antara dua fragmen tersebut dengan nukleotida

  96 Genetika

  DNA. Tugas Polimerase DNA I akan berakhir bila semua nukleotida RNA habis tergantikan oleh nukleotida DNA. Pada saat itu rangkaian basa DNA yang disintesis telah mencapai rangkaian DNA dari fragmen Okazaki yang ada di depannya.

  C4. Penyatuan Fragmen-Fragmen DNA oleh Ligase.

  Ligase adalah enzim yang berfungsi menyambungkan dua fragmen DNA. Dalam replikasi, ligase berperanan menyambungkan dua fragmen Okazaki setelah RNA promer dibuang oleh Polierase DNA I. Dengan disambungkannya berbagai fragmen Okazaki maka diperolehlah satu utasan nukleotida sebagai utasan baru dari heliks ganda.

  Mekanisme Replikasi Berbagai DNA

  A. Replikasi Model θ pada Kromosom Bakteri

  Visualisasi kromosom bakteri serta cara replikasinya pertama kali dilakukan oleh John Cairns (1963), dengan bantuan teknik autoradiografi pada kromosom E. coli. Dari hasil penelitiannya diperoleh pengetahuan pertama tentang bentuk kromosom sirkular, dan yang kedua mekanisme replikasi dari kromosom tersebut. Pada kromosom bakteri, replikasi dimulai pada satu titik awal, yaitu Ori-C, dan kemudian bergerak kedua arah atau dwiarah (Gambar 4.17). Pada foto autoradiografi, utasan DNA utuh akan terlihat sebagai garis, dan titik awal replikasi terlihat sebagai gelembung. Gelembung ini sesuai dengan periode

  Titik Ori Pertumbuhan dwiarah Titik Ori Pertumbuhan uniarah

Gambar 4.7. Perbandingan replikasi model θ dwiarah dan uni arah pada kromosom bakteri. (a)

  replikasi dwiarah, dan (b) replikasi uniarah

Bab 4 Replikasi Bahan Genetik

  97

  pertumbuhan bakteri, akan membesar ke dua arah, dan pada satu saat akan terlihat sebagai huruf Yunani teta ( θ).

  Bentuk gelembung ditafsirkan sebagai akibat terjadinya pengudaran heliks ganda menjadi utas tunggal, dan masing-masing utas tunggal menjadi media untuk sitesis utas DNA baru. Pada kedua ujung gelembung terbentuk percabangan replikasi; proses replikasi akan berlangsung pada kedua ujung tersebut. Oleh karena itu replikasi akan berjalan ke dua arah, atau dwiarah. Hasil akhir dari proses replikasi model

  θ adalah dua molekul DNA sirkular (Gambar 4.17). Selain berlangsung pada kromosom bakteri, replikasi model

  θ juga digunakan dalam replikasi vegetatif plasmid.

B. Replikasi Kromosom Eukariot Berjalan dari Banyak Titik Ori

  Secara garis besar replikasi DNA kromosom eukariot sama dengan yang berlangsung pada kromosom bakteri, tetapi terdapat beberapa perbedaan yang menarik. Enzim yang mengkatalisis polimerisasi DNA eukariot berbeda dari yang digunakan dalam replikasi prokariot. Perbedaan yang kedua ialah bahwa eukariot mempunyai banyak titik Ori (situs awal replikasi). Hal ini diperlukan karena eukariot mempunyai ukuran kromosom yang sangat besar. Adanya banyak titik, ori terlihat pada foto autoradiografi sebagai banyak gelembung.

  DNA kromosom eukariot merupakan molekul linear, pada setiap situs awal yang terdapat sepanjang molekul tersebut akan terjadi pemisahan utas ganda dan terjadi replikasi dwiarah. Dari setiap situs awal akan terbentuk gelembung yang akan membesar, dan berbagai

  Ori Ori Ori Ori Ori Ori

Gambar 4.8. Replikasi

  kromosom eukariot dimulai dari banyak titik Ori. Replikasi berjalan ke dua arah; dari banyak titik awal akan terbentuk gelembung yang membesar, kemudian gelembung-gelembung tersebut menyatu dan akhirnya terbentuk dua kromosom

  98 Genetika

  gelembung akan menyatu membentuk gelembung yang lebih besar, dan akhirnya terbentuk dua molekul DNA linear atau kromosom (Gambar 4.18).

C. Model Replikasi Lingkaran Berputar Cara ini digunakan untuk memperbanyak kromosom virus atau plasmid saat konjugasi.

  Sistem kerja replikasi ini mirip dengan kerja mesin stensil, untuk memperbanyak tulisan dengan cara memutar lembaran model pencetak. Dalam model lingkaran berputar, satu utas DNA dipertahankan dalam bentuk sirkular dan satu dipotong linear. Utas sirkular akan digunakan sebagai model cetakan dan sintesis utas baru akan menghasilkan utas DNA linear sebagai hasil cetakannya.

  Untuk menjelaskan proses ini kita gunakan kromosom virus DNA utas ganda; kita akan mendapatkan padanya utas(+) dan utas(-). Tahap awal dari replikasi ini ialah pemotongan utas(-) tanpa memotong utas(+), (sering disebut dengan istilah nick) (Gambar 4.18). Dari hasil pemotongan ini akan diperoleh ujung 5'P dan ujung 3'OH pada utas(-). Bersamaan dengan perputaran utas(+) sirkular bagian ujung 5'P utas(-) akan terlepas dari pilinan heliks ganda membentuk utas tunggal, sedangkan bagian ujung 3'OH masih tetap menempel sebagai heliks ganda dengan utas(+). Bersamaan dengan gerakan berputar tersebut, Polimerase DNA

  III akan mensintesis runtunan nukleotida baru pada ujung 3'OH

  Ujung 3’

  dengan menggunakan utas(+) sebagai modelnya. Bersamaan

  Ujung 5’

  dengan gerakan tersebut, utas tunggal arah ujung 5'P yang terlepas dari pilinan heliks ganda juga bertambah panjang. Polimerase

  Polimerase DNA melakukan sintesis pada ujung 3’

  DNA III juga mensintesis utas(+) dengan menggunakan utas(-) yang

  Ujung 5’ membentuk utas

tunggal bebas

  terlepas tersebut sebagai modelnya.

  Jadi sejalan dengan perputaran lingkaran utas(+) sirkular itu akan

  Sintesis serempak pada diperoleh heliks ganda linear baru. ujung 3’dan utas bebas

  Satu putaran lengkap dari utas(+) sirkular akan menghasilkan utasan

Gambar 4.9. Model replikasi lingkaran berputar,

  digunakan pada replikasi virus

  heliks ganda baru yang linear

Bab 4 Replikasi Bahan Genetik

  99

  berukuran sama dengan kromosom virus. Perputaran yang berlangsung berulang kali akan menghasilkan satu molekul linear yang panjang, yang di dalamnya terkandung banyak salinan dari kromosom virus. Molekul seperti itu disebut molekul konkatamer, dan pada proses pengemasan atau pembentukan virus konkatamer ini akan dipenggal menjadi kromosom virus tunggal.

D. DNA Mitokondria Memiliki Titik Ori Untuk Masing-Masing Utasan

  Mitokondria adalah organel yang terdapat di dalam sitoplasma eukariot. Organel ini mempunyai fungsi utama sebagai tempat sintesis ATP yang berfungsi dalam respirasi. Untuk mendukung fungsinya DNA dilengkapi dengan bahan genetik sendiri yang bebas dari bahan genetik yang terdapat pada inti.

  Mitokondria mempunyai DNA sirkular berutas ganda. Replikasi DNA mitokondria mempunyai ciri tersendiri yang berbeda dari DNA lain, yaitu terdapat dua titik Ori yang berbeda untuk masing-masing utasan. Posisi titik Ori satu utasan berbeda dari titik Ori utasan lain. Mula-mula replikasi akan berjalan pada satu utasan yang bergerak ke satu arah, sedangkan pada utasan lain tidak terjadi kegiatan sintesis DNA. Setelah proses sintesis pada utasan pertama berjalan dan mencapai posisi Ori utasan kedua, maka pada utasan kedua baru berlangsung sintesis DNA dengan arah yang berlawanan dari arah pada utasan pertama. Kedua proses sintesis tersebut berjalan secara kontinu.

  Ketepatan Replikasi DNA

  DNA sebagai bahan genetik merupakan unsur yang sangat penting bagi organisme sebab molekul itu akan menentukan pola kehidupan organisme tersebut. Karena fungsinya yang sangat menentukan maka kestabilan DNA harus dijaga dengan baik. Kestabilan tersebut meliputi dua hal, yaitu terpelihara dari kerusakan struktur molekul akibat pengaruh luar, dan terpelihara dari kesalahan selama replikasi, yang dapat merubah struktur DNA. Struktur heliks ganda dengan ikatan kovalen gula fosfat yang terletak di bagian luar menjamin kestabilan DNA dari berbagai serangan enzim atau aksi fisik. Model replikasi semikonservatif menjamin kesamaan struktur DNA baru dengan DNA tetuanya. Di samping kedua hal tersebut, sistem kerja enzim Polimerase DNA juga menjamin kestabilan struktur DNA.

  Polimerase DNA mempunyai sistem pemeriksaan ketepatan pemasangan basa saat replikasi. Enzim ini mempunyai aktivitas ganda, yaitu aktivitas sintesis DNA, dan sekaligus

  100 Genetika

  Fragmen Okazaki terdahulu Situs utas DNA cetakan

  Situs eksonuklease 5’-3’ Situs nukleotida trifosfat Ujung 3’OH utas DNA baru Situs eksonuklease 3’-5’

  Utasan DNA yang baru disintesi

Situs utasan DNA baru

Gambar 4.10. Skema polimerase DNA I. Situs eksonuklease 3-5 berfungsi dalam

  pembacaan ulang basa yang menjamin ketepatan replikasi aktivitas kontrol ketepatan sintesis tersebut. Enzim ini mempunyai kemampuan pembacaan ulang terhadap hasil sintesis, berkat adanya situs eksonuklease 3--5. Pada Gambar 4.19 dilukiskan skema polimerase DNA I denan berbagai situs penting yang dikandungnya, yaitu situs utas cetakan, situs utas hasil cetakan, situs nukleosida-trifosfat, situs eksonuklease 3--5, dan situs eksonuklease 5-3. Polimerase DNA III mempunyai semua situs tersebut kecuali situs eksonuklease 5-3, yang dipunyai oleh Polimerase DNA I untuk memotong RNA primer.

  Polimerase DNA akan menempel pada utas tunggal DNA yang sedang bereplikasi, dan menempatkannya pada situs utas cetakan. Mononukleosida-trifosfat bebas, yang akan dirangkaikan menjadi rantai nukleotida akan masuk menempati situsnya pada Polimerase DNA. Kemudian enzim tersebut akan memasangkan basa dari mononukleosida-trifosfat yang terakhir masuk dengan basa pada utas cetakan. Pemeriksaan pertama untuk ketepatan pemasangan basa dilakukan pada situs ini. Kecocokan diperiksa berdasarkan jumlah ikatan hidrogen yang terbentuk, yaitu dua untuk A-T dan tiga untuk C=G. Pasangan basa yang cocok akan dapat membentuk ikatan hidrogen.

Bab 4 Replikasi Bahan Genetik

  101

  Bila basa-basa yang diperiksa ternyata bukan pasangannya, maka mononukleosida trifosfat akan dikeluarkan oleh polimerase DNA, dan selanjutnya akan dipilih nukleosida- trifosfat yang lain. Bila nukleosida-trifosfat ternyata merupakan pasangan yang tepat dari basa nukleotida pada utas cetakan, maka polimerase DNA akan merangkaikan nukleosida tersebut dengan membentuk ikatan fosfodiester kepada nukleotida terakhir dari Polinukleotida baru yang sedang disintesis. Selanjutnya polimerase DNA akan bergerak maju membaca nukloetida berikutnya pada utas cetakan, dan nukleotida terakhir yang baru saja dirangkaikan akan masuk ke dalam situs eksonuklease 3-5, yang berada di belakang situs mononukleotida-trifosfat. Di dalam situs ini dilakukan pemeriksaan kedua terhadap kecocokan pasangan basa antara nukleotida utas cetakan dengan basa yang terakhir dirangkaikan. Seandainya masih terdapat pasangan basa yang tidak tepat dan lolos dari pemeriksaan pertama, maka nukleotida tersebut akan dipotong dari rantai polinukleotida dengan kegiatan eksonuklease 3-5; kemudian Polimerase DNA akan mundur satu langkah dan mengulangi proses sintesis DNA. Adanya pemeriksaan ganda ini menjamin ketepatan yang tinggi dari replikasi DNA dalam menyusun runtunan basa. Telah diketahui bahwa

• 9 -7 frekuensi kesalahan dalam replikasi sangat kecil, yaitu antara 10 , sampai 10 .

  Rangkuman

  Replikasi DNA mengikuti pola semikonservatif dimana sejumlah enzim dan protein dilibatkan di dalamnya. Heliks ganda akan diudar menjadi utas tunggal dengan bantuan helikase, girase, dan protein SSB. Utas tunggal yang terbentuk akan membentuk percabangan replikasi dan akan digunakan sebagai utas model cetakan. Karena pertumbuhan sintesis DNA berjalan dengan arah 5-3, maka pada utas leading (berujung 3'OH) sintesis akan bergerak dari ujung ke arah pangkal percabangan replikasi. Sebaliknya pada utas lagging (berujung 5'P), sintesis berjalan dari pangkal ke ujung percabangan . Sintesis ini berjalan secara bertahap dalam bentuk fragmen Okazaki.

  Polimerase DNA mempunyai tingkat ketepatan yang tinggi karena dilengkapi dengan perangkat baca ulang. Dengan situs eksonuklease 3-5 nukleotida yang salah akan dibuang dan diganti dengan nukleotida yang seharusnya.

  Dalam replikasi kromosomnya, bakteri menggunakan replikasi model q yang dimulai dari satu titik Ori yaitu Ori-C. Replikasi kromosom eukariot dimulai dari banyak titik Ori, dan berjalan dwiarah. Virus menggunakan cara replikasi lingkaran berputar dalam proses replikasinya.

  Soal Latihan

  Pilih jawaban yang benar 1) Pada kromosom E. coli terdapat satu titik Ori (Ori-C), replikasi dari titik Ori ini akan menghasilkan....

  A. dua DNA sirkular

  B. satu DNA sirkular dan satu DNA linear

  102 Genetika

  C. dua DNA linear

  D. satu DNA sirkular 2) Replikasi plasmid F. E. coli yang dimulai dari Ori T plasmid akan menghasilkan....

  A. dua DNA sirkular

  B. satu DNA sirkular dan satu DNA linear

  C. dua DNA linear

  D. semuanya benar 3) Helikase mempunyai fungsi....

  A. mengudar pilinan heliks ganda

  B. menghilangkan tegangan yang muncul pada pangkal percabangan replikasi

  C. mencegah utas tunggal DNA berpasangan kembali membentuk heliks ganda

  D. semuanya benar 4) Girase mempunyai fungsi....

  A. mengudar pilinan heliks ganda

  B. menghilangkan tegangan yang muncul pada pangkal percabangan replikasi

  C. mencegah utas tunggal DNA berpasangan kembali membentuk heliks ganda

  D. semuanya benar 5) Akibat pertumbuhan 5-3 maka pada percabangan replikasi....

  1. pada utas lagging sintesis DNA akan berjalan dari ujung menuju pangkal percabangan 2. pada utas leading proses sintesis akan berjalan secara kontinu 3. pada utas lagging akan terbentuk fragmen-fragmen Okazaki

  A, B, C, D 6) RNA primer dibentuk....

  1. oleh Polimerase RNA 2. di depan semua fragmen Okazaki 3. karena polimerase DNA tidak mampu meletakkan basa pertama atau mengawali sintesis DNA

  A, B, C, D 7) Polimerase DNA III diganti oleh Polimerase DNA I karena....

  1. Polimerase DNA III tidak mampu mengawali proses replikasi 2.

  Polimerase DNA III tidak mampu membuang RNA primer yang ada di depannya 3. Polimerase DNA I mengandung situs eksonuklease 5-3

  A, B, C, D

  Daftar Pustaka

  Adams RLP, Knowler JT, and Leader DP. 1986. The Biochemistry of Nucleic Acids. Tenth Edition. Chapman and Hall. London, New York. Albert B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, and Watson JD. 1994. Molecular Biology of The Cell. Third Edition. Garland Publishing Inc. New York, London. Chargaff E, Visher E, Doninger R, Green C, and Missani F. 1949. The Composition of the

  Deoxyribonucleic Acid of Thymus and Spleen. J. Biol Chem. 177: 405-416 Lehninger, A.L. 1982. Principle of Biochemistry, Worth Publisher, New York

Bab 4 Replikasi Bahan Genetik

  103

  Levine, L. (ed) 1971. Papers of Genetics. A book of readings. Mosby International Edition.

  The C.V. Mosby Cmpany Saint Lovis. Singer M and Berg P. 1991. Genes and Genom. University Science Books, Mill Valley

  California. Blackwell Scientific Publications. Oxford, London, Edinburgh, Melbourne, London, Berlin, Vienna

  Stryer L. 1995. Biochemistry. WH Freeman and Company. New York Watson J.D. and Crick FHC. 1953. The Structure of DNA. Cold Spring Harbour Symposia

  Quant Biol XVIII :123-131

  Watson JD and Crick FHC. 1953. Genetical Implication of The Structure of Deoxyribo- nucleic Acid. Nature 171:738-740 Zubay G and Marmur J. (Eds). 1973. Papers in Biochemical Genetics. Second Edition. Holt,

  Rinehart and Winston, Inc. New York, Chicago, San Francisco, Atlanta, Dallas, Montreal, Toronto, London. Zubay, G. 1987. Genetics. The Benjamin/Cumming Publishing Company Inc. Menlo Park.

  California.