KEKERABATAN FILOGENETIK BUAH MAKASSAR (Brucea javanica) BERDASAR- KAN GEN RIBULOSA-1,5-BIFOSFAT KARBOKSILASEOKSIGENASE Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribu- lose-1,5-biphosphate carboxylaseoxyigenase gene

  

KEKERABATAN FILOGENETIK BUAH MAKASSAR (Brucea javanica) BERDASAR-

KAN GEN RIBULOSA-1,5-BIFOSFAT KARBOKSILASE/OKSIGENASE

Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribu-

lose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene

  

Tri Widayat, Dyah Subositi

  Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional, Badan Litbangkes, Departemen Kesehatan

  Jl. Lawu, Tawangmangu, Karanganyar, Jawa tengah

  

ABSTRAK

Buah makassar (Brucea javanica) adalah salah satu tanaman obat yang dikoleksi Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT), Tawangmangu. Salah satu aspek dari

tanaman obat tersebut yang datanya belum terkoleksi di B2P2TO-OT adalah kekerabatan. Oleh karena itu,

tujuan dari studi kekerabatan B. javanica adalah untuk mengetahui hubungan kekerabatan buah B.javanica

berdasarkan penanda molekuler gen ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/oksigenase (rbcL). Hubungan kekera-

batan tersebut dapat dilihat dari pohon filogeni yang dkonstruksi berdasarkan sequence nukleotida pada rbcL.

  Sequence rbcL diperoleh dari National Center for Biotechnology Information (NCBI) dan aligment sequence un-

tuk konstruksi pohon filogenetik menggunakan program ClustalW yang diakses dari DNA Data Bank of Japan

  

(DDBJ) secara online. Pohon filogenetik menunjukkan bahwa B. javanica berkerabat dengan beberapa spesies

tanaman anggota familia Anacardiaceae.

  Kata kunci: Brucea javanica , filogenetik, rbcL

  

ABSTRACT

Buah makassar (Brucea javanica) is one of medicinal plant collections in Medicinal plant and Traditional Medi-

cine Research Center (B2P2TO-OT) Tawangmangu. Phyllogenetic relationship data of B. javanica is important in-

formation as a database for further research. The objective of this study was to provide phylogenetic relationship

of B. javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene(rbcL). The rbcL

sequence in this research was taken from National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the sequence

was aligned by using ClustalW program to construct phylogenetic tree. The result showed that B. javanica has a

closed relationship with some species of Anacardiaceae.

  Key words: Brucea javanica, phylogenetic relationship, rbcL

  KEKERABATAN FILOGENETIK BUAH MAKASSAR ( BRUCEA JAVANICA) BERDASARKAN GEN RIBULOSA-1,5-BIFOSFAT KARBOKSILASE/OKSIGENASE Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene

  PENDAHULUAN

  Buah Makassar (Brucea javanica) merupakan salah satu jenis tanaman obat yang ditanam di kebun koleksi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT), Tawangmangu. Tanaman yang termasuk dalam familia Simarubaceae tersebut secara empiris digunakan untuk mengobati disentri, malaria, kudis dan penawar racun lipan. Ekstrak biji B. javanica efektif sebagai amubisida. Senyawa bruseantin dan brusein C yang diisolasi dari ekstrak biji diketahui aktif menghambat pertumbuhan

  Entamoeba hystolitica. (Anonim, 2009).

  Kegunaan buah makassar untuk pengobatan menjadikannya salah satu tanaman obat yang menarik untuk diteliti. Salah satu studi yang belum banyak dilakukan terhadap buah makassar adalah dari bidang sistematika. Similaritas buah makassar dengan tanaman lain dapat diketahui melalui studi taksonomi numerik dengan memanfaatkan data fenetik sebagai karakter. Sedangkan kekerabatannya dapat diketahui melalui konstruksi pohon filogenetik dengan memanfaatkan data molekuler.

  Saat ini data molekuler organisme dari semua divisi yang berupa sequence DNA dapat diakses dengan relatif mudah dari bank data yang menyimpannya. Salah satu data molekuler yang dapat digunakan adalah sequence DNA untuk gen ribulosa-1,5-bifosfat karbosilase/ oksigenase (rbc

  L). Gen tersebut dapat dipergunakan sebagai penanda molekuler dalam penyusunan klasifikasi filogenetik karena gen tersebut terdapat pada organisme kemoautotrof, misalnya beberapa jenis bakteri, dan organisme fototrof, misalnya tumbuhan. Ekspresi dari rbcL adalah protein fungsional ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/ oksigenase atau RubisCO yang berfungsi mengkatalisis fiksasi dan reduksi CO ₂ dari udara menjadi karbon organik (Tabita et al., 2008). Dalam klasifikasi filogenetik ini data sequence rbcL pada protoplast tanaman B.

  javaniva yang disimpan di National Center for Biotechnology Information

  (NCBI) akan digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang menggambarkan kekerabatan evolusioner tanaman B. javanica. Pohon filogenetik adalah ilustrasi evolusi yang terjadi pada sekelompok organisme yang berasal dari nenek moyang yang sama, yang disusun berdasarkan kesamaan dalam beberapa hal, misalnya gen, protein dan organ (Ochieng et al., 2007).

  METODE PENELITIAN Bahan

  Sekuens rbcL yang diunduh dari bank data internasional National Center for Biotechnology

  Information (NCBI) melalui situs http//:www.

  ncbi.nlm.niv.gov.

  Cara kerja

  Klasifikasi filogenetik tanaman B. javanica ini dibuat dengan memanfaatkan data sequence DNA yang disimpan di bank data internasional NCBI dan program untuk konstruksi pohon filogenetik secara online yang disediakan oleh DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Data sequence DNA pengkode enzim Rubisco untuk tanaman buah Makassar (Brucea javanica) diunduh dari situs http//:www.ncbi.nlm.niv.gov. Sequence DNA tersebut kemudian disalin ke program Tri Widayat, Dyah Subositi Basic Local Alignment Search Tool

  (BLAST) yang dibuka di http//www.ddbj.ac.jp/l untuk mengukur similiritas antara data sequence yang dimasukkan dengan data yang ditemukan dalam database. Selanjutnya, dilakukan alignment menggunakan program Clustal W versi 1.83 pada situs yang sama. Hasil alignment digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang visualisasinya dilakukan menggunakan program TREEVIEW. Selain itu, data sequence DNA dari NCBI juga digunakan untuk memprediksi struktur tiga dimensi protein yang dikode oleh gen rbcL melalui query yang dikirim ke DDBJ.

• 55.000 Da) dan rantai pendek (
• 13.000 Da) (Yoon et al., 2001). Substrat yang berupa ribulosa-1,5-bifosfat terikat pada sisi pengikatan subunit besar. Keseluruhan enzim ini tersusun atas delapan dimer rantai panjang dan delapan rantai pendek yang membentuk sebuah kompleks yang lebih besar yaitu protein berukuran 54.000 Da (Stryer et al., 2002).

  Data karakter molekular yang diunduh dari NCBI adalah sequence gen lengkap subunit besar ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/ oksigenase yang terdapat di dalam kloroplast tanaman B. javanica

  . Gen tersebut dapat digunakan sebagai penanda universal dalam sistematika molekular khususnya sistematika tumbuhan karena dimiliki oleh semua organisme yang berfotosintesis. Ekspresi dari rbcL adalah enzim ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/ oksigenase (RubisCO) yang berfungsi dalam katalisis fiksasi karbon di dalam siklus Calvin. Selain mengkatalisis pengikatan karbon dioksida pada substrat ribulosa-1,5-bifosfat, RubisCO juga mempercepat oksigenasi substrat tersebut sehingga RubisCO disebut enzim ribulosa-1,5- bifosfat karboksilase/ oksegenase (Tabita et al., 2008).

  Pada data sequence gen RubisCO yang disimpan oleh NCBI terdapat data translasi gen tersebut. Data translasi gen yang merupakan deretan asam amino kemudian dikirimkan DDBJ untuk mengetahui bentuk tiga dimensi protein hasil translasi. Struktur tiga dimensi subunit besar protein fungsional RubisCO yang ditunjukkan oleh DDBJ ditampilkan dalam Gambar 1.

  Enzim RubisCO pada tanaman biasanya terdiri atas dua subunit protein yaitu rantai panjang (

HASIL DAN PEMBAHASAN

  Gambar 1. Subunit besar enzim ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/oksigenase

  Program yang digunakan untuk menentukan similaritas antar sequence yang adalah BLAST dan ClustalW. Di dalam kedua program tersebut terdapat algoritme yang berfungsi mengukur similaritas antar sequence yang diperbandingkan. Perbedaan keduanya adalah bahwa ClustalW mengukur similaritas di antara beberapa input sequence, sedangkan BLAST membandingkan satu input sequence dengan semua sequence yang ditemukan dalam hubungan evolusioner, sedangkan BLAST ditunjukkan oleh Gambar 2. Berdasarkan KEKERABATAN FILOGENETIK BUAH MAKASSAR ( BRUCEA JAVANICA) BERDASARKAN GEN RIBULOSA-1,5-BIFOSFAT KARBOKSILASE/OKSIGENASE Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene

  database. Pengukuran similaritas menggunakan ClustalW dapat digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang menggambarkan hubungan evolusioner, sedangkan BLAST mengukur semua similaritas tanpa memandang asal-usul evolusioner.

  Pohon filogenetik yang dikonstruksi berdasarkan rbcL pada tanaman B. javanica ditunjukkan oleh Gambar 2. Berdasarkan gambar tersebut diketahui bahwa pohon filogeni tersusun dari banyak klaster kecil yang berupa percabangan. Pohon filogenetik selain menunjukkan kekerabatan antar spesies yang diperbandingkan, juga menggambarkan perubahan yang terjadi pada gen penanda untuk masing-masing spesies. Semakin panjang suatu cabang artinya semakin banyak perubahan yang terjadi pada gen penanda selama proses evolusi, akibatnya spesies yang berada pada cabang tersebut dapat dikatakan lebih maju. Menurut Ochieng et al., (2007) pohon filogenetik tersusun atas nodus-nodus dan percabangan. Masing- masing nodus menggambarkan proses spesiasi selama terjadinya evolusi. Nodus-nodus ujung mewakili data yang dibandingkan (operational

  taxonomic units), sedangkan nodus internal

  melambangkan unit nenek moyang (hypothetical

  taxonomic unit). Panjang masing-masing cabang

  mewakili jumlah perubahan yang terjadi pada karakter yang digunakan sebelum terjadinya separasi berikutnya. Oleh karenanya, karakter yang sangat mirip akan berdekatan di dalam percabangan.

  Tri Widayat, Dyah Subositi Gambar 2. Pohon filogenetik yang menggambarkan hubungan kekerabatan B. javanica.

  KEKERABATAN FILOGENETIK BUAH MAKASSAR ( BRUCEA JAVANICA) BERDASARKAN GEN RIBULOSA-1,5-BIFOSFAT KARBOKSILASE/OKSIGENASE Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene

  Salah satu tahap penting dalam mengkonstruksi pohon filogenetik adalah

  alignment, yaitu membandingkan sisi yang

  homolog-homolog dan variable-variabel antar sequence sehingga diperoleh nilai similaritas. Berdasarkan alignment menggunakan program ClustalW yang dilakukan pada sequence rbcL B.

  javanica diketahui bahwa nilai similaritasnya

  terhadap sequence rbcL spesies-spesies yang lain berkisar antara 95-99% (Tabel 1).

  Dari 31 spesies tanaman yang dibandingkan dengan B. javanica dalam konstruksi pohon filogenetik diketahui bahwa terdapat lima familia yaitu Anacardiaceae, Sapindaceae, Burseraceae, Meliaceae dan Simarubaceae, yang posisinya di dalam pohon filogenetik terlokalisir dalam klaster-klaster yang berdekatan untuk setiap anggota familia yang sama. Nama familia untuk masing-masing spesies disajikan dalam Tabel 1.

  Berdasarkan pohon filogenetik diketahui bahwa klaster-klaster kecil di bagian bawah pohon filogenetik ditempati oleh anggota familia Anacardiaceae dengan nilai similaritas sebesar 98-99%. Spesies tanaman anggota Meliaceae mempunyai nilai similaritas sebesar 96% dan berada pada klaster bagian tengah. Klaster di bagian atas ditempati oleh Burseraceae dengan kisaran similaritas 96-97%. Pengelompokan dalam satu klaster untuk tanaman familia yang sama menggambarkan kedekatan kekerabatannya. Semakin banyak sequence DNA yang sama semakin tinggi similaritasnya sehingga posisinya di dalam percabangan pohon filogeni berdekatan.

  Kejanggalan posisi beberapa spesies terdapat pada letaknya yang berjauhan, tidak menjadi satu klaster, meskipun spesies-spesies tersebut menjadi anggota familia yang sama ditunjukkan oleh Blepharocarya depauperata dan

  Buchanania latifolia (Anacardiaceae), Dobinea delavayi dan Diploglottis campbelli (Sapindaceae).

  Spesies-spesies tersebut berada terpisah satau sama lain dan juga terpisah dari klaster besar anggota familianya. Anggota Simarubaceae yang lain, B. tenuifolia, bahkan hanya memiliki nilai similaritas 95% terhadap B. javanica. Posisi dalam klaster yang saling berjauhan untuk keenam spesies tersebut kemungkinan terjadi karena urutan nukleotida pada gen RubisCO yang mereka miliki perbedaannya cukup besar meskipun spesies tersebut adalah anggota familia yang sama. Pengaruh habitat dapat menyebabkan terjadinya variasi dalam RubisCO. Berdasarkan data dari NCBI diketahui bahwa sumber gen untuk B. javanica dengan kode aksesi AY510146 adalah tanaman dari Korea, sedangkan sumber gen B. tenuifolia dengan kode aksesi EU042988 adalah tanaman dari Amerika Serikat. Menurut Kellog dan Juliano (1997) variasi pada RubisCO kemungkinan karena protein protein fungsional ini bersifat adaptif dan keberadaannya merupakan hasil evolusi sebagai respon terhadap kondisi lingkungan. Oleh karena rbcL adalah gen pengkode proten fungsional, maka jumlah sisi variabelnya kecil, kurang dari 1428 bp dan laju perubahan sisi variabel sangat berbeda-beda. Hal itu merupakan kelemahan penggunaan rbcL dalam sistematika. Tri Widayat, Dyah Subositi

Tabel 1. Nilai similaritas spesies dalam pohon filogenetik.

  No Spesies Familia Similaritas (%)

  26 Laurophyllus capensis Anacardiaceae

  97

  19 Tapirira mexicana Anacardiaceae

  97

  20 Cyrtocarpa procera Anacardiaceae

  97

  21 Mangifera indica Anacardiaceae

  97

  22 Anacardium occidentale Anacardiaceae

  96

  23 Heeria argentea Anacardiaceae

  98

  24 Brucea javanica Simarubaceae 100

  25 Brucea javanica Simarubaceae 100

  98

  96

  27 Pistacea vera Anacardiaceae

  98

  28 Cotinus coggygria Anacardiaceae

  99

  29 Schinus molle Anacardiaceae

  98

  30 Amphypterygium adstringens Anacardiaceae

  99

  31 Rhus ambigua Anacardiaceae

  99

  32 Toxicodendron succedaneum Anacardiaceae

  99 KESIMPULAN

  Berdasarkan pohon filogenetik yang dihasilkan dapat disimpulkan sequence rbcL dapat digunakan sebagai karakter molekuler untuk menyusun pohon filogenetik. Penggunaan sequence rbcL untuk kosntruksi pohon filogenetik memperlihatkan bahwa tanaman buah Makassar (B. javanica) berkerabat dekat dengan beberapa tanaman dari familia Anacardiaceae. Pohon filogenetik yang dikonstruksi berdasarkan gen pengkode protein fungsional dimungkinkan dapat digunakan untuk menduga kemiripan kandungan metabolit antar tanaman yang berkerabat dekat. Studi kekerabatan dengan menggunakan metabolit sebagai karakter diperlukan untuk membuktikan dugaan tersebut.

  Anonim. 2009. Kwalot . Diakses dari http// www:iptek.net.id/ind/pd_tanobat/ view. php?mnu=2&id=233 pada tanggal 12

  18 Spondias cytherea Anacardiaceae

  17 Cipadessa baccifera Meliaceae

  1 Blepharocarya depauperata Anacardiaceae

  97

  98

  2 Dobinea delavayi Sapindaceae

  97

  3 Buchanania latifolia Anacardiaceae

  97

  4 Beiselia mexicana Burseraceae

  97

  5 Canarium ovatum Burseraceae

  97

  6 Canarium indicum Burseraceae

  96

  7 Proteum madagascariense Burseraceae

  97

  8 Bursera inaguensis Burseraceae

  9 Commiphora habessinica Burseraceae

  96

  96

  10 Diploglottis campbelli Sapindaceae

  95

  11 Brucea tenuifolia Simarubaceae

  95

  12 Cedrella odorata Meliaceae

  96

  13 Khaya anthotheca Meliaceae

  96

  14 Swietenia macrophylla Meliaceae

  96

  15 Trichilia emetica Meliaceae

  96

  16 Nymania capensis Meliaceae

DAFTAR PUSTAKA

  KEKERABATAN FILOGENETIK BUAH MAKASSAR ( BRUCEA JAVANICA) BERDASARKAN GEN RIBULOSA-1,5-BIFOSFAT KARBOKSILASE/OKSIGENASE Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene Oktober 2009.

  Kellog EA., and Juliano ND. 1997. The structure and function of rubisco and theirimplication for systematic studies. American Journal of Botany 84(3): 413-428. Ochieng JW., Muigai AWT., and Ude GN.

  2007. Review: Phylogenetics in plant biotechnology: principles, obstacles and opportunities for resource poor. African

  Journal of Biotechnology

  , Vol. 6 (6): 639- 649. Stryer L., Berg JM., and Tymoczko JL. 2002.

  Chapter 20: The Calvin Cycle and the Pentose Phosphate Pathway. Biochemistry (5th ed.). WH Freeman, San Francisco. Tabita FR., Hanson TE., Satagopan S., Witte BH., and Kreel NE. 2008. Review: Phylogenetic and evolutionary relationships of RubisCO and the RubisCO-like proteins and the functional lessons provided by diverse molecular forms. Phil. Trans

  . R. Soc. B., 363: 2629-2640. Yoon M., Putterill JJ., Ross GS., and Laing WA. 2001.

  Determination of the relative expression levels of rubisco small subunit genes in Arabidopsis by rapid amplification of cDNA ends. Anal. Biochem., 291(2): 237–44.