EFEK PEMBERIAN EKSTRAK DAN MINYAK BUAH MERAH (Pandanus conoideus Lam) TERHADAP TOKSISITAS SEL LIMFOSIT MANUSIA SECARA IN VITRO Cytotoxic study of Pandanus conoideus Lam extract and oil on human lymphocytes in vitro

  

EFEK PEMBERIAN EKSTRAK DAN MINyAK BUAH MERAH ( Pandanus conoideus

Lam) TERHADAP TOKSISITAS SEL LIMFOSIT MANUSIA SECARA IN VITRO

Cytotoxic study of Pandanus conoideus Lam extract and oil

on human lymphocytes in vitro

• _{** ** *}

  Sukirno , Fransiska Zakaria Rungkat , Nurheni SriPalupi

• Pusat Riset Obat dan Makanan, Badan POM RI Gedung Pusat Riset Jl. Percetakan Negara No.23 - Jakarta 10560
• Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor

  

Jalan Raya Darmaga Bogor Jawa Barat 16003

ABSTRAK

  

Buah merah (Pandanus conoideus Lam) diduga memiliki sejumlah senyawa yang memiliki efek potensial da-

lam meningkatkan respon imun. Buah merah mengandung karotenoid sebesar 55.000 ppm (9.185 β-karoten,

3.685 α-tokoferol, dan 42.009 tokoferol total). Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi efek sitotoksik

buah merah. Uji menggunakan kultur sel limfosit manusia yang diberi perlakuan ekstrak metanol, n-heksan,

air, dan minyak atsiri buah merah dengan konsentrasi 8.3; 33.3; dan 66.7 µg/mL. Inkubasi perlakuan selama

72 jam 37

  C. Sel limfosit dihitung manual dengan triphan blue dan dianalisa dengan metode MTT [3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazolium]. Hasil penelitian menunjukkan bahwa mortalitas sel menurun secara

dramatis dan berkorelasi positif dengan besaran konsentrasi ekstrak dan minyak atsiri buah merah. Kultur sel

_{4 4} menjadi 22x10

dengan perlakuan ekstrak air 8.3 µg/ml menurunkan mortalitas sel dari 134x10 sel/ml, per-

_{4 4 4} menjadi 38x10

lakuan minyak atsiri 33.3 µg/ml dari 100x10 sel/ml, ekstrak metanol 8.3 µg/ml dari 78x10

_{4 4 4}

menjadi 64x10 sel/ml, dan ekstrak n-heksan 8.3 µg/ml dari 92x10 menjadi 66x10 sel/ml. Dapat disimpul-

kan bahwa ekstrak dan minyak atsiri buah merah tidak toksik terhadap sel limfosit manusia. Toksisitas sel ter-

gantung pada polaritas dan dosis ekstrak/minyak atsiri, polaritas dan konsentrasi tertinggi mengindikasikan

toksisitas sel yang paling rendah.

  Kata kunci: buah merah (Pandanus conoideus Lam), sitotoksik sel limfosit, respon imun

ABSTRACT

  

Buah merah (Pandanus conoideus Lam) has been assumed to contain a great number of substances which have

potential effect in increasing immune responses. Buah merah contain carotenoid 55.000 ppm (β-caroten 9.185,

α-tocopherol 3.685 and tocopherol total 42,009 ppm).This research was aimed to evaluate cytotoxic effect of

buah merah. This study was carried out by treating human lymphocyte cell culture with methanol, n-hexana,

water extracts and oil of buah merah with various dosages 8,3; 33,3 and 66,7 µg/ml, then incubated at 37°C,

for 72 hours. The lymphocyte cells were counted manually with triphan blue and analized by MTT method.The

result showed that cell mortality decreased dramatically with the increase of dosage of all extracts and oil of

buah merah. Cells cultured with the addition of 8.3 µg/ml water extracts resulted decreasing of cell mortality

_{4 4 4 4}

from134x10 to 22 x10 sel/ml, with the addition of 33.3 µg/ml oil decreased from 100x10 cell/ mL and

₄ to 38x10 ₄ to 64x10

the addition of 8.3 µg/ml methanol extracts decrease cell mortality from 78x10 cell/ml, and with 8.3

_{4 4}

µg/ml n-hexana extracts decreased from 92x10 to 66x10 cell/ml.It can be concluded that extracts and oil of

  

Pandanus conoideus Lam were not toxic to human lymphocyte cells. The cell toxicity depends on the polarity and

dosage of the extracts/oil, the highest polarity and dose indicate the lowest cell toxicity.

  Key words: buah merah (Pandanus conoideus Lam), cytotoxicity, lymphocyte cell, immune response Volume 2, No. 2, Desember 2009

SECARA IN VITRO

  Volume 2, No. 2, Desember 2009 EFEK PEMBERIAN EKSTRAK DAN MINYAK BUAH MERAH ( Pandanus conoideus Lam) TERHADAP TOKSISITAS SEL LIMFOSIT MANUSIA

  Cytotoxic study of Pandanus conoideus Lam extract and oil on human lymphocytes in vitro PENDAHULUAN

  Indonesia merupakan salah satu negara yang kaya akan keanekaragaman hayati terutama tumbuh-tumbuhan. Ada lebih dari 30.000 jenis tumbuhan yang terdapat di Indonesia, dan lebih dari 1.000 jenis telah diketahui dapat dimanfaatkan untuk pengobatan. Obat bahan alam yang telah terdaftar di Badan POM hingga saat ini berjumlah 11.776 produk, sedangkan jumlah industri obat bahan alam Indonesia pada saat ini berjumlah 1046 industri (Sampurno, 2004). Hal ini mendorong bekembangnya penelitian pengembangan bahan alam sebagai obat, makanan dan kosmetika. Penelitian khasiatdan keamanan dapat dilakukan secara praklinik maupun klinik. Uji praklinik dapat dilakukan secara invivo maupun invitro (World

  Heath Organization, 1993).

  Salah satu bahan alam yang popular dimanfaatkan sebagai obat bahan alam adalah buah merah. Buah merah diklaim dapat menanggulangi beberapa penyakit, walaupun belum didukung oleh hasil penelitian ilmiah, seperti HIV/AIDS, stroke, kanker payudara, kanker rahim, thalasemia, asam urat, tekanan darah tinggi, tumor, kista, diabetes, gangguan prostat, dan gangguan imunitas serta sebagai hepatoprotektor.

  Buah merah dapat berfungsi sebagai pereda batuk, penghalus kulit, pengering luka, penyubur rambut, dan obat cacing. Di samping efek yang menguntungkan ada pula dampak negatip yang dilaporkan akibat konsumsi buah merah, antara lain diarhe, warna faeces dan urine membiru, dan penurunan hemoglobin (Redaksi Agro Media, 2005).

  Dengan adanya klaim khasiat dan efek samping tersebut, maka perlu dilakukan penelitian tentang khasiat dan toksisitas. Penelitian ini bertujuan mengamati toksisitas khususnya sifat toksik terhadap sel-sel limfosit manusia dari pengaruh pemberian ekstrak dan minyak buah merah. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai sifat toksik buah merah yang dapat digunakan sebagai salah satu dasar pengambilan kebijakan dan keputusan oleh Badan POM terhadap konsumsi buah merah sehingga masyarakat dapat terlindungi. Selain itu dapat merupakan dasar untuk penelitian dan pengembangan buah merah lebih lanjut.

  METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian

  Penelitian dilakukan di Laboratorium Pusat Riset Obat dan Makanan Badan POM dan di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Kedokteran Hewan IPB, bulan Februari-Maret 2006.

  Bahan

  Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah buah merah segar yang diperoleh dari Papua. Sedangkan bahan kimia yang diperlukan untuk mengisolasi dan uji invitro limfosit adalah darah segar dari donatur yang sehat, ficoll/ Histopaque-1077, RPMI-1640 (Gibco BRL), NaHCO _3, aquabidest, Phospat Buffer Saline

  (PBS) pH 7.4, Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma Chemical,

  USA), antibiotik penisilin-streptomisin, MTT(3- [4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-difenil-tetrazolium), larutan biru tripan, larutan HCl-isopropanol 0,04N, Na ₂ HPO _{4 /Na 2} HPO ₄ .2H _{2 O, alkohol 70%.}

  Cara Kerja Volume 2, No. 2, Desember 2009 Sukirno*, Fransiska Zakaria Rungkat**, Nurheni SriPalupi** Identifikasi Buah Merah

  Identifikasi sistematika/taksonomi buah merah dilakukan di Herbarium Bogoriense Pusat Penelitian Biologi, LIPI di Bogor, dengan metode analisa DNA secara molekular (Keim, 2005).

  Pembuatan ekstrak dan minyak buah merah

  Pembuatan minyak Buah merah segar yang disimpan dalam

  deep freezer, dikeluarkan, dilakukan thawing pada

  suhu kamar lalu buah merah ditimbang sebanyak 700 gram dan dikukus. Kemudian kukusan buah merah tersebut dimaserasi hingga keluar cairan, setelah disaring cairan tersebut direbus pada temperatur ± 45°C selama 72 jam hingga keluar minyaknya. Kemudian minyak ditimbang untuk menentukan rendemen. Pembuatan ekstraksi metanol

  Buah merah ditimbang sebanyak 100,9 gram, dimaserasi dengan metanol 500 ml, kemudian dimaserasi lagi dengan metanol 350 ml. Selanjutnya dimaserasi kembali dengan metanol sisa pelarut rotavapor, disaring didapat maserat ketiga lalu dilakukan evaporasi. Ekstrak ditimbang untuk menentukan rendemen. Pembuatan ekstraksi heksana

  Buah merah ditimbang sebanyak 100,5 gram, dimaserasi dengan 500 mL n–heksana. Setelah 3 hari dimaserasi kembali dengan 350 mL n-heksana. Setelah 24 jam dimaserasi kembali dengan n-heksana sisa pelarut dari rotavapor, lalu setelah 24 jam disaring, untuk mendapatkan maserat ketiga. Setelah pelarut diuapkan ekstrak ditimbang untuk menentukan rendemen. Pembuatan ekstrak air

  Buah merah ditimbang sebanyak 100,9 gram, dimaserasi dengan 500 mL air, kemudian dimaserasi lagi dengan350 mL air, selanjutnya dimaserasi kembali dengan 250 mL air sisa pelarut dari rotavapor, lalu setelah 24 jam disaring, untuk mendapatkan maserat ketiga.

  Setelah pelarut diuapkan ekstrak diitimbang untuk menentukan rendemen.

  Kultur Sel Limfosit

  Persiapan Kultur limfosit disiapkan dengan metode pemisahan sel darah menggunakan Ficoll,

  (nama dagang histopaque). Ficoll merupakan larutan campuran ficoll-paque yang cocok untuk pemisahan sel mononuklear manusia (Jeffrey W Pollar and John M. Walker, 1997). Sel memerlukan media pertumbuhan agar sel tersebut dapat bertahan hidup, berkembang dan berdiferensiasi. Media biasanya ditambah dengan serum berkisar antara 5%-20% yang terbukti dapat menunjang pertumbuhan sel diluar tubuh (Malole,1990). Isolasi limfosit

  Limfosit diisolasi dari darah perifer mahasiswa dewasa sehat, laki-laki dan telah menyetujui pengambilan darah tersebut. Pengambilan darah dilakukan oleh seorang perawat, dengan cara darah (50 mL) diambil lewat vena menggunakan tabung vacutaener steril yang berisi EDTA 5%, kemudian di goyang pelan-pelan. Di dalam laminar air flow, vacutaener yang berisi darah tersebut dihilangkan udaranya dengan cara membuka tutupnya dekat api, kemudian tutup tabung dikencangkan lagi. Tabung disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 1.500 rpm, sehingga terbentuk 3 lapisan, lapisan paling atas yang berwarna kuning dibuang menggunakan mikropipet. Lapisan tengah setinggi 1 cm diambil menggunakan mikropipet dimasukkan

SECARA IN VITRO

  Dosis pemberian Dosis dari ekstrak air, ekstrak metanol, ekstrak heksana dan minyak dari buah merah masing-masing adalah : 8,33. 10 ^-3

  Rendemen yang diperoleh dari minyak, ekstrak metanol, ekstrak heksana, ekstrak air, berturut-turut adalah 1,72; 17,58; 5,83; 1,72%. Rendemen ekstrak yang diperoleh, digunakan sebagai dasar untuk penentuan dosis uji. Rendemen tertinggi adalah ekstrak metanol yang menunjukkan bahwa sebagian besar senyawa dari buah merah bersifat sedikit polar.Sel limfosit yang mati karena perlakuan ekstrak dan minyak

  HASIL DAN PEMBAHASAN

  AE : Rata-rata absorban ekstrak AK : Rata-rata absorban kontrol (-)

  AE-AK X 100 AK

  Penetapan pertumbuhan sel Penghitungan sel limfosit dilakukan dengan dua cara yaitu dengan cara manual menggunakan pewarnaan biru tripan dan MTT. Setelah dilakukan inkubasi selama 72 jam, ke dalam semua sumur ditambahkan MTT sebanyak 10 µl, diaduk dan dimasukkan lagi di dalam inkubator CO2 selama 4 jam. Setelah itu ditambahkan larutan isopropanol sebanyak 100 µl, kemudian ditentukan absorbansinya dengan spektrofotometer microplate reader, pada panjang gelombang 570 nm. Hasil absobansi digunakan untuk menghitung persentase pertumbuhan sel limfosit dengan rumus:

  ; 33,3. 10 ^-3 dan 66,7. 10 ^-3 µg/ml.

  Volume 2, No. 2, Desember 2009 EFEK PEMBERIAN EKSTRAK DAN MINYAK BUAH MERAH ( Pandanus conoideus Lam) TERHADAP TOKSISITAS SEL LIMFOSIT MANUSIA

  Cytotoxic study of Pandanus conoideus Lam extract and oil on human lymphocytes in vitro

  N = A x FP x 10 ⁴ sel/ml

  Reaksi Suspensi limfosit masing-masing sejumlah 80 µl dimasukkan ke dalam sumur, kemudian pada setiap sumur diisi dengan ekstrak sesuai dosis sebanyak 20 µl. Kelompok kontrol (+) menggunakan 50 µg/mL lipopolisakarida dan convanalin A sedangkan kelompok kontrol (-) menggunakan kultur sel limfosit tanpa penambahan ekstrak. Setelah itu, dilakukan

  Keterangan : N = Jumlah sel limfosit A = Jumlah sel hidup rata-rata per bidang pandang FP = Faktor pengenceran

  dengan rumus :

  hematositometer. Jumlah limfosit dihitung

  kedalam tabung valkon steril berisi larutan ficoll 3 mL dengan cara dialirkan lewat dinding tabung pelan-pelan, kemudian disentrifus lagi dengan kecepatan 2.500 rpm selama 30 menit. Tabung dikeluarkan dan akan terlihat cincin ditengah, bagian atas cincin dibuang, dan diambil cincin ½ cm bersama cairan dibawahnya ½ cm, lalu ditambahkan media RPMI hingga volumenya 9 mL. Tabung disentrifus dengan kecepatan 1.500 rpm selama 5 menit hingga terjadi endapan berwarna putih, RPMI diganti dengan RPMI yang baru sebanyak 5 ml, disentrifus 1.500 rpm selama 5 menit, hingga terjadi endapan. Setelah ditambahkan RPMI sebanyak 5 mL, sel limfosit dihitung dengan hematositometer. Gelas hematositometer dibersihkan dengan alkohol, di masukkan ke dalam inkubator, diambil 20 µl kultur limfosit, setelah sebelumnya ditambahkan biru tripan sebanyak 20 µl dan dianalisis dengan

  inkubasi di dalam inkubator CO ₂ pada suhu 37°C selama 72 jam. Sukirno*, Fransiska Zakaria Rungkat**, Nurheni SriPalupi** dan tergantung pada besarnya dosis uji.

  buah merah dapat dilihat pada Gambar 1 berikut ini.

  Polaritas ekstrak yang semakin tinggi dapat menyebabkan kematian sel limfosit yang semakin rendah. Semakin besar dosis uji akan menyebabkan kematian sel limfosit yang semakin rendah.

DAFTAR PUSTAKA

  Jeffrey, W Pollar and John M. Walker. 1997. Basic

  Cell Culture Protocols, Methods in Molecular Biology Volume 75. Humana Press Inc.

  Gambar 1. Tingkat kematian sel limfosit

  Totowa, NJ Keim, A.P 2005.“Pandan Buah Merah” Klasifikasi

  Pada Gambar 1 terlihat bahwa ekstrak dan Permasalahan Yang Terkait Dengannya. air yang mempunyai tingkat polaritas tertinggi

  Bagian Botani (Herbarium Bogoriense) menyebabkan tingkat kematian sel terendah. Pusat Penelitian Biologi LIPI. Demikian juga pada dosis 66,7 µg/mL tingkat

  Malole, M.B.M. 1990. Kultur sel dan Jaringan kematian sel lebih rendah dari pada dosis 8,3

  Hewan. Pusat Antar Universitas. Institut

  dan dosis 33,3 µg/mL. Pada minyak terjadi Pertanian Bogor. penurunan kematian sel mulai dosis 33.3 µg/mL

  Redaksi Agro Media. 2005 . Pro & Kontra Buah dan terendah pada dosis 66,7 µg/mL, sedangkan

  Merah Pendapat Pakar dan Praktisi.

  pada ekstrak metanol dan ekstrak heksana Penerbit PT Agro Media Pustaka Cetakan juga terjadi penurunan, tetapi tidak sebesar ke 1. Jakarta. ekstrak air dan minyak. Jumlah sel yang mati

  Sampurno.2004. Monografi Ekstrak Tumbuhan mempunyai kecenderungan menurun sesuai

  Obat Indonesia

  , volume 1. Badan Pengawas dengan peningkatan dosis uji dan peningkatan Obat dan Makanan Republik Indonesia. polaritas ekstrak.

  World Health Organization (WHO).1993. Research

  guidelines for evaluating the safety and KESIMPULAN efficacy of herbal medicines.WHO Regional

  Dari hasil penelitian dan pembahasan tersebut office for the western Pacific. dapat disimpulkan bahwa:

  1. Semua ekstrak dan minyak dari buah merah tidak menyebabkan toksisitas terhadap sel limfosit manusia.

  2. Penurunan kematian sel limfosit tersebut sesuai dengan sifat polaritas dari ekstrak

  Volume 2, No. 2, Desember 2009