Efek Minyak Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.) terhadap Ekspresi Gen Siklooksigenase-2 (Cox-2) pada Mencit Model Kolitis Ulserativa.

ABSTRACT

THE EFFECT OF RED FRUIT OIL (Pandanus conoideus Lam.) TOWARDS CYCLOOXYGENASE-2 (COX-2) GENE EXPRESSION IN ULCERATIVE

COLITIS MICE MODEL Yohan Hapdijaya, 2015. 1st Supervisor : Sijani Prahastuti, dr., M.Kes.

2nd Supervisor : Dr. Teresa Liliana Wargasetia, S.Si., M.Kes., PA(K).

Background Ulcerative colitis (UC) is a subtype of Inflammatory Bowel Disease (IBD) which is mediated by the dysregulation of immune system that can be chronic, progressive and develop into colorectal cancer (CRC). Previous experiment showed that antioxidants in red fruit (Pandanus conoideus Lam.) could decrease expression of COX-2 in colorectal mice model, however there is no study in ulcerative colitis mice model has been done yet.

Aim To examine the effect of the red fruit oil to the COX-2 expression in ulcerative colitis mice model.

Methods The BALB/c male mice were divided into 4 groups, each consists of 6 mice. KN group (negative control group) and KBM group (red fruit oil control group) were not induced by DSS, whereas DSS group (DSS) was ulcerative colitis induced by DSS, first on day 8 until day 14. DSS+BM (Red fruit group treatment) was given treatment with red fruit oil 0.1mL/day for 14 days started from day one, and ulcerative colitis induced by DSS for 7 days from day 8. Data of COX-2 and HPRT colons were analyzed using RT-PCR method followed by electrophoresis. All observed data were analyzed using One-Way ANOVA continued with Tukey HSD test (α_=0.05).

Result COX-2 expression of red fruit treated group (DSS+BM) significantly decreased compared to the positive control group (DSS).

Conclusion Red fruit oil could decrease COX-2 expression in ulcerative colitis mice model.

ABSTRAK

EFEK MINYAK BUAH MERAH (Pandanus conoideus Lam.) TERHADAP EKSPRESI GEN SIKLOOKSIGENASE-2 (COX-2) PADA MENCIT

MODEL KOLITIS ULSERATIVA Yohan Hapdijaya, 2015. Pembimbing 1 : Sijani Prahastuti, dr., M.Kes.

Pembimbing 2 : Dr. Teresa Liliana Wargasetia, S.Si., M.Kes., PA(K).

Latar Belakang Kolitis ulserativa (KU) merupakan salah satu bentuk penyakit Inflammatory Bowel Disease (IBD) yang disebabkan oleh disregulasi sistem imun yang bersifat kronis dan progresif sehingga dapat menimbulkan komplikasi kanker kolorektal. Penelitian terdahulu menunjukkan bahwa kandungan antioksidan yang terdapat pada buah merah (Pandanus conoideus Lam.) dapat menurunkan ekspresi COX-2 pada mencit model kanker kolorektal, akan tetapi penelitian pada mencit model kolitis belum dilakukan.

Tujuan Mengetahui peranan minyak buah merah terhadap ekpresi gen COX-2 pada mencit model kolitis ulserativa.

Metode Subjek penelitian menggunakan mencit jantan galur BALB/c yang dibagi dalam 4 kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri dari 6 mencit. Kelompok kontrol negatif (KN) dan kontrol buah merah (KBM) merupakan kelompok yang tidak diinduksi kolitis ulserativa, sedangkan kelompok kontrol positif (DSS) diinduksi kolitis ulserativa pada hari ke-8 dan kelompok perlakuan buah merah (DSS+BM) diberi minyak buah merah 0,1 mL/hari melalui sonde lambung selama 14 hari kemudian diinduksi kolitis ulserativa dengan DSS yang dimulai pada hari ke-8. Data ekspresi COX-2 dan HPRT kolon dinilai dengan RT-PCR dilanjutkan dengan elektroforesis. Uji statistik dengan Analisis Varian (ANAVA) satu arah dilanjutkan dengan uji Tukey HSD (α_=0,05).

Hasil Rerata ekspresi COX-2 pada kelompok perlakuan (DSS+BM) lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol positif (DSS) yang secara statistik berbeda sangat bermakna.

Simpulan Minyak buah merah dapat menurunkan ekspresi gen COX-2 pada mencit model kolitis ulserativa.

DAFTAR ISI

JUDUL i

LEMBAR PERSETUJUAN ii SURAT PERNYATAAN iii ABSTRAK iv ABSTRACT v KATA PENGANTAR vi DAFTAR ISI viii DAFTAR TABEL xi DAFTAR GAMBAR xii DAFTAR LAMPIRAN xiii BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang 1

1.2 Identifikasi Masalah 3

1.3 Maksud dan Tujuan Penelitian 3

1.4 Manfaat Penelitian 3

1.5 Kerangka Pemikiran dan Hipotesis 3

1.5.1 Kerangka Pemikiran 3

1.5.2 Hipotesis Penelitian 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Anatomi Intestinum Crassum _{(Usus Besar) 6}

2.2 Kolitis Ulserativa 11

2.3 Kolitis Ulserativadan Siklooksigenase-2 (COX-2) 12

2.4 Model Hewan Kolitis Ulserativa 14

2.5 Buah Merah ₁₅

2.5.1 Deskripsi Tanaman Buah Merah 16

2.5.2 Kandungan Kimia Buah Merah dan Manfaatnya 18

BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.1 Alat, Bahan, dan Subjek Penelitian 22

3.1.1 Alat dan Bahan 22

3.1.2 Subjek Penelitian 24

3.1.3 Lokasi dan Waktu Penelitian ₂₄

3.2 Metode Penelitian 24

3.2.1 Desain Penelitian 24

3.2.2 Variabel Penelitian 24

3.2.2.1 Definisi Konsepsional Variabel 24

3.2.2.2 Definisi Operasional Variabel 25

3.2.3 Perhitungan Besar Sampel 26

3.2.4 Prosedur Kerja 26

3.2.4.1 Pengumpulan Bahan 26

3.2.4.2 Persiapan Bahan Uji 27

3.2.4.3 Persiapan Hewan Coba 27

3.2.4.4 Sterilisasi Alat 28

3.2.3.5 Pelaksanaan Penelitian 28

3.2.5 Cara Pemeriksaan 29

3.2.5.1 Isolasi RNA 29

3.2.5.2 Pembuatan cDNA 30

3.2.6 Metode Analisis 32

3.2.6.1 Hipotesis Statistik 32

3.2.6.2 Kriteria Uji 32

3.2.7 Aspek Etik 33

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Penelitian 34

4.1.1 Ekspresi COX-2 Kolon Mencit 34

4.1.2 Analisis Statistik 36

4.2 Pembahasan 38

BAB V SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan 42

5.2 Saran 42

DAFTAR PUSTAKA 43

LAMPIRAN 52

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Taksonomi Pandanus conoideus _Lam. ₁₆ Tabel 2.2 Kandungan Senyawa dalam Minyak Buah Merah 18 Tabel 2.3 Kandungan Senyawa Fenol Total dalam Buah Merah 19 Tabel 2.4 Kandungan Senyawa Flavonoid Total dalam Buah Merah 19 Tabel 4.1 Persentase Ekspresi COX-2 Kolon antar Kelompok Perlakuan 34 Tabel 4.2 Hasil Uji ANAVA 36 Tabel 4.3 Hasil Uji Beda Rerata Tukey HSD 37

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.1 Skema Kerangka Pemikiran Penelitian 5 Gambar 2.1 Anatomi Intestinum crassum ₉ Gambar 2.2 Pandanus conoideus _{Lam. 15} Gambar 4.1 Gambar Hasil Elektroforesis COX-2 dan HPRT 35 Gambar 4.2. Grafik Rerata Ekspresi COX-2 38

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Perhitungan Dosis Bahan Uji dan Pembanding 52

Lampiran 2 Dokumentasi 53

Lampiran 3 Surat Keputusan Komisi Etik Penelitian 54

BAB I

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Inflammatory Bowel Disease (IBD) merupakan penyakit yang ditandai dengan inflamasi kronik akibat beberapa faktor, yaitu predisposisi genetik, kegagalan regulasi sistem imun, dan ketidakseimbangan mikrobiota pada saluran cerna. IBD meliputi dua kelainan, yaitu kolitis ulserativa (KU) dan Crohn’s disease (CD) (Danese & Fiocchi, 2011; Turner, 2015).

Insidensi IBD bervariasi di berbagai negara sesuai dengan geografis dan ras. Insidensi tertinggi terjadi di negara belahan bumi utara seperti, Amerika Serikat, Norwegia, Inggris, dan Swedia. Di Amerika Serikat, insidensi kolitis ulserativa sebanyak 35 sampai 100 per 100.000 populasi dengan perbandingan antara laki-laki dan perempuan adalah 1:1. IBD dapat meningkatkan risiko timbulnya kanker kolorektal yang berkorelasi dengan luas dan durasi penyakit ini. Berdasarkan penelitian Dharmika tahun 2000, data dari unit endoskopi pada beberapa Rumah Sakit di Jakarta (RS Cipto Mangunkusumo, RS Tebet, RS Siloam Gleaneagles, RS Jakarta) didapatkan data bahwa kasus IBD 5,5% pada 378 total kasus diare kronik, berdarah, dan nyeri perut (Podolsky, 2002; Djojoningrat, 2006; Lakatos, 2006; Gommeaux et al., 2007; Popivanova et al., 2008; Rutgeertet al., 2009).

KU merupakan bentuk penyakit yang tersering dari IBD yang ditandai dengan reaksi inflamasi kronis dengan kerusakan mukosa dan ulserasi yang mengenai rectum, menyebar secara proksimal, dan terbatas pada colon. KU yang tidak diobati atau KU yang mengenai seluruh colon selama lebih dari 10 tahun merupakan predisposisi terjadinya colorectal cancer (Popivanova et al., 2008; Danese & Fiocchi, 2011). Etiologi dan patogenesis KU masih belum diketahui secara lengkap, berbagai teori menduga terkait faktor genetik dan lingkungan seperti musin, flora normal maupun patogen. Kelainan genetik pada KU tidak hanya terkait satu gen melainkan beberapa gen dan gen reseptor yang terlibat

dalam respons imun (Podolsky, 2002; Sartor, 2006; Xavier & Podolsky, 2007; Sollid & Johansen, 2008).

Pada KU terjadi respons imun yang berlebihan sehingga menghasilkan

reactive oxygen spesies (ROS), sitokin, maupun berbagai mediator inflamasi yang akan mengaktifkan nuclear factor-kappa B (NF-κB). Inflamasi pada KU menghasilkan radikal bebas yang melepaskan reactive oxygen species (ROS) dan reactive nitrogen species (RNS) sehingga akan menyebabkan terjadinya kerusakan DNA. Kerusakan DNA yang luas mengakibatkan terjadinya hiperplasia usus. Dengan demikian, stres oksidatif dan kerusakan selular oksidatif yang merupakan hallmark IBD dan berperan penting pada IBD dan IBD-carcinogenesis (Gommeaux et al., 2007; Meira et al., 2008).

Senyawa antioksidan merupakan penangkal radikal bebas yang ada dalam tubuh. Tubuh dapat menghasilkan antioksidan endogen secara alamiah dalam upaya menghadapi senyawa radikal bebas, akan tetapi jumlahnya terbatas. Bila radikal bebas dalam tubuh berlebihan maka dibutuhkan senyawa antioksidan eksogen. Salah satu sumber senyawa antioksidan eksogen yaitu buah merah yang berasal dari papua sudah dipakai turun temurun sebagai tanaman obat (Budi, 2005; Ratnawati et al., 2008; Khiong et al., 2009).

Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa pemberian sari buah merah 0,1 mL setiap hari selama 3 minggu pada mencit model kolitis yang diinduksi DSS dapat menurunkan derajat keparahan penyakit yang ditandai dengan menurunnya nilai clinical score, perbaikan gambaran histopatologis (Ratnawati et al., 2008). Pemberian buah merah 0,1 mL pada mencit model kolitis yang diinduksi Listeria monocytogenes, meningkatkan proliferasi limfosit, dan menurunkan kadar IFN-_ﻻ (Khiong et al., 2009). Pemberian minyak buah merah 0,1 mL pada mencit model kanker kolorektal yang diinduksi DSS dapat memperbaiki clinical score dan menurunkan ekspresi COX-2 (Khiong & Andhika, 2012).

Berdasarkan hal-hal di atas perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui peranan buah merah terhadap ekspresi COX-2 pada mencit model kolitis ulserativa.

1.2Identifikasi Masalah

Apakah minyak buah merah memiliki efek preventif pada mencit model kolitis ulserativa dengan cara menurunkan ekspresi COX-2.

1.3 Maksud dan Tujuan

Maksud penelitian adalah untuk mengetahui efek buah merah sebagai tanaman obat yang dapat menghambat kolitis ulserativa.

Tujuan penelitian adalah untuk mengukur atau menilai peranan buah merah dalam menurunkan ekspresi COX-2 pada mencit yang diinduksi kolitis ulserativa.

1.4Manfaat Penelitian

Manfaat akademis adalah memperluas wawasan pembaca mengenai tanaman obat asli Indonesia, khususnya buah merah dalam menghambat kolitis ulserativa pada mencit model kolitis ulserativa.

Manfaat praktis adalah mengeksplorasi potensi buah merah dalam menurunkan ekspresi COX-2 pada mencit kolitis ulserativa.

1.5 Kerangka Pemikiran dan Hipotesis

1.5.1 Kerangka Pemikiran

Kolitis ulserativa (KU) adalah salah satu jenis penyakit IBD etiologi dan patogenesisnya belum diketahui secara tepat, berbagai teori menghubungkan berbagai kombinasi faktor berupa perubahan mikrobiota saluran cerna, disfungsi epitel saluran cerna, respons imun saluran cerna (Danese & Fiocchi, 2011; Turner, 2015). Proses Inflamasi juga mengakibatkan teraktivasinya enzim COX-2 dan 5-lipoxygenase yang menghasilkan PGE2 dan leukotriene, pelepasan berbagai sitokin dan mediator inflamasi lainnya, dan produksi radikal bebas yang jika

produksi melebihi kapasitas tubuh untuk menetralisir maka timbul keadaan stres oksidatif. Bila stres oksidatif berlangsung terus menerus akan terjadi perubahan struktur DNA dan berakhir menjadi kanker (Xavier & Podolsky, 2007; Novo & Parola, 2008).

Penelitian menunjukkan bahwa OAINS terbukti dapat menghambat aktivitas COX-1 dan COX-2 pada mencit yang induksi kolitis ulserativa dengan pemberian DSS akan mengaktivasi nuclear factor-kappa B (NF-κB) pada sel epitel kolon yang selanjutnya menyebabkan peningkatan ekspresi COX-2 dan sitokin proinflamasi lain (Burstein & Fearon, 2008; Meira et al., 2008; Greenhough et al., 2009; Loukanov et al., 2009).

Buah merah mengandung antioksidan, yaitu karoten 12.000 ppm, tokoferol 11.000 ppm, dan β-karoten 7.000 ppm. Antioksidan yang terkandung dalam 100 gram minyak buah merah adalah α-karoten 130 µg, β-karoten 1,98 µg, β-kriptosantin 1,46 µg, dan α-tokoferol atau vitamin E 21,2 mg. Selain itu ternyata buah merah juga mengandung senyawa phenolic dan flavonoid (Budi, 2005; Rohman et al., 2010).

Penelitian menunjukkan bahwa β-karoten dapat memperbanyak sel imun, seperti limfosit T, dan sel natural killer (NK) (Watson et al., 1991; Kazi et al., 1997), serta penurunan mediator inflamasi antara lain PGE2, TNF- α, IL-1β, COX-2, penekanan aktivasi NF-κB (Bai et al., 2007). Menurut Wahyuniari dkk, menunjukkan bahwa α-tokoferol dapat menghambat faktor transkripsi NF-κB dan AP-1 (Wahyuniari et al., 2009). Penelitian yang dilakukan oleh Yan dkk, menunjukkan bahwa senyawa antioksidan dapat meningkatkan kadar antibodi, jumlah splenosit, dan massa limpa serta timus (Yan et al., 2007).

Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa pemberian minyak buah merah sebanyak 0,1 mL/hari dapat menurunkan ekspresi COX-2 pada mencit model kanker kolorektal (Khiong & Andhika, 2012). Berdasarkan hal-hal di atas maka penelitian ini dilakukan untuk memberikan gambaran mengenai efek buah merah dalam menghambat produksi COX-2 pada mencit yang diinduksi kolitis dengan DSS. Skema kerangka pemikiran dapat dilihat pada gambar 1.1.

Gambar 1.1 Skema Kerangka Pemikiran Penelitian

1.5.2 Hipotesis Penelitian

Minyak buah merah menurunkan ekspresi COX-2 pada mencit model kolitis ulserativa.

Inflamasi

ROS, RNS, TNF-α, IFN-γ, IL-4,5,13, IL-1β

PGE2

Buah Merah

Antioksidan

DSS

Kolitis ulserativa

Stress

oksidatif

COX-2

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pemberian minyak buah merah memiliki efek preventif pada mencit model kolitis ulserativa dengan cara menurunkan ekspresi COX-2.

5.2 Saran

1. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui mekanisme penghambatan NF-_κB oleh minyak buah merah pada mencit model kolitis ulserativa.

2. Diperlukan uji klinis untuk mengetahui lebih lanjut mengenai efek minyak buah merah dalam mencegah kolitis ulserativa pada manusia.

DAFTAR PUSTAKA

Abraham C, Cho JH. 2009. Inflammatory bowel disease. N Engl J Med. 361, 2066–2078.

Aggarwal BB, Shishodia S, Sandur SK, Pandey MK, Sethi. 2006. Inflammation and cancer: How hot is the link? Biochemical Pharmacology. 72: 1605-21. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002. Pathogens,

Infection, and Innate Immunity in Alberts B, Johnson , Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P, Molecular Biology of The Cell. 4 th.ed. Garland Science, a member of the Taylor & Francis Group. p.1423-1462.

Ananthakrishnan AN. 2015. Epidemiolgy and risk factor for IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12: 205–217.

AVMA Guidelines on Euthanasia. 2007. American Veterinary Medical Association. 1-36.

Bai SK, Lee SJ, Na HJ, Ha KS, Han JA, Lee H, et al. 2005. B-Carotene inhibits inflammatory gene expression in lipopolysaccharide-stimulated macrophages by suppressing redox-based NF-kB activation. Experiment Mol Med. 37(4): 322-34.

Backlund MG, Mann JR, Dubois RN. 2005. Mechanisms for prevention of gastrointestinal cancer: the role of prostaglandin E2. Oncology. 69 (Suppl 1): 28-32.

Balkwill F & Mantovani A. 2001. Inflammation and cancer: back to Virchow?. Lancet. 357: 539-45.

Battistini B, Botting R, Bakhle YS. 1994. COX-1 and COX-2: toward the development of more selective NSAIDs. Drug News Perspect. 7: 501-12. Block JB, Evans S. 2001. A review of recent results addressing the potential

interactions of antioxidants with cancer drug therapy. JANA. 4(1): 11-9. Budi IM. 2005. Seri Agrisehat Buah Merah. Jakarta: Penebar Swadaya. 17-23. Burstein E, Fearon ER. 2008. Colitis and cancer: a tale of inflammatory cells and

Chandrasekharan NV, Dai H, Roos KL, Evanson NK, Tomsik J, Elton TS, et al. COX-3, a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: cloning, structure, and expression. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 13926-13931.

Chinery R, Beauchamp DR, Shyr Y, Kirkland SC, Coffey RJ, Morrow JD. 1998. Antioxidants reduce cyclooxygenase-2 expression, prostaglandin production, and proliferation in colorectal cancer cells. Cancer Research. 58: 2323-7.

Colville-Nash PR, Qureshi SS, Willis D, Willoughby DA. 1998. Inhibition of inducible nitric oxide synthase by peroxisome proliferator-activated receptor

agonists: correlation with induction of heme oxygenase 1. J Immunol. 161: 978-984.

Cosnes, J. et al. 2011.Epidemiology and natural history of inflammatory bowel diseases. Gastroenterology.140. 1785–1794.

Coussens LM, Werb Z. 2002. Inflammation and cancer. Nature. 420: 860-7. Danese S, Fiocchi C. 2011. Review article. Medical progress Ulcerative colitis. N

Engl J Med 365:1713-25.

Danese S, Mantovani A. 2010. Inflammatory bowel disease and intestinal cancer: a paradigm of the Yin-Yang interplay between inflammation and cancer. Oncogene. 1-11.

Deininger MH, Weller M, Streffer J, Mittelbronn M, Meyermann R. 1999. Patterns of cyclooxygenase-1 and -2 expression in human gliomas in vivo. Acta Neuropathol. 98: 240-44.

Desagayam TPA, Tilak JK, Boloor KK, Sane KS, Ghaskadbi SS, Lele RD. 2004. Rewiew Article Free Radicals and Antioxidants in Human Health: Current Status and Future Prospects. 52:794-803.

Djojoningrat. 2006. Inflammatory Bowel Disease : Alur Diagnosis Dan Pengobatannnya di Indonesia. Dalam : Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, Simadibrata M, Setiati S. Buku Ajar Penyakit Dalam. Edisi 4. Pusat Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam Fakultas kedokteran Universitas Indonesia. 384-88.

Dubyak GR. Fundamentals of signal Transduction. 2006. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. 6thed. New York:Wiley-Liss, Hoboken. 515-579.

Eberhart CE, Dubois RN. 1995. Eicosanoids and the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 109: 285-301.

El-Agamey A, Lowe GM, McGarvey DJ, Mortensen A, Phillip DM, Truscott TG. 2004. Carotenoid radical chemistry and antioxidant/pro-oxidant properties. Arch Biochem Biophys. 430; 37–48.

Foell D, Kucharzik T, Kraft M, Vogl T, Sorg C and Domschke W. 2003. Inflammatory Bowel Disease. Neutrophil derived human S100A12 (EN- RAGE) is strongly expressed during chronic active inflammatory bowel disease. Gut. 52:847-853.

Gan HT, Chen YQ, Quyang Q. 2005. Sulfasalazine inhibits activation of nuclear factor- kappa B in patients with ulcerative colitis. J Gastroenterol Hepatol. 20(7):1016-24.

Gevers D. et al. 2014. The treatment-naive microbiome in new-onset Crohn’s disease. Cell Host Microbe15, 382–392.

Gionchetti P. et al. 2003. Prophylaxis of pouchitis onset with probiotic therapy: a double-blind, placebo-controlled trial. Gastroenterology 124, 1202–1209. Gommeaux J, Cano C, Garcia S, Gironella M, Pietri S, Culcasi M. et al. 2007.

Colitis and colitis-associated cancer are exacerbated in mice deficient for tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Mol Cell Biol. 27:6. p. 2215-28. Greenberg ER, Baron JA, Tosteson TD, Freeman DH, Beck GJ, Bond JH. 1994. Clinical-trial of antioxidant vitamins to prevent colorectal adenoma, N Engl J Med. 331: 141–7.

Hanafiah KA. 2000. Rancangan Percobaan. Teori dan Aplikasi. PT. Raja Grafindo Persada. Jakarta. 6-7.

Hussain SP, Harris CC. 2007. Inflammation and cancer : an ancient link with novel potentials. Int J Cancer. 121: 2373-80.

Ito Y, Yoshida H, Nakano K, Takamura Y, Miya A, Kobayashi K, et al. 2003. Cyclooxygenase-2 expression in thyroid neoplasms. Histopathology. 42: 492-497.

Karp G. 2005. The Immune Response. In : Karp G, Cell and Molecular Biology. 4th ed. John Wiley & Sons.p.700-732.

Kazi N, Radvan R, Oldham T, Keshavarzian A, Frommel TO, Libertin C. et al.

1997. Immunomodulatory effect of beta-carotene on T lymphocyte subsets in patient with resected colonic polyps and cancer. Nutr Cancer. 28(2):140-5.

Khiong K, Andhika OA. 2012. Peranan Minyak Buah Merah (Pandanus Conoideus Lam.) Terhadap Mencit Model Kanker Kolorektal. J Indon Med Assoc. 62(8): 307-13.

Khiong K, Ratnawati H, Soeng S, Hudaya S, Griselda. 2009. Pengaruh buah merah terhadap proliferasi limfosit dan kadar IFN-γ pada mencit model kolitis ulserativa yang diinokulasi dengan Listeria monocytogenes. Simposium penelitian bahan obat alami XIV & Muktamar XI PERHIPBA. 11-12 Agustus 2009. Jakarta.

Khiong K, Soeng S, Ratnawati H. 2012. Pengaruh minyak buah merah (Pandanus conoideus Lam.) terhadap mencit model kolitis ulserativa. J Indon Med Assoc. 62(4):144-50.

Kim TW, Seo JN, Suh YH, Park HJ, Kim JH, Kim JY et al. 2006. Involvement of lymphocytes in dextran sulfate sodium-induced experimental colitis. World JGastroenterol. 12(2): 302-305.

Koga H, Sakisaka S, Ohishi M, Kawaguchi T, Taniguchi E, Sasatomi K, et al. 1999. Expression of cyclooxygenase-2 in human hepatocellular carcinoma: relevance to tumor dedifferentiation. Hepatology. 29: 688-696.

Kohno H, Suzuki R, Sugie S, Tanaka T. 2005. Suppression of colitis related mouse colon carcinogenesis by a COX-2 inhibitor and PPAR ligands. BMC Cancer 5: 46.

Kostic AD, Xavier RJ, Gevers D. 2014. The microbiome in inflammatory bowel disease: current status and the future ahead. Gastroenterology146, 1489– 1499.

Kruidenier L and Vespaget HW. 2002. Review article: oxidative stress as a pathogenic factor in infloammatory bowel disease-radicals or ridiculous?.Aliment Pharmacol Ther. 16:1997-2015.

Kugathasan S, Cohen S. 2008. Searching for new clues in inflammatory bowel disease: tell tales from pediatric IBD natural history studies. Gastroenterology. 135:1038-41.

Lakatos PL. 2006. Recent trends in the epidemiology of inflammatory bowel diseases: Up or down?. World J Gastroenterol. 12(38):6102-08.

Loftus EV. 2004. Jr Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: incidence, prevalence, and environmental influences. Gastroenterology. 126, 1504–1517.

Loukanov T, Kirilov M, Furstenberger G, Muller-Decker K. 2010. Localization of cyclo-oxygenase-2 in human colorectal cancer. Clin Invest Med. 33(1):E22-9.

Machmud Yahya H dan Bernard T Wahyu Wiryanta, 2005. Khasiat dan manfaat buah merah, si emas merah dari Papua. PT. AgroMedia Pustaka. Jakarta. Hal 24-34.

Manichanh C. et al. 2012. The gut microbiota in IBD. Nat Rev Gastroenterol. Hepatol. 9: 599–608.

Meira LB, Bugni JM, Green SL, Lee C, Pang B, Borenshtein D. et al. 2008. DNA damage induced by chronic inflammation contributes to colon carcinogenesis in mice. JCI. 118 (7): 2516-25.

Mitchell JA, Larkin S, Williams TJ. 1995. Cyclooxygenase-2: regulation and relevance in inflammation. Biochem Pharmacol. 50: 1535-1542.

Morgan XC. et al. 2012. Dysfunction of the intestinal microbiome in inflammatory bowel disease and treatment. Genome Biol. 13, R79.

Moore KL, Dalley AF, Agur AMR. Clinically Oriented Anatomy. 2014. 7thEd. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. pp 246-53; 368-71; 411-14.

Mortensen A, Skibsted LH, Truscott TG. 2001. The interaction of dietary carotenoids with radical species. Arch. Biochem Biophys. 385: 13–9.

Nagahori M, Nemoto Y, Wanatabe M. 2010. Pathogenesis of inflammatory bowel disease. 8: 9-17.

Nagalingam NA & Lynch SV. 2012. Role of the microbiota in inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis.18: 968–984.

Niles RM. 2004. Signaling pathways in retinoid chemoprevention and treatment of cancer. Mut Res Fund-Mol Mech Mutagen. 555: 81–96.

Nielsen OH, Rask-Madsen J. 1996. Mediators of inflammation in chronic inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol Suppl. 216: 149-159. Novo E, Parola M. 2008. Review article. Redox mechanisms in hepatic chronic

wound healing and fibrogenesis. In : Fibrogenesis & tissue repair.1-58. Nur Alam Syah A. 2005. Perpaduan sang penakluk penyakit VCO + minyak buah

merah. PT Argo Media Pustaka.

Paiotti APR, Neto RA, Forones NM, Oshima CTF, Miszputen SJ, Franco M. 2007. Immunoexpression of Cyclooxygenase-1 and -2 in Ulcerative Colitis Braz J Med Biol Res. 2007. 40(7): 911-8.

Parslow TG. 2003. The Immune Response. Medical Immunology. In Parslow TG, Sites DP, Terr A, Imboden JB. Medical Immonology. 10th ed. McGraw Hill Companies. p 61-71.

Podolsky DK. 2002. Review Article. Inflammatory bowel disease. N Engl J Med. 2002. 347(6): 417-27.

Popivanova BK, Kitamura K, Wu Y, Kondo T, Kagaya T, Kaneko K. et al. 2008. Blocking TNF-α in Mice Reduces Colorectal Carcinogenesis Associated with Chronic Colitis. JCI.118 (2): 560-70.

Pryor WA. 2000. Vitamin E and heart disease: basic science to clinical intervention. Free Radic Biol Med. 28(1):141-64.

Ratnawati H, Khiong K, Soeng S, Sugeng SU, Kristiono E, Hudaya S. 2008. Pengaruh Ekstrak Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.) terhadap Berat Limpa, Jumlah dan Proliferasi Limfosit pada Mencit Jantan Galur Swiss-Webster yang Diinokulasi Listeria monocytogenes. Disampaikan dalam

KONAS XII dan PIN PAAI (Perhimpunan Ahli Anatomi Indonesia). Jakarta, 20-21 Juni 2008.

Renes IB, Boshuizen JA, Van Nispen DJ, Bulsing NP, Buller HA, Dekker J. et al.

2002. Alterations in Muc2 biosynthesis and secretion during dextran sufate sodium induced colitis.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002;282:G382-89.

Rohman A, Riyanto S, Yuniarti N, Saputra WR, Utami R, Mulatsih W. 2010. Antioxidant activity, total phenolic, and total flavaonoid of extracts and fractions of red fruit (Pandanus conoideus Lam). International Food Research Journal. 17:97-06.

Rutgeerts P, Vermeire S, Van Assche G. Ulcerative colitis is a type of inflammatory bowel disease (IBD) that affects the large intestine (colon) and rectum. Gastroenterol. 2009;136(4).

Sano H, Kawahito Y, Wilder RL, Hashiramoto A, Mukai S, Asai K. et al. 1995. Expression of cyclooxygenase-1 and -2 in human colorectal cancer. Cancer Res. 55: 3785-3789.

Sartor RB. 2006. Mechanisms of Disease : pathogenesis of Chron’s disease and ulcerative colitis. J Gastroenterol Hepatol. 3(7):390-05.

Schroeter H, Boyd C, Spencer JPE, Williams RJ, Cadenas E, Rice-Evans C. 2002. MAPK signaling in neurodegeneration: influences of flavonoids and of nitric oxide, Neurobiol Aging. 23: 861–80.

Sergei LG, Greten FR, Karin M. 2010. Immunity, Inflammation, and cancer. Cell. 140: 883-99.

Shattuck-Brandt RL, Varilek GW, Radhika A, Yang F, Washington MK, DuBois RN. 2000. Cyclooxygenase-2 expression is increased in the subepithelial myofibroblasts of colon and cecal carcinomas from IL-10 (-/-) mice. Gastroenterology 118: 337–345.

Shao HB, Chu LY, Lu ZH, Kang CM. 2008. Primary antioxidant free radical scavenging ang redox signaling pathways in higher plant cells. Int J Biol Sci. 4(1): 8-14.

Smith WL, Dewitt DL, Garavito RM. 2000. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology. Annu Rev Biochem. 69: 145-182.

Singer II, Kawka DW, Schloemann S, Tessner T, Riehl T, Stenson WF. 1998. Cyclooxygenase 2 is induced in colonic epithelial cells in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 115: 297–306.

Stenhouse L. Crash Course Anatomy. 2012. 4thEd. Mosby Elsevier, pp 100-1. Sollid LM, Johansen FE. 2008. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease at

the Dawn of the New Genetics Era. PLos Medicine. 5(9):1338-1342.

Surono IS, Nishigaki T, Endaryanto A, Waspodo P. 2008. Indonesia biodiversities, from micobes to herbal plants as potential functional foods. Journal of Faculty of Agriculture Shinshu University. 44 (1): 23-7.

Sutherland L. et al. 1991. Double blind, placebo controlled trial of metronidazole in Crohn’s disease. Gut 32, 1071–1075.

Terminologia anatomica: International anatomical terminology by the Federative Committee on Anatomical Terminology (FCAT). 1998. Stuttgart: Georg Thieme Verlag. 300 pp.

Turner JR. 2015. The Gastrointestinal Tract. In: Kumar V, Abbas AK, Aster JC, eds. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease, 9th ed. Philadelphia, USA: Elsevier Inc. 796-800.

Tortora GJ, Derrickson B. Principles of anatomy and physiology. 2012. 13rdEd. Biological Science Textbooks. USA, p 1006.

Vane JR, Bakhle YS, Botting RM. 1998. Cyclooxygenases 1 and 2. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 38: 97-120.

Wang D, DuBois RN. 2010. The role of COX-2 in intestinal inflammation and colorectal cancer. Oncogene. 29: 781–788.

Watson RR, Prabhala RH, Pleizia PM, Alberts DS. 1991. Effect of beta-carotene on lymphocyte subpopulations in elderly humans L evidence for a dose-respone relationship. Am J Clin Nutr. 53(2): 90-4.

Wahyuniari I, Marsetyawan HNE Soesatyo, Muhammad Ghufron, Yustina, Andwi Ari Sumiwi, Sri Wiryawan. 2009. Minyak buah merah meningkatkan aktivitas proliferasi limfosit limpa mencit setelah infeksi

Listeria monocytogenes. Jurnal Veteriner. 10 (3): 143-9.

Wijaya H, Pohan HG. 2009. Kajian teknis standar minyak buah merah (Pandanus conoideus Lam.). Prosiding PPI Standardisasi. Jakarta, 19 November 2009.

Wiryanta BTW. 2005. Keajaiban buah merah: Kesaksian dari mereka yang tersembuhkan. PT AgroMedia Pustaka. Jakarta.

Xavier RJ, Podolsky DK. 2007. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448: 427–34.

Yan Y, Wanshun L, Baoqin H, Changhong W, Chenwel F, Bing L. et al. 2007. The antioxidant and immunostimulating properties of D-glucosamine. Int Immunopharmacol.1: 29-35.

Young LE, Sanduja S, Bemis-Standoli K, Pena EA, Price RL, Dixon DA. 2009. The mRNA binding proteins HuR and tristetraprolin regulate cyclooxygenase 2 expression during colon carcinogenesis. Gastroenterology 136: 1669–167.

Ito Y, Yoshida H, Nakano K, Takamura Y, Miya A, Kobayashi K, et al. 2003. Cyclooxygenase-2 expression in thyroid neoplasms. Histopathology. 42: 492-497.

Karp G. 2005. The Immune Response. In : Karp G, Cell and Molecular Biology. 4th ed. John Wiley & Sons.p.700-732.

Kazi N, Radvan R, Oldham T, Keshavarzian A, Frommel TO, Libertin C. et al. 1997. Immunomodulatory effect of beta-carotene on T lymphocyte subsets in patient with resected colonic polyps and cancer. Nutr Cancer. 28(2):140-5.

Khiong K, Andhika OA. 2012. Peranan Minyak Buah Merah (Pandanus Conoideus Lam.) Terhadap Mencit Model Kanker Kolorektal. J Indon Med Assoc. 62(8): 307-13.

Khiong K, Ratnawati H, Soeng S, Hudaya S, Griselda. 2009. Pengaruh buah merah terhadap proliferasi limfosit dan kadar IFN-γ pada mencit model kolitis ulserativa yang diinokulasi dengan Listeria monocytogenes. Simposium penelitian bahan obat alami XIV & Muktamar XI PERHIPBA. 11-12 Agustus 2009. Jakarta.

Khiong K, Soeng S, Ratnawati H. 2012. Pengaruh minyak buah merah (Pandanus conoideus Lam.) terhadap mencit model kolitis ulserativa. J Indon Med Assoc. 62(4):144-50.

Kim TW, Seo JN, Suh YH, Park HJ, Kim JH, Kim JY et al. 2006. Involvement of lymphocytes in dextran sulfate sodium-induced experimental colitis. World J Gastroenterol. 12(2): 302-305.

Koga H, Sakisaka S, Ohishi M, Kawaguchi T, Taniguchi E, Sasatomi K, et al. 1999. Expression of cyclooxygenase-2 in human hepatocellular carcinoma: relevance to tumor dedifferentiation. Hepatology. 29: 688-696.

Kohno H, Suzuki R, Sugie S, Tanaka T. 2005. Suppression of colitis related mouse colon carcinogenesis by a COX-2 inhibitor and PPAR ligands. BMC Cancer 5: 46.

Kostic AD, Xavier RJ, Gevers D. 2014. The microbiome in inflammatory bowel disease: current status and the future ahead. Gastroenterology 146, 1489– 1499.

Kruidenier L and Vespaget HW. 2002. Review article: oxidative stress as a pathogenic factor in infloammatory bowel disease-radicals or ridiculous?.Aliment Pharmacol Ther. 16:1997-2015.

Kugathasan S, Cohen S. 2008. Searching for new clues in inflammatory bowel disease: tell tales from pediatric IBD natural history studies. Gastroenterology. 135:1038-41.

Lakatos PL. 2006. Recent trends in the epidemiology of inflammatory bowel diseases: Up or down?. World J Gastroenterol. 12(38):6102-08.

Loftus EV. 2004. Jr Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: incidence, prevalence, and environmental influences. Gastroenterology. 126, 1504–1517.

Loukanov T, Kirilov M, Furstenberger G, Muller-Decker K. 2010. Localization of cyclo-oxygenase-2 in human colorectal cancer. Clin Invest Med. 33(1):E22-9.

Machmud Yahya H dan Bernard T Wahyu Wiryanta, 2005. Khasiat dan manfaat buah merah, si emas merah dari Papua. PT. AgroMedia Pustaka. Jakarta. Hal 24-34.

Manichanh C. et al. 2012. The gut microbiota in IBD. Nat Rev Gastroenterol. Hepatol. 9: 599–608.

Meira LB, Bugni JM, Green SL, Lee C, Pang B, Borenshtein D. et al. 2008. DNA damage induced by chronic inflammation contributes to colon carcinogenesis in mice. JCI. 118 (7): 2516-25.

Mitchell JA, Larkin S, Williams TJ. 1995. Cyclooxygenase-2: regulation and relevance in inflammation. Biochem Pharmacol. 50: 1535-1542.

Morgan XC. et al. 2012. Dysfunction of the intestinal microbiome in inflammatory bowel disease and treatment. Genome Biol. 13, R79.

Moore KL, Dalley AF, Agur AMR. Clinically Oriented Anatomy. 2014. 7thEd. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. pp 246-53; 368-71; 411-14.

Mortensen A, Skibsted LH, Truscott TG. 2001. The interaction of dietary carotenoids with radical species. Arch. Biochem Biophys. 385: 13–9.

Nagahori M, Nemoto Y, Wanatabe M. 2010. Pathogenesis of inflammatory bowel disease. 8: 9-17.

Nagalingam NA & Lynch SV. 2012. Role of the microbiota in inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 18: 968–984.

Niles RM. 2004. Signaling pathways in retinoid chemoprevention and treatment of cancer. Mut Res Fund-Mol Mech Mutagen. 555: 81–96.

Nielsen OH, Rask-Madsen J. 1996. Mediators of inflammation in chronic inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol Suppl. 216: 149-159. Novo E, Parola M. 2008. Review article. Redox mechanisms in hepatic chronic

wound healing and fibrogenesis. In : Fibrogenesis & tissue repair.1-58. Nur Alam Syah A. 2005. Perpaduan sang penakluk penyakit VCO + minyak buah

merah. PT Argo Media Pustaka.

Paiotti APR, Neto RA, Forones NM, Oshima CTF, Miszputen SJ, Franco M. 2007. Immunoexpression of Cyclooxygenase-1 and -2 in Ulcerative Colitis

Braz J Med Biol Res. 2007. 40(7): 911-8.

Parslow TG. 2003. The Immune Response. Medical Immunology. In Parslow TG, Sites DP, Terr A, Imboden JB. Medical Immonology. 10th ed. McGraw Hill Companies. p 61-71.

Podolsky DK. 2002. Review Article. Inflammatory bowel disease. N Engl J Med. 2002. 347(6): 417-27.

Popivanova BK, Kitamura K, Wu Y, Kondo T, Kagaya T, Kaneko K. et al. 2008. Blocking TNF-α in Mice Reduces Colorectal Carcinogenesis Associated with Chronic Colitis. JCI.118 (2): 560-70.

Pryor WA. 2000. Vitamin E and heart disease: basic science to clinical intervention. Free Radic Biol Med. 28(1):141-64.

Ratnawati H, Khiong K, Soeng S, Sugeng SU, Kristiono E, Hudaya S. 2008. Pengaruh Ekstrak Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.) terhadap Berat Limpa, Jumlah dan Proliferasi Limfosit pada Mencit Jantan Galur Swiss-Webster yang Diinokulasi Listeria monocytogenes. Disampaikan dalam

KONAS XII dan PIN PAAI (Perhimpunan Ahli Anatomi Indonesia). Jakarta, 20-21 Juni 2008.

Renes IB, Boshuizen JA, Van Nispen DJ, Bulsing NP, Buller HA, Dekker J. et al. 2002. Alterations in Muc2 biosynthesis and secretion during dextran sufate sodium induced colitis.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002;282:G382-89.

Rohman A, Riyanto S, Yuniarti N, Saputra WR, Utami R, Mulatsih W. 2010. Antioxidant activity, total phenolic, and total flavaonoid of extracts and fractions of red fruit (Pandanus conoideus Lam). International Food Research Journal. 17:97-06.

Rutgeerts P, Vermeire S, Van Assche G. Ulcerative colitis is a type of inflammatory bowel disease (IBD) that affects the large intestine (colon) and rectum. Gastroenterol. 2009;136(4).

Sano H, Kawahito Y, Wilder RL, Hashiramoto A, Mukai S, Asai K. et al. 1995. Expression of cyclooxygenase-1 and -2 in human colorectal cancer. Cancer Res. 55: 3785-3789.

Sartor RB. 2006. Mechanisms of Disease : pathogenesis of Chron’s disease and ulcerative colitis. J Gastroenterol Hepatol. 3(7):390-05.

Schroeter H, Boyd C, Spencer JPE, Williams RJ, Cadenas E, Rice-Evans C. 2002. MAPK signaling in neurodegeneration: influences of flavonoids and of nitric oxide, Neurobiol Aging. 23: 861–80.

Sergei LG, Greten FR, Karin M. 2010. Immunity, Inflammation, and cancer. Cell. 140: 883-99.

Shattuck-Brandt RL, Varilek GW, Radhika A, Yang F, Washington MK, DuBois RN. 2000. Cyclooxygenase-2 expression is increased in the subepithelial myofibroblasts of colon and cecal carcinomas from IL-10 (-/-) mice. Gastroenterology 118: 337–345.

Shao HB, Chu LY, Lu ZH, Kang CM. 2008. Primary antioxidant free radical scavenging ang redox signaling pathways in higher plant cells. Int J Biol Sci. 4(1): 8-14.

Smith WL, Dewitt DL, Garavito RM. 2000. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology. Annu Rev Biochem. 69: 145-182.

Singer II, Kawka DW, Schloemann S, Tessner T, Riehl T, Stenson WF. 1998. Cyclooxygenase 2 is induced in colonic epithelial cells in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 115: 297–306.

Stenhouse L. Crash Course Anatomy. 2012. 4thEd. Mosby Elsevier, pp 100-1. Sollid LM, Johansen FE. 2008. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease at

the Dawn of the New Genetics Era. PLos Medicine. 5(9):1338-1342.

Surono IS, Nishigaki T, Endaryanto A, Waspodo P. 2008. Indonesia biodiversities, from micobes to herbal plants as potential functional foods. Journal of Faculty of Agriculture Shinshu University. 44 (1): 23-7.

Sutherland L. et al. 1991. Double blind, placebo controlled trial of metronidazole in Crohn’s disease. Gut 32, 1071–1075.

Terminologia anatomica: International anatomical terminology by the Federative Committee on Anatomical Terminology (FCAT). 1998. Stuttgart: Georg Thieme Verlag. 300 pp.

Turner JR. 2015. The Gastrointestinal Tract. In: Kumar V, Abbas AK, Aster JC, eds. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease, 9th ed. Philadelphia, USA: Elsevier Inc. 796-800.

Tortora GJ, Derrickson B. Principles of anatomy and physiology. 2012. 13rdEd. Biological Science Textbooks. USA, p 1006.

Vane JR, Bakhle YS, Botting RM. 1998. Cyclooxygenases 1 and 2. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 38: 97-120.

Wang D, DuBois RN. 2010. The role of COX-2 in intestinal inflammation and colorectal cancer. Oncogene. 29: 781–788.

Watson RR, Prabhala RH, Pleizia PM, Alberts DS. 1991. Effect of beta-carotene on lymphocyte subpopulations in elderly humans L evidence for a dose-respone relationship. Am J Clin Nutr. 53(2): 90-4.

Wahyuniari I, Marsetyawan HNE Soesatyo, Muhammad Ghufron, Yustina, Andwi Ari Sumiwi, Sri Wiryawan. 2009. Minyak buah merah meningkatkan aktivitas proliferasi limfosit limpa mencit setelah infeksi Listeria monocytogenes. Jurnal Veteriner. 10 (3): 143-9.

Wijaya H, Pohan HG. 2009. Kajian teknis standar minyak buah merah (Pandanus conoideus Lam.). Prosiding PPI Standardisasi. Jakarta, 19 November 2009.

Wiryanta BTW. 2005. Keajaiban buah merah: Kesaksian dari mereka yang tersembuhkan. PT AgroMedia Pustaka. Jakarta.

Xavier RJ, Podolsky DK. 2007. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448: 427–34.

Yan Y, Wanshun L, Baoqin H, Changhong W, Chenwel F, Bing L. et al. 2007. The antioxidant and immunostimulating properties of D-glucosamine. Int Immunopharmacol.1: 29-35.

Young LE, Sanduja S, Bemis-Standoli K, Pena EA, Price RL, Dixon DA. 2009. The mRNA binding proteins HuR and tristetraprolin regulate cyclooxygenase 2 expression during colon carcinogenesis. Gastroenterology 136: 1669–167.