Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada (Piper nigrum L.).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRAK
Tanaman Lada (Piper nigrum L.) termasuk dalam famili Piperaceae yang
diketahui memiliki kandungang kimia yaitu Flavonoid yang termasuk dalam
golongan senyawa polifenol. Polifenol merupakan senyawa utama yang paling
banyak terdapat pada tanaman, yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Tujuan
dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kandungan fenolik
total dan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak
metanol daun lada (Piper nigrum L.). Penetapan kangungan fenolik total
dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan untuk pengukuran aktivitas
antioksidan dilakukan dengan metode Ferric Thiocyanate
(FTC) dan
Thiobarbituric Acid (TBA) dengan menggunakan BHT (butylated hydroxy
toluene). Jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lemak diukur dengan
metode FTC, sedangkan jumlah peroksida pada tahap kedua diukur dengan
metode TBA. Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak
metanol daun lada mempunyai kandungan fenolik total sebesar 133,83 ± 5,4365
mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol
daun lada dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar (5,061 ±
0,598)%, dan (93,19 ± 2,245)%.
Kata kunci: Lada, Piper nigrum L. Fenolik Total, Metode Folin-Ciocalteu,
Antioksidan, Metode Ferric Thiocyanate (FTC), Metode Thiobarbituric Acid
(TBA).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
Pepper is a plant in piperaceae family which has been known to have
phytochemical content such as flavonoid included in the polyphenol group.
Polyphenol is the most numerous main compound in plant which have a potential
as antioxdant. The aim of this research were to measure total phenolic content and
antioxidant activity in ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
(Piper nigrum L.) total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu
method mean while antioxidant activity were measured by ferric thiocyanat (FTC)
method and thiobarbituric acid (TBA) using BHT (butylated hydroxy toluene.
Peroxide amount in the first stage of lipid peroxidation were measured by FTC
method, meanwhile ferric-thiocyanate complex reaction and to measure peroxide
amount in the secound stage of lipid peroxidation were measured by TBA metho.
The result showed that ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
has a total phenolic content of 133,83 ± 5,4365 mg gallic acid equivalents (GAE).
Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
showed as percent inhibition value was (5,061 ± 0,598)%, and (93,19 ± 2,245)%
for FTC and TBA method respectively.
Keywords: Piper nigrum L., Phenolic Content, Antioxidant, Folin-Ciocalteu
Method, Ferric Thiocyanat (FTC) Method, Thiobarbituric Acid (TBA).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL
DAUN LADA (Piper nigrum L.)
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Yuliana Rati Kamara Dewi
NIM: 128114017
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL
DAUN LADA (Piper nigrum L.)
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Yuliana Rati Kamara Dewi
NIM: 128114017
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
i
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Persetujuan Pembimbing
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL-ASETAT EKSTRAK METANOL
DAUN LADA (Piper nigrumL.)
Skripsi yang diajukan oleh:
Yuliana Ratih Kamara Dewi
NIM:
128114017
Telah disetujui oleh:
Pembimbing Utama
"/-/11{r
I
Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si.. Apt.
tarrggal
)7
lu h, ,D jL
....'.....J...
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pengesahan Skripsi Berjudul
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTNTTAS
ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL
DAUN LADA (Piper nigrumL;1
Oleh:
Yuliana Rati Kamara Dewi
NIM: lz81l4}n
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
pada tanggal: 20 Juli 2016
Mengetahui
'p
Eil
T, U;
'7^
Y.'i'
r
\
-b#
(Aris
;M.Si., Ph.D., Apt.)
Panitia Penguji:
L
Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt.
2. Yohsnes Dwiatmaka, M.Si.
3. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt.
rll
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya rnc'rr1'lLtakan ilengrin sesunggr-rhnya bahrva skripsi vang sa\a 1r-rlis ini
ticlak rnemuat kar,va atau bagian dalj karya
()riu-r-s
lain- kccuali
van-rr tclah
disebr-rtlian dalan-r kr-rtipan rian clatir"u-trustaka, seba-qaimana layakn.,'a kar-y'a rlrniah.
Apabila di kemudian hari ciiternukan inclikasi plagiarisme dalanr
nasl.:alr
ini, rnaka saya berseclia rnenanggung segala sanksi peraturan pcrunclang-uurlarrgan
vzrng berlaku.
Yogyakaria. 27 Juni 20I(r
Penr-rlis
\''uiiana Riiti Kamara Dcui
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LEi\'IB;\R PERNI'A]-AAN PERSETUJUi\N I'}LjBLIK'\S! KARYA II,NIIAH
TINTTIK KEPENTINGAI\ AKADE} I IS
Yang berrancia tangan cli bawah ini. siiya rtrahasisu,a L,nivcrsitas Siutata
DhiLn-na:
Nau-rii
:
Yuliana Rati Karnat'a Dcw,i
Norror N,lahasisu,a : 1281
14011
l)enti ircngerrbangan ihnu ncngetahuan.
siiy;a rnerrberikan kcpacia Pcrpustakaan
Ljniversitir*s Saniita f)hanna kary,'a ilrniah sa-va vang beriutlul:
PENETAPAN KA]\T,UNGAN FENOLIK TOTAT- DAN T].II AKTI\IITAS
,{NTI0KSID.\N FIIAKSI ETIL ASETAI- EKSTR..\K }tE'I\NOL
DATJN
LADA (Piper nigrum L.).
Besefia peratrgltat y'ang diperiukan (bila ada). Deng_ran cletrikiair sa\ r tnentbcrikan
keparia Petpustlrkaan Universitas Sanata Dhai'nra hak Llntrlk
nrelvir-r-rpiir-r.
rnengalihkatt clalam bentuk meclia lain. mengcloian\a cialarn hentuk pangkalan
clata" tnenclistribusikan scoaril terbatas, c'ian mcutpr-rbliiiasikai-lt_r'a
media lain rurtuk kepentrngan akadenris tanpa perlu ntentirrta
lllallpuil rnen-,berikan royalti kepada
Dcngiur clernikian pcnrr,irtaan ini saya buat clengan sebenarnva.
Pacla tan ugal
2
7 jLili 20 I (r
Yang nrer-ivatakait
(\'Lrliana Rali l(antar-a Deu'i)
ataur
ijin dari sa1,a
saYa selarna tctap rnenclrntLu.nkan
sebagai penulis.
DibLrat di Yog,vakarla
ili iitiernet
narla saya
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
Dear God,
Thank you for creating such a magical piece Known as a “smile”. It’s
indescribable, the feeling when someone smiles at you sincerely, and their eyes
sparkle as they do so. No matter how close, no matter how much of a stranger, a
sincere smile just melts the heart.
Dear God,
Thank you for creating another magical piece known as a “cry”. The
feeling of seeing someone cry warms my heart, because it simply shows how
fragile and connected we all are. And, the feeling when i my self cry, it brings
relief and appreciation to life.
Dear God,
I enjoy talking to You
~Dian Rikasari~
He has made everything beautiful in it’s time.
Ecclesiastes 3 : 11
Ku persembahkan karya ini untuk:
Tuhan Yesus Kristus, Bunda Maria
Papa Kolai, Mama Emma, dan Kakak ku tercinta Maria
Semua keluarga besar serta para sahabat yang selalu mendukung & medoakan ku
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmatNya serta segenap kasih-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
dengan baik yang berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji
Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Lada (Piper
nigrum L.)”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Strata Satu (S1) Program Studi Farmasi (S.Farm) di
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam proses penyusunan skripsi ini penulis banyak mendapat bantuan
dan bimbingan dari berbagai pihak, sehingga penulis ingin mengucapkan terima
kasih kepada:
1. Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. sebagai Dosen Pembimbing yang telah
memberikan bimbingan, pengarahan, serta ilmu dalam penelitian dan
penyusunan skripsi ini.
2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas masukan, kritik,
saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.
3. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. sebagai Dosen Penguji atas masukan,
kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.
4. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma.
5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. sebagai Kepala Penanggung Jawab
Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas izin
penggunaan laboratorium yang diberikan kepada penulis.
6. Segenap laboran dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
khususnya Pak Wagiran, Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Sigit, Mas Agung, dan
Pak Ketul atas bantuan dan kerjasamanya selama ini.
7. Mama, Papa, Kak Maria, atas dukungan, doa, kasih sayang dan semangat
yang diberikan, yang selalu mengingatkan penulis untuk tidak mudah
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
menyerah dan selalu menyertakan Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria
dalam menjalani segala sesuatu.
8. Sepupu-sepupuku tercinta Gita, Andri, Kori, Tuti,Yuyun, Titin, Sari, Fran dan
segenap keluarga besar yang tidak bisa saya sebutkan satu per satu atas
dukungan dan doanya.
9. Teman-teman skripsi payung piperaceae, Violeta Jesmile, Maria Indah
Rosari, Agatha Herny Sekar Natalia, dan Clementia Nova, terimakasih atas
suka, duka dan kerjasmanya yang telah dilewati bersama selama penelitian
ini.
10. Sahabat penulis: Violeta, Hossianna Yosi Agustina, Elisabeth Sarci Fitriwati
Enny, Fransisca Melani, Monika Meitasari Astuti, Dewi Anugrah Fitriani,
Indah, Agtha yang selalu menjadi tempat berbagi suka dan duka, selalu
memberikan dukungan dan semangat. Terima kasih atas kebersamannnya
selama ini, senang bisa mengenal kalian.
11. Teman-teman KKN reguler kelompok 32: Agustinus Bambang Satria Utama,
Lucia Ida Ayu Kristiana, Kurnia Novariany, terima kasih atas dinamika, tawa,
canda dan persahabatannya selama KKN sampai KKN berakhir. Bisa bertemu
dan mengenal kalian adalah salah satu anugerah terindah dalam hidupku.
12. Teman-teman kost Amakus: Kak Ita, Kak seruni, Kak Herta, Kak Nita, Kak
Intan, Kak Dewi, Kak Geka, Eni, Esthy, Friesca, Ratri, Indah, Herlina,
Karina, Penina, Chyntia, Valent terima kasih atas kebersamaannya selama ini.
13. Teman-teman angkatan 2012 yang luar biasa, khususnya FSM A dan FKK A
2012 yang telah memberikan semangat dan dukungan bagi penulis, terima
kasih atas kebersamaannya.
14. Semua pihak yang turut membantu dalam penyusunan skripsi ini yang tidak
dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan baik dari segi penelitian
maupun penyusunan skrips. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan
saran yang membangun. Semoga penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaat
bagi seluru pihak serta mendukung perkembangan ilmu pengetahuan.
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Yogyakarta, ……Juni 2016
Penulis
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................................... iv
PERSETUJUAN PUBLIKASI .................................................................... v
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... vi
PRAKATA .................................................................................................. vii
DAFTAR ISI ................................................................................................. x
DAFTAR TABEL ........................................................................................ xi
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xii
ABSTRAK ................................................................................................. xiv
ABSTRACT ................................................................................................. xv
PENDAHULUAN ....................................................................................... 1
METODE PENELITIAN .............................................................................. 2
HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 6
KESEMPULAN DAN SARAN .................................................................. 13
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 14
LAMPIRAN ................................................................................................ 16
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Daftar Tabel
Halaman
Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam
galat replikasi 3 ..................................... ....................................
8
Tabel II. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat
daun Lada .......................................................................................
9
Tabel III. Perhitungan persen inhibisi berdasarkan
absorbansi hari ke-6 .......................................................................
11
Tabel IV. Aktivitas antioksidan sampel (Fraksi Etil Asetat Ekstrak
Metanol Daun Lada) dengan metode TBA ........................................... 13
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Daftar Gambar
Halaman
Gambar 1. Reaksi Reagen Folin-Ciocalteu Dengan .......................................
Senyawa Fenol ............................................................................. 8
Gambar 2. Reaksi Pembentukan Kompleks Fe3+-Tiosianat dari
Kompleks Fe2+ Tiosianat oleh Hiperoksida ................................ 9
Gambar 3. Profil Kenaikan Rata-Rata Absorbansi Kontrol Negatif
Kontrol Positif, dan Sampel Fraksi Etil Asetat Ekstrak
Metanol Daun lada ................................................................... 11
Gambar 4. Reaksi Pembentukan Kompleks MDA-TBA ............................ 12
xii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Daftar Lampiran
Halaman
Lampiran 1.
Surat Determinasi Tanaman ................................................. 17
Lampiran 2.
Klasifikasi Tanaman Lada ................................................... 18
Lampiran 3.
Perhitungan Penetapan Kadar Air ........................................ 18
Lampiran 4.
Perhitungan Rendemen Ekstrak dan Fraksi ......................... 19
Lampiran 5.
Data Penimbangan Untuk Kandungan Fenolik Total .......... 19
Lampiran 6.
Data Perhitungan Konsentrasi Asam GalatDan Fraksi
Etil Asetat Untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total ...... 20
Lampiran 7.
Hasil Optimasi Operating Time Untuk Penetapan
Kandungan Fenolik Total .................................................... 22
Lampiran 8.
Optimasi Panjang Gelombang Maksimum Untuk
Kandungan Fenolik Total .................................................... 23
Lampiran 9.
Hasil Pengukuran Kurva Baku Untuk Penetapan
Kandungan Fenolik Total .................................................... 26
Lampiran 10. Perhitungan Kandungan Fenolik Total
Fraksi Etil Asetat ................................................................. 27
Lampiran 11. Data Penimbangan untuk Uji Aktivitas Antioksidan
Metode FTC-TBA ............................................................... 28
Lampiran 12. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan FTC-TBA ...... 29
Lampiran 13. Perhitungan Persen Inhibisi Uji Aktivitas Antioksidan
Metode FTC-TBA ............................................................... 33
Lampiran 14. Hasil Pengukuran Uji Aktivitas Antioksidan
Dengan Metode TBA ........................................................... 35
Lampiran 15. Gambar Proses Penelitian .................................................... 37
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRAK
Tanaman Lada (Piper nigrum L.) termasuk dalam famili Piperaceae yang
diketahui memiliki kandungang kimia yaitu Flavonoid yang termasuk dalam
golongan senyawa polifenol. Polifenol merupakan senyawa utama yang paling
banyak terdapat pada tanaman, yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Tujuan
dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kandungan fenolik
total dan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak
metanol daun lada (Piper nigrum L.). Penetapan kangungan fenolik total
dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan untuk pengukuran aktivitas
antioksidan dilakukan dengan metode Ferric Thiocyanate
(FTC) dan
Thiobarbituric Acid (TBA) dengan menggunakan BHT (butylated hydroxy
toluene). Jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lemak diukur dengan
metode FTC, sedangkan jumlah peroksida pada tahap kedua diukur dengan
metode TBA. Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak
metanol daun lada mempunyai kandungan fenolik total sebesar 133,83 ± 5,4365
mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol
daun lada dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar (5,061 ±
0,598)%, dan (93,19 ± 2,245)%.
Kata kunci: Lada, Piper nigrum L. Fenolik Total, Metode Folin-Ciocalteu,
Antioksidan, Metode Ferric Thiocyanate (FTC), Metode Thiobarbituric Acid
(TBA).
xiv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
Pepper is a plant in piperaceae family which has been known to have
phytochemical content such as flavonoid included in the polyphenol group.
Polyphenol is the most numerous main compound in plant which have a potential
as antioxdant. The aim of this research were to measure total phenolic content and
antioxidant activity in ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
(Piper nigrum L.) total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu
method mean while antioxidant activity were measured by ferric thiocyanat (FTC)
method and thiobarbituric acid (TBA) using BHT (butylated hydroxy toluene.
Peroxide amount in the first stage of lipid peroxidation were measured by FTC
method, meanwhile ferric-thiocyanate complex reaction and to measure peroxide
amount in the secound stage of lipid peroxidation were measured by TBA metho.
The result showed that ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
has a total phenolic content of 133,83 ± 5,4365 mg gallic acid equivalents (GAE).
Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
showed as percent inhibition value was (5,061 ± 0,598)%, and (93,19 ± 2,245)%
for FTC and TBA method respectively.
Keywords: Piper nigrum L., Phenolic Content, Antioxidant, Folin-Ciocalteu
Method, Ferric Thiocyanat (FTC) Method, Thiobarbituric Acid (TBA).
xv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1. Pendahuluan
Berbagai penyakit dalam tubuh disebabkan oleh adanya radikal bebas.
Radikal bebas merupakan molekul berbasis oksigen atau nitrogen dengan elektron
tidak berpasangan yang umumnya dihasilkan di dalam tubuh pada saat proses
metabolisme. Radikal bebas yang berlebihan dapat mengakibatkan penyakitpenyakit degeneratif seperti diabetes, penyakit jantung dan kanker (Winarsi,
2011).
Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat melindungi kerusakan
sel karena mampu menetralkan radikal bebas dengan mekanisme mendonorkan
atom hidrogen ke atom yang tidak memiliki pasangan elektron (Muhtadi, 2014.)
Senyawa fenolik dari tanaman obat memiliki berbagai bioaktivitas yang
memainkan peran penting dalam pencegahan kanker. Bioaktvitas dari senyawa
fenolik memiliki efek misalnya, antioksidan, anti kanker, antimutagenik dan anti
inflamasi (Huang dan Cai, 2010). Senyawa fenolik berfungsi sebagai antioksidan
karena senyawa fenolik dapat bereaksi dengan reactive oxygen species (ROS) dan
menghilangkan aktivitas radikalnya sehingga tidak berbahaya lagi terhadap sel
tubuh manusia (Sochor et al., 2010).
Rempah-rempah dan tanaman herbal merupakan salah satu sumber
antioksidan alami dan memiliki peran penting dalam pencegahan penyakit kanker
dan penuaan dini. Salah satu famili tanaman yang telah diketahui menunjukkan
potensi yang besar sebagai antioksidan adalah Piperaceae (Dodson, et al., 2000).
Piper nigrum atau biasa disebut lada merupakan salah satu tanaman dalam famili
piperaceae. . Pada penelitian yang dilakukan oleh Nahak dan Sahu (2011) daun
lada diketahui memiliki kandungan kimia seperti: alkaloid, glikosida, terpenoid,
steroid, flavonoid, tanin, gula pereduksi, dan antrakuinon. Flavonoid termasuk
dalam golongan senyawa polifenol. Polifenol merupakan senyawa utama yang
paling banyak terdapat pada tanaman, yang memiliki aktivitas antioksidan.
Pemilihan fraksi etil asetat didasarkan pada kemampuannya dalam
menarik senyawa-senyawa yang bersifat kurang polar. Flavonoid yang terkandung
dalam daun lada merupakan senyawa fenolik yang bersifat kurang polar, sehingga
dengan pelarut etil asetat diharapkan senyawa flavonoid yang terdapat dalam daun
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
lada dapat terambil secara optimal (Andersen dan Markham, 2006). Sedangkan
pemilihan ekstrak metanol didasarkan pada penelitian Cowan (1999) yang
menyatakan bahwa metanol dapat menarik lebih banyak senyawa metabolit
dibandingkan dengan air, etanol, klorofrom, diklorometanol, eter dan aseton.
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dalam penelitian ini ingin
mengetahui seberapa besar aktivitas antioksidan dari daun lada (Piper nigrum L.)
dengan menggunakan metode Ferric Thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric Acid
(TBA). Untuk mendukung hasil aktivitas antioksidan yang didapat maka pada
penelitian ini dilakukan penentuan jumlah fenolik total untuk mempresentasikan
jumlah fenolik yang menyebabkan aktivitas antioksidan.
2. Metode penelitian
A. Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Daun lada segar yang
diperoleh dari kebun obat “MERAPI FARMA” daerah KM 21,5, Kaliurang,
Cangkringan, Sleman, Yogyakarta. Akuades, metanol teknis,metanol p.a 99,6%,
etanol p.a 99,6 %, etanol 75%, etil asetat p.a, buffer fosfat 0,05m (pH7), asam
galat p.a (sigma), reagen Folin-Ciocalteu, larutan Na2CO3 1 M, amonium tiosianat
30%, FeCl3 0,02 M, asam linoleat 2,5% (sigma), larutan asam trikloroasetat (TCA
10%), larutan tiobarbitarat 0,67%, dan BHT (butylated hydroxy toluene) p.a
(Sigma).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik (Scalec
SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath
(labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-VIS
(Shimadzu UV mini), blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000µL; 110 mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang
lazim digunakan dilaboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).
2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
B. Persiapan sampel
1. Pembuatan simplisa
Tanaman lada diperoleh dari kebun obat “MERAPI FARMA” daerah KM
21,5, Kaliurang, Cangkringan, Sleman, Yogyakarta. Pengumpulan dilakukan pada
bulan maret 2016. Determinasi tanaman Lada dilakukan di Laboratorium
Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
Determinasi tanaman lada ini untuk memastikan bahwa tumbuhan yang
digunakan untuk penelitian benar-benar tumbuhan lada. Daun lada dicuci dengan
cara dialiri dengan air mengalir sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada
daun. Pencucian dilakukan sebanyak tiga kali, agar daun lada bersih dari
pengotor. Daun lada dirajang dengan ukuran seragam kurang lebih 1 cm. Daun
lada yang masih basah kemudian dikeringkan menggunakan oven dengan suhu
60o C. Daun lada yang telah kering ditunjukan dengan mudah hancurnya daun
ketika diremas. Setelah itu, daun lada kering dipisahkan dari bahan-bahan
pengotor yang ikut serta selama proses pengeringan. Daun lada dibuat menjadi
serbuk dengan blender, kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor
mesh 50, kemudian dilakukan uji kadar air dan dilakukan perhitungan rendemen
ekstrak. Serbuk daun lada yang telah diperoleh kemudian disimpan dengan cara
membungkus serbuk menggunakan wadah kedap udara. Penyimpanan serbuk
daun lada dilakukan pada suhu ruangan.
2. Pembutan ekstrak metanol daun lada (Piper nigrum L.)
Pembuatan ekstrak metanol lada mengacu pada jurnal penelitian Artini et
al., (2013) sebanyak 31,509 g serbuk simplisia daun Lada ditimbang, kemudian
dimaserasi dengan pelarut metanol sebanyak 100 mL hingga simplisia terendam
sempurna. Maserasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ruangan dan terlindung
dari sinar matahari langsung, dilakukan pengojokan secara otomatis dengan
menggunakan shaker setelah 24 jam dimaserasi, filtrat disaring dengan
menggunakan corong Buchner dan ampasnya diremaserasi dengan metanol
selama 24 jam lalu disaring, proses maserasi dihentikan ketika sudah diperoleh
filtrat yang bening, yang menandakan bahwa senyawa aktif dalam sampel telah
terekstrak secara sempurna. Pelarut pada filtrat dihilangkan dengan cara diuapkan
3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 400C. Kemudian diuapkan
kembali dengan menggunakan water bath ada suhu 40 0C untuk diperoleh ekstrak
kental yang bebas dari penyari yang diketahui melalui selisih antar penimbangan
ekstrak pertama dan penimbangan kedua sebesar 0,0005.
3. Pembuatan fraksi etil asetat ekstrak metanol Daun Lada
Ekstrak kental yang diperoleh difraksinasi menggunakan metode cair-cair.
Ekstrak kental dilarutkan dalam akuades hangat, kemudian difraksinasi
menggunakan etil asetat dengan perbandingan akuades : etil asetat 1:1 v/v
didalam corong pisah. Terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan air dan lapisan etil
asetat. Lapisan etil asetat (bagian atas) kemudian diambil dan ditampung dalam
wadah. Lapisan air (bagian bawah) difraksinasi kembali menggunakan etil asetat
dengan perbandingan yang sama. Tahapan ini diulang hingga fraksi jernih. Fraksi
etil asetat kemudian dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada
suhu 770C yang merupakan titik didih dari etil asetat. Fraksi etil asetat pekat
kemudian dikeringkan menggunakan waterbath. Fraksi etil asetat yang diperoleh
kemudian di simpan dalam desikator.
C. Penetapan kandungan fenolik total.
Larutan sampel dibuat dengan menimbang fraksi eti asetat ekstrak metanol
daun lada sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL metanol:air (1:1)
sehingga didapatkan konsentrasi larutan stok 1 mg/mL. Kemudian dibuat larutan
intermedietdengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet
dengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet dicampur
dengan 2 mL reagen Folin-Ciocalteu dan diinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya
ditambahkan 4 ml larutan Na2CO3 1 M kemudian didiamkan selama operating
time yang telah ditentukan sebelumnya yaitu 30 menit dan dibaca pada panjang
gelombang 753 nm,yang merupakan hasil dari penentuan panjang gelombang
maksimum. Replikasi dilkukan sebanyak 3 kali. Kurva baku asam galat dibuat
dengan konsentrasi 40; 50; 60; 70; 80 µg/mL. Hasil dinyatakan sebagai GAE
(gallic acid equivalent)/g ekstrak.
4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
D. Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC-TBA
a. Pembuatan larutan A
Larutan A dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada
sebanyak 4 mg, dilarutkan dengan etanol pada tabung raksi bertutup, kemudian
ditambahkan 4,1 mL asam linoleat 2,5 % , 8 mL buffer fosfat (pH 7) 0,05 m, 3,9
mL aquadest kemudian diinkubasi didalam oven dengan suhu 37-40oC selama 24
jam. Dibuat replikasi sebanyak 3 kali.
b. Pembuatan larutan B
Preparasi larutan B dibuat dengan cara menambahkan 9,7 mL etanol 75% dengan
0,1 mL ammonium thiocyanate 30% dalam tabung flakon, selanjutnya
ditambahkan 100µL sampel larutan A yang sudah diinkubasi selama 24 jam,
100µL FeCl3 0,02 m ditunggu selama operating time yaitu 5 menit dan diukur ada
panjang gelombang 488,5 nm.
E. Penegasan aktivitas antioksidan dengan metode TBA
Larutan sampel dan larutan standar yang digunakan pada metode FTC
pada hari terakhir diambil sebanyak 2 mL dan ditambahkan 1 mL larutan
trikloroasetat 20%, 2 mL larutan asam tiobarbiturat 0,67%. Setelah didihkan
selama 10 menit, sampel didinginkan, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
3.000 rpm selama 30 menit. Absorbansi supernatan dibaca pada panjang
gelombang 532 dengan spektrofotometer visibel.
F. Analisis data
1. Penetapan kandungan fenolik total
Kandungan fenolik total dinyatakan dalam nilai mg ekivalen asam galat per gram
fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data
kurva baku asam galat, sehingga diperoleh kandungan fenolik total dengan
perhitungan menggunakan rumus:
Kandungan fenolik total = X
X = kadar fenolik yang diperoleh dari persamaan kurva baku (mg/ml)
v = volume akhir larutan dikali faktor pengenceran (ml)
m = bobot fraksi (gram)
2. Uji aktivitas antioksidan
5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Aktivitas antioksidan dengan metode FTC-TBA dinyatakan dalam persen inhibisi
yang dapat dihitung dengan rumus:
Persentase inhibisi = 100 – [
]
A1 = absorbansi maksimum sampel
A0 = absorbansi maksimum kontrol negatif
3. Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan One Sampel T-Test menggunakan program
PSPP untuk persen inhibisi antar kelompok kontrol positif dan sampel (fraksi etil
asetat ekstrak metanol daun Lada) pada FTC dan TBA untuk melihat perbedaan
keduanya.
3. Hasil dan Pembahasan
Senyawa fenolik termasuk fenol sederhana, asam fenolik, kumarin,
flavonoid, stilbenes, hydrolysabl, tanin terkondensasi, lignan, dan lignin. Senyawa
fenolik merupakan metabolit sekunder yang paling banyak terkandung dalam
tanaman. Senyawa tersebut berfungsi sebagai pencegahan proses pigmentasi,
antioksidan dan agen pelindung terhadap sinar UV (Kambojo et al., 2015).
Banyak metode yang digunakan untuk mengkuantifikasi senyawa fenolik.
Salah satu metode yang sering digunakan adalah kuantifikasi dengan
sektrofotometri,
karena
mudah
dilakukan,
cepat
dan
dapat
diterapkan
dilaboratorium secara rutin, dan murah. Reaksi kolorimetri banyak digunakan
dalam metode spektrofotometri UV-VIS. Metode ini akan mengukur konsentrasi
senyawa fenolik secara total dalam ekstrak tumbuhan (Blainski, et al., 2013).
Prinsip metode kolorimetri Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang cepat
dengan menggunakan alkali (biasanya natrium karbonat), dimana nilai yang
didapat signifikan dengan ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011)
Penentuan operating time dilakukan dengan tujuan agar reaksi antara
gugus hidroksi dari senyawa fenolik dan reagen Folin-Ciocalteu dapat berjalan
maksimal. Keadaan reaksi yang optimum ditunjukan dengan nilai absorbansi yang
relatif stabil. Pada saat terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna akan
terus meningkat hingga pada waktu tertentu akan diperoleh absorbansi yang
stabil. Namun semakin lama waktu pengukuran, ada kemungkinan senyawa
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
berwarna tersebut akan mengalami kerusakan sehingga menyebabkan intensitas
warnanya menurun dan absorbansinya juga menurun (Gandjar dan Rohman,
2007).
Penentuan operating time pada metode Folin-Ciocalteu untuk penetapan
kandungan fenolik total ini dilakukan selama 60 menit. Absorbansi larutan diukur
setiap 5 menit pada panjang gelombang teoritis (750 nm). Absorbansi yang
diperoleh selama 60 menit kemudian dilihat pada menit keberapa menghasilkan
absorbansi yang cenderung stabil atau selisihnya kecil. Operating time yang
didapat untuk penetapan kandungan fenolik total adalah 30 menit. Pada waktu
tersebut diperoleh nilai absorbansi yang stabil.
Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk mendapatkan
nilai serapan maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan reagen FolinCiocalteu. Pengukuran suatu analit harus pada panjang gelombang maksimum
karena pada panjang gelombang maksimum kepekaannya tinggi, sehingga
perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar
(Gandjar dan Rohman, 2007). Pada panjang gelombang maksimum digunakan
tiga tingkat konsentrasi yaitu rendah (40 µg/mL), sedang (60 µg/mL), tinggi (80
µg/mL). Tujuan dilakukan scanning pada tiga tingkat konsentrasi yang berbeda
adalah untuk mempresentasikan panjang gelombang maksimum pada tiap
konsentrasi. Pengukuran lambda maksimum dilakukan pada rentang panjang
gelombang 600-800 nm.
Panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah 735 nm. Hasil
yang diperoleh dari scanning panjang gelombang maksimum menunjukan hasil
yang berbeda dengan lambda maksimum teoritis. Hal ini dapat disebabkan oleh
beberapa hal antara lain jenis pelarut, pH larutan, suhu, konsentrasi tinggi, dan
zat-zat penganggu (Gandjar dan Rohman, 2007).
Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan membuat kurva baku
asam galat. Asam galat digunakan sebagai standar kurva baku karena asam galat
merupakan senyawa polifenol yang dapat menggambarkan senyawa fenolik dalam
suatu sampel. Tidak semua persamaan regresi linier digunakan dalam menentukan
kandungan fenolik total. Persamaan regresi dengan linearitas terbaik (nilai R
7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
mendekati 1) akan digunakan untuk menentukan kandungan fenolik total. Tabel I
berikut ini menunjukkan hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat yang
digunakan.
Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat replikasi 3
Konsentrasi
Absorbansi
40,4 µg/Ml
0,369
50,5 µg/mL
0,424
60,6 µg/mL
0,492
70,7 µg/mL
0,587
80,8 µg/mL
0,622
Persamaan regresi
A = 0,0974
B = 0,00662
r = 0,9924
y = 0,00662x 0,0974
Persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total
adalah persamaan regresi dari replikasi ketiga, yaitu y = 0,00624x + 0,0974
dengan linearitas sebesar 0,9924. Nilai linearitas menunjukan korelasi antara
konsentrasi dan absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linearitas (nilai R
sama dengan 1 atau mendekati 1) maka korelasinya juga semakin baik.
Uji kandungan fenolik total bertujuan untuk mengetahui jumlah fenol yang
terdapat pada sampel. Uji kandungan fenolik total dilakukan dengan
menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Kompleks biru yang terbentuk terjadi
karena reaksi oksidasi reduksi dari fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol
Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat
akan membentuk kompleks berwarna biru di sekitar panjang gelombang 745-750
nm (Ronald, et al., 2005). Adapun reaksi yang terjadi sebagai berikut:
Gambar 1. Reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenol
8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel II. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol
daun lada
Kandungan
Rata-rata
Fenolik total
SD
Konsentrasi
Absorbansi
Replikasi 1
200 µg/mL
0,270
130,5
Replikasi 2
200 µg/mL
0,269
129,5
Replikasi 3
200 µg/mL
0,285
141,5
133,83 ±
5,4365
% CV
4,0622 %
Tabel II menunjukan hasil pengukuran sampel uji pada penetapan
kandungan fenolik total. Absorbansi sampel yang diperoleh kemudian
dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier yang telah didapatkan. Hasil
perhitungan menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada
memiliki nilai kandungan fenolik total sebesar 133,83 ± 5,4365 mg ekivalen asam
galat. Radikal bebas dan peroksidasi lemak dalam tubuh dapat menyebabkan
penyakit degeneratif seperti kanker, atherosklerosis dan inflamasi, dengan adanya
senyawa antioksidan kecepatan peroksidasi lemak dapat dikurangi (Thitilertdecha,
et al.,1999).
Salah satu metode penentuan aktivitas antioksidan adalah metode FTC
(Ferri-tiosianat) yang mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi
lemak (Aris, et al., 2009). Pada metode FTC, asam linoleat yang digunakan
sebagai sumber peroksida. Peroksida yang terbentuk akan bereaksi dengan FeCl2
untuk membentuk ion Fe3+ yang kemudian bereaksi dengan ammonium tiosianat
(SCN) membentuk kompleks ferri-tiosianat (Fe(SCN)3) berwarna merah yang
dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang teoritis
500 nm. Adapun reaksi yang terjadi sebagai berikut
Gambar 2. Reaksi pembentukan kompleks Fe3+-tiosianat dari kompleks Fe2+
tiosianat oleh hidroperoksida (Moon dan Shibamoto, 2009)
Beberapa penelitian umumnya menggunakan metode FTC untuk
mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lipid dilanjutkan dengan
penggunaan metode TBA (thiobarbituric acid) untuk mengukur jumlah peroksida
9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang ada setelah
oksidasi peroksida (Aqil, et al., 2006; Rezaeizadeh, et al., 2011).
Penentuan operating time pada uji aktivitas antioksidan dengan metode
FTC dilakukan dengan menggunakan antioksidan sintesis yaitu Butylated
hydroxyrotoluene (BHT) sebagai kontrol positif yang diukur selama 10 menit,
dengan waktu pengukuran pada menit ke- 1,3, 5, 7, dan 10 secara triplo.
Pengukuran
dilakukan menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang
gelombang teoritis yaitu 500 nm (Aris, et al., 2009). Dari pengukuran diperoleh
operating time untuk metode FTC adalah 5 menit, yang ditunjukkan dengan nilai
absorbansi yang stabil.
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan bertujuan untuk
mendapatkan daerah serapan maksimum. Pada uji aktivitas antioksidan metode
FTC dilakukan dengan menggunakan tiga kali pengukuran yang diukur pada
rentang 400-600 nm.
Lambda yang dipilih adalah pengukuran ketiga yang
absorbansinya paling besar yaitu 488,5 nm dengan absorbansi sebesar 1,222.
Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC (Ferric Thiocyanate)
dilakukan pengukuran selama beberapa hari hingga kontrol negatif menunjukkan
absorbansi maksimum yang ditunjukan dengan larutan berwarna merah yang
diakibatkan oleh pembentukan kompleks ferri-tiosianat yang semakin pekat. Hal
ini menunjukan bahwa proses peroksidasi lipid asam linoleat sudah berjalan
secara maksimal. Pengukuran absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan
sampel dilakukan selama 7 hari dengan rentang waktu pembacaan sampel setiap
24 jam. Absorbansi maksimal kontrol negatif dicapai pada hari keenam yang
menandakan semakin banyak peroksida atau radikal bebas yang terbentuk.
10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2,4
Absorbansi
2,2
2,0
1,8
kontrol negatif
1,6
kontrol positif
1,4
sampel
1,2
1,0
1
2
3
4
5
6
7
Hari keGambar 3. Profil kenaikan rata-rata absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan
sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada.
Hasil yang diperoleh menunjukkan kesesuaian dengan mekanisme reaksi
di mana nilai absorbansi kontrol negatif lebih tinggi dibandingkan nilai absorbansi
kontrol positif dan sampel. Hal tersebut disebabkan karena tidak ada senyawa
antioksidan pada kontrol negatif yang dapat menghambat proses peroksidasi lipid,
sehingga ion Fe3+ yang terbentuk semakin banyak dan menyebabkan warna merah
akibat pembentukan kompleks ferri-tiosianat lebih pekat dibandingkan kontrol
positif yang berisi BHT (kontrol positif) dan sampel yang berisi fraksi etil asetat
ekstrak metanol daun lada. Pengukuran dilakukan pada hari keenam, saat proses
proksidasi lipid sudah berjalan secara maksimal.
Tabel III. Perhitungan % inhbisi berdasarkan absobansi hari ke-6
Kontrol positif
Sampel
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3
Absorbansi
% inhibisi
1,952
1,965
1,955
2,094
2,068
2,084
10,989
10,397
10,853
4,514
5,699
4,970
Rata-rata ±
SD %
inhibisi
% CV
10,746
± 0,310
2,885
5,061
± 0,598
11,816
Dari hasil perhitungan persen inhibisi diketahui bahwa kontrol positif,
menunjukan nilai % inhibisi yang lebih besar dibandingkan fraksi etil asetat
ekstrak metanol daun Lada, yaitu sebesar (10,746 ± 0,310) % , sementara fraksi
etil asetat ekstrak metanol daun Lada sebesar (5,061 ± 0,598)%. Secara statistik
11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna (P
ABSTRAK
Tanaman Lada (Piper nigrum L.) termasuk dalam famili Piperaceae yang
diketahui memiliki kandungang kimia yaitu Flavonoid yang termasuk dalam
golongan senyawa polifenol. Polifenol merupakan senyawa utama yang paling
banyak terdapat pada tanaman, yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Tujuan
dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kandungan fenolik
total dan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak
metanol daun lada (Piper nigrum L.). Penetapan kangungan fenolik total
dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan untuk pengukuran aktivitas
antioksidan dilakukan dengan metode Ferric Thiocyanate
(FTC) dan
Thiobarbituric Acid (TBA) dengan menggunakan BHT (butylated hydroxy
toluene). Jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lemak diukur dengan
metode FTC, sedangkan jumlah peroksida pada tahap kedua diukur dengan
metode TBA. Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak
metanol daun lada mempunyai kandungan fenolik total sebesar 133,83 ± 5,4365
mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol
daun lada dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar (5,061 ±
0,598)%, dan (93,19 ± 2,245)%.
Kata kunci: Lada, Piper nigrum L. Fenolik Total, Metode Folin-Ciocalteu,
Antioksidan, Metode Ferric Thiocyanate (FTC), Metode Thiobarbituric Acid
(TBA).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
Pepper is a plant in piperaceae family which has been known to have
phytochemical content such as flavonoid included in the polyphenol group.
Polyphenol is the most numerous main compound in plant which have a potential
as antioxdant. The aim of this research were to measure total phenolic content and
antioxidant activity in ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
(Piper nigrum L.) total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu
method mean while antioxidant activity were measured by ferric thiocyanat (FTC)
method and thiobarbituric acid (TBA) using BHT (butylated hydroxy toluene.
Peroxide amount in the first stage of lipid peroxidation were measured by FTC
method, meanwhile ferric-thiocyanate complex reaction and to measure peroxide
amount in the secound stage of lipid peroxidation were measured by TBA metho.
The result showed that ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
has a total phenolic content of 133,83 ± 5,4365 mg gallic acid equivalents (GAE).
Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
showed as percent inhibition value was (5,061 ± 0,598)%, and (93,19 ± 2,245)%
for FTC and TBA method respectively.
Keywords: Piper nigrum L., Phenolic Content, Antioxidant, Folin-Ciocalteu
Method, Ferric Thiocyanat (FTC) Method, Thiobarbituric Acid (TBA).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL
DAUN LADA (Piper nigrum L.)
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Yuliana Rati Kamara Dewi
NIM: 128114017
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL
DAUN LADA (Piper nigrum L.)
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Yuliana Rati Kamara Dewi
NIM: 128114017
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
i
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Persetujuan Pembimbing
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL-ASETAT EKSTRAK METANOL
DAUN LADA (Piper nigrumL.)
Skripsi yang diajukan oleh:
Yuliana Ratih Kamara Dewi
NIM:
128114017
Telah disetujui oleh:
Pembimbing Utama
"/-/11{r
I
Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si.. Apt.
tarrggal
)7
lu h, ,D jL
....'.....J...
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pengesahan Skripsi Berjudul
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTNTTAS
ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL
DAUN LADA (Piper nigrumL;1
Oleh:
Yuliana Rati Kamara Dewi
NIM: lz81l4}n
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
pada tanggal: 20 Juli 2016
Mengetahui
'p
Eil
T, U;
'7^
Y.'i'
r
\
-b#
(Aris
;M.Si., Ph.D., Apt.)
Panitia Penguji:
L
Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt.
2. Yohsnes Dwiatmaka, M.Si.
3. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt.
rll
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya rnc'rr1'lLtakan ilengrin sesunggr-rhnya bahrva skripsi vang sa\a 1r-rlis ini
ticlak rnemuat kar,va atau bagian dalj karya
()riu-r-s
lain- kccuali
van-rr tclah
disebr-rtlian dalan-r kr-rtipan rian clatir"u-trustaka, seba-qaimana layakn.,'a kar-y'a rlrniah.
Apabila di kemudian hari ciiternukan inclikasi plagiarisme dalanr
nasl.:alr
ini, rnaka saya berseclia rnenanggung segala sanksi peraturan pcrunclang-uurlarrgan
vzrng berlaku.
Yogyakaria. 27 Juni 20I(r
Penr-rlis
\''uiiana Riiti Kamara Dcui
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LEi\'IB;\R PERNI'A]-AAN PERSETUJUi\N I'}LjBLIK'\S! KARYA II,NIIAH
TINTTIK KEPENTINGAI\ AKADE} I IS
Yang berrancia tangan cli bawah ini. siiya rtrahasisu,a L,nivcrsitas Siutata
DhiLn-na:
Nau-rii
:
Yuliana Rati Karnat'a Dcw,i
Norror N,lahasisu,a : 1281
14011
l)enti ircngerrbangan ihnu ncngetahuan.
siiy;a rnerrberikan kcpacia Pcrpustakaan
Ljniversitir*s Saniita f)hanna kary,'a ilrniah sa-va vang beriutlul:
PENETAPAN KA]\T,UNGAN FENOLIK TOTAT- DAN T].II AKTI\IITAS
,{NTI0KSID.\N FIIAKSI ETIL ASETAI- EKSTR..\K }tE'I\NOL
DATJN
LADA (Piper nigrum L.).
Besefia peratrgltat y'ang diperiukan (bila ada). Deng_ran cletrikiair sa\ r tnentbcrikan
keparia Petpustlrkaan Universitas Sanata Dhai'nra hak Llntrlk
nrelvir-r-rpiir-r.
rnengalihkatt clalam bentuk meclia lain. mengcloian\a cialarn hentuk pangkalan
clata" tnenclistribusikan scoaril terbatas, c'ian mcutpr-rbliiiasikai-lt_r'a
media lain rurtuk kepentrngan akadenris tanpa perlu ntentirrta
lllallpuil rnen-,berikan royalti kepada
Dcngiur clernikian pcnrr,irtaan ini saya buat clengan sebenarnva.
Pacla tan ugal
2
7 jLili 20 I (r
Yang nrer-ivatakait
(\'Lrliana Rali l(antar-a Deu'i)
ataur
ijin dari sa1,a
saYa selarna tctap rnenclrntLu.nkan
sebagai penulis.
DibLrat di Yog,vakarla
ili iitiernet
narla saya
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
Dear God,
Thank you for creating such a magical piece Known as a “smile”. It’s
indescribable, the feeling when someone smiles at you sincerely, and their eyes
sparkle as they do so. No matter how close, no matter how much of a stranger, a
sincere smile just melts the heart.
Dear God,
Thank you for creating another magical piece known as a “cry”. The
feeling of seeing someone cry warms my heart, because it simply shows how
fragile and connected we all are. And, the feeling when i my self cry, it brings
relief and appreciation to life.
Dear God,
I enjoy talking to You
~Dian Rikasari~
He has made everything beautiful in it’s time.
Ecclesiastes 3 : 11
Ku persembahkan karya ini untuk:
Tuhan Yesus Kristus, Bunda Maria
Papa Kolai, Mama Emma, dan Kakak ku tercinta Maria
Semua keluarga besar serta para sahabat yang selalu mendukung & medoakan ku
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmatNya serta segenap kasih-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
dengan baik yang berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji
Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Lada (Piper
nigrum L.)”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Strata Satu (S1) Program Studi Farmasi (S.Farm) di
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam proses penyusunan skripsi ini penulis banyak mendapat bantuan
dan bimbingan dari berbagai pihak, sehingga penulis ingin mengucapkan terima
kasih kepada:
1. Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. sebagai Dosen Pembimbing yang telah
memberikan bimbingan, pengarahan, serta ilmu dalam penelitian dan
penyusunan skripsi ini.
2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas masukan, kritik,
saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.
3. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. sebagai Dosen Penguji atas masukan,
kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.
4. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma.
5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. sebagai Kepala Penanggung Jawab
Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas izin
penggunaan laboratorium yang diberikan kepada penulis.
6. Segenap laboran dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
khususnya Pak Wagiran, Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Sigit, Mas Agung, dan
Pak Ketul atas bantuan dan kerjasamanya selama ini.
7. Mama, Papa, Kak Maria, atas dukungan, doa, kasih sayang dan semangat
yang diberikan, yang selalu mengingatkan penulis untuk tidak mudah
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
menyerah dan selalu menyertakan Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria
dalam menjalani segala sesuatu.
8. Sepupu-sepupuku tercinta Gita, Andri, Kori, Tuti,Yuyun, Titin, Sari, Fran dan
segenap keluarga besar yang tidak bisa saya sebutkan satu per satu atas
dukungan dan doanya.
9. Teman-teman skripsi payung piperaceae, Violeta Jesmile, Maria Indah
Rosari, Agatha Herny Sekar Natalia, dan Clementia Nova, terimakasih atas
suka, duka dan kerjasmanya yang telah dilewati bersama selama penelitian
ini.
10. Sahabat penulis: Violeta, Hossianna Yosi Agustina, Elisabeth Sarci Fitriwati
Enny, Fransisca Melani, Monika Meitasari Astuti, Dewi Anugrah Fitriani,
Indah, Agtha yang selalu menjadi tempat berbagi suka dan duka, selalu
memberikan dukungan dan semangat. Terima kasih atas kebersamannnya
selama ini, senang bisa mengenal kalian.
11. Teman-teman KKN reguler kelompok 32: Agustinus Bambang Satria Utama,
Lucia Ida Ayu Kristiana, Kurnia Novariany, terima kasih atas dinamika, tawa,
canda dan persahabatannya selama KKN sampai KKN berakhir. Bisa bertemu
dan mengenal kalian adalah salah satu anugerah terindah dalam hidupku.
12. Teman-teman kost Amakus: Kak Ita, Kak seruni, Kak Herta, Kak Nita, Kak
Intan, Kak Dewi, Kak Geka, Eni, Esthy, Friesca, Ratri, Indah, Herlina,
Karina, Penina, Chyntia, Valent terima kasih atas kebersamaannya selama ini.
13. Teman-teman angkatan 2012 yang luar biasa, khususnya FSM A dan FKK A
2012 yang telah memberikan semangat dan dukungan bagi penulis, terima
kasih atas kebersamaannya.
14. Semua pihak yang turut membantu dalam penyusunan skripsi ini yang tidak
dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan baik dari segi penelitian
maupun penyusunan skrips. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan
saran yang membangun. Semoga penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaat
bagi seluru pihak serta mendukung perkembangan ilmu pengetahuan.
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Yogyakarta, ……Juni 2016
Penulis
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................................... iv
PERSETUJUAN PUBLIKASI .................................................................... v
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... vi
PRAKATA .................................................................................................. vii
DAFTAR ISI ................................................................................................. x
DAFTAR TABEL ........................................................................................ xi
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xii
ABSTRAK ................................................................................................. xiv
ABSTRACT ................................................................................................. xv
PENDAHULUAN ....................................................................................... 1
METODE PENELITIAN .............................................................................. 2
HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 6
KESEMPULAN DAN SARAN .................................................................. 13
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 14
LAMPIRAN ................................................................................................ 16
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Daftar Tabel
Halaman
Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam
galat replikasi 3 ..................................... ....................................
8
Tabel II. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat
daun Lada .......................................................................................
9
Tabel III. Perhitungan persen inhibisi berdasarkan
absorbansi hari ke-6 .......................................................................
11
Tabel IV. Aktivitas antioksidan sampel (Fraksi Etil Asetat Ekstrak
Metanol Daun Lada) dengan metode TBA ........................................... 13
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Daftar Gambar
Halaman
Gambar 1. Reaksi Reagen Folin-Ciocalteu Dengan .......................................
Senyawa Fenol ............................................................................. 8
Gambar 2. Reaksi Pembentukan Kompleks Fe3+-Tiosianat dari
Kompleks Fe2+ Tiosianat oleh Hiperoksida ................................ 9
Gambar 3. Profil Kenaikan Rata-Rata Absorbansi Kontrol Negatif
Kontrol Positif, dan Sampel Fraksi Etil Asetat Ekstrak
Metanol Daun lada ................................................................... 11
Gambar 4. Reaksi Pembentukan Kompleks MDA-TBA ............................ 12
xii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Daftar Lampiran
Halaman
Lampiran 1.
Surat Determinasi Tanaman ................................................. 17
Lampiran 2.
Klasifikasi Tanaman Lada ................................................... 18
Lampiran 3.
Perhitungan Penetapan Kadar Air ........................................ 18
Lampiran 4.
Perhitungan Rendemen Ekstrak dan Fraksi ......................... 19
Lampiran 5.
Data Penimbangan Untuk Kandungan Fenolik Total .......... 19
Lampiran 6.
Data Perhitungan Konsentrasi Asam GalatDan Fraksi
Etil Asetat Untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total ...... 20
Lampiran 7.
Hasil Optimasi Operating Time Untuk Penetapan
Kandungan Fenolik Total .................................................... 22
Lampiran 8.
Optimasi Panjang Gelombang Maksimum Untuk
Kandungan Fenolik Total .................................................... 23
Lampiran 9.
Hasil Pengukuran Kurva Baku Untuk Penetapan
Kandungan Fenolik Total .................................................... 26
Lampiran 10. Perhitungan Kandungan Fenolik Total
Fraksi Etil Asetat ................................................................. 27
Lampiran 11. Data Penimbangan untuk Uji Aktivitas Antioksidan
Metode FTC-TBA ............................................................... 28
Lampiran 12. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan FTC-TBA ...... 29
Lampiran 13. Perhitungan Persen Inhibisi Uji Aktivitas Antioksidan
Metode FTC-TBA ............................................................... 33
Lampiran 14. Hasil Pengukuran Uji Aktivitas Antioksidan
Dengan Metode TBA ........................................................... 35
Lampiran 15. Gambar Proses Penelitian .................................................... 37
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRAK
Tanaman Lada (Piper nigrum L.) termasuk dalam famili Piperaceae yang
diketahui memiliki kandungang kimia yaitu Flavonoid yang termasuk dalam
golongan senyawa polifenol. Polifenol merupakan senyawa utama yang paling
banyak terdapat pada tanaman, yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Tujuan
dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kandungan fenolik
total dan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak
metanol daun lada (Piper nigrum L.). Penetapan kangungan fenolik total
dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan untuk pengukuran aktivitas
antioksidan dilakukan dengan metode Ferric Thiocyanate
(FTC) dan
Thiobarbituric Acid (TBA) dengan menggunakan BHT (butylated hydroxy
toluene). Jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lemak diukur dengan
metode FTC, sedangkan jumlah peroksida pada tahap kedua diukur dengan
metode TBA. Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak
metanol daun lada mempunyai kandungan fenolik total sebesar 133,83 ± 5,4365
mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol
daun lada dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar (5,061 ±
0,598)%, dan (93,19 ± 2,245)%.
Kata kunci: Lada, Piper nigrum L. Fenolik Total, Metode Folin-Ciocalteu,
Antioksidan, Metode Ferric Thiocyanate (FTC), Metode Thiobarbituric Acid
(TBA).
xiv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
Pepper is a plant in piperaceae family which has been known to have
phytochemical content such as flavonoid included in the polyphenol group.
Polyphenol is the most numerous main compound in plant which have a potential
as antioxdant. The aim of this research were to measure total phenolic content and
antioxidant activity in ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
(Piper nigrum L.) total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu
method mean while antioxidant activity were measured by ferric thiocyanat (FTC)
method and thiobarbituric acid (TBA) using BHT (butylated hydroxy toluene.
Peroxide amount in the first stage of lipid peroxidation were measured by FTC
method, meanwhile ferric-thiocyanate complex reaction and to measure peroxide
amount in the secound stage of lipid peroxidation were measured by TBA metho.
The result showed that ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
has a total phenolic content of 133,83 ± 5,4365 mg gallic acid equivalents (GAE).
Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves
showed as percent inhibition value was (5,061 ± 0,598)%, and (93,19 ± 2,245)%
for FTC and TBA method respectively.
Keywords: Piper nigrum L., Phenolic Content, Antioxidant, Folin-Ciocalteu
Method, Ferric Thiocyanat (FTC) Method, Thiobarbituric Acid (TBA).
xv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1. Pendahuluan
Berbagai penyakit dalam tubuh disebabkan oleh adanya radikal bebas.
Radikal bebas merupakan molekul berbasis oksigen atau nitrogen dengan elektron
tidak berpasangan yang umumnya dihasilkan di dalam tubuh pada saat proses
metabolisme. Radikal bebas yang berlebihan dapat mengakibatkan penyakitpenyakit degeneratif seperti diabetes, penyakit jantung dan kanker (Winarsi,
2011).
Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat melindungi kerusakan
sel karena mampu menetralkan radikal bebas dengan mekanisme mendonorkan
atom hidrogen ke atom yang tidak memiliki pasangan elektron (Muhtadi, 2014.)
Senyawa fenolik dari tanaman obat memiliki berbagai bioaktivitas yang
memainkan peran penting dalam pencegahan kanker. Bioaktvitas dari senyawa
fenolik memiliki efek misalnya, antioksidan, anti kanker, antimutagenik dan anti
inflamasi (Huang dan Cai, 2010). Senyawa fenolik berfungsi sebagai antioksidan
karena senyawa fenolik dapat bereaksi dengan reactive oxygen species (ROS) dan
menghilangkan aktivitas radikalnya sehingga tidak berbahaya lagi terhadap sel
tubuh manusia (Sochor et al., 2010).
Rempah-rempah dan tanaman herbal merupakan salah satu sumber
antioksidan alami dan memiliki peran penting dalam pencegahan penyakit kanker
dan penuaan dini. Salah satu famili tanaman yang telah diketahui menunjukkan
potensi yang besar sebagai antioksidan adalah Piperaceae (Dodson, et al., 2000).
Piper nigrum atau biasa disebut lada merupakan salah satu tanaman dalam famili
piperaceae. . Pada penelitian yang dilakukan oleh Nahak dan Sahu (2011) daun
lada diketahui memiliki kandungan kimia seperti: alkaloid, glikosida, terpenoid,
steroid, flavonoid, tanin, gula pereduksi, dan antrakuinon. Flavonoid termasuk
dalam golongan senyawa polifenol. Polifenol merupakan senyawa utama yang
paling banyak terdapat pada tanaman, yang memiliki aktivitas antioksidan.
Pemilihan fraksi etil asetat didasarkan pada kemampuannya dalam
menarik senyawa-senyawa yang bersifat kurang polar. Flavonoid yang terkandung
dalam daun lada merupakan senyawa fenolik yang bersifat kurang polar, sehingga
dengan pelarut etil asetat diharapkan senyawa flavonoid yang terdapat dalam daun
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
lada dapat terambil secara optimal (Andersen dan Markham, 2006). Sedangkan
pemilihan ekstrak metanol didasarkan pada penelitian Cowan (1999) yang
menyatakan bahwa metanol dapat menarik lebih banyak senyawa metabolit
dibandingkan dengan air, etanol, klorofrom, diklorometanol, eter dan aseton.
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dalam penelitian ini ingin
mengetahui seberapa besar aktivitas antioksidan dari daun lada (Piper nigrum L.)
dengan menggunakan metode Ferric Thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric Acid
(TBA). Untuk mendukung hasil aktivitas antioksidan yang didapat maka pada
penelitian ini dilakukan penentuan jumlah fenolik total untuk mempresentasikan
jumlah fenolik yang menyebabkan aktivitas antioksidan.
2. Metode penelitian
A. Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Daun lada segar yang
diperoleh dari kebun obat “MERAPI FARMA” daerah KM 21,5, Kaliurang,
Cangkringan, Sleman, Yogyakarta. Akuades, metanol teknis,metanol p.a 99,6%,
etanol p.a 99,6 %, etanol 75%, etil asetat p.a, buffer fosfat 0,05m (pH7), asam
galat p.a (sigma), reagen Folin-Ciocalteu, larutan Na2CO3 1 M, amonium tiosianat
30%, FeCl3 0,02 M, asam linoleat 2,5% (sigma), larutan asam trikloroasetat (TCA
10%), larutan tiobarbitarat 0,67%, dan BHT (butylated hydroxy toluene) p.a
(Sigma).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik (Scalec
SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath
(labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-VIS
(Shimadzu UV mini), blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000µL; 110 mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang
lazim digunakan dilaboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).
2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
B. Persiapan sampel
1. Pembuatan simplisa
Tanaman lada diperoleh dari kebun obat “MERAPI FARMA” daerah KM
21,5, Kaliurang, Cangkringan, Sleman, Yogyakarta. Pengumpulan dilakukan pada
bulan maret 2016. Determinasi tanaman Lada dilakukan di Laboratorium
Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
Determinasi tanaman lada ini untuk memastikan bahwa tumbuhan yang
digunakan untuk penelitian benar-benar tumbuhan lada. Daun lada dicuci dengan
cara dialiri dengan air mengalir sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada
daun. Pencucian dilakukan sebanyak tiga kali, agar daun lada bersih dari
pengotor. Daun lada dirajang dengan ukuran seragam kurang lebih 1 cm. Daun
lada yang masih basah kemudian dikeringkan menggunakan oven dengan suhu
60o C. Daun lada yang telah kering ditunjukan dengan mudah hancurnya daun
ketika diremas. Setelah itu, daun lada kering dipisahkan dari bahan-bahan
pengotor yang ikut serta selama proses pengeringan. Daun lada dibuat menjadi
serbuk dengan blender, kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor
mesh 50, kemudian dilakukan uji kadar air dan dilakukan perhitungan rendemen
ekstrak. Serbuk daun lada yang telah diperoleh kemudian disimpan dengan cara
membungkus serbuk menggunakan wadah kedap udara. Penyimpanan serbuk
daun lada dilakukan pada suhu ruangan.
2. Pembutan ekstrak metanol daun lada (Piper nigrum L.)
Pembuatan ekstrak metanol lada mengacu pada jurnal penelitian Artini et
al., (2013) sebanyak 31,509 g serbuk simplisia daun Lada ditimbang, kemudian
dimaserasi dengan pelarut metanol sebanyak 100 mL hingga simplisia terendam
sempurna. Maserasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ruangan dan terlindung
dari sinar matahari langsung, dilakukan pengojokan secara otomatis dengan
menggunakan shaker setelah 24 jam dimaserasi, filtrat disaring dengan
menggunakan corong Buchner dan ampasnya diremaserasi dengan metanol
selama 24 jam lalu disaring, proses maserasi dihentikan ketika sudah diperoleh
filtrat yang bening, yang menandakan bahwa senyawa aktif dalam sampel telah
terekstrak secara sempurna. Pelarut pada filtrat dihilangkan dengan cara diuapkan
3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 400C. Kemudian diuapkan
kembali dengan menggunakan water bath ada suhu 40 0C untuk diperoleh ekstrak
kental yang bebas dari penyari yang diketahui melalui selisih antar penimbangan
ekstrak pertama dan penimbangan kedua sebesar 0,0005.
3. Pembuatan fraksi etil asetat ekstrak metanol Daun Lada
Ekstrak kental yang diperoleh difraksinasi menggunakan metode cair-cair.
Ekstrak kental dilarutkan dalam akuades hangat, kemudian difraksinasi
menggunakan etil asetat dengan perbandingan akuades : etil asetat 1:1 v/v
didalam corong pisah. Terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan air dan lapisan etil
asetat. Lapisan etil asetat (bagian atas) kemudian diambil dan ditampung dalam
wadah. Lapisan air (bagian bawah) difraksinasi kembali menggunakan etil asetat
dengan perbandingan yang sama. Tahapan ini diulang hingga fraksi jernih. Fraksi
etil asetat kemudian dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada
suhu 770C yang merupakan titik didih dari etil asetat. Fraksi etil asetat pekat
kemudian dikeringkan menggunakan waterbath. Fraksi etil asetat yang diperoleh
kemudian di simpan dalam desikator.
C. Penetapan kandungan fenolik total.
Larutan sampel dibuat dengan menimbang fraksi eti asetat ekstrak metanol
daun lada sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL metanol:air (1:1)
sehingga didapatkan konsentrasi larutan stok 1 mg/mL. Kemudian dibuat larutan
intermedietdengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet
dengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet dicampur
dengan 2 mL reagen Folin-Ciocalteu dan diinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya
ditambahkan 4 ml larutan Na2CO3 1 M kemudian didiamkan selama operating
time yang telah ditentukan sebelumnya yaitu 30 menit dan dibaca pada panjang
gelombang 753 nm,yang merupakan hasil dari penentuan panjang gelombang
maksimum. Replikasi dilkukan sebanyak 3 kali. Kurva baku asam galat dibuat
dengan konsentrasi 40; 50; 60; 70; 80 µg/mL. Hasil dinyatakan sebagai GAE
(gallic acid equivalent)/g ekstrak.
4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
D. Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC-TBA
a. Pembuatan larutan A
Larutan A dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada
sebanyak 4 mg, dilarutkan dengan etanol pada tabung raksi bertutup, kemudian
ditambahkan 4,1 mL asam linoleat 2,5 % , 8 mL buffer fosfat (pH 7) 0,05 m, 3,9
mL aquadest kemudian diinkubasi didalam oven dengan suhu 37-40oC selama 24
jam. Dibuat replikasi sebanyak 3 kali.
b. Pembuatan larutan B
Preparasi larutan B dibuat dengan cara menambahkan 9,7 mL etanol 75% dengan
0,1 mL ammonium thiocyanate 30% dalam tabung flakon, selanjutnya
ditambahkan 100µL sampel larutan A yang sudah diinkubasi selama 24 jam,
100µL FeCl3 0,02 m ditunggu selama operating time yaitu 5 menit dan diukur ada
panjang gelombang 488,5 nm.
E. Penegasan aktivitas antioksidan dengan metode TBA
Larutan sampel dan larutan standar yang digunakan pada metode FTC
pada hari terakhir diambil sebanyak 2 mL dan ditambahkan 1 mL larutan
trikloroasetat 20%, 2 mL larutan asam tiobarbiturat 0,67%. Setelah didihkan
selama 10 menit, sampel didinginkan, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
3.000 rpm selama 30 menit. Absorbansi supernatan dibaca pada panjang
gelombang 532 dengan spektrofotometer visibel.
F. Analisis data
1. Penetapan kandungan fenolik total
Kandungan fenolik total dinyatakan dalam nilai mg ekivalen asam galat per gram
fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data
kurva baku asam galat, sehingga diperoleh kandungan fenolik total dengan
perhitungan menggunakan rumus:
Kandungan fenolik total = X
X = kadar fenolik yang diperoleh dari persamaan kurva baku (mg/ml)
v = volume akhir larutan dikali faktor pengenceran (ml)
m = bobot fraksi (gram)
2. Uji aktivitas antioksidan
5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Aktivitas antioksidan dengan metode FTC-TBA dinyatakan dalam persen inhibisi
yang dapat dihitung dengan rumus:
Persentase inhibisi = 100 – [
]
A1 = absorbansi maksimum sampel
A0 = absorbansi maksimum kontrol negatif
3. Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan One Sampel T-Test menggunakan program
PSPP untuk persen inhibisi antar kelompok kontrol positif dan sampel (fraksi etil
asetat ekstrak metanol daun Lada) pada FTC dan TBA untuk melihat perbedaan
keduanya.
3. Hasil dan Pembahasan
Senyawa fenolik termasuk fenol sederhana, asam fenolik, kumarin,
flavonoid, stilbenes, hydrolysabl, tanin terkondensasi, lignan, dan lignin. Senyawa
fenolik merupakan metabolit sekunder yang paling banyak terkandung dalam
tanaman. Senyawa tersebut berfungsi sebagai pencegahan proses pigmentasi,
antioksidan dan agen pelindung terhadap sinar UV (Kambojo et al., 2015).
Banyak metode yang digunakan untuk mengkuantifikasi senyawa fenolik.
Salah satu metode yang sering digunakan adalah kuantifikasi dengan
sektrofotometri,
karena
mudah
dilakukan,
cepat
dan
dapat
diterapkan
dilaboratorium secara rutin, dan murah. Reaksi kolorimetri banyak digunakan
dalam metode spektrofotometri UV-VIS. Metode ini akan mengukur konsentrasi
senyawa fenolik secara total dalam ekstrak tumbuhan (Blainski, et al., 2013).
Prinsip metode kolorimetri Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang cepat
dengan menggunakan alkali (biasanya natrium karbonat), dimana nilai yang
didapat signifikan dengan ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011)
Penentuan operating time dilakukan dengan tujuan agar reaksi antara
gugus hidroksi dari senyawa fenolik dan reagen Folin-Ciocalteu dapat berjalan
maksimal. Keadaan reaksi yang optimum ditunjukan dengan nilai absorbansi yang
relatif stabil. Pada saat terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna akan
terus meningkat hingga pada waktu tertentu akan diperoleh absorbansi yang
stabil. Namun semakin lama waktu pengukuran, ada kemungkinan senyawa
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
berwarna tersebut akan mengalami kerusakan sehingga menyebabkan intensitas
warnanya menurun dan absorbansinya juga menurun (Gandjar dan Rohman,
2007).
Penentuan operating time pada metode Folin-Ciocalteu untuk penetapan
kandungan fenolik total ini dilakukan selama 60 menit. Absorbansi larutan diukur
setiap 5 menit pada panjang gelombang teoritis (750 nm). Absorbansi yang
diperoleh selama 60 menit kemudian dilihat pada menit keberapa menghasilkan
absorbansi yang cenderung stabil atau selisihnya kecil. Operating time yang
didapat untuk penetapan kandungan fenolik total adalah 30 menit. Pada waktu
tersebut diperoleh nilai absorbansi yang stabil.
Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk mendapatkan
nilai serapan maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan reagen FolinCiocalteu. Pengukuran suatu analit harus pada panjang gelombang maksimum
karena pada panjang gelombang maksimum kepekaannya tinggi, sehingga
perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar
(Gandjar dan Rohman, 2007). Pada panjang gelombang maksimum digunakan
tiga tingkat konsentrasi yaitu rendah (40 µg/mL), sedang (60 µg/mL), tinggi (80
µg/mL). Tujuan dilakukan scanning pada tiga tingkat konsentrasi yang berbeda
adalah untuk mempresentasikan panjang gelombang maksimum pada tiap
konsentrasi. Pengukuran lambda maksimum dilakukan pada rentang panjang
gelombang 600-800 nm.
Panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah 735 nm. Hasil
yang diperoleh dari scanning panjang gelombang maksimum menunjukan hasil
yang berbeda dengan lambda maksimum teoritis. Hal ini dapat disebabkan oleh
beberapa hal antara lain jenis pelarut, pH larutan, suhu, konsentrasi tinggi, dan
zat-zat penganggu (Gandjar dan Rohman, 2007).
Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan membuat kurva baku
asam galat. Asam galat digunakan sebagai standar kurva baku karena asam galat
merupakan senyawa polifenol yang dapat menggambarkan senyawa fenolik dalam
suatu sampel. Tidak semua persamaan regresi linier digunakan dalam menentukan
kandungan fenolik total. Persamaan regresi dengan linearitas terbaik (nilai R
7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
mendekati 1) akan digunakan untuk menentukan kandungan fenolik total. Tabel I
berikut ini menunjukkan hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat yang
digunakan.
Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat replikasi 3
Konsentrasi
Absorbansi
40,4 µg/Ml
0,369
50,5 µg/mL
0,424
60,6 µg/mL
0,492
70,7 µg/mL
0,587
80,8 µg/mL
0,622
Persamaan regresi
A = 0,0974
B = 0,00662
r = 0,9924
y = 0,00662x 0,0974
Persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total
adalah persamaan regresi dari replikasi ketiga, yaitu y = 0,00624x + 0,0974
dengan linearitas sebesar 0,9924. Nilai linearitas menunjukan korelasi antara
konsentrasi dan absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linearitas (nilai R
sama dengan 1 atau mendekati 1) maka korelasinya juga semakin baik.
Uji kandungan fenolik total bertujuan untuk mengetahui jumlah fenol yang
terdapat pada sampel. Uji kandungan fenolik total dilakukan dengan
menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Kompleks biru yang terbentuk terjadi
karena reaksi oksidasi reduksi dari fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol
Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat
akan membentuk kompleks berwarna biru di sekitar panjang gelombang 745-750
nm (Ronald, et al., 2005). Adapun reaksi yang terjadi sebagai berikut:
Gambar 1. Reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenol
8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel II. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol
daun lada
Kandungan
Rata-rata
Fenolik total
SD
Konsentrasi
Absorbansi
Replikasi 1
200 µg/mL
0,270
130,5
Replikasi 2
200 µg/mL
0,269
129,5
Replikasi 3
200 µg/mL
0,285
141,5
133,83 ±
5,4365
% CV
4,0622 %
Tabel II menunjukan hasil pengukuran sampel uji pada penetapan
kandungan fenolik total. Absorbansi sampel yang diperoleh kemudian
dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier yang telah didapatkan. Hasil
perhitungan menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada
memiliki nilai kandungan fenolik total sebesar 133,83 ± 5,4365 mg ekivalen asam
galat. Radikal bebas dan peroksidasi lemak dalam tubuh dapat menyebabkan
penyakit degeneratif seperti kanker, atherosklerosis dan inflamasi, dengan adanya
senyawa antioksidan kecepatan peroksidasi lemak dapat dikurangi (Thitilertdecha,
et al.,1999).
Salah satu metode penentuan aktivitas antioksidan adalah metode FTC
(Ferri-tiosianat) yang mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi
lemak (Aris, et al., 2009). Pada metode FTC, asam linoleat yang digunakan
sebagai sumber peroksida. Peroksida yang terbentuk akan bereaksi dengan FeCl2
untuk membentuk ion Fe3+ yang kemudian bereaksi dengan ammonium tiosianat
(SCN) membentuk kompleks ferri-tiosianat (Fe(SCN)3) berwarna merah yang
dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang teoritis
500 nm. Adapun reaksi yang terjadi sebagai berikut
Gambar 2. Reaksi pembentukan kompleks Fe3+-tiosianat dari kompleks Fe2+
tiosianat oleh hidroperoksida (Moon dan Shibamoto, 2009)
Beberapa penelitian umumnya menggunakan metode FTC untuk
mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lipid dilanjutkan dengan
penggunaan metode TBA (thiobarbituric acid) untuk mengukur jumlah peroksida
9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang ada setelah
oksidasi peroksida (Aqil, et al., 2006; Rezaeizadeh, et al., 2011).
Penentuan operating time pada uji aktivitas antioksidan dengan metode
FTC dilakukan dengan menggunakan antioksidan sintesis yaitu Butylated
hydroxyrotoluene (BHT) sebagai kontrol positif yang diukur selama 10 menit,
dengan waktu pengukuran pada menit ke- 1,3, 5, 7, dan 10 secara triplo.
Pengukuran
dilakukan menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang
gelombang teoritis yaitu 500 nm (Aris, et al., 2009). Dari pengukuran diperoleh
operating time untuk metode FTC adalah 5 menit, yang ditunjukkan dengan nilai
absorbansi yang stabil.
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan bertujuan untuk
mendapatkan daerah serapan maksimum. Pada uji aktivitas antioksidan metode
FTC dilakukan dengan menggunakan tiga kali pengukuran yang diukur pada
rentang 400-600 nm.
Lambda yang dipilih adalah pengukuran ketiga yang
absorbansinya paling besar yaitu 488,5 nm dengan absorbansi sebesar 1,222.
Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC (Ferric Thiocyanate)
dilakukan pengukuran selama beberapa hari hingga kontrol negatif menunjukkan
absorbansi maksimum yang ditunjukan dengan larutan berwarna merah yang
diakibatkan oleh pembentukan kompleks ferri-tiosianat yang semakin pekat. Hal
ini menunjukan bahwa proses peroksidasi lipid asam linoleat sudah berjalan
secara maksimal. Pengukuran absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan
sampel dilakukan selama 7 hari dengan rentang waktu pembacaan sampel setiap
24 jam. Absorbansi maksimal kontrol negatif dicapai pada hari keenam yang
menandakan semakin banyak peroksida atau radikal bebas yang terbentuk.
10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2,4
Absorbansi
2,2
2,0
1,8
kontrol negatif
1,6
kontrol positif
1,4
sampel
1,2
1,0
1
2
3
4
5
6
7
Hari keGambar 3. Profil kenaikan rata-rata absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan
sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada.
Hasil yang diperoleh menunjukkan kesesuaian dengan mekanisme reaksi
di mana nilai absorbansi kontrol negatif lebih tinggi dibandingkan nilai absorbansi
kontrol positif dan sampel. Hal tersebut disebabkan karena tidak ada senyawa
antioksidan pada kontrol negatif yang dapat menghambat proses peroksidasi lipid,
sehingga ion Fe3+ yang terbentuk semakin banyak dan menyebabkan warna merah
akibat pembentukan kompleks ferri-tiosianat lebih pekat dibandingkan kontrol
positif yang berisi BHT (kontrol positif) dan sampel yang berisi fraksi etil asetat
ekstrak metanol daun lada. Pengukuran dilakukan pada hari keenam, saat proses
proksidasi lipid sudah berjalan secara maksimal.
Tabel III. Perhitungan % inhbisi berdasarkan absobansi hari ke-6
Kontrol positif
Sampel
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3
Absorbansi
% inhibisi
1,952
1,965
1,955
2,094
2,068
2,084
10,989
10,397
10,853
4,514
5,699
4,970
Rata-rata ±
SD %
inhibisi
% CV
10,746
± 0,310
2,885
5,061
± 0,598
11,816
Dari hasil perhitungan persen inhibisi diketahui bahwa kontrol positif,
menunjukan nilai % inhibisi yang lebih besar dibandingkan fraksi etil asetat
ekstrak metanol daun Lada, yaitu sebesar (10,746 ± 0,310) % , sementara fraksi
etil asetat ekstrak metanol daun Lada sebesar (5,061 ± 0,598)%. Secara statistik
11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna (P