Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu (Piper sarmentosum Roxb.).

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT

EKSTRAK METANOL DAUN DUDU (Piper sarmentosum Roxb.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Progam Studi Farmasi

Oleh : Mario Yedi Mau NIM : 128114028

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

i

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS

ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN

DUDU (Piper sarmentosum Roxb.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Progam Studi Farmasi

Oleh :

Mario Yedi Mau

NIM : 128114028

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

vi

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Diberkatilah orang yang mengandalkan Tuhan, yang menaruh harapannya pada Tuhan!”

(Yeremia. 17 : 7)

Kupersembahkan skripsi ku ini kepada :

Tuhan Yesus Kristus, yang selalu menemani aku

Dalam pengerjaan skripsiku,

Ayah dan Ibu yang selalu mendukung aku

Dalam menyelesaikan skripsi,

vii

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Ynag Maha Esa atas berkat dan

hikmat-Nya penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total

dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Dudu (Piper sarmentosum Roxb.)” sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar sarjana farmasi di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Proses penyusunan skripsi penulis banyak mendapatkan bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, sehingga penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada :

1. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

2. Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., selaku Dosen Pembimbing dan Dosen Penguji Skrpsi atas segala kesabaran dan amsukan sehingga skripsi penulis dapat diselesaikan dengan baik

3. Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku Dosen Penguji Skripsi atas masukan kritik, dan saran kepada penulis dalam penyusunan skripsi ini

4. Damiana Sapta Candrasari, S.Si. M.Sc., selaku Dosen Penguji Skripsi atas masukan kritik, dan saran kepada penulis dalam penyusunan skripsi ini

5. Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan ijin dalam penggunaan laboratorium

6. Segenap laboran dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, khususnya buat Pak Wagiran, Pak Suparlan, Pak Kunto, Pak Bimo, Pak Kayat, Pak Agung, Pak Sigit atas bantuan dan kerjasamanya

7. Ayah dan Ibu atas dukungan doa dan motivasi semangat yang diberikan kepada penulis 8. Agatha Herny S. N., Yuliana Kamara Dewi, Maria Indah Rosari, Violeta Jesmile dan

Clementia Nova, Marselinus Alberto Moa, dan Fransisca Melani, terima kasih atas segala bantuan dalam penelitian ini.

9. Teman-teman JOY atas dukungan dan semangat dalam penulis menyelesaikan skripsi 10.Seluruh dosen, teman-teman FSM A 2012, teman-teman FKK A 2012, serta seluruh

viii

11.Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu penulis selama ini, terima kasih

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini banyak kekurangan dan jauh dari sempurna, untuk itu dengan segala kerendahan hati penulis mengharapkan saran dan kritik guna perbaikan dan penyempurnaan skripsi ini. Harapan penulis semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi.

Yogyakarta, 21 Maret 2017

ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ……….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBINGAN ………... ii

HALAMAN PENGESAHAN ………... iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ………. iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ……… v

HALAMAN PERSEMBAHAN ………. vi

PRAKATA ………. vii

DAFTAR ISI ……….. ix

DAFTAR TABEL ……….. x

DAFTAR GAMBAR ……….. xi

DAFTAR LAMPIRAN ……….. xii

ABSTRAK ………. xiv

ABSTRACT ………. xv

PENDAHULUAN ……….. 1

METODE PENELITIAN ………... 2

HASIL DAN PEMBAHASAN ……….. 5

KESIMPULAN DAN SARAN ……….. 10

DAFTAR PUSTAKA ………. 11

LAMPIRAN ………... 12

x

DAFTAR TABEL

Halaman

Table I. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol

daun dudu ……….. 6

Table II. Nilai persen inhibisi sampel dengan metode FTC ……….. 8 Table III. Aktivitas antioksidan sampel dengan metode TBA ……… 9

xi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Profil kenaikan rata-rata absorbansi sampel dengan metode FTC selama

tujuh hari ………

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat determinasi tanaman ……… 14 Lampiran 2. Gambar daun dudu ……… 15 Lampiran 3. Perhitungan pengujian kadar air serbuk simplisia daun sirih dudu 15 Lampiran 4. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan

metode Folin-Ciocalteu ………. 16 Lampiran 5. Perhitungan randeman ekstrak dan fraksi ………. 16 Lampiran 6. Data penimbangan untuk penetapan kandungan fenolik total ….. 17 Lampiran 7. Data perhitungan konsentrasi asam galat dan fraksi etil asetat

untuk penetapan kandungan fenolik total ……….. 18

Lampiran 8. Hasil optimasi operating time untuk penetapan kandungan

fenolik total ………... 19

Lampiran 9. Optimasi panjang gelombang maksimum untuk penetapan

kandungan fenolik total ………. 21

Lampiran 10. Hasil pengukuran kurva baku untuk penetapan kandungan

fenolik total ………... 22

Lampiran 11. Perhitungan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ………….. 23 Lampiran 12. Data penimbangan untuk optimasi operating time uji aktivitas

antioksidan dengan metode FTC ………... 23

Lampiran 13. Hasil optimasi optimasi operating time uji aktivitas antioksidan

dengan metode FTC ……….. 23

Lampiran 14. Data penimbangan untuk optimasi panjang gelombang

maksimum untuk uji antioksidan dengan metode FTC …………. 24

Lampiran 15. Hasil optimasi panjang gelombang untuk uji aktivitas

antioksidan dengan metode FTC ……… 24 Lampiran 16. Data penimbangan untuk uji antioksidan dengan metode

FTC-TBA ………... 24

Lampiran 17. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC .. 25 Lampiran 18. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode TBA.. 29

xiii

Lampiran 19. Gambar larutan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kumukus pada metode FTC setelah penambahan FeCl3 selama 7

hari (tiga kali replikasi) ………. 33

xiv

ABSTRAK

Senyawa fenolik yang terkandung dalam tanaman, khususnya asam fenolat dan flavonoid, telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan yang dapat menghambat radikal bebas dan peroksidasi lipid. Dudu (Piper sarmentosum Roxb.) merupakan salah satu tanaman dari famili Piperaceae yang telah diketahui memiliki berbagai kandungan fitokimia yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu (Piper Sarmentosum Roxb.). Penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan untuk pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode

Ferric Thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric Acid (TBA) dengan menggunakan Alfa-tokoferol. Jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lemak diukur dengan metode FTC, sedangkan jumlah pada tahap kedua diukur dengan metode TBA. Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu mempunyai kandungan fenolik total sebesar 205,6073 ± 5,7823 mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar 22,9177 ± 1,5566 % dan 96,6916 ± 0,3848 %.

Kata kunci: Dudu, fenolik total, antioksidan, Ferric Thiocyanate (FTC), Thiobarbituric Acid (TBA).

xv

ABSTRACT

Phenolic compounds contained in plants, especially phenolic acid and flavonoid, has been known to have antioxidant activity which can inhibit free radical and lipid peroxidation. Dudu (Piper sarmentosum Roxb.), is a plant in Piperaceae family, has been known to have some phytochemical content that can exhibit potential antioxidant activity. The aims of this research were to measure total phenolic content and antioxidant activity in ethyl acetate fraction of methanol exstract of dudu leaves (Piper sarmentosum Roxb.) Total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu method mean while antioxidant activity were measured by ferric thiocyanat (FTC) method and thiobarbituric acid (TBA) using Alfa-tokoferol. Peroxide amount in the first stage of lipid peroxidation were measured by FTC method, meanwhile ferric-thiocyanate complex reaction and to measure peroxide amount in the secound stage of lipid peroxidation were measured by TBA method. The result showed that ethyl acetate fraction of methanol exstract of dudu leaves has a total phenolic content of 205,6073 ± 5,7823 mg gallic acid equivalents (GAE). Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of dudu leaves showed as percent inhibition value were 22,9177 ± 1,5566 % and 96,6916 ± 0,3848 % for FTC and TBA method respectively.

Keywords: Dudu, phenolic total, antioxidant, Ferric thiocyanat (FTC), Thiobarbituric Acid (TBA).

1 PENDAHULUAN

Radikal bebas merupakan molekul yang relatif tidak stabil, memiliki elektron yang tidak berpasangan di orbital luarnya sehingga bersifat reaktif dalam mencari pasangan elektron. Jika terbentuk dalam tubuh, akan menjadi reaksi berantai dan menghasilkan radikal bebas baru yang jumlahnya terus bertambah, radikal bebas yang berlebihan menyebabkan antioksidan seluler tidak dapat menetralkannya sehingga mengakibatkan pada kerusakan sel. Radikal bebas dapat dijumpai pada lingkungan seperti, beberapa logam (misalnya besi, tembaga), asap rokok, polusi udara, obat, bahan beracun, makanan dalam kemasan, bahan aktif, dan sinar ultraviolet dari matahari maupun radiasi (Agarwal et al, 2010). Semakin tinggi produksi ROS (Reaktif Stres Oksidatif) maka kapasitas antioksidan akan menurun yang berefek berbahaya pada pembentukan radikal bebas atau stres oksidatif (OS) (Borza et al, 2013). Stress oksidatif yang terlibat dalam pembentukan Peroksidasi lipid adalah penyebab utama dari disfungsi seluler seperti penuaan dan penyakit yang berhubungan dengan stres oksidatif. Hasil stres oksidatif berasal dari ketidakseimbangan antara radikal bebas pada tubuh sehingga mempengaruhi proses oksigen reaktif stress (ROS) (Sies, 1997). Peroksida lipid dapat mengakibatkan penuaan, alseimer, dan karsinogenesis (Lin, et al., 2005).

Senyawa antioksidan dapat menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif. Akibatnya, kerusakan sel akan dihambat. Senyawa antioksidan enzimatis merupakan sistem pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stres oksidatif. Antioksidan enzimatis bekerja dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru. Contoh senyawa enzim (misalnya superoksida dismutase atau SOD) (Hery, 2007). SOD merupakan antioksidan pencegah meningkatnya produksi ROS seperti ion superoxide (O2-) dan ion hydroxyl, dampak jika SOD menurun adalah tidak ada perlawanan terhadap ROS sehingga terjadi stress oksidatif (Purnomo, 2011). Senyawa antioksidan terdiri atas dua macam yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Antioksidan sintetik memiliki kelemahan yaitu dapat mengakibatkan toksisitas, biaya produksi yang tinggi (Soong, 2004) sedangkan antioksidan alami mudah diterima oleh konsumen, lebih aman dan dan tidak membutuhkan tes keamanan yang sesuai oleh undang-undang (Bera, 2006).

Piper sarmentosum Roxb. atau daun dudu merupakan salah satu tanaman dalam famili Piperaceceae. Hasil penelitian yang dilakukan Chanwitheesuk (2004) menunjukan bahwa ekstrak tanaman Piper sarmentosum Roxb. dengan pelarut aseton : metanol : air (7:7:6 v/v/v) memiliki kandungan fenolik 123± 0,12 mg%. Senyawa fenol berfungsi sebagai

2

antioksidan karena kemampuannya menangkap radikal bebas dan radikal peroksida sehingga efektif menghambat peroksida lipid (Kinsell, et al., 1993).

Pemilihan fraksi etil asetat didasarkan pada kemampuannya dalam menarik senyawa-senyawa yang bersifat kurang polar sehingga memudahkan untuk mendapatkan senyawa-senyawa flavonoid (Ritna, 2016). Flavonoid yang terkandung dalam daun dudu merupakan senyawa fenolik yang bersifat kurang polar sehingga dengan penyari etil asetat diharapkan senyawa flavonoid yang terkandung dapat terambil secara optimal. Sedangkan pemilihan ekstrak metanol didasarkan pada jurnal Suryanto (2009), yang menyatakan bahwa kandungan total fenolik metanol dapat menarik lebih banyak senyawa metabolit dibandingkan etanol dan aseton.

Penelitian ini menggunakan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu. Hal ini didasarkan pada hasil penelitian yang dilakukan oleh Risdian (2011) yang menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun Piper betle L. memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi ditunjukan dengan tingginya kandungan fenolik total dan rendahnya nilai IC50 yang

diukur dengan metode DPPH dibandingkan pada ekstrak etanol, fraksi heksan, fraksi butanol, dan fraksi air (Risdian, et al., 2011).

Salah satu metode dalam mengukur nilai aktivitas antioksidan adalah metode Ferric thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric acid (TBA). Metode FTC merupakan metode yang dapat digunakan untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lipid dilanjutkan dengan menggunakan metode TBA yang dapat digunakan untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang ada setelah oksidasi peroksida (Sonia, 2013).

METODE PENELITIAN

Bahan penelitian yang digunakan adalah daun dudu segar yang diperoleh dari Merapi Farma, metanol teknis, metanol p.a. 99,6%, akuades, etanol 75%, etanol p.a. 99,6%, etil asetat p.a., asam galat p.a, buffer fosfat 0,05M (pH 7), natrium karbonat (Na2CO3) 1M,

reagen Folin-Ciocalteu, besi klorida (FeCl3) 0,02M, amonium tiosianat 30%, asam linoleat

2,5%, larutan asam trikloroasetat (TCA) 10%, larutan tiobarbiturat 0,67%, dan alfa tokoferol p.a.

Alat penelitian yang digunakan adalah pisau stainless steel, blender, oven, neraca analitik,

3

saring, vortex, spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1240), mikropipet, tabung sentrifuge, desikator, dan alat-alat gelas.

Tata cara penelitian :

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman dudu dilakukan di Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

2. Preparasi daun sirih dudu

Daun dudu dilakukan sortasi basah untuk membersihkan kotoran-kotoran dan bahan asing lainnya yang terbawa pada waktu panen, kemudian dicuci dengan cara dialiri air sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada daun. Pencucian dilakukan hingga daun bersih. Daun dudu dirajang kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu 60oC. Posisi daun dudu tidak boleh saling menumpuk dan harus sering dibalik agar pengeringan merata. Pengeringan dianggap selesai apabila daun sudah dapat pecah atau patah apabila diremas. Setelah itu, daun dudu dibuat menjadi serbuk dengan blender, kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 50.

3. Pembuatan ekstrak daun dudu

Serbuk simplisia daun dudu dimaserasi dengan metanol teknis hingga simplisia terendam sempurna. Maserasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ruangan sambil dilakukan penggojokan secara otomatis dengan menggunakan orbital shaker. Setelah 3 hari dimaserasi, filtrat disaring dengan corong Buchner dibantu oleh pompa vakum dan ampasnya diremaserasi dengan metanol teknis selama 2 hari lalu disaring. Penyari pada filtrat dihilangkan dengan cara diuapkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 60oC. Kemudian diuapkan kembali dengan menggunakan waterbath untuk diperoleh ekstrak kental. Setelah itu, dilakukan penimbangan bobot tetap untuk memastikan ekstrak bebas dari penyari.

4. Fraksinasi

Ekstrak kental yang diperoleh difraksinasi menggunakan metode ekstrak cair-cair. Ekstrak kental dilarutkan dalam akuades hangat, kemudian difraksinasi menggunakan etil asetat dengan perbandingan akuades : etil asetat 1:1 v/v di dalam corong pisah. Terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan air dan lapisan etil asetat. Lapisan etil asetat (bagian atas) diambil dan ditampung dalam wadah sedangkan lapisan air (bagian bawah) difraksinasi kembali menggunakan etil asetat dengan perbandingan yang sama. Tahapan ini diulang hingga fraksi jernih. Fraksi etil asetat kemudian

4

dipekatkan menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 60oC. Fraksi etil asetat pekat kemudian diuapkan menggunakan waterbath untuk menghilangkan sisa penyari, dilanjutkan dengan penimbangan bobot tetap. Fraksi etil asetat yang sudah bebas dari penyari kemudian disimpan dalam desikator.

5. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteau Uji kontrol positif asam galat ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dimasukkan kedalam labu takar 10 ml dan ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) hingga tanda batas, kemudian diambil konsentrasi 1,0 mL lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi selanjutnya ditambahkan 2 mL reagen Folin-Ciocalteau dan diinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 4 mL larutan Na2CO3 kemudian didiamkan selama operating

time yang telah ditentukan sebelumnya. Pembuatan kontrol negatif sama seperti pembuatan kontrol positif tanpa penambahan asam galat, tetapi menggunakan larutan metanol : air (1:1).

Uji sampel dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL metanol:air (1:1) sehingga didapatkan konsentrasi larutan stok 1 mg/mL. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet dicampur dalam 2 mL reagen Folin-Ciocalteu dan diinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 4 mL larutan Na2CO3 1M kemudian didiamkan selama operating time yang telah

ditentukan sebelumnya.

6. Penetapan kandungan fenolik total

Larutan sampel dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL metanol:air (1:1) sehingga didapatkan konsentrasi larutan stok 1 mg/mL. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet dicampur dalam 2 mL reagen Folin-Ciocalteu dan diinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 4 mL larutan Na2CO3 1M kemudian didiamkan selama

operating time yang telah ditentukan sebelumnya, yaitu 70 menit dan dibaca pada panjang gelombang 748 nm, yang merupakan hasil dari penentuan panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali. Kurva baku asam galat dibuat dengan konsentrasi 40; 50; 60; 70; dan 80 µg/mL. Hasil dinyatakan sebagai mg ekuivalen asam galat per gram ekstrak.

5

7. Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC (Ferri-Tiosianat) a. Pembuatan larutan A kontrol positif dan kontrol negatif

Kontrol positif yang digunakan adalah alfa tokoferol. Sebanyak 4 mg alfa tokoferol ditimbang kemudian dilarutkan dalam 4 ml etanol absolut dalam tabung reaksi tertutup. Kemudian ditambahkan 4,1 mL asam linoleat 2,5%, 8 mL buffer fosfat (pH 7) 0,05 M, dan 3,9 mL akuades. Larutan tersebut diinkubasi dalam oven dengan suhu 40oC selama 24 jam. Pembuatan kontrol negatif sama seperti pembuatan kontrol positif tanpa penambahan alfa tokoferol.

b. Pembuatan larutan A sampel

Larutan sampel dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat daun dudu sebanyak 4 mg kemudian dilarutkan dalam 4 mL etanol absolut dalam tabung reaksi bertutup. Kemudian ditambahkan 4,1 mL asam linoleat 2,5%, 8 mL buffer fosfat (pH 7) 0,05 M, dan 3,9 mL akuades. Lalu diberi label dan dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Larutan tersebut diinkubasi dalam oven dengan suhu 40oC selama 24 jam.

c. Pengujian antioksidan

Dibuat larutan B untuk masing-masing larutan A kontrol positif, kontrol negatif, dan sampel untuk pengujian antioksidan dengan mencapur 9,7 mL etanol 75% dan 0,1 mL ammonium tiosianat 30% dalam tabung sentrifuge. Masing-masing larutan A kontrol positif, kontrol negatif, dan sampel yang telah diinkubasi selama 24 jam diambil sebanyak 100 µL dan ditambahkan ke dalam larutan B. Larutan tersebut di vortex kemudian ditambahkan 100 µL FeCl3 0,02 M dalam HCL 3,5% dan di vortex

kembali sampai homogen. Larutan tersebut didiamkan selama operating time yang telah ditentukan sebelumnya, yaitu 5 menit, kemudian diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 468 nm, yang merupakan hasil dari penentuan panjang gelombang maksimum. Pengukuran dilakukan setiap 24 jam selama beberapa hari hingga larutan kontrol negatif jenuh yang ditunjukkan dengan menurunnya nilai absorbansi (dalam penelitian ini, inkubasi dilakukan selama 7 hari).

8. Uji aktivitas antioksidan dengan metode TBA (asam tiobarbiturat)

Larutan sampel dan larutan standar yang digunakan pada metode FTC pada hari terakhir diambil sebanyak 2 mL dan ditambahkan 1 mL asam trikloroasetat 20% dan 2 mL larutan asam tiobarbiturat 0,67%. Setelah didihkan selama 10 menit. Larutan tersebut kemudian disentrifuge pada kecepatan 3.000 rpm selama 30 menit. Absorbansi supernatan dibaca pada panjang gelombang 468 nm dengan spektrofotometer visibel.

6

9. Analisis statistik

Hasil dari kontrol positif, kontrol negatif dan sampel dilakukan replikasi sebanyak tiga kali dan data ditunjukan dalam rata-rata ± SD. Uji statistik data dilakukan dengan metode One Sample T-test dan independent sampel T-test untuk data terdistribusi normal, menggunakan program PSPP untuk menentukan signifikansi perbedaan pada level p<0,05.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Bahan yang digunakan untuk penelitian adalah daun dudu (Piper sarmentosum Roxb.) yang diperoleh dari Merapi Farma, Kaliurang, Yogyakarta. Determinasi tanaman (Lampiran 1) dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta (UGM).

Dari percobaan kandungan fenolik didapat absorbansi kurva baku asam galat, sehingga diketahui kandungan fenolik total dalam ekstrak uji, diperoleh persamaan regresi y = 0,0063x + 0,1114. Hasil perhitungan menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu memiliki nilai kandungan fenolik total sebesar 205,6073 ± 5,7823 mg ekivalen asam galat per gram sampel. Pada tabung larutan uji menunjukan perubahan warna menjadi biru yang menandakan terdapat fenol pada ekstrak.

Table I. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu

Absorbansi Rata-rata ± SD

(mg ekivalen asam galat (GAE) per gram fraksi etil asetat daun dudu)

Replikasi 1 0,349

205,6073 ± 5,7823 Replikasi 2 0,358

Replikasi 3 0,334

Penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu, larutan menunjukan warna biru setelah ditambah reagen Folin-Ciocalteu dan larutan Na2CO3

yangmenghasilkan warna biru, bahwa terdapat senyawa fenolik yang terkandung di dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu.

Penelitian lain menurut Dewi (2016) yang mengukur kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak daun lada, Rosari (2016) yang mengukur kandungan fenolik total fraksi etil

7

asetat ekstrak daun kumukus, dan Jesmile (2016) yang mengukur kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak daun cabe jawa, menemukan jumlah kandungan fenolik total fraksi ekstrak masing-masing sebesar secara beturut turut 133,83 ± 5,4365; 155,157 ± 5,642; 140,43 ± 5,1219 mg GAE per gram, dari hasil tersebut menunjukan daun dudu memiliki kandungan rata-rata fenolik total fraksi etil asetat ekstrak yang lebih tinggi yaitu 205,6073 ± 5,7823 mg GAE per gram.

Hasil uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC dilakukan selama 7 hari hingga kontrol negatif menunjukan absorbansi yang maksimum dan membentuk warna merah pekat pada larutan uji. Hal ini menandakan bahwa proses peroksidasi lipid asam linoleat sudah berjalan secara maksimal. Pengukuran absorbansi kontrol negatif, kontrol positif dan sampel dilakukan selama tujuh hari dengan rentang waktu pembacaan sampel 24 jam. Absorbansi maksimal kontrol negatif dicapai pada hari kelima, menandakan proses peroksidasi telah berjalan maksimal dan semakin banyak peroksida.

Gambar 1. Profil absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel selama 7 hari dengan metode FTC

Dari (Gambar 1) menunjukan mekanisme reaksi di mana nilai absorbansi kontrol negatif lebih tinggi dibandingkan nilai absorbansi kontrol positif dan sampel. Hal ini disebabkan tidak adanya senyawa antioksidan pada kontrol negatif yang dapat menghambat proses peroksidasi lipid, sehingga ion Fe3+ yang terbentuk semakin banyak dan warna merah akibat pembentukan kompleks ferri-tiosianat lebih pekat dibandingkan kontrol positif yang berisi alfa tokoferol dan sampel yang berisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu.

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

1 2 3 4 5 6 7

A b sor b an si Hari ke- Kontrol Negatif Kontrol Positif

Fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu

8

Pada pengukuran hari kelima, saat proses peroksidasi lipid sudah berjalan secara maksimal, kontrol positif yang berisi alfa tokoferol menunjukan nilai persen inhibisi yang lebih besar dibandingkan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu, yaitu sebesar 35,0590 ± 1,6836 %, sementara fraksi etil asetat ekstrak metanol memiliki nilai persen inhibisi sebesar 22,9177 ± 1,5566 %. Secara statistik nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna (p<0,05). Hal tersebut menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu kurang mampu menghambat peroksidasi yang terbentuk dibandingkan alfa tokoferol yang merupakan antioksidan sintetis. Namun fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu tetap memiliki aktivitas antioksidan yang mampu menghambat proses peroksidasi lipid, ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang lebih kecil dibandingkan kontrol negatif.

Table II. Nilai persen inhibisi sampel dengan metode FTC

Bahan uji Replikasi Absorbansi %inhibisi Rata-rata %I ± SD Alfa-tokoferol 1 2,0100 36,4185

35,0590 ± 1,6836 2 2,1280 32,6859

3 2,0210 36,0706 FEA Sirih dudu 1 2,3690 25,0624

22,9177 ± 1,5566 2 2,4571 22,2756

3 2,4843 21,4152

*Absorbansi kontrol (-) : 3,1613

Setelah dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode FTC, dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode TBA. Metode TBA digunakan untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang ada setelah oksidasi peroksida.

Penelitian lain menurut Dewi (2016) yang mengukur kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak daun lada, Rosari (2016) yang mengukur kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak daun kumukus, dan Jesmile (2016) yang mengukur kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak daun cabe jawa yang masing-masing menggunakan metode FTC menghasilkan hasil secara berturut-turut sebesar 5,061 ± 0,5980; 9,378 ± 0,2630; 2,1888 ± 0,3246 mg GAE per gram, dari hasil tersebut menunjukan fraksi etil asetat ekstrak daun dudu memiliki kandungan rata-rata yang lebih tinggi yaitu 22,9177 ± 1,5566 mg GAE per gram.

Pada hari kedelapan setelah pengujian dengan metode FTC selama tujuh hari, dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode TBA untuk mengukur nilai

9

penghambatan MDA, produk oksidasi sekunder yang terbentuk setelah tahap pertama peroksidasi lipid. Produk sekunder seperti malonaldehyde tidak stabil untuk jangka waktu yang panjang karena akan berubah menjadi alkohol atau asam, yang mana tidak dapat dideteksi oleh spektrofotometer dan kontrol positif dapat teroksidasi jika disimpan pada waktu yang lama (dalam penelitian ini selama tujuh hari) (Huda-Faujan et al, 2009) sehingga dalam penelitian dilakukan uji TBA pada hari kedelapan. Pada hari kelima, jumlah peroksida yang terbentuk sudah mulai stabil, ditunjukkan dengan menurunnya nilai absorbansi kontrol negatif. Hal tersebut disebabkan karena pembentukan senyawa MDA dari asam linoleat.

Tujuan dilakukannya pengukuran antioksidan dengan metode TBA ini untuk mengetahui banyaknya senyawa MDA yang terbentuk, dimana senyawa ini merupakan turunan senyawa peroksida yang terbentuk pada tahap kedua reaksi peroksidasi lemak. Sehingga diharapkan hasil uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC dapat dikonfirmasikan dengan hasil TBA. Sama seperti metode FTC, semakin rendah absorbansinya maka menunjukkan aktivitas antioksidan yang semakin meningkat. Adapun hasil pengukuran rata-rata dengan metode TBA menunjukkan bahwa FEA daun dudu memiliki daya hambat MDA yang sedikit lebih besar daripada kontrol positif (Tabel III).

Aktivitas antioksidan yang terdeteksi dengan metode TBA lebih tinggi dibandingkan dengan FTC. Hal ini dapat disebabkan karena peroksida yang terbentuk pada tahap awal peroksidasi lipid jumlahnya lebih kecil dibandingkan pada jumlah turunan senyawa peroksida yang terbentuk pada tahap kedua. Selain itu produk turunan malonaldehida yang terbentuk lebih stabil pada beberapa waktu (Aqil et al, 2006).

Table III. Aktivitas antioksidan sampel dengan metode TBA

Bahan uji Replikasi Absorbansi %inhibisi Rata-rata %I ± SD

Alfa tokoferol

1 0,161 84,9251

83,8951 ± 0,8055 2 0,182 82,9588

3 0,173 83,8015

FEA Sirih dudu

1 0,040 96,2547

96,6916 ± 0,3848 2 0,030 97,1910

3 0,036 96,6292

Pada Tabel III. menunjukan bahwa nilai persen inhibisi fraksi ekstrak metanol daun dudu 96,6916 ± 0,3848 %, sedangkan nilai persen inhibisi alfa tokoferol sebesar 83,8951 ± 0,8055 %. Secara statistik, nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna (p<0,05). Hal tersebut menunjukan bahwa pada tahap kedua peroksidasi lipid, aktivitas

10

penghambatan MDA oleh fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu lebih besar dibandingkan penghambatan peroksida pada tahap pertama peroksida lipid.

Penelitian lain menurut Dewi (2016) yang mengukur kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak daun lada, Rosari (2016) yang mengukur kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak daun kumukus, dan Jesmile (2016) yang mengukur kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak daun cabe jawa yang masing-masing menggunakan metode TBA menghasilkan hasil secara berturut-turut sebesar 93,19 ± 2,2450; 90,942 ± 0,7500; 90,2098 ± 0,9083 mg GAE per gram, fraksi etil asetat daun dudu menunjukan hasil 96,6916 ± 0,3848 mg GAE per gram memiliki kandungan rata-rata %Inhibisi yang lebih tinggi atau memiliki presentasi hambatan yang tinggi untuk menghambat senyawa radikal bebas.

Metode FTC dan TBA memiliki kelemahan yaitu hanya mampu menunjukan aktivitas antioksidan dengan hasil persen penghambatan peroksida. Metode ini tidak dapat menunjukan pada konsentrasi berapa sampel yang diuji mampu menghambat radikal bebas secara efektif karena banyak penelitian yang menunjukan kosentrasi yang berbeda-beda.

11 KESIMPULAN DAN SARAN

Kandungan fenolik total per gram sampel pada fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu sebesar 205,6073 ± 5,7823 mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu yang dinyatakan dalam persen inhibisi untuk metode FTC dan metode TBA berturut-turut sebesar 22,9177 ± 1,5566 %, 96,6916 ± 0,3848 %. Hasil tersebut menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu memiliki potensi sebagai antioksidan.

Saran untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan penambahan jumlah replikasi sampel untuk mengatasi masalah ketidakakuratan pembacaan absorbansi dengan metode FTC akibat kelemahan dalam pembentukan kompleks warna dan melakukan pengujian FTC lebih dari tujuh hari atau lebih hingga mendapatkan hasil nilai kontrol negatif yang turun.

12 Daftar Pustaka

Agarwal, A., Thompson, A., Kothari, S., Plessis, Stefan, S., 2010. Free radical : Their Beneficial and Detrimental Effects on Sperm Function, Indianjournal of experimental biology., 48, 425-435.

Bera, D., Lahiri, D., Nag, A., 2006. Studies on a Natural Antioxidant for Stabilization of Edible Oil and Comparison with Synthetic Antioxidants. Journal of Food Engineering., 74, 542-545.

Borza, C., Muntean, D., Dehelean, C., Germaine, S., 2013. Oxidative Stress and Lipid Peroxidation – A lipid Metabolism Dysfunction. Licensee InTech., 25-26.

Chanwitheesuk, A., Teerawutgulrag, A., & Rakariyatham, N., 2004. Screening of Antioxidant Activity and Antioxidant Compounds of Some Edible Plants of Thailand.

Food Chemistry., 92, 491-497.

Cowan, M.M., 1999. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology Review., 12 (4), 564-582.

Dewi, Y.R.K., 2016. Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Lada (Piper nigrum L.). Yogyakarta, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, 9-13.

Hery , W., 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Kanisius, Yogyakarta, 20-21.

Jesmile, V., 2016. Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Cabe Jawa (Piper retrofractum Vahl.). Yogyakarta,

Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, 9-12.

Kinsella, J.E., Frankel, E., German, B., & Kanner, J., 1993. Possible Mechanisms for the Protective Role of Antioxidants in Wine and Plant Foods. Food Technology., 47, 85-89.

Lin, C.C., Wu, S.J., Chang, C.H., Ng, L.T., 2005. Antioxidant Activity of Cinnamomum cassia. Phytoter Res., 17, 726.

Purnomo, M., 2011. Asam Laktat dan Aktivitas SOD Eritrosit Pada Fase Pemulihan Setelah Latihan Submaksimal. Jurnal Media Ilmu Keolahragaan Indonesia., 1(2), 155-157.

13

Risdian, C., Widowati, W., Mozet, T., Wargasetia, T.L., dan Khong, K., 2011, Free Radical Scaveging Activity of Ethanolic Leaves Extract and Its Different Solvent Fractions of

Piper betle L. In Vitro, Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention, 2(1): 141-145.

Ritna, A., Anam, S., Khumaidi, A., 2016. Identification of Flavonoid Compounds in Ethyl Acetate Fraction of Benalu Batu (Beyonia sp.) Originated from North Morowali Regency. Galenika Journal of Pharmacy., 2, 83-89.

Rosari, M.I., 2016. Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Kumukus (Piper cubeba L.). Yogyakarta, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, 9-14.

Sies, H., 1997. Oxidative Stress: Oxidants and Antioxidants. Exp Physiol., 82, 291-295.

Sonia, S., 2013. Evaluation of In Vitro Antioxidant Properties Of Methanol and Aqueous Extracts of Parkinsonia Aculeata L. Leaves. Hindawi Publishing Corporation The Scientific World Journal., 4-5.

Soong, Y-Y., 2004. Antioxidant Activity and Phenolic Content of Selected Fruit Seeds. Food Chemistry., 8, 411-417.

Suryanto, E., dan Mehantouw, F., 2009. Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas dari Ekstrak Fenolik Daun Sukun (Artocarpus altilis F.). Chem. Prog., 2(1), 1-7.

14

15 Lampiran 1. Surat determinasi tanaman

16 Lampiran 2. Gambar daun dudu

Daun dudu Bunga dan Buah dudu Lampiran 3. Perhitungan pengujian kadar air serbuk simplisia daun dudu

X 100% a. Replikasi 1

Bobot awal = 5,019 gram Bobot akhir = 4,558 gram % Kadar air = 9,185% b. Replikasi 2

17

Bobot akhir = 4,558 gram % Kadar air = 9,203% c. Replikasi 3 Bobot awal = 5,011 gram Bobot akhir = 4,545 gram % Kadar air = 9,229%

Keterangan Kadar Air (%) Rata-rata Replikasi 1 9,185

Replikasi 2 9,203 9,205

Replikasi 3 9,229

Lampiran 4. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteau

A B C

Keterangan :

A = Kontrol positif (asam galat + reagen Folin-Ciocalteu + Na2CO3)

B = Kontrol negatif (metanol : air (1:1) + reagen Folin-ciocalteau + Na2CO3)

C = Sampel (fraksi etil asetat ekstrak methanol daun sirih dudu + reagen Folin-Ciocalteau + Na2CO 3)

Lampiran 5. Perhitungan rendemen ekstrak dan fraksi a. Ekstrak methanol daun sirih dudu

Bobot (gram) Bobot simplisia yang

digunakan

18

Bobot cawan kosong 59,2074 Bobot cawan + ekstrak 61,3887 Bobot ekstrak 2,1813

% rendemen fraksi =

X 100%

% rendemen fraksi =

x 100% = 5,3998%

b. Fraksi etil asetat daun sirih dudu

Bobot (gram) Bobot simplisia yang digunakan 40,3952 Bobot cawan kosong 60,2067 Bobot cawan + fraksi etil asetat 62,4436 Bobot fraksi etil asetat 2,2369

% rendemen fraksi =

X 100%

% rendemen fraksi =

x 100% = 5,5375%

Lampiran 6. Data penimbangan untuk penetapan kandungan fenolik total

a. Penimbangan asam galat (larutan stok)

Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram) Bobot gelas beker 62,4312 62,4311 62,5062

Bobot gelas beker + isi

62,4412 62,4411 62,5162

Bobot zat 0,01 0,01 0,01 b. Penimbangan fraksi etil asetat

Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram) Bobot gelas beker 62,4329 62,4378 62,4294

Bobot gelas beker + isi

62,4428 62,4478 62,4394

19

Lampiran 7. Data perhitungan konsentrasi asam galat dan fraksi etil asetat untuk penetapan kandungan fenolik total

a. Contoh perhitungan konsentrasi asam galat replikasi 1 Bobot asam galat replikasi 1 = 0,0101 g = 10,1 mg

Konsentrasi larutan stok asam galat

= 1010 µg/mL

Perhitungan seri konsentrasi replikasi 1 Seri 1 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,4 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 40,4 µg/mL

Seri 2 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,5 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 50,5 µg/mL

Seri 3 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,6 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 60,6 µg/mL

Seri 4 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,7 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 70,7 µg/mL

Seri 5 :

V1 . C1 = V2 . C2

0,8 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 80,8 µg/mL

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Seri 1 40,4 µg/mL 40 µg/mL 40,4 µg/mL Seri 2 50,5 µg/mL 50 µg/mL 50,5 µg/mL Seri 3 60,6 µg/mL 60 µg/mL 60,6 µg/mL Seri 4 70,7 µg/mL 70 µg/mL 70,7 µg/mL

20

Seri 5 80,8 µg/mL 80 µg/mL 80,8 µg/mL b. Contoh perhitungan konsentrasi fraksi etil asetat

Bobot fraksi etil asetat replikasi 1 = 0,0100 gram = 1000 µg/mL Pengenceran fraksi etil asetat replikasi 1

V1 . C1 = V2 . C2

2 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 200 µg/mL

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi fraksi 200 µg/mL 200 µg/mL 200 µg/mL

Lampiran 8. Hasil optimasi operating time untukn penetapan kandungan fenolik total a. Replikasi 1

Menit ke- Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL 5 0.380 1.351 1.803 10 0.557 1.361 1.931 15 0.547 1.264 1.864 20 0.514 1.171 1.743 25 0.474 0.997 1.349 30 0.451 0.927 1.219 35 0.427 0.863 1.191 40 0.414 0.817 1.045 45 0.408 0.793 0.990 50 0.396 0.745 0.945 55 0.387 0.725 0.899 60 0.381 0.688 0.864 65 0.378 0.661 0.840 70 0.377 0.659 0.838 Pada replikasi 1, operating time didapat adalah 70 menit

b. Replikasi 2

Menit ke- Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL 5 0.307 1.009 1.049 10 0.634 1.404 1.110

21

15 0.485 1.403 0.947 20 0.381 1.241 0.850 25 0.361 1.195 0.816 30 0.332 1.082 0.793 35 0.320 0.966 0.757 40 0.305 0.942 0.719 45 0.298 0.869 0.705 50 0.291 0.792 0.682 55 0.286 0.774 0.679 60 0.283 0.716 0.665 65 0.280 0.697 0.658 70 0.279 0.695 0.655 Pada replikasi 2, operating time yang didapat adalah 70 menit

c. Replikasi 3

Menit ke- Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm

40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL

5 0.298 1.076 1.455 10 0.400 1.212 1.585 15 0.472 1.124 1.502 20 0.475 0.841 0.999 25 0.474 0.752 0.963 30 0.469 0.705 0.919 35 0.462 0.672 0.870 40 0.458 0.649 0.812 45 0.457 0.623 0.771 50 0.454 0.609 0.764 55 0.452 0.587 0.743 60 0.447 0.584 0.730 65 0.443 0.570 0.718 70 0.441 0.568 0.716 Pada replikasi 3, operating time yang didapat adalah 70 menit

22

Lampiran 9. Optimasi panjang gelombang maksimum untuk penetapan kandungan fenolik total

a. Konsentrasi 40 µg/mL

23

c. Konsentrasi 80 µg/mL

Lampiran 10. Hasil pengukuran kurva baku untuk penetapan kandungan fenolik total

a. Replikasi 1

seri Konsentrasi Absorbansi Persamaan kurva baku 1 40 µg/ml 0.324 y = 0.00777x + 0.0526

r = 0.9658 2 50 µg/ml 0.480

3 60 µg/ml 0.548 4 70 µg/ml 0.579 5 80 µg/ml 0.663 b. Replikasi 2

seri Konsentrasi Absorbansi Persamaan kurva baku 1 40 µg/ml 0.307 y = 0.00856x + 0.005

r = 0.9783 2 50 µg/ml 0.469

3 60 µg/ml 0.508 4 70 µg/ml 0.579 5 80 µg/ml 0.680

c. Replikasi 3

24

1 40 µg/ml 0.349 Y = 0.00663x + 0.1114 r = 0.9668

2 50 µg/ml 0.474 3 60 µg/ml 0.532 4 70 µg/ml 0.547 5 80 µg/ml 0.644

Lampiran 11. Perhitungan kandungan fenolik total fraksi etil asetat

Konsentrasi Absorbansi Kandungan fenolik total

Rata-rata %CV

Replikasi 1 200 µg/mL 0,349 179,185

177,677 ± 7,4658

4,2% Replikasi 2 200 µg/mL 0,358 185,973

Replikasi 3 200 µg/mL 0,334 167,873

Lampiran 12. Data penimbangan untuk optimasi operating time uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC

a. Penimbangan α-tocopherol Bobot gelas beker = 62, 4973 Bobot gelas beker + isi = 62, 4933 Bobot zat = 0,0040

Lampiran 13. Hasil optimasi operating time untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC

Hasil OT, Calfa-tokoferol = 4 mg

Menit ke Absorbansi

Pengukuran 1 Pengukuran 2 Pengukuran 3 1 3.311 3.311 3.436

3 3.436 3.214 3.311 5 3.214 3.311 3.436 7 3.311 3.311 3.436 10 3.311 3.436 3.436

25

Lampiran 14. Data penimbangan untuk optimasi panjang gelombang maksimum uji antioksidan dengan metode FTC

a. Penimbangan α-tochoperol (control positif)

Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram) Bobot gelas beker

61,5081 61,7617 63,6569

Bobot gelas beker + isi

61,5121 61,7657 63,6609

Bobot isi 0,0040 0,0040 0,0040

Lampiran 15. Hasil optimasi panjang gelombang untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC

Dibuat lima seri :

Seri Panjang gelombang / Absorbansi

5 468 / 3,239 √

7,5 445 / 3,053

10 530 / 3,229

12,5 463 / 3,101

15 509 / 3,031

Lampiran 16. Data penimbangan untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC-TBA

a. Penimbangan α-tocopherol (kontrol positif)

Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram) Bobot beker 61,4654 62,4275 61,0764 Bobot beker

+ isi

61,4694 62,4315 61,0804

26

b. Penimbangan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram) Bobot beker 27,9589 27,7332 27,5955 Bobot beker

+ isi

27,9629 27,7372 27,5995

Bobot zat 0,0040 0,0040 0,0040

Lampiran 17. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC

a. Nilai absorbansi kontrol negative, control positif, dan sampel Hari

ke-

kontrol (-) kontrol (+) Sampel

R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 1 2,6350 2,7670 1,8680 1,4460 1,4490 1,7990 1,5440 1,2710 0,8700 2 2,8340 2,8340 2,7670 1,6700 1,9680 1,9840 1,9740 1,9400 1,6150 3 2,9130 3,1350 2,9590 1,8720 2,0560 1,9890 2,2140 2,0810 2,2420 4 3,1350 3,1350 3,1350 2,4360 2,5520 2,0100 2,2410 2,1500 2,4360

5 3,1350 3,2140 3,1350 2,0100 2,1280 2,0210 2,3690 2,4571 2,4843

6 3,1350 3,2140 3,2140 2,7090 2,8720 3,0100 2,7090 2,7090 2,7090 7 3,2140 3,2140 3,2140 3,0680 3,1350 3,2140 2,8720 3,1350 3,1350 b. Rata-rata nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel

kontrol (-) kontrol (+) Sampel Rata-rata ± SD Rata-rata ± SD Rata-rata ±SD 1 2.4233 ±0.3964 1.5647±0.165 1.2283±0.2768 2 2.8117±0.0316 1.8740±0.1444 1.8430±0.1618 3 3.0023±0.0957 1.9723±0.0760 2.1790±0.0702 4 3.1350±0.0000 2.3327±0.2330 2.2757±0.1193

5 3.1613±0.0372 2.0530±0.0320 2.4368±0.0492

6 3.1877±0.0372 2.8637±0.1230 2.6920±0.0240 7 3.2140±0.0000 3.1390±0.0597 3.0473±0.1240

27

c. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode FTC (hari kelima) Persen inhibisi =(A0– A1/A0) x 100%

Absorbansi %inhibisi Rata-rata %I ± SD

Alfa-tokoferol

Replikasi 1

2,0100 36,4192

35,0590 ± 1,6836 Replikasi

2

2,1280 32,6866

Replikasi 3

2,0210 36,0713

FEA Sirih dudu

Replikasi 1

2,3690 25,0624

22,9177 ± 1,5566 Replikasi

2

2,4571 22,2756

Replikasi 3

2,4843 21,4152

Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1 hari ke-1 :

Persen inhibisi =

x 100%

28

d. Grafik absorbansi FTC control negatif, control positif, dan sampel selama tujuh hari

e. Uji statistik FTC

1) Distribusi Normal  Alfa tokoferol

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

1 2 3 4 5 6 7

A

b

sor

b

an

si

Hari ke-

Kontrol Negatif

Kontrol Positif

Fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu

29

 FEA Sirih Dudu

2) uji One sampel T-Test

 Alfa tokoferol

30

3) Uji Independendent Sampel T-Test

Lampiran 18. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode TBA

a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel

kontrol negatif Alfa tokoferol FEA Sirih dudu R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 1,094 1,042 1,068 0,161 0,182 0,173 0,040 0,030 0,036

b. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode TBA

31

Absorbansi %inhibisi Rata-rata %I Alfa

tokoferol

Replikasi 1 0,161 84,9251 83,8951 ± 0,8055 Replikasi 2 0,182 82,9588

Replikasi 3 0,173 83,8015 FEA Sirih

dudu

Replikasi 1 0,040 96,2547 96,6916 ± 0,3848 Replikasi 2 0,030 97,1910

Replikasi 3 0,036 96,6292

Statistik uji TBA :

1) Distribusi Normal  Alfa tokoferol

32

 FEA Sirih dudu

2) uji One sampel T-Test

33

 FEA Sirih dudu

34

Lampiran 19. Gambar larutan kontrol positif, kontrol negatif dan sampel fraksi etil asetat ekstrak methanol daun dudu pada metode FTC setelah penambahan FeCl3

selama 7 hari (tiga kali replikasi)

Gambar 1 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-1

A B C

Gambar 2 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-2

35

Gambar 3 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-3

A B C

Gambar 4 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-4

A B C

Gambar 5 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-5

36

Gambar 6 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-6

A B C

Gambar 7 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-7

A B C

Keterangan :

A. Kontrol positif B. Kontrol negatif

37

Lampiran 20. Gambar larutan uji pada metode TBA

a. Larutan kontrol positif dan kontrol negatif

Kontrol Positif Kontrol Negatif

b. Larutan uji berisi fraksi etil asetat ekstrak methanol daun sirih dudu (tiga kali replikasi)

38

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak metanol Daun Sirih Dudu (Piper sarmentosum Roxb.)” ini memiliki nama lengkap Mario Yedi Mau. Dilahirkan di Dili pada tanggal 29 April 1994 dari pasangan Bapak Yesaya Mau dan Ibu Dina Patadungan. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Silo Kupang pada tahun 1998 hingga 2000, kemudian melanjutkan pendidikan dasar di SD Santa Familia Kupang pada tahun 2000 hingga 2006, pendidikan menengah di SMP Kristen Mercusuar Kupang pada tahun 2006 hingga 2009, dan SMA Kristen Mercusuar Kupang pada tahun 2009 hingga 2012. Penulis kemudian melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2012 hingga 2017. Selama menjadi mahasiswa di Universitas Sanata Dharma, penulis cukup aktif dalam organisasi kepanitian di ruang lingkup fakultas farmasi dengan berbagai jabatan dalam sebuah organisasi.

INTISARI

Senyawa fenolik yang terkandung dalam tanaman, khususnya asam fenolat dan flavonoid, telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan yang dapat menghambat radikal bebas dan peroksidasi lipid. Dudu (Piper sarmentosum

Roxb.) merupakan salah satu tanaman dari famili Piperaceae yang telah diketahui memiliki berbagai kandungan fitokimia yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu (Piper Sarmentosum Roxb.). Penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan untuk pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode Ferric Thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric Acid (TBA) dengan menggunakan Alfa-tokoferol. Jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lemak diukur dengan metode FTC, sedangkan jumlah pada tahap kedua diukur dengan metode TBA. Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu mempunyai kandungan fenolik total sebesar 205,6073 ± 5,7823 mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar 22,9177 ± 1,5566 % dan 96,6916 ± 0,3848 %.

Kata kunci: Dudu, fenolik total, antioksidan, Ferric Thiocyanate (FTC), Thiobarbituric Acid (TBA).

ABSTRACT

Phenolic compounds contained in plants, especially phenolic acid and flavonoid, has been known to have antioxidant activity which can inhibit free radical and lipid peroxidation. Dudu (Piper sarmentosum Roxb.), is a plant in Piperaceae family, has been known to have some phytochemical content that can exhibit potential antioxidant activity. The aims of this research were to measure total phenolic content and antioxidant activity in ethyl acetate fraction of methanol exstract of dudu leaves (Piper sarmentosum Roxb.) Total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu method mean while antioxidant activity were measured by ferric thiocyanat (FTC) method and thiobarbituric acid (TBA) using Alfa-tokoferol. Peroxide amount in the first stage of lipid peroxidation were measured by FTC method, meanwhile ferric-thiocyanate complex reaction and to measure peroxide amount in the secound stage of lipid peroxidation were measured by TBA method. The result showed that ethyl acetate fraction of methanol exstract of dudu leaves has a total phenolic content of 205,6073 ± 5,7823 mg gallic acid equivalents (GAE). Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of dudu leaves showed as percent inhibition value were 22,9177 ± 1,5566 % and 96,6916 ± 0,3848 % for FTC and TBA method respectively.

Keywords: Dudu, phenolic total, antioxidant, Ferric thiocyanat (FTC), Thiobarbituric Acid (TBA).

35

Gambar 3 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-3

A B C

Gambar 4 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-4

A B C

Gambar 5 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-5

36

Gambar 6 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-6

A B C

Gambar 7 : sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun sirih dudu hari ke-7

A B C

Keterangan :

A. Kontrol positif B. Kontrol negatif

37

Lampiran 20. Gambar larutan uji pada metode TBA

a. Larutan kontrol positif dan kontrol negatif

Kontrol Positif Kontrol Negatif

b. Larutan uji berisi fraksi etil asetat ekstrak methanol daun sirih dudu (tiga kali replikasi)

38

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak metanol Daun Sirih Dudu (Piper sarmentosum Roxb.)” ini memiliki nama lengkap Mario Yedi Mau. Dilahirkan di Dili pada tanggal 29 April 1994 dari pasangan Bapak Yesaya Mau dan Ibu Dina Patadungan. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Silo Kupang pada tahun 1998 hingga 2000, kemudian melanjutkan pendidikan dasar di SD Santa Familia Kupang pada tahun 2000 hingga 2006, pendidikan menengah di SMP Kristen Mercusuar Kupang pada tahun 2006 hingga 2009, dan SMA Kristen Mercusuar Kupang pada tahun 2009 hingga 2012. Penulis kemudian melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2012 hingga 2017. Selama menjadi mahasiswa di Universitas Sanata Dharma, penulis cukup aktif dalam organisasi kepanitian di ruang lingkup fakultas farmasi dengan berbagai jabatan dalam sebuah organisasi.

INTISARI

Senyawa fenolik yang terkandung dalam tanaman, khususnya asam fenolat dan flavonoid, telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan yang dapat menghambat radikal bebas dan peroksidasi lipid. Dudu (Piper sarmentosum

Roxb.) merupakan salah satu tanaman dari famili Piperaceae yang telah diketahui memiliki berbagai kandungan fitokimia yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu (Piper Sarmentosum Roxb.). Penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan untuk pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode Ferric

Thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric Acid (TBA) dengan menggunakan

Alfa-tokoferol. Jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lemak diukur dengan metode FTC, sedangkan jumlah pada tahap kedua diukur dengan metode TBA. Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu mempunyai kandungan fenolik total sebesar 205,6073 ± 5,7823 mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar 22,9177 ± 1,5566 % dan 96,6916 ± 0,3848 %.

Kata kunci: Dudu, fenolik total, antioksidan, Ferric Thiocyanate (FTC), Thiobarbituric Acid (TBA).

ABSTRACT

Phenolic compounds contained in plants, especially phenolic acid and flavonoid, has been known to have antioxidant activity which can inhibit free radical and lipid peroxidation. Dudu (Piper sarmentosum Roxb.), is a plant in Piperaceae family, has been known to have some phytochemical content that can exhibit potential antioxidant activity. The aims of this research were to measure total phenolic content and antioxidant activity in ethyl acetate fraction of methanol exstract of dudu leaves (Piper sarmentosum Roxb.) Total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu method mean while antioxidant activity were measured by ferric thiocyanat (FTC) method and thiobarbituric acid (TBA) using Alfa-tokoferol. Peroxide amount in the first stage of lipid peroxidation were measured by FTC method, meanwhile ferric-thiocyanate complex reaction and to measure peroxide amount in the secound stage of lipid peroxidation were measured by TBA method. The result showed that ethyl acetate fraction of methanol exstract of dudu leaves has a total phenolic content of 205,6073 ± 5,7823 mg gallic acid equivalents (GAE). Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of dudu leaves showed as percent inhibition value were 22,9177 ± 1,5566 % and 96,6916 ± 0,3848 % for FTC and TBA method respectively.

Keywords: Dudu, phenolic total, antioxidant, Ferric thiocyanat (FTC), Thiobarbituric Acid (TBA).