Pemanfaatan Rizobakteri yang Diisolasi dari Rizosfer Tanaman Leguminosae untuk Mengendalikan Penyakit Rebah Kecambah pada Tanaman Kedelai.

1

TESIS

PEMANFAATAN RIZOBAKTERI YANG DIISOLASI

DARI RIZOSFER TANAMAN LEGUMINOSAE

UNTUK MENGENDALIKAN PENYAKIT REBAH

KECAMBAH PADA TANAMAN KEDELAI

KOMANG ADI MAHARTHA

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

2016

i

TESIS

PEMANFAATAN RIZOBAKTERI YANG DIISOLASI

DARI RIZOSFER TANAMAN LEGUMINOSAE

UNTUK MENGENDALIKAN PENYAKIT REBAH

KECAMBAH PADA TANAMAN KEDELAI

KOMANG ADI MAHARTHA NIM 1490861001

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

ii

PEMANFAATAN RIZOBAKTERI YANG DIISOLASI

DARI RIZOSFER TANAMAN LEGUMINOSAE

UNTUK MENGENDALIKAN PENYAKIT REBAH

KECAMBAH PADA TANAMAN KEDELAI

Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister

Pada Program Magister, Program Studi Bioteknologi Pertanian, Program Pascasarjana Universitas Udayana

KOMANG ADI MAHARTHA NIM 1490861001

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

iii

LEMBAR PENGESAHAN

TESIS INI TELAH DISETUJUI TANGGAL 20 JUNI 2016

Pembimbing I,

Prof. Dr. Ir. Dewa Ngurah Suprapta, M.Sc NIP. 195811281985031003

Mengetahui

Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana

Universitas Udayana,

Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, MP NIP. 196210091988031002

Pembimbing II,

Dr. G. N. Alit Susanta Wirya, S.P., M. Agr NIP. 196801151994031001

Direktur

Program Pascasarjana Unversitas Udayana,

Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S (K) NIP. 195902151985102001

iv

Tesis Ini Telah Diuji pada Tanggal 20 Juni 2016

Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor

Universitas Udayana, No.: 2657/UN14.4/HK/2016, Tanggal: 9 Juni 2016

Ketua : Prof. Dr. Ir. Dewa Ngurah Suprapta, M.Sc Anggota :

1. Dr. G. N. Alit Susanta Wirya, S.P., M. Agr 2. Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, MS

3. Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, MP 4. I Putu Sudiarta, S.P., M.Si, Ph.D

v

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT

Saya yang bertandatangan di bawah ini:

Nama : Komang Adi Mahartha

NIM : 1490861001

Program Studi : Magister Bioteknologi Pertanian

Judul Tesis : Pemanfaatan Rizobakteri yang Diisolasi dari Rizosfer Tanaman Leguminosae untuk Mengendalikan Penyakit Rebah Kecambah pada Tanaman Kedelai

Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah Tesis ini bebas plagiat.

Apabila di kemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan peraturan perundangan-undangan yang berlaku.

Denpasar, 20 Juni 2016 Yang membuat pernyataan

vi

UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa, karena atas segala rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Pemanfaatan Rizobakteri yang Diisolasi dari Rizosfer Tanaman Leguminosae untuk Mengendalikan Penyakit Rebah Kecambah pada Tanaman Kedelai”.

Pada kesempatan ini perkenalkanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Prof. Dr. Ir. Dewa Ngurah Suprapta, M.Sc. selaku pembimbing I yang dengan penuh perhatian telah memberikan dorongan, semangat, bimbingan, dan saran-saran selama penulis mengikuti program Magister, khususnya dalam menyelesaikan tesis ini. Penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih sebesar-besarnya juga kepada Dr. Gusti Ngurah Alit Susanta Wirya, SP., M.Agr selaku pembimbing II atas bimbingan dan arahannya kepada penulis selama melaksanakan penelitian dan menyesaikan tesis.

Ucapan yang sama pula penulis tujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. I Ketut Suastika, Sp.PD-KEMD atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti program Magister di Universitas Udayana. Ucapan terima kasih juga penulis tujukan kepada Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. dr. A. A. Raka Sudewi, Sp.S(K). Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ketua Program Studi Magister Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana yang juga selaku pembimbing akademik penulis, Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, MP atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa

vii

Program Magister Bioteknologi Pertanian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kepala Laboratorium Biopestisida Fakultas Pertanian Unud dan Kepala Kebun Percobaan Fakultas Pertanian Unud atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis selama melakukan penelitian.

Ucapan terima kasih yang tulus penulis sampaikan kepada penguji, yaitu: Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, MS, Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, MP, dan I Putu Sudiarta, S.P., M.Si, Ph.D yang telah banyak memberikan saran, arahan, dan koreksi sehingga tesis ini dapat diselesaikan.

Pada kesempatan ini, penulis juga mengucapkan terima kasih kepada I Ketut Arthana, B.Sc dan Ni Nyoman Lateri, S.Pd selaku orang tua serta kakak Ni Wayan Sri Agustanthi dan Ni Kadek Yulia Arthati yang tercinta, karena atas semua dukungan mereka dalam memberikan doa dan semangat baik itu dalam bentuk material dan motivasi dalam menyelesaikan tesis ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih atas segala bantuan kepada teman-teman Magister Bioteknologi Pertanian Angkatan 2014 dan teman-teman Lab. Biopestisida, yakni Bapak Khamdan Khalimi, SP., M.Si, Bapak Dr. Sang Ketut Sudirga, S.Si, M.Si., Bapak Dr. Drs. A. A. Ketut Darmadi, M.Si., dan Ibu Dr. Ni Luh Suriani, S.Si., M.Si.. Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada seluruh pihak yang telah membantu penulis selama penyelesaian tesis ini, dan semoga tesis ini berguna bagi pembaca.

Denpasar, 20 Juni 2016

viii ABSTRAK

Kedelai (Glycine max L.) merupakan salah satu komoditas penting di Indonesia. Produksi kedelai di Indonesia mengalami penurunan dari tahun 2009 sampai 2013 secara terus-menerus Salah satu faktor yang menyebabkan penurunan produksi kedelai adalah penyakit rebah kecambah yang disebabkan oleh jamur Sclerotium rolfsii. Penyakit rebah kecambah pada kedelai dapat mengakibatkan penurunan hasil mencapai 59%. Beberapa rizobakteri yang diisolasi dari rizosfer tanaman Leguminosae dikenal memiliki kemampuan mengendalikan patogen tular tanah. Penelitian ini bertujuan untuk menguji rizobakteri yang diisolasi dari rizosfer tanaman Leguminosae yang mampu menekan pertumbuhan jamur S. rolfsii dan mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai. Sebanyak 11 isolat dari 112 isolat rizobakteri yang diisolasi dari tanaman Leguminosae memiliki aktivitas antijamur terhadap S. rolfsii. Uji daya hambat 11 isolat rizobakteri terhadap jamur S. rolfsii menunjukkan bahwa tiga isolat memiliki kemampuan menghambat S. rolfsii tertinggi, yaitu: isolat KtD1, KtD6, dan KtB3. Filtrat kultur rizobakteri mampu menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii dengan luas zona hambat yang bervariasi, yaitu: isolat KtB3 (237,1 mm2), KtD6 (130,5 mm2), dan KtD1 (84,1 mm2). Hasil identifikasi menggunakan Oxoid Microbacttm GNB Kit menunjukan bahwa isolat KtD1 memiliki kemiripan sebesar 99,99% dengan Vibrio alginolyticus dan KtD6 memiliki kemiripan sebesar 99,99% dengan Burkholderia pseudomallei. Hasil identifikasi berdasarkan analisis gen 16S rRNA menunjukkan bahwa rizobakteri isolat KtB3 memiliki persentase kemiripan antara 99-100% dengan spesies Enterobacter cloacae.

Persentase pre-emergence damping off pada pengamatan 7 HST (hari setelah tanam) terkecil ditunjukkan pada perlakuan KtB3 (2,11%), diikuti KtD6 (4,41%), dan KtD1 (6,73%). Persentase post emergence damping off pada pengamatan 19 HST terkecil ditunjukkan pada perlakuan formula rizobakteri KtB3 (12,59%), KtD6 (27,78%), KtD1 (35,88%), dan kontrol (100%). Hasil perhitungan jumlah sklerotia jamur S. rolfsii di dalam tanah menunjukkan bahwa jumlah sklerotia paling banyak diperoleh pada perlakuan kontrol sebesar 243,83 butir/g tanah, sedangkan sklerotia pada tiap perlakuan rizobakteri sebesar 0,00 butir/g tanah. Populasi tiap perlakuan rizobakteri dalam formula kompos yang akan diaplikasikan dan rizosfer bibit kedelai menunjukan populasi koloni yang bervariasi. Formula kompos dengan rizobakteri E. cloacae isolat KtB3 paling efektif menurunkan persentase penyakit rebah kecambah paling rendah di rumah kaca.

ix ABSTRACT

Soybean (Glycine max L.) is one of the important commodity in Indonesia. Production of soybean in Indonesia had decreased from 2009 to 2013 continuously. One of the factors that caused the decrease in the production of soybean is damping off disease caused by Sclerotium rolfsii. Damping off disease in soybean could cause a decrease in yield until 59%. Some of rhizobacteria isolated from the rhizospheres of Leguminosae plants were known could control soil-borne pathogens. This study aims to test rhizobacteria isolated from the rhizosphere of Leguminosae plants that able to suppress the growth of S. rolfsii and control damping off disease on soybean plant. Total of 11 isolates of 112 isolates rhizobacteria that could be isolated from Leguminosae plants had antifungal activity against S. rolfsii. Inhibition test of 11 isolates of rhizobacteria against S. rolfsii showed that three isolates had the highest ability to inhibit the growth of S. rolfsii namely isolates KtD1, KtD6, and KtB3. Culture filtrates of these rhizobacteria could inhibit the growth of S. rolfsii with varied broad zones of inhibition were 237.1 mm2 for isolate KtB3, 130.5 mm2 for KtD6, and 84.1 mm2 for KtD1. The identification results using Oxoid Microbacttm GNB Kit showed that isolate KtD1 had 99.99% similarity with Vibrio alginolyticus and KtD6 had 99.99% similarity with Burkholderia pseudomallei. Results of identification based on 16S rRNA gene analysis showed that isolate KtB3, showed percentage of similarity between 99-100% with species of Enterobacter cloacae.

The percentage of pre-emergence damping off on observation 7 DAT (days after transplanting) indicated that in the treatment of rhizobacteria formula KtB3 was smallest (2.11%), followed by KtD6 (4.41%), and KtD1 (6.73%). The percentage of post-emergence damping off on 19 HST observations indicated in the treatment of rhizobacteria formula KtB3 was smallest (12.59%), KtD6 (27.78%), KtD1 (35.88%), and control (100%). Total of sclerotia S. rolfsii in soil showed that the number of the most widely sclerotia obtained in the control treatment amounted to 243.83 grain/g soil, while sclerotia in each treatments of rhizobacteria of 0.00 grain/g soil. Population of rhizobacteria in compost formula that will be applied and rhizosphere of soybean plant showed varied population of colonies. Compost formula with E. cloacae isolates KtB3 most effectively with less the percentage of damping-off disease among in the greenhouse.

x RINGKASAN

Kedelai (Glycine max L.) merupakan salah satu komoditas strategis di Indonesia. Permintaan kedelai nasional terus mengalami peningkatan untuk bahan industri makanan. Walaupun permintaan kedelai nasional terus mengalami peningkatan, nampaknya produksi kedelai di Indonesia mengalami penurunan dari tahun 2009 sampai 2013 secara terus-menerus Salah satu faktor yang menyebabkan penurunan produksi kedelai adalah penyakit rebah kecambah yang disebabkan oleh jamur Sclerotium rolfsii. Penyakit rebah kecambah pada kedelai mampu menyebabkan penurunan hasil mencapai 59% (Akem & Dashiell, 1991).

Pengendalian penyakit rebah kecambah hingga saat ini masih mengandalkan penggunaan fungisida kimia sintetis, namun upaya pengendalian tersebut belum optimal. Selain itu, penggunaan fungisida sintetis secara kurang tepat bisa menimbulkan berbagai masalah negatif bagi lingkungan dan kesehatan manusia. Pemanfaatan agen hayati untuk mengendalikan serangan jamur S. rolfsii menjadi pilihan alternatif yang perlu dipertimbangkan. Salah satu cara alternatif yang semakin berkembang saat ini adalah pemanfaatan rizobakteri yang juga dikenal dengan Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) sebagai agen hayati patogen tular tanah. Rizobakteri memiliki daya antagonisme terhadap mikroba antagonis melalui produksi siderofor, β-1,3-glukanase, dan kitinase (Soesanto, 2008). Rizobakteri dapat diisolasi dari beragam rizosfer tanaman, salah satunya dari rizosfer tanaman Leguminosae. Tanaman Leguminosae dikenal memiliki keragaman mikroba dalam tanah melalui eksudat akarnya yang mampu memberikan dampak positif untuk pengendalian patogen tular tanah.

Tujuan penelitian ini yaitu: 1) untuk mengetahui efektivitas rizobakteri yang diisolasi dari rizosfer tanaman Leguminosae dalam menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii penyebab penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai, 2) untuk mengetahui spesies rizobakteri yang efektif dapat menghambat pertumbuhan S. rolfsii, 3) untuk mengetahui mekanisme kerja rizobakteri dalam menghambat pertumbuhan S. rolfsii, 4) untuk mengetahui efektivitas formula rizobakteri dalam mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai.

xi

Pengujian secara in vitro dilakukan di Laboratorium Biopestisida, Fakultas Pertanian, Universitas Udayana, dan pengujian secara in vivo dilakukan di dalam rumah kaca Kebun Percobaan Fakultas Pertanian Universitas Udayana. Identifikasi jenis isolat rizobakteri secara molekuler dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor.

Penelitian diawali dengan pengumpulan sampel dari rizosfer tanaman Leguminosae dari delapan jenis tanaman Leguminosae di sekitar Kota Denpasar, Kabupaten Badung, Tabanan, dan Gianyar, seperti: kedelai (Glycine max L.), kacang tanah (Arachis hypogaea), kacang panjang (Vigna unguiculata), lamtoro (Leucaena leucocephala), trembesi (Samanea saman), putri malu (Mimosa pudica), kacang merah (Vigna angularis), dan orok-orok (Crotalaria juncea).

Penelitian di laboratorium dimulai dari peremajaan isolat jamur S. rolfsii dan uji patogenisitas jamur S. rolfsii terhadap tanaman kedelai. Kemudian, dilakukan isolasi rizobakteri dan seleksi rizobakteri rizosfer tanaman Leguminosae sebagai agen hayati jamur S. rolfsii. Lalu, dilanjutkan dengan uji daya hambat rizobakteri terhadap jamur S. rolfsii secara in vitro dan uji daya hambat filtrat rizobakteri terhadap jamur S. rolfsii. Identifikasi spesies rizobakteri dilakukan melalui uji karakter biokimia dan molekuler. Identifikasi secara molekuler dilakukan pada isolat rizobakteri yang menunjukkan persentase kemiripan di bawah 90% berdasarkan hasil identifikasi secara biokimia. Identifikasi secara molekuler dilakukan berdasarkan karakterisasi gen 16S rRNA menggunakan primer primer 16S (63F 5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3' dan 1387R (5'-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3'), yang kemudian dilanjutkan dengan analisis filogeni.

Penelitian secara in vivo dilakukan di rumah kaca meliputi pengujian untuk mengetahui kemampuan isolat rizobakteri dalam mengurangi persentase penyakit sebelum muncul ke atas permukaan tanah (pre-emergence damping off), persentase penyakit setelah muncul ke atas permukaan tanah (post emergence damping off), populasi sklerotia jamur S. rolfsii di dalam tanah, dan populasi rizobakteri dalam formula dan rizosfer bibit kedelai.

xii

Hasil uji patogenisitas jamur S. rolfsii terhadap tanaman kedelai menunjukkan bahwa jamur tersebut bersifat patogen terhadap tanaman kedelai. Kemudian hasil isolasi rizobakteri dari sampel yang diambil dari rizosfer delapan jenis tanaman famili Leguminosae diperoleh sebanyak 112 isolat rizobakteri. Lalu, hasil seleksi 112 isolat rizobakteri yang memiliki aktivitas antijamur terhadap jamur S. rolfsii, diperoleh sebanyak 11 isolat rizobakteri yang mampu menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii.

Uji daya hambat 11 isolat rizobakteri terhadap jamur S. rolfsii menunjukkan bahwa masing-masing isolat memiliki kemampuan menekan pertumbuhan jamur patogen yang bervariasi, yaitu: isolat KmD2 (77,57%), KtT1 (81,00%), TrD1 (89,11%), TrD4 (89,39%), KtT3 (89,89%), KdB5 (91,70%), KdT1 (91,74%), KtD2 (92,38%), KtD1 (92,56%), KtD6 (92,78%), KtB3 (96,97%). Dari isolat tersebut kemudian dipilih tiga isolat yang memiliki kemampuan menghambat S. rolfsii tertinggi, yaitu: isolat KtD1, KtD6, dan KtB3.

Hasil pengujian terhadap filtrat kultur rizobakteri untuk menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii menunjukkan luas zona hambat yang bervariasi, yaitu: isolat KtB3 (237,1 mm2), KtD6 (130,5 mm2), dan KtD1 (84,1 mm2). Hasil pengujian gram terhadap tiga isolat rizobakteri yaitu isolat KtB3, KtD1, dan KtD6 dapat dikelompokkan ke dalam rizobakteri Gram negatif. Hasil identifikasi secara biokimia Oxoid Microbacttm GNB Kit menunjukkan rizobakteri isolat KtD1 mempunyai kemiripan dengan Vibrio alginolyticus sebesar 99,99%, dan rizobakteri isolat KtD6 mempunyai kemiripan dengan Burkholderia pseudomallei sebesar 99,99%. Sedangkan, rizobakteri isolat KtB3 hanya mempunyai persentase kemiripan dengan Aeromonas hydrophila sebesar 61,22% (<90%). Kemudian, hasil analisis terhadap gen 16S rRNA menunjukkan bahwa sekuen 16S rRNA rizobakteri isolat KtB3 memiliki kekerabatan yang dekat dengan spesies Enterobacter cloacae.

Adanya aplikasi formula rizobakteri pada benih tanaman kedelai di rumah kaca mampu menekan persentase penyakit sebelum muncul ke atas permukaan tanah (pre-emergence damping off) dan persentase penyakit setelah muncul ke atas permukaan tanah (post emergence damping off) secara efektif. Persentase

xiii

pre-emergence damping off pada pengamatan 7 HST terkecil ditunjukkan pada perlakuan formula rizobakteri KtB3 (2,11%), diikuti formula rizobakteri KtD6 (4,41%), formula rizobakteri KtD1 (6,73%), dan kontrol (29,55%). Persentase post emergence damping off pada pengamatan 19 HST terkecil ditunjukkan pada perlakuan formula rizobakteri KtB3 (12,59%), diikuti formula rizobakteri KtD6 (27,78%), formula rizobakteri KtD1 (35,88%), dan kontrol (100%). Hasil perhitungan jumlah sklerotia jamur S. rolfsii di dalam tanah menunjukkan bahwa jumlah sklerotia paling banyak diperoleh pada perlakuan kontrol (243,83 butir/g tanah), sedangkan tidak diperoleh sklerotia (0,00 butir/g tanah) pada masing-masing perlakuan formula rizobakteri. Selain itu, dari hasil perhitungan kerapatan populasi terhadap tiap perlakuan rizobakteri dalam formula kompos yang akan diaplikasikan dan rizosfer bibit kedelai menunjukan bahwa tiap isolat rizobakteri memiliki populasi koloni yang bervariasi.

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa tiga isolat rizobakteri yaitu KtB3, KtD6, dan KtD1 terbukti efektif menghambat pertumbuhan jamur Sclerotium rolfsii pada media PDA. Mekanisme kerja rizobakteri dalam menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii kemungkinan secara antibiosis melalui produksi senyawa antijamur berdasarkan uji filtrat dari tiga isolat rizobakteri KtB3, KtD6, dan KtD1. Sebanyak tiga isolat rizobakteri yang tergolong ke dalam bakteri gram negatif telah diidentifikasi, yaitu V. alginolyticus isolat KtD1, B. pseudomallei isolat KtD6, dan E. cloacae isolat KtB3. Formula kompos dengan rizobakteri E. cloacae isolat KtB3 paling efektif menurunkan persentase penyakit rebah kecambah paling rendah di rumah kaca.

xiv DAFTAR ISI

Halaman

SAMPUL DALAM ... i

PRASYARAT GELAR ... ii

LEMBAR PERSETUJUAN ... iii

PENETAPAN PANITIA PENGUJI ... iv

HALAMAN SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ... v

UCAPAN TERIMA KASIH ... vi

ABSTRAK ... viii

ABSTRACT ... ix

RINGKASAN ... x

DAFTAR ISI ... xiv

DAFTAR TABEL ... xvii

DAFTAR GAMBAR ... xviii

DAFTAR LAMPIRAN ... xx

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah ... 4

1.3 Tujuan Penelitian ... 5

1.4 Manfaat Penelitian ... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 7

2.1 Botani Tanaman Kedelai (Glycine max L.) ... 7

2.1.1 Morfologi ... 8

2.1.2 Syarat tumbuh ... 9

2.2 Penyakit Rebah Kecambah ... 10

2.2.1 Penyebab penyakit rebah kecambah ... 10

2.2.2 Morfologi dan siklus hidup jamur S. rolfsii ... 11

2.2.3 Gejala penyakit ... 13

2.2.4 Mekanisme infeksi jamur S. rolfsii ... 14

2.2.5 Faktor-faktor yang mempengaruhi perkembangan penyakit rebah kecambah ... 15

2.3 Tanaman Leguminosae ... 16

xv

BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS

PENELITIAN ... 21

3.1 Kerangka Berpikir ... 21

3.2 Konsep Penelitian ... 23

3.3 Hipotesis ... 26

BAB IV METODE PENELITIAN ... 27

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 27

4.2 Bahan dan Alat ... 27

4.2.1 Bahan ... 27

4.2.2 Alat ... 28

4.3 Pelaksanaan Penelitian ... 28

4.3.1 Peremajaan isolat jamur S. rolfsii ... 28

4.3.2 Uji patogenisitas jamur S. rolfsii pada benih kedelai ... 28

4.3.3 Pengambilan sampel tanaman Leguminosae ... 29

4.3.4 Isolasi rizobakteri dari rizosfer tanaman Leguminosae ... 30

4.3.5 Seleksi rizobakteri sebagai agen hayati jamur S. rolfsii ... 30

4.3.6 Uji daya hambat rizobakteri terhadap jamur S. rolfsii secara in vitro ... 31

4.3.7 Uji daya hambat filtrat kultur rizobakteri terhadap koloni jamur S. rolfsii ... 32

4.3.8 Identifikasi rizobakteri menggunakan Oxoid Microbacttm GNB Kit ... 33

4.3.9 Identifikasi rizobakteri secara molekuler ... 34

4.3.10 Uji daya kecambah benih kedelai di laboratorium ... 37

4.3.11 Uji efektivitas formula rizobakteri untuk pengendalian penyakit rebah kecambah pada bibit kedelai di rumah kaca ... 37

4.3.12 Parameter yang diamati ... 41

4.4 Analisis Data ... 43

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN ... 44

5.1 Patogenisitas Jamur S. rolfsii pada Benih Kedelai ... 44

5.2 Isolat Rizobakteri ... 45

5.3 Isolat Rizobakteri yang bersifat Antagonis terhadap Jamur S. rolfsii ... 49

5.4 Daya Hambat Rizobakteri terhadap Jamur S. rolfsii pada Media PDA ... 50

xvi

5.5 Daya Hambat Filtrat Kultur Rizobakteri terhadap

Jamur S. rolfsii pada Media PDA ... 54

5.6 Identifikasi Rizobakteri Menggunakan Oxoid Microbacttm GNB Kit ... 56

5.7 Identifikasi Rizobakteri Isolat KtB3 secara Molekuler .. 60

5.8 Efektivitas Formula Rizobakteri untuk Pengendalian Penyakit Rebah Kecambah pada Bibit Kedelai di Rumah Kaca ... 63

5.9 Pengaruh Perlakuan Rizobakteri terhadap Jumlah Sklerotia dalam Tanah ... 69

5.10 Kerapatan Populasi Rizobakteri dalam Formula dan Rizosfer Bibit Kedelai ... 71

BAB VI SIMPULAN DAN SARAN ... 75

6.1 Simpulan ... 75

6.2 Saran ... 75

DAFTAR PUSTAKA ... 77

xvii

DAFTAR TABEL

Halaman 5.1 Daftar isolat, jenis tanaman, dan lokasi pengambilan sampel

rizobakteri ... 46 5.2 Daya hambat isolat rizobakteri terhadap pertumbuhan koloni jamur

S. rolfsii umur 3 hari pada media PDA ... 50 5.3 Daya hambat filtrat kultur isolat rizobakteri terhadap jamur

S. rolfsii ... 54 5.4 Hasil karakterisasi morfologi dan uji biokimia menggunakan Oxoid

Microbacttm GNB Kit pada tiga isolat rizobakteri ... 57 5.5 Hasil identifikasi tiga isolat rizobakteri menggunakan Oxoid

Microbacttm GNB Kit ... 59 5.6 Perbandingan persentase kemiripan gen 16S rRNA rizobakteri isolat

KtB3 dengan beberapa sekuen DNA di Genbank menggunakan

program BLAST ... 61 5.7 Tingkat homolog (%) rizobakteri isolat KtB3 dengan isolat bakteri

E. cloacae berdasarkan gen 16S rRNA hasil pensejajaran dengan

ClustalW ... 62 5.8 Pengaruh formula rizobakteri terhadap persentase penyakit sebelum

muncul ke atas permukaan tanah (pre-emergence damping off) pada

7 HST ... 64 5.9 Pengaruh formula rizobakteri terhadap persentase penyakit setelah

muncul ke atas permukaan tanah (post emergence damping off) pada 19 HST ... 67 5.10 Jumlah sklerotia jamur S. rolfsii di dalam tanah ... 70 5.11 Populasi rizobakteri pada formula dan rizosfer bibit kedelai pada

xviii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

2.1 Tanaman kedelai ... 9

2.2 Morfologi jamur Sclerotium rolfsii dalam media PDA ... 12

2.3 Tanaman kedelai yang terserang jamur S. rolfsii ... 14

3.1 Bagan alir konsep penelitian ... 25

4.1 Denah masing-masing perlakuan di rumah kaca ... 38

5.1 Uji patogenitas jamur S. rolfsii terhadap benih kedelai. Isolat jamur S. rolfsii umur 7 hari (A), tanaman kedelai yang mengalami gejala rebah kecambah (B), isolat jamur S. rolfsii hasil reisolasi umur 7 hari (C), dan sklerotia isolat jamur S. rolfsii hasil reisolasi umur 14 hari (D).. 44

5.2 Aktivitas antijamur isolat rizobakteri dari kacang tanah terhadap jamur S. rolfsii (A) dan kontrol (B) pada media PDA umur 2 hari setelah inokulasi ... 49

5.3 Aktivitas penghambatan beberapa rizobakteri terhadap pertumbuhan jamur S. rolfsii pada media PDA umur 3 hari setelah inokulasi. (A) Kontrol S. rolfsii, (B) koloni jamur yang diberi perlakuan rizobakteri isolat KtB3, (C) isolat KtD6, (D) isolat KtD1, (E) isolat KtD2, (F) isolat KdT1, (G) isolat KdB5, (H) isolat TrD4, (I) isolat TrD1, (J) isolat KtT3, (K) isolat KtT1, dan (L) isolat KmD2. . ... 51

5.4 Zona hambatan yang terbentuk di sekitar sumur difusi (tanda panah) pada umur 3 hari yang diberi pelakuan filtrat biakan rizobakteri terhadap jamur S. rolfsii, masing-masing untuk isolat KtB3 (A), isolat KtD6 (B), perlakuan filtrat biakan rizobakteri isolat KtD1 (C), dan kontrol (D). ... 55

5.5 Sel rizobakteri isolat KtB3 (A), isolat KtD6 (B), dan isolat KtD1 (C) hasil pengujian Gram yang bersifat Gram negatif melalui mikroskop binokuler dengan pembesaran 1.000 kali. ... 58

xix

5.6 Amplifikasi PCR dari gen 16S rRNA menggunakan primer 16S pada gel agarose. (M= marker 100 pb (penanda DNA), KtB3 =

hasil PCR rizobakteri isolat KtB3) ... 60 5.7 Hubungan kekerabatan 15 isolat bakteri hasil analisis kelompok

berdasarkan gen 16S rRNA dengan metode Maximum Parsimony. Angka pada cabang merupakan persentase tingkat kepercayaan

pengelompokan ... 63 5.8 Gejala pre-emergence damping off pada benih perlakuan kontrol (A)

dan benih kedelai berkecambah yang tidak menunjukkan gejala penyakit pada perlakuan formula rizobakteri: isolat KtB3 (B), KtD1

(C), dan KtD6 (D) di rumah kaca ... 64 5.9 Gejala post emergence damping off pada tanaman kedelai perlakuan

kontrol (A) dan tanaman kedelai yang tidak terserang penyakit pada perlakuan formula rizobakteri: isolat KtB3 (B), KtD1 (C), dan KtD6

(D) di rumah kaca ... 66 5.10 Perkembangan post emergence damping off pada tanaman kedelai

pada perlakuan kontrol dan rizobakteri hingga 19 HST di rumah

kaca ... 67 5.11 Sklerotia jamur S. rolfsii pada perlakuan kontrol pada pengamatan

xx

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Media Potato Dextrose Agar (PDA) ... 84 2. Media cair Potato Dextrose Broth (PDB) ... 85 3. Pengumpulan sampel tanah dan isolasi rizobakteri dari rizosfer

tanaman Leguminosae ... 86 4. Analisis sidik ragam luas koloni jamur S. rolfsii dengan perlakuan

rizobakteri pada 3 hari setelah inkubasi (HSI) ... 87 5. Pengujian secara biokimia menggunakan Oxoid Microbacttm GNB

Kit terhadap rizobakteri isolat KtB3, KtD1, dan KtD6 ... 88 6. Sekuen gen rizobakteri E. cloacae isolat KtB3 ... 89 7. Perbandingan hasil pensejajaran DNA rizobakteri isolat KtB3 dengan

isolat bakteri E. cloacae lainnya melalui ClustalW ... 90 8. Rata-rata persentase daya kecambah benih kedelai ... 96 9. Persiapan inokulum S. rolfsii dan formula kompos rizobakteri ... 97 10. Inokulasi inokulum S. rolfsii dan aplikasi formula kompos

rizobakteri dalam tanah ... 98 11. Kondisi tanaman kedelai di rumah kaca ... 99 12. Analisis sidik ragam persentase penyakit sebelum muncul ke atas

permukaan tanah (pre-emergence damping off) pada 7 HST ... 100 13. Analisis sidik ragam persentase penyakit setelah muncul ke atas

permukaan tanah (post emergence damping off) pada 19 HST ... 101 14. Analisis sidik ragam jumlah sklerotia pada masing-masing

1 BAB I PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Kedelai (Glycine max L.) merupakan salah satu komoditas strategis di Indonesia. Kedelai menjadi tanaman terpenting ketiga setelah padi dan jagung (Danapriatna, 2007). Kedelai menjadi sumber protein nabati yang murah, sehingga dapat memenuhi gizi masyarakat dan aman untuk dikonsumsi. Permintaan kedelai terus mengalami peningkatan untuk bahan industri makanan, seperti: kecap, tahu, tempe, tauco, dan susu kedelai. Menurut BPS (2014), produksi kedelai pada tahun 2009 hingga 2013 secara berturut-turut sebesar 974.512 ton, 907.031 ton, 851.286 ton, 843.153 ton, dan 779.992 ton. Data ini menunjukkan bahwa produksi kedelai terus mengalami penurunan. Salah satu kendala dalam upaya peningkatan produksi kedelai adalah adanya serangan patogen yang mengakibatkan penyakit pada tanaman kedelai.

Salah satu penyakit penting pada tanaman kedelai adalah penyakit rebah kecambah yang disebabkan oleh Sclerotium rolfsii (Semangun, 2004). Infeksi S. rolfsii pada tanaman kedelai umumnya terjadi pada awal pertumbuhan tanaman dengan menunjukkan gejala rebah kecambah atau busuk kecambah. Tanaman kedelai yang terserang S. rolfsii akan menjadi layu dan menguning secara perlahan. Tanaman kedelai yang berumur 2-3 minggu, akan menunjukkan gejala berupa busuk pangkal batang dan layu (Semangun, 1993). Penyakit rebah kecambah yang disebabkan oleh S. rolfsii merupakan penyakit penting pada

2

tanaman kedelai, karena tanaman yang terserang akan mati dan patogen dapat bertahan lama di dalam tanah dalam bentuk sklerotia (Semangun, 1991). Akibat adanya serangan S. rolfsii pada tanaman kedelai terjadi penurunan hasil panen hingga 59% (Akem & Dashiell, 1991).

Beragam upaya pengendalian menggunakan fungisida sintetis telah banyak dilakukan, namun belum mampu mengendalikan penyakit rebah kecambah secara tuntas. Penggunaan fungisida kimia sintetis secara terus-menerus bisa menyebabkan efek negatif seperti resistensi patogen target, dan residu fungisida sintetis cukup lama terurai di dalam tanah. Aplikasi fungisida sintetis yang bersifat tidak spesifik juga dapat membunuh banyak jenis mikroorganisme termasuk musuh alami sehingga dapat mengakibatkan keseimbangan alam terganggu. Selain itu, dampak negatif dari aplikasi fungisida sintetis secara berkepanjangan ialah terjadinya peningkatan penyakit tanaman akibat resistensi dari jamur patogen. Menurut Soesanto (2008), terjadi peningkatan penyakit tanaman yang disebabkan oleh Phytium, Fusarium, dan Phytopthora akibat penggunaan pestisida pentaklorobenzena (PCNB).

Pemanfaatan agen hayati untuk mengendalikan serangan jamur S. rolfsii menjadi pilihan alternatif yang perlu dipertimbangkan. Penggunaan agen hayati tersebut dapat digunakan untuk mengurangi penggunaan fungisida kimia sintetis di lapangan. Salah satu cara alternatif yang semakin berkembang ialah dengan memanfaatkan rizobakteri yang juga dikenal dengan Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) sebagai agen hayati patogen tular tanah.

3

Rizobakteri adalah bakteri dalam tanah yang secara agresif mengkolonisasi perakaran tanaman, serta memberikan keuntungan bagi tanaman dengan memacu pertumbuhan (Saharan & Nehra, 2011). Rizobakteri mampu menghasilkan fitohormon indole acetic acid (IAA), memfiksasi N2, memiliki daya

antagonisme terhadap mikroba patogen melalui produksi siderofor, β -1,3-glukanase, kitinase, selulase, antibiotik, dan sianida, serta mampu melarutkan mineral fosfat serta unsur hara lainnya (Soesanto, 2008). Rizobakteri sebagai agen hayati mampu menghasilkan berbagai senyawa antijamur yang dapat menghambat pertumbuhan jamur patogen. Rizobakteri Pseudomonas fluorescens mampu menghasilkan 2,4-diacetyl phloroglucinol yang dapat menghambat pertumbuhan jamur patogen tumbuhan (Nowak-Thompson et al., 1994). Rizobakteri Pseudomonas stutzeri menghasilkan enzim kitinase ekstraseluler dan laminarinase yang mampu melisiskan miselia Fusarium solani (Mauch et al., 1988).

Tanaman Leguminosae dikenal memiliki keragaman mikroba dalam tanah melalui eksudat akarnya serta dapat memberikan dampak positif untuk pengendalian patogen tular tanah. Menurut Sugiyama dan Yazaki (2012), tanaman Leguminosae menciptakan interaksi simbiosis dengan rhizobia dan jamur mikoriza arbuskular untuk mendapatkan beberapa unsur hara seperti nitrogen dan fosfat. Dalam interaksi ini, flavonoid dan strigolactones dalam eksudat akar berfungsi sebagai molekul sinyal untuk menciptakan interaksi simbiosis. Sebagai agen hayati, rizobakteri yang diisolasi dari tanaman legum memiliki potensi dalam menekan serangan patogen tular tanah. Penelitian Hynes et al. (2008) menunjukkan bahwa dari hasil screening 563 bakteri yang berasal dari akar

4

kacang ercis (Pisum sativum), lentil (Lens culinaris), dan kacang arab (Cicer arietinum) memiliki kemampuan untuk menekan pertumbuhan jamur patogen tanaman legum dan mampu memacu pertumbuhan tanaman. Berdasarkan hasil screening bakteri menunjukkan bahwa 76% isolat menghasilkan siderofor, 5% isolat menunjukkan aktivitas ACC deaminase, dan 7% isolat mampu memproduksi indol. Dua puluh enam isolat (5%) mampu menekan pertumbuhan Phytium sp. strain P88-p3, 7% mampu menekan pertumbuhan Fusarium avenaceum dan 9% mampu menekan pertumbuhan Rhizoctonia solani CKP7. Solichatun et al. (2013) juga melaporkan bahwa rizobakteri yang diisolasi dari akar kacang tanah mampu menghambat Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici secara in vitro dengan persentase daya hambat terhadap Klebsiella pneumoniae isolat KTNA2 sebesar 89,98%, Klebsiella pneumoniae isolat KTGA1 sebesar 84,29%, Acinetobacter baumannii isolat KTGA3 sebesar 77,26%, dan Stenotrophomonas maltophilia isolat KTTA4 sebesar 73,21%.

Berdasarkan uraian di atas, perlu dilakukan penelitian untuk memanfaatkan rizobakteri yang berasal dari perakaran tanaman Leguminosae sebagai agen pengendali penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai.

1.2 Rumusan Masalah

Adapun masalah yang akan dicarikan jawaban melalui penelitian ini ialah: 1. Apakah rizobakteri yang diisolasi dari rizosfer tanaman Leguminasae efektif menghambat pertumbuhan jamur Sclerotium rolfsii penyebab penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai?

5

2. Apa saja jenis rizobakteri yang efektif dapat menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii?

3. Bagaimanakah mekanisme kerja rizobakteri yang efektif dapat menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii?

4. Apakah formula rizobakteri efektif mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai?

1.3 Tujuan Penelitian

Adapun tujuan penelitian ini ialah:

1. Untuk mengetahui efektivitas rizobakteri yang diisolasi dari rizosfer tanaman Leguminosae dalam menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii penyebab penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai. 2. Untuk mengetahui spesies rizobakteri yang efektif dapat menghambat

pertumbuhan S. rolfsii.

3. Untuk mengetahui mekanisme kerja rizobakteri dalam menghambat pertumbuhan S. rolfsii.

4. Untuk mengetahui efektivitas formula rizobakteri dalam mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai.

1.4 Manfaat Penelitian

Adapun manfaat penelitian ini ialah :

1. Secara akademik, dapat diketahui spesies dan efektivitas rizobakteri yang diisolasi dari rizosfer tanaman Leguminosae dalam menghambat

6

pertumbuhan jamur S. rolfsii. Selain itu, hasil penelitian ini akan memberikan fakta mekanisme kerja rizobakteri dalam menghambat pertumbuhan S. rolfsii.

2. Secara praktis, hasil penelitian ini akan memberikan referensi tentang pemanfaatan agen hayati berupa formula rizobakteri untuk

21 BAB III

KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Berpikir

Produksi kedelai di Indonesia dari tahun 2009 sampai 2013 secara terus menerus mengalami penurunan, walaupun permintaan kedelai nasional terus mengalami peningkatan. Salah satu faktor yang menyebabkan penurunan produksi kedelai di Indonesia adalah penyakit rebah kecambah yang disebabkan oleh jamur S. rolfsii. Penyakit rebah kecambah pada kedelai bisa menyebabkan penurunan hasil sampai 59% (Akem & Dashiell, 1991). Pengendalian penyakit rebah kecambah masih mengandalkan penggunaan fungisida kimia sintetis, tetapi karena patogen penyakit ini merupakan patogen tular tanah dan bisa bertahan cukup lama di dalam tanah dalam bentuk sklerotia, maka upaya pengendalian tersebut belum mampu mengendalikan penyakit rebah kecambah secara memuaskan. Selain itu, penggunaan fungisida sintetis secara kurang tepat bisa menimbulkan berbagai masalah lingkungan dan kesehatan manusia. Salah satu masalah lingkungan yang mungkin timbul adalah terjadinya pencemaran air dan tanah, munculnya resistensi jamur terhadap fungisida sintetis, punahnya mikroorganisme non-target yang mungkin sangat bermanfaat sebagai antagonis terhadap patogen.

Salah satu cara alternatif yang semakin berkembang saat ini adalah pemanfaatan rizobakteri yang juga dikenal dengan Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) sebagai agen hayati patogen tular tanah. Menurut Soesanto (2008), rizobakteri mampu menghasilkan fitohormon indole acetic acid (IAA),

22

memfiksasi N2, memiliki daya antagonisme terhadap mikroba antagonis melalui

produksi siderofor, β-1,3-glukanase, kitinase, selulase, antibiotik, dan sianida, serta mampu melarutkan fosfat mineral serta nutrisi lainnya. Yan et al. (2002) juga melaporkan bahwa PGPR strain Bacillus pumilus SE34 dan Pseudomonas flurescens 89B61 mampu memacu ketahanan sistemik pada tanaman tomat dan mengurangi keparahan penyakit yang disebabkan oleh Phytophthora infestans.

Tanaman Leguminosae dikenal memiliki keragaman mikroba dalam tanah melalui eksudat akarnya serta dapat memberikan dampak positif untuk pengendalian patogen tular tanah. Menurut Sugiyama dan Yazaki (2012), tanaman Leguminosae menciptakan interaksi simbiosis dengan rhizobia dan jamur mikoriza arbuskular untuk mendapatkan beberapa nutrisi seperti nitrogen dan fosfat. Dalam interaksi ini, flavonoid dan strigolactones dalam eksudat akar berfungsi sebagai molekul sinyal untuk menciptakan interaksi simbiosis.

Berdasarkan hasil penelitian Hynes et al. (2008) bahwa bakteri yang berasal dari akar kacang ercis (Pisum sativum), lentil (Lens culinaris), dan kacang arab (Cicer arietinum) mampu menekan jamur patogen tanaman legum dan memacu pertumbuhan tanaman. Sebanyak 76% isolat menghasilkan siderofor, 5% isolat menunjukkan aktivitas ACC-deaminase, dan 7% isolat mampu memproduksi indol. Sebanyak 5% isolat mampu menekan pertumbuhan Phytium sp. strain P88-p3, 7% mampu menekan pertumbuhan Fusarium avenaceum, dan 9% mampu menekan pertumbuhan Rhizoctonia solani CKP7. Dey et al. (2004) melaporkan bahwa Pseudomonas sp. isolat PGPR1 dapat menghambat pertumbuhan Aspergillus niger dan A. flavus secara in vitro. Pseudomonas sp.

23

isolat PGPR4 juga menunjukkan penghambatan yang kuat terhadap S. rolfsii secara in vitro. Hasil penelitian Solichatun et al. (2013), menunjukkan bahwa rizobakteri yang diisolasi dari akar kacang tanah mampu menghambat pertumbuhan jamur Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici secara in vitro dengan daya hambat bervariasi antara 73,21% sampai 84,29%.

Berdasarkan kerangka berpikir tersebut di atas, maka penelitian ini dilakukan untuk menemukan rizobakteri dari rizosfer tanaman Leguminosae yang efektif menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii dan mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai.

3.2 Konsep Penelitian

Penelitian ini akan diawali dengan pengumpulan sampel tanah yang berasal dari rizosfer tanaman Leguminosae yang tumbuh di sekitar Kota Denpasar, Kabupaten Badung, Tabanan, dan Gianyar, seperti: kedelai (Glycine max L.), kacang tanah (Arachis hypogaea), kacang panjang (Vigna unguiculata), kacang buncis (Phaseolus vulgaris), lamtoro (Leucaena leucocephala), trembesi (Samanea saman), putri malu (Mimosa pudica), dan beberapa tanaman lain. Diharapkan akan diperoleh beberapa isolat rizobakteri yang efektif menekan pertumbuhan jamur S. rolfsii dengan daya hambat minimal 60%.

Mekanisme kerja rizobakteri dalam menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii akan dilakukan dengan melakukan pengujian terhadap daya hambat filtrat rizobakteri menggunakan metode sumur difusi. Bila perlakuan filtrat dapat menghasilkan zona hambatan di sekeliling sumur difusi maka dapat disimpulkan

24

mekanisme kerja rizobakteri adalah antibiosis. Isolat rizobakteri yang efektif menekan pertumbuhan jamur S. rolfsii akan diidentifikasi secara biokimia dengan Oxoid Microbacttm GNB Kit untuk mengetahui spesies rizobakteri tersebut. Bila persentase kemiripan spesies isolat rizobakteri yang akan diidentifikasi kurang di bawah 90%, maka akan dilanjutkan identifikasi secara molekuler berdasarkan sekuen gen 16S rRNA.

Isolat rizobakteri yang menghasilkan daya hambat tertinggi akan dipilih untuk dibuatkan formulanya dan diuji efektivitasnya dalam mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai pada percobaan di rumah kaca. Berdasarkan data kejadian penyakit (persentase tanaman kedelai yang menunjukkan gejala penyakit rebah kecambah) akan diketahui efektivitas formula rizobakteri dalam mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai. Secara ringkas, konsep penelitian disajikan pada Gambar 3.1.

25

Gambar 3.1

Bagan alir konsep penelitian Sampel

rizosfer tanaman Leguminosae

Isolat rizobakteri Isolasi

Uji daya hambat terhadap S. rolfsii pada PDA

Efektif : daya hambat < 60%

Kurang atau tidak efektif

Uji mekanisme hambatan terhadap

S. rolfsii

Pengendalian penyakit rebah kecambah pada kedelai

Identifikasi rizobakteri secara molekuler dilakukan bila persentase kemiripan < 90% dari hasil identifikasi

mengunakan Oxoid Microbacttm GNB Kit

Identifikasi rizobakteri dengan Oxoid Microbacttm

GNB Kit

26

3.3 Hipotesis

1. Rizobakteri yang diisolasi dari rizosfer tanaman Leguminosae efektif menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii penyebab penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai.

2. Spesies rizobakteri yang efektif menghambat pertumbuhan S. rolfsii adalah Pseudomonas sp. dan Enterobacter sp.

3. Mekanisme kerja rizobakteri dalam menghambat pertumbuhan S. rolfsii adalah melalui antibiosis.

4. Formula rizobakteri efektif mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai di rumah kaca.

21 3.1 Kerangka Berpikir

Produksi kedelai di Indonesia dari tahun 2009 sampai 2013 secara terus menerus mengalami penurunan, walaupun permintaan kedelai nasional terus mengalami peningkatan. Salah satu faktor yang menyebabkan penurunan produksi kedelai di Indonesia adalah penyakit rebah kecambah yang disebabkan oleh jamur S. rolfsii. Penyakit rebah kecambah pada kedelai bisa menyebabkan penurunan hasil sampai 59% (Akem & Dashiell, 1991). Pengendalian penyakit rebah kecambah masih mengandalkan penggunaan fungisida kimia sintetis, tetapi karena patogen penyakit ini merupakan patogen tular tanah dan bisa bertahan cukup lama di dalam tanah dalam bentuk sklerotia, maka upaya pengendalian tersebut belum mampu mengendalikan penyakit rebah kecambah secara memuaskan. Selain itu, penggunaan fungisida sintetis secara kurang tepat bisa menimbulkan berbagai masalah lingkungan dan kesehatan manusia. Salah satu masalah lingkungan yang mungkin timbul adalah terjadinya pencemaran air dan tanah, munculnya resistensi jamur terhadap fungisida sintetis, punahnya mikroorganisme non-target yang mungkin sangat bermanfaat sebagai antagonis terhadap patogen.

Salah satu cara alternatif yang semakin berkembang saat ini adalah pemanfaatan rizobakteri yang juga dikenal dengan Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) sebagai agen hayati patogen tular tanah. Menurut Soesanto (2008), rizobakteri mampu menghasilkan fitohormon indole acetic acid (IAA),

memfiksasi N2, memiliki daya antagonisme terhadap mikroba antagonis melalui produksi siderofor, β-1,3-glukanase, kitinase, selulase, antibiotik, dan sianida, serta mampu melarutkan fosfat mineral serta nutrisi lainnya. Yan et al. (2002) juga melaporkan bahwa PGPR strain Bacillus pumilus SE34 dan Pseudomonas flurescens 89B61 mampu memacu ketahanan sistemik pada tanaman tomat dan mengurangi keparahan penyakit yang disebabkan oleh Phytophthora infestans.

Tanaman Leguminosae dikenal memiliki keragaman mikroba dalam tanah melalui eksudat akarnya serta dapat memberikan dampak positif untuk pengendalian patogen tular tanah. Menurut Sugiyama dan Yazaki (2012), tanaman Leguminosae menciptakan interaksi simbiosis dengan rhizobia dan jamur mikoriza arbuskular untuk mendapatkan beberapa nutrisi seperti nitrogen dan fosfat. Dalam interaksi ini, flavonoid dan strigolactones dalam eksudat akar berfungsi sebagai molekul sinyal untuk menciptakan interaksi simbiosis.

Berdasarkan hasil penelitian Hynes et al. (2008) bahwa bakteri yang berasal dari akar kacang ercis (Pisum sativum), lentil (Lens culinaris), dan kacang arab (Cicer arietinum) mampu menekan jamur patogen tanaman legum dan memacu pertumbuhan tanaman. Sebanyak 76% isolat menghasilkan siderofor, 5% isolat menunjukkan aktivitas ACC-deaminase, dan 7% isolat mampu memproduksi indol. Sebanyak 5% isolat mampu menekan pertumbuhan Phytium sp. strain P88-p3, 7% mampu menekan pertumbuhan Fusarium avenaceum, dan 9% mampu menekan pertumbuhan Rhizoctonia solani CKP7. Dey et al. (2004) melaporkan bahwa Pseudomonas sp. isolat PGPR1 dapat menghambat pertumbuhan Aspergillus niger dan A. flavus secara in vitro. Pseudomonas sp.

isolat PGPR4 juga menunjukkan penghambatan yang kuat terhadap S. rolfsii secara in vitro. Hasil penelitian Solichatun et al. (2013), menunjukkan bahwa rizobakteri yang diisolasi dari akar kacang tanah mampu menghambat pertumbuhan jamur Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici secara in vitro dengan daya hambat bervariasi antara 73,21% sampai 84,29%.

Berdasarkan kerangka berpikir tersebut di atas, maka penelitian ini dilakukan untuk menemukan rizobakteri dari rizosfer tanaman Leguminosae yang efektif menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii dan mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai.

3.2 Konsep Penelitian

Penelitian ini akan diawali dengan pengumpulan sampel tanah yang berasal dari rizosfer tanaman Leguminosae yang tumbuh di sekitar Kota Denpasar, Kabupaten Badung, Tabanan, dan Gianyar, seperti: kedelai (Glycine max L.), kacang tanah (Arachis hypogaea), kacang panjang (Vigna unguiculata), kacang buncis (Phaseolus vulgaris), lamtoro (Leucaena leucocephala), trembesi (Samanea saman), putri malu (Mimosa pudica), dan beberapa tanaman lain. Diharapkan akan diperoleh beberapa isolat rizobakteri yang efektif menekan pertumbuhan jamur S. rolfsii dengan daya hambat minimal 60%.

Mekanisme kerja rizobakteri dalam menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii akan dilakukan dengan melakukan pengujian terhadap daya hambat filtrat rizobakteri menggunakan metode sumur difusi. Bila perlakuan filtrat dapat menghasilkan zona hambatan di sekeliling sumur difusi maka dapat disimpulkan

mekanisme kerja rizobakteri adalah antibiosis. Isolat rizobakteri yang efektif menekan pertumbuhan jamur S. rolfsii akan diidentifikasi secara biokimia dengan Oxoid Microbacttm GNB Kit untuk mengetahui spesies rizobakteri tersebut. Bila persentase kemiripan spesies isolat rizobakteri yang akan diidentifikasi kurang di bawah 90%, maka akan dilanjutkan identifikasi secara molekuler berdasarkan sekuen gen 16S rRNA.

Isolat rizobakteri yang menghasilkan daya hambat tertinggi akan dipilih untuk dibuatkan formulanya dan diuji efektivitasnya dalam mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai pada percobaan di rumah kaca. Berdasarkan data kejadian penyakit (persentase tanaman kedelai yang menunjukkan gejala penyakit rebah kecambah) akan diketahui efektivitas formula rizobakteri dalam mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai. Secara ringkas, konsep penelitian disajikan pada Gambar 3.1.

Gambar 3.1

Bagan alir konsep penelitian Sampel

rizosfer tanaman Leguminosae

Isolat rizobakteri Isolasi

Uji daya hambat terhadap S. rolfsii pada PDA

Efektif : daya hambat < 60%

Kurang atau tidak efektif

Uji mekanisme hambatan terhadap

S. rolfsii

Pengendalian penyakit rebah kecambah pada kedelai

Identifikasi rizobakteri secara molekuler dilakukan bila persentase kemiripan < 90% dari hasil identifikasi

mengunakan Oxoid Microbacttm GNB Kit

Identifikasi rizobakteri dengan Oxoid Microbacttm

GNB Kit

3.3 Hipotesis

1. Rizobakteri yang diisolasi dari rizosfer tanaman Leguminosae efektif menghambat pertumbuhan jamur S. rolfsii penyebab penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai.

2. Spesies rizobakteri yang efektif menghambat pertumbuhan S. rolfsii adalah Pseudomonas sp. dan Enterobacter sp.

3. Mekanisme kerja rizobakteri dalam menghambat pertumbuhan S. rolfsii adalah melalui antibiosis.

4. Formula rizobakteri efektif mengendalikan penyakit rebah kecambah pada tanaman kedelai di rumah kaca.