PROSEDUR PERBANYAKAN GEN PT2 MENGGUNAKAN
KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
DIREKTORAT RISET, PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT, DAN INOVASI
PUSAT RISET BIOTEKNOLOGI MOLEKULER DAN
BIOINFORMATIKA
Jalan Singaperbangsa No. 2 Bandung 40133 Telp./Faks (022) 2507874; 0821 2138 7874
e-mail: puslit.bio.inform@unpad.ac.id
PROSEDUR PERBANYAKAN GEN PT2 MENGGUNAKAN METODE PCR
DAN KARAKTERISASINYA
A. PCR
Alat
: Eppendorf mastercycler gradient, Micropipette eppendorf 0,1-2,5 µL; 0,5-10
µL; dan 2-20 µL, rak tabung.
Bahan : Gen PT2-pJET1.2, Gen PT2, Primer forward PT2-EcoRI, Primer reverse PT2SacII, Nuclease Free Water, DreamTaq Green PCR Master Mix (2x), tabung mikro
0,6 mL, tip putih (0,1-10 µL) dan tip kuning (10-200 µL).
Prosedur:
1. Templat untuk reaksi PCR adalah 1 µL gen PT2-pJET1.2 dan 1 µL gen PT2
(sebagai kontrol positif)
2. Masukkan 12,5 µL DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) kedalam tabung mikro
0,6 mL, tambahkan Primer Forward PT2-EcoRI 1 µL, tambahkan Primer
Reverse PT2-SacII 1 µL, tambahkan 9,5 µL Nuclease Free Water serta tambahkan
1 µL gen PT2-pJET1.2 (sebagai templat DNA sampel) atau 1 µL gen PT2
(sebagai templat DNA kontrol positif)
Catatan:
Pada saat pemipetan semua reagen disimpan di atas es agar berada dalam
keadaan dingin.
Enzim harus disimpan pada -20oC dan hanya dikeluarkan dari freezer sesaat
sebelum digunakan
Ketika menambahkan reagen harus selalu dilakukan resuspensi.
Komposisi DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) terdiri dari DreamTaq
DNA Polymerase, 2x DreamTag Green buffer, dATP, dCTP, dGTP, serta dTTP
masing-masing 0,4 mM, dan 4 mM MgCl2.
KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
DIREKTORAT RISET, PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT, DAN INOVASI
PUSAT RISET BIOTEKNOLOGI MOLEKULER DAN
BIOINFORMATIKA
Jalan Singaperbangsa No. 2 Bandung 40133 Telp./Faks (022) 2507874; 0821 2138 7874
e-mail: puslit.bio.inform@unpad.ac.id
3. Set-up mesin PCR atau siapkan program file PCR untuk 25 siklus dengan masingmasing siklus terdiri atas:
Tahapan
Suhu
Waktu
Jumlah
siklus
Denaturasi awal
95°C
2 menit
1
Denaturasi
95°C
1 menit
Annealing
55,5°C
1 menit
Elongasi
72°C
1 menit
Elongasi akhir
72°C
10 menit
25 siklus
1
4. Letakkan tabung mikro di dalam mesin PCR kemudian start reaksi PCR
5. Setelah selesai (tahap HOLD 4°C), klik enter. Saat suhu mencapai 25°C, sampel
dapat diambil dan alat PCR dimatikan.
B. Elektroforesis Agarosa
Alat
: Elektroforesis horizontal mini subTM DNA electrophoresis cell (Biorad),
Labu erlenmeyer 250 mL, Micropipette eppendorf 0,1-2,5 uL; 0,5-10 uL; dan
2-20 uL, UV-transiluminator
Bahan
: Agarosa, bufer TAE 1x (Tris-asetat 0,04 M, EDTA 0,001 M pH 8,0),
Loading buffer (Sukrosa 50%, EDTA 0,1 M pH 8,0, bromfenol biru 0,1% pH
8,0), Marka DNA 1 kb, GelRed.
Prosedur:
Siapkan gel agarosa ketika menunggu proses PCR selesai dengan prosedur sebagai
berikut:
KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
DIREKTORAT RISET, PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT, DAN INOVASI
PUSAT RISET BIOTEKNOLOGI MOLEKULER DAN
BIOINFORMATIKA
Jalan Singaperbangsa No. 2 Bandung 40133 Telp./Faks (022) 2507874; 0821 2138 7874
e-mail: puslit.bio.inform@unpad.ac.id
1. Timbang 0,35 gram agarosa dalam labu erlenmeyer 250 mL, tambahkan 35 mL
bufer TAE 1x.
2. Panaskan larutan tersebut hingga semua agarosa larut, lalu dinginkan hingga suhu
larutan mencapai 50-60oC.
3. Siapkan gel tray dengan memasang penyumbat dan pembentuk sumur gel.
4. Tuang larutan gel ke dalam gel tray, tunggu sampai membeku (sekitar 1 jam).
5. Ambil pembentuk sumur dan penyumbat gel dengan hati-hati. Masukkan gel tray
ke dalam electrophoresis chamber yang telah berisi bufer TAE 1x (sampai gel
terendam).
6. Campurkan 5 µL produk PCR dengan 1 µL GelRed kedalam tabung mikro 0,6
mL.
7. Untuk pembuatan marka, campurkan 1 µL DNA 1 kb, 1 µL loading buffer, 4 µL
Nuclease Free Water, dan 1 uL GelRed ke dalam tabung mikro 0,6 mL.
8. Pasang penutup chamber, atur alat pada tegangan 80 volt selama 45 menit.
9. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan UV-transiluminator.
Catatan:
Sinar UV dapat merusak mata dan menyebabkan kanker kulit, pemakaian
transiluminator harus dalam keadaan tertutup kaca dan menggunakan
kacamata khusus.
Ketika menambahkan reagen harus selalu dilakukan resuspensi.
UNIVERSITAS PADJADJARAN
DIREKTORAT RISET, PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT, DAN INOVASI
PUSAT RISET BIOTEKNOLOGI MOLEKULER DAN
BIOINFORMATIKA
Jalan Singaperbangsa No. 2 Bandung 40133 Telp./Faks (022) 2507874; 0821 2138 7874
e-mail: puslit.bio.inform@unpad.ac.id
PROSEDUR PERBANYAKAN GEN PT2 MENGGUNAKAN METODE PCR
DAN KARAKTERISASINYA
A. PCR
Alat
: Eppendorf mastercycler gradient, Micropipette eppendorf 0,1-2,5 µL; 0,5-10
µL; dan 2-20 µL, rak tabung.
Bahan : Gen PT2-pJET1.2, Gen PT2, Primer forward PT2-EcoRI, Primer reverse PT2SacII, Nuclease Free Water, DreamTaq Green PCR Master Mix (2x), tabung mikro
0,6 mL, tip putih (0,1-10 µL) dan tip kuning (10-200 µL).
Prosedur:
1. Templat untuk reaksi PCR adalah 1 µL gen PT2-pJET1.2 dan 1 µL gen PT2
(sebagai kontrol positif)
2. Masukkan 12,5 µL DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) kedalam tabung mikro
0,6 mL, tambahkan Primer Forward PT2-EcoRI 1 µL, tambahkan Primer
Reverse PT2-SacII 1 µL, tambahkan 9,5 µL Nuclease Free Water serta tambahkan
1 µL gen PT2-pJET1.2 (sebagai templat DNA sampel) atau 1 µL gen PT2
(sebagai templat DNA kontrol positif)
Catatan:
Pada saat pemipetan semua reagen disimpan di atas es agar berada dalam
keadaan dingin.
Enzim harus disimpan pada -20oC dan hanya dikeluarkan dari freezer sesaat
sebelum digunakan
Ketika menambahkan reagen harus selalu dilakukan resuspensi.
Komposisi DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) terdiri dari DreamTaq
DNA Polymerase, 2x DreamTag Green buffer, dATP, dCTP, dGTP, serta dTTP
masing-masing 0,4 mM, dan 4 mM MgCl2.
KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
DIREKTORAT RISET, PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT, DAN INOVASI
PUSAT RISET BIOTEKNOLOGI MOLEKULER DAN
BIOINFORMATIKA
Jalan Singaperbangsa No. 2 Bandung 40133 Telp./Faks (022) 2507874; 0821 2138 7874
e-mail: puslit.bio.inform@unpad.ac.id
3. Set-up mesin PCR atau siapkan program file PCR untuk 25 siklus dengan masingmasing siklus terdiri atas:
Tahapan
Suhu
Waktu
Jumlah
siklus
Denaturasi awal
95°C
2 menit
1
Denaturasi
95°C
1 menit
Annealing
55,5°C
1 menit
Elongasi
72°C
1 menit
Elongasi akhir
72°C
10 menit
25 siklus
1
4. Letakkan tabung mikro di dalam mesin PCR kemudian start reaksi PCR
5. Setelah selesai (tahap HOLD 4°C), klik enter. Saat suhu mencapai 25°C, sampel
dapat diambil dan alat PCR dimatikan.
B. Elektroforesis Agarosa
Alat
: Elektroforesis horizontal mini subTM DNA electrophoresis cell (Biorad),
Labu erlenmeyer 250 mL, Micropipette eppendorf 0,1-2,5 uL; 0,5-10 uL; dan
2-20 uL, UV-transiluminator
Bahan
: Agarosa, bufer TAE 1x (Tris-asetat 0,04 M, EDTA 0,001 M pH 8,0),
Loading buffer (Sukrosa 50%, EDTA 0,1 M pH 8,0, bromfenol biru 0,1% pH
8,0), Marka DNA 1 kb, GelRed.
Prosedur:
Siapkan gel agarosa ketika menunggu proses PCR selesai dengan prosedur sebagai
berikut:
KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
DIREKTORAT RISET, PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT, DAN INOVASI
PUSAT RISET BIOTEKNOLOGI MOLEKULER DAN
BIOINFORMATIKA
Jalan Singaperbangsa No. 2 Bandung 40133 Telp./Faks (022) 2507874; 0821 2138 7874
e-mail: puslit.bio.inform@unpad.ac.id
1. Timbang 0,35 gram agarosa dalam labu erlenmeyer 250 mL, tambahkan 35 mL
bufer TAE 1x.
2. Panaskan larutan tersebut hingga semua agarosa larut, lalu dinginkan hingga suhu
larutan mencapai 50-60oC.
3. Siapkan gel tray dengan memasang penyumbat dan pembentuk sumur gel.
4. Tuang larutan gel ke dalam gel tray, tunggu sampai membeku (sekitar 1 jam).
5. Ambil pembentuk sumur dan penyumbat gel dengan hati-hati. Masukkan gel tray
ke dalam electrophoresis chamber yang telah berisi bufer TAE 1x (sampai gel
terendam).
6. Campurkan 5 µL produk PCR dengan 1 µL GelRed kedalam tabung mikro 0,6
mL.
7. Untuk pembuatan marka, campurkan 1 µL DNA 1 kb, 1 µL loading buffer, 4 µL
Nuclease Free Water, dan 1 uL GelRed ke dalam tabung mikro 0,6 mL.
8. Pasang penutup chamber, atur alat pada tegangan 80 volt selama 45 menit.
9. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan UV-transiluminator.
Catatan:
Sinar UV dapat merusak mata dan menyebabkan kanker kulit, pemakaian
transiluminator harus dalam keadaan tertutup kaca dan menggunakan
kacamata khusus.
Ketika menambahkan reagen harus selalu dilakukan resuspensi.